Wiki FKKT - User contributions [en]

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-02T09:36:20Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM ''SLEEPING BEAUTY'' TRANSPOZICIJE ==

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozaznega vezavnega mesta vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz iz drugih podobnih družin na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

===Nastanek sinaptičnega kompleksa===

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

===Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona===

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

Prosti 3'-OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==

===Vstavljanje SB transpozona===

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na pravilno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

===Optimizacija metod uporabe SB===

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

===Primeri biotehnološke uporabe===

"Sleeping beauty" transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost) kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejo. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij. Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

===Prednosti in slabosti uporabe SB===

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distribucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

==VIRI==

‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-02T08:39:01Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM ''SLEEPING BEAUTY'' TRANSPOZICIJE ==

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozaznega vezavnega mesta vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz iz drugih podobnih družin na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

===Nastanek sinaptičnega kompleksa===

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

===Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona===

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==

===Vstavljanje SB transpozona===

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

===Optimizacija metod uporabe SB===

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

===Primeri biotehnološke uporabe===

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

===Prednosti in slabosti uporabe SB===

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

==VIRI==

‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-02T08:32:03Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM ''SLEEPING BEAUTY'' TRANSPOZICIJE ==

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozaznega vezavnega mesta vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

===Nastanek sinaptičnega kompleksa===

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

===Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona===

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==

===Vstavljanje SB transpozona===

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

===Optimizacija metod uporabe SB===

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

===Primeri biotehnološke uporabe===

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

===Prednosti in slabosti uporabe SB===

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

==VIRI==

‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:52:37Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM ''SLEEPING BEAUTY'' TRANSPOZICIJE ==

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

===Nastanek sinaptičnega kompleksa===

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

===Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona===

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==

===Vstavljanje SB transpozona===

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

===Optimizacija metod uporabe SB===

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

===Primeri biotehnološke uporabe===

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

===Prednosti in slabosti uporabe SB===

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

==VIRI==

‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:51:47Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM ''SLEEPING BEAUTY'' TRANSPOZICIJE ==

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

===Nastanek sinaptičnega kompleksa===

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

===Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona===

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==

===Vstavljanje SB transpozona===

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

===Optimizacija metod uporabe SB===

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

===Primeri biotehnološke uporabe===

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

===Prednosti in slabosti uporabe SB===

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

==VIRI==

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Talk:Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:49:44Z

Nuša Kos Thaler:

'''Neža Peternel''': uvod, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona, integracija ''Sleeping beauty'' transpozona, prednosti in slabosti uporabe SB

'''Andraž Rotar''': optimizacija metod uporabe SB, primeri biotehnološke uporabe

'''Nuša Kos Thaler''': vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, vstavljanje SB transpozona

Talk:Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:40:02Z

Nuša Kos Thaler: New page: '''Neža Peternel''': uvod, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona, integracija ''Sleeping beauty'' transpozona '''Andraž Rotar''': optimizacija metod uporabe SB, primeri biotehnolo...

'''Neža Peternel''': uvod, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona, integracija ''Sleeping beauty'' transpozona

'''Andraž Rotar''': optimizacija metod uporabe SB, primeri biotehnološke uporabe

'''Nuša Kos Thaler''': vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, vstavljanje SB transpozona

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:37:41Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE ==

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

===Nastanek sinaptičnega kompleksa===

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

===Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona===

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==

===Vstavljanje SB transpozona===

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

===Optimizacija metod uporabe SB===

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

===Primeri biotehnološke uporabe===

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

===Prednosti in slabosti uporabe SB===

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

==VIRI==

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:37:17Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE ==

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

===Nastanek sinaptičnega kompleksa===

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

===Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona===

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==

===Vstavljanje SB transpozona===

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

===Optimizacija metod uporabe SB===

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

===Primeri biotehnološke uporabe===

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

===Prednosti in slabosti uporabe SB===

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

==VIRI==

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:36:05Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE ==

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

----

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

----

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:35:44Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE ==

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

----

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

----

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:35:28Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==
----

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE ==
----

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

----

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

----

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:34:31Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

----

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE ==

----

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

----

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

----

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:33:57Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

----

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE ==

----

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

----

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

----

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:33:30Z

Nuša Kos Thaler:

== UVOD ==

----

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

== MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE ==

----

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

----

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

----

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:31:56Z

Nuša Kos Thaler:

'''UVOD'''

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

----

'''MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE'''

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

----

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

----

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:31:27Z

Nuša Kos Thaler:

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:31:11Z

Nuša Kos Thaler:

'''UVOD'''

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

----

'''MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE'''

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na Sleeping beauty transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

----

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

----

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:29:25Z

Nuša Kos Thaler:

'''UVOD'''

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

'''MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE'''

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na Sleeping beauty transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:28:38Z

Nuša Kos Thaler:

'''UVOD'''

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo ''Sleeping beauty'' transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

'''MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE'''

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na Sleeping beauty transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za Sleeping beauty transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

Sleeping beauty transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:28:06Z

Nuša Kos Thaler:

'''UVOD'''

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo Sleeping beauty transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

'''MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE'''

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na Sleeping beauty transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za Sleeping beauty transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

Sleeping beauty transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:27:53Z

Nuša Kos Thaler:

'''UVOD'''

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo Sleeping beauty transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

'''MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE'''

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na Sleeping beauty transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za Sleeping beauty transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

Sleeping beauty transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:27:07Z

Nuša Kos Thaler:

'''UVOD'''

''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo Sleeping beauty transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

'''MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE'''

Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na Sleeping beauty transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za Sleeping beauty transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''

Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''

Sleeping beauty transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

'''VIRI'''

-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:26:14Z

Nuša Kos Thaler:

'''UVOD'''
''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo Sleeping beauty transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

'''MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE'''
Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

'''Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA'''
Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na Sleeping beauty transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za Sleeping beauty transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

'''Nastanek sinaptičnega kompleksa'''
Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

'''Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona'''
Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

'''Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona'''
Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

'''BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA'''

'''Vstavljanje SB transpozona'''
Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

'''Optimizacija metod uporabe SB'''
Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

'''Primeri biotehnološke uporabe'''
Sleeping beauty transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

'''Prednosti in slabosti uporabe SB'''
Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

'''VIRI'''
-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

2022-05-01T17:23:54Z

Nuša Kos Thaler: New page: BIOTEHNOLOŠKA UPORABA TRANSPOZICIJSKEGA MEHANIZMA: PRIMER ''SLEEPING BEAUTY'' UVOD ''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije ...

BIOTEHNOLOŠKA UPORABA TRANSPOZICIJSKEGA MEHANIZMA: PRIMER ''SLEEPING BEAUTY''

UVOD
''Sleeping Beauty'' (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime ''Sleeping Beauty'' izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib.
Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo Sleeping beauty transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE
Mehanizem ''Sleeping beauty'' (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona in integracija ''Sleeping beauty'' transpozona.

Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA
Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozazne vezavne domene vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na Sleeping beauty transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za Sleeping beauty transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

Nastanek sinaptičnega kompleksa
Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona
Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze, kar privede do proste 3'-OH skupine. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona
Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA

Vstavljanje SB transpozona
Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na prvailno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

Optimizacija metod uporabe SB
Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

Primeri biotehnološke uporabe
Sleeping beauty transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejske. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

Prednosti in slabosti uporabe SB
Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distirbucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

VIRI
‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).
M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.
Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.
‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).
S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.

Transpozicijski elementi

2022-04-25T08:54:41Z

Nuša Kos Thaler:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2021/22 obravnavajo odkritje, mehanizem in vlogo transpozicijskih elementov pri prokariontih in evkariontih. Okvirni naslovi teme so navedeni na spodnjem seznamu.

Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene teme, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato je smiselno, da vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200–1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 15–20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali, in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj zgolj umesti vašo temo v kontekst transpozicijskih elementov.

Seminarske predstavitve bodo potekale predvidoma od 19.4. do 9.5. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot torkovi termini namenjeni seminarjem.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>. Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_koronavirusov Molekularna biologija koronavirusov (2020/21)].

Poglavja za seminarje so:

# [[Odkritje transpozicijskih elementov pri bakterijah]] (Teja Spruk, Urša Štefan, Urša Zevnik) 
# [[Klasifikacija transpozicijskih elementov in pregled načina delovanja]] (Klara Ažbe, Pia Trošt, Ana Maučec) 
# [[Katalitični mehanizem transpozaz]] (Nuša Brdnik, Mark Loborec, Maj Priveršek) 
# [[Transpozoni kot prenašalci odpornosti bakterij proti antibiotikom]] (Ana Kastelic, Lev Jošt, Gašper Struna) 

----

# [[Pomen retroelementov v mikrobnih genomih]] (Ema Kavčič, Špela Rapuš, Ivana Vukšinić) 
# [[Integracija transpozonov pri kvasovkah]] (Katja Resnik, Pia Špehar, Zarja Weingerl) 
# [[Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje]] (Ana Kodra, Neža Lanišek, Gašper Možina) 
# [[TE kot regulatorji transkripcije]] (Marko Kovačić, Nik Vidmar, David Valte) 

----

# [[Interakcije transpozon – gostitelj]] (Maja Deutsch, Sara Jerič, Martin Stanonik) 
# [[Sodobni pogled na TE pri koruzi]] (Špela Sotlar, Tina Zajec, Žan Žnidar) 
# [[Vloga TE pri razvoju zarodka]] (Pia Sotlar, Petja Premrl, Pia Mencin) 
# [[Transpozoni in rak]] (Maša Mencigar, Alliana Kolar, Klara Kočman) 

----

# Uporabna vrednost transpozonov za gensko zdravljenje 
# [[Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty]] (Neža Peternel, Andraž Rotar, Nuša Kos Thaler) 
# Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska 
# TE kot gonilo sprememb v genomu pšenice 

----

# [[TE pri mentalnih boleznih]] (Tina Javeršek, Hana Glavnik, Jan Trebušak) 
# TE pri vnetnih boleznih 

----

# Preferenčna integracijska mesta retrotranspozona Tf1 v genomu kvasovke ''Schizosaccharomyces pombe''

BIO2 Povzetki seminarjev 2021

2021-11-12T18:18:49Z

Nuša Kos Thaler: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 =
==Marko Kovačić - Vloga citokinov poddružine IL-1 pri regulaciji glikolize in njihov vpliv na bolezni, povezane z glikolizo==

Citokini so proteini z majhno molekulsko maso (približno 5-25 kDa), ki so pomembni v celičnem signaliziranju. Delujejo tako, da se vežejo na specifične membranske receptorje in s tem regulirajo transkripcijo genov ali njihovih transkripcijskih faktorjev. Tako sprožijo imunski odziv na vnetje, infekcijo ali na druga stanja. S svojimi signalnimi mehanizmi kontrolirajo rast in aktivnost drugih celic imunskega sistema ter krvnih celic. Interlevkini so skupina citokinov, ki imajo različne funkcije, predvsem so pomembni pri komunikaciji med celicami imunskega sistema, pri vnetnih in imunomodulatornih procesih. Citokini IL-1a, IL-1β, IL-1Ra in IL-33 so zelo pomembni člani družine interlevkinov interlevkin-1 (IL-1). Številne raziskave so pokazale, da je ta poddružina interlevkinov pomembna pri regulaciji glikolize, tj. poti, ki je pomembna za pridobivanje energije v obliki ATP. Glikolizo lahko regulirajo na nivoju vnosa glukoze v celice ali pa na nivoju reguliranja glikolitičnih encimov, ker se njihove signalne poti prepletajo s signalnimi potmi, ki so ključne pri regulaciji glikolize. Disregulacija glikolize lahko vodi do številnih bolezni (rak, diabetes tipa 2, reumatoidni artritis, osteoartritis, astma), poddružina IL-1 pa z regulacijo glikolize lahko vpliva na potek le-teh. Vpliv na delovanje citokinov IL-1a, IL-1β, IL-1Ra in IL-33 tako daje številne možnosti pri zdravljenju z glikolizo povezanih bolezni in prav to je predmet številnih raziskav.

==Janja Bohte - Vloga in regulacija aerobne glikolize pri hepatocelularnem karcinomu==

Rak jeter je šesta najpogostejša oblika raka na svetu. Kar 90% primarnih rakov jeter predstavlja hepatocelularni karcinom (HCC). Za zdravljenje te bolezni se med drugim uporabljalo zdravila za zaviranje specifičnih signalnih poti, ki so odgovorne za rast tumorja. Tako zdravilo je sorafenib, zaviralec tirozin kinaze, na katerega organizem zaradi povečane aerobne glikolize v nekem časovnem obdobju razvije odpornost. Aerobna glikoliza oziroma Warburgov učinek je pojav, ko tumorske celice pretvarjajo glukozo v laktat kljub zadostni količini kisika. Prehod z metabolične poti oksidativne fosforilacije na pot glikolize pri HCC spodbuja celično proliferacijo ter ponuja ugodno mikrookolje za napredovanje tumorja. Odgovorna je za regulacijo invazije, metastaze, angiogeneze in odpornosti na zdravila pri HCC. Mehanizem Warburgovega učinka je kompleksen, pomembno vlogo pa imajo trije encimi, ki sodelujejo v sami presnovi glukoze: heksokinaza 2 (HK2), fosfofruktokinaza 1 (PFK1) in piruvat kinaza tipa M2 (PKM2). Ti so regulirani na več načinov in s številnimi transkripcijskimi faktorji ter metaboličnimi potmi, kot so AMPK, PI3K/Akt metabolična pot, HIF-1α, c-Myc ter nekodirajoče RNA. Zaradi pomembne vloge glikolize pri napredovanju tumorja, je usmerjanje na glavne dejavnike na tej poti, kot je inhibicija HK2, PFK ali PKM2, ključnega pomena za razvoj novih terapevtskih pristopov za zdravljenje HCC.

==Urša Štefan - Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji==

Pojav dvovijačne DNA v citosolu je v celici največkrat pokazatelj celične abnormalnosti – virusne okužbe, poškodbe dednega materiala, oksidativnega stresa ali rakave transformacije. Celice so zato razvile načine zaznavanja prisotnosti DNA v citosolu. Eden izmed takšnih je signalna pot STING. Protein ciklična GMP-AMP sintetaza po vezavi z DNA sintetizira cGAMP, ki aktivira protein STING, vezan v membrani endoplazmatskega retikuluma. Ta se transportira do Golgijevega aparata, kjer mu vezava kinaze TBK1 omogoča aktivacijo transkripcijskih faktorjev IRF3 in NF-κB za citokine. Poleg odziva na citosolno DNA protein STING sodeluje tudi v regulaciji celičnega metabolizma, celičnega cikla, pri indukciji avtofagije, regulaciji ravni kalcija in kot senzor poškodb DNA. Zaradi svojega velikega obsega delovanja je signalna pot STING tarča razvoja številnih zdravil, ki pa je do zdaj bil le delno uspešen. Članek opiše signalno pot STING, njene funkcije v celici in na kratko povzame vlogo signalne poti pri zdravljenju rakavih obolenj.

==Hana Glavnik - S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida==

S-glutationilacija proteinov ima v celici pomembno vlogo. Ob zvišanju koncentracije reaktivnih kisikovih spojin (ROS), se v celici vzpostavi stanje oksidativnega stresa. Ker so za celico te spojine toksične, je razvila mehanizme, ki ji pomagajo uravnavati njihovo koncentracijo in zaščitijo ostale spojine v celici pred ireverzibilno oksidacijo. Najbolj pomembna spojina med ROS je vodikov peroksid, ki ima poleg toksičnih vplivov tudi lastnosti sekundarnega sporočevalca. Ob nastopu oksidativnega stresa v celici in povišane koncentracije vodikovega peroksida, zaznata signale encima GRX1 in GRX2, ki glutationilirata proteine z vezavo glutationa (GSH) na tiolne skupine cisteinov (-SH) in jih tako zaščitita pred poškodbami. Hkrati se s potekom S-glutationilacije aktivirajo tiste metabolične poti, pri katerih nastajajo antioksidanti, največkrat NADPH, ki pomagajo razgraditi vodikov peroksid in ostale ROS spojine. Tiste poti, pri katerih nastajajo ROS spojine so inhibirane s strani S-glutationilacije, dokler ne pride do signala, ki ga sprejmeta GRX1/2. To sproži njune deglutationilacijske aktivnosti in z deglutationilacijo encimov se stanje v celici se normalizira in metabolične poti lahko potekajo nemoteno.

==Tinkara Butara - Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih==
Kemotaksija je oblika gibanja, kjer se organizem giba k ugodnemu kemijskemu gradientu ali stran od toksičnega oziroma neugodnega. Oblika gibanja je značilna za premikajoče se bakterije in arheje. Kemotaksija igra pomembno vlogo pri iskanju hrane, oblikovanju biofilma in tudi pri patogenezi. Takšno gibanje, s prepoznavanjem različnih kemijskih zvrsti, nadzorujejo kemoreceptorji. To so transmembranski proteini, ki vežejo snovi iz okolice in tako sprožijo nadaljnjo signalizacijo znotraj celice, ta pa vodi do spremembe v rotaciji bička. Vezava ugodne signalne molekule vodi do konformacijskih sprememb v kemoreceptorju, ki preprečijo avtofosforilacijo kinaze CheA, ki omogoča fosforilacijo proteina CheY. Fosforiliran CheY se namreč veže na motor bička in tako spremeni njegovo rotacijo iz nasprotne smeri urinega kazalca v smer urinega kazalca. Ko biček rotira v smeri urinega kazalca, to spodbudi naključno gibanje v prostoru, ki na novo orientira bakterijsko celico. Če biček rotira v nasprotni smeri urinega kazalca, pa se celica giba naravnost proti ugodnemu kemijskemu gradientu. Prilagoditev na signal nadzorujejo regulatorni proteini (CheR, CheB, za zaključek signala pa je pomemben protein CheZ, ki hidrolizira CheY-P. Kemoreceptorji se nahajajo na polih bakterijske celice in se združujejo v skupke, kar predstavlja dodatno možnost prilagoditve na kemijski signal.

==David Valte - Jedrni hormonski receptorji in izražanje genov==

Jedrni hormonski receptorji (NHR) so poleg g-proteinov, receptorjev z encimsko aktivnostjo in ionskih kanalčkov le še eden od načinov biosignalizacije, ki pa se po načinu delovanja od drugih precej razlikuje. Jedrni hormonski receptorji neposredno vplivajo na transkripcijo in tako posledično tudi na izražanje genov. Z vezavo ligandov, kot so na primer vitamin d, retinoidni hormoni, tiroidni hormoni in steroidi, na receptor, pride na hormonskih receptorjih do konformacijskih sprememb. Spremembe v konformaciji receptorja pa omogočajo interakcije receptorja s specifičnimi sekvencami DNA. Te sekvence imenujemo hormonski odzivni elementi HRE/HREs, HRE se ponavadi nahajajo znotraj promotorja tarčnega gena, na teh mestih NHR delujejo kot aktivatorji transkripcije DNA. Transkripcija DNA povzroči nastanek mRNA z zapisom za nastanek proteinov, katere celica potrebuje, preko teh pa se lahko odzove na zunanje motnje. Prepoznavo zaporedij HRE in vezavo na DNA omogoča specifična sestava jedrnih receptorjev. Te so sestavljeni iz večih domen, vsaka od teh ima specifično funkcijo brez katere delovanje NR ni mogoče. Posebne domene omogočajo prepoznavo HRE, vezavo na DNA in dimerizacijo z drugimi NR. Na hormonske odzivne elemente se lahko NHR vežejo v obliki monomerov, lahko pa se NHR-ji vežejo drug z drugim, tako nastajajo dimeri. Dimeri omogočajo drugačne afinitete za vezavo z DNA.

==Alliana Kolar - Pomen upravljanja z agonisti, antagonisti in signalnimi modulatorji receptorjev abscizinske kisline (ABA) v agronomiji==
Abscizinska kislina (ABA) je naravno prisoten rastlinski hormon, katerega koncentracija se poviša, ko je rastlina pod vplivom stresa in se na stres tudi odzove. Igra vlogo pri zapiranju listnih rež, ko rastlini primanjkuje vode, inhibira kalitev, spodbuja dormanco, vpliva na cvetenje, staranje listov, zorenju plodov ipd. Ker je sintetična ABA nestabilna in ob zunanjem nanosu ne pokaže vpliva na rastlino, je potrebno z modeliranjem antagonistov oziroma agonistov sintetizirati analoge, ki bi bodisi promovirali/oponašali ali zavirali njeno delovanje. Z njimi bi agronomi lahko manipulirali na delovanje rastline in imeli nadzor nad njim, kar bi posledično prineslo večji donos zaradi večje količine in kakovosti proizvodov. Za to pa je potrebno dobro poznati molekulo in njeno biokemijsko delovanje ob signalizaciji in tudi druge spojine, s katerimi regulira procese v rastlini. Ker pa je to področje še dokaj neraziskano in nepojasnjeno, je zelo težko najti prave analoge in dodatno sintetizirati še boljše. Vendar pa po odkritju sintetične molekule pirabaktin, ki je delovala kot primeren agonist, so odkrili še 14 receptorjev ABA, imenovanih PYR (Pyrabactin Resistance)/PYR-like/(RCARs)Regulatory Components of ABA Receptors in s tem še boljše razumeli delovanje ABA in njene signalizacije.

== Gaja Starc - Medsebojni vpliv vodikovega sulfida in drugih signalnih molekul pri uravnavanju signaliziranja celic zapiralk in odzivu na abiotski oziroma biotski stres==

Vse daljša sušna obdobja, visoke temperature in nizka vlažnost, od pritrjenih organizmov zahtevajo prilagoditve, s katerimi lahko izboljšajo uporabo energije in kemijskih virov v raznovrstnih razmerah. Kot mehanizem, ki omogoča nadzor nad ravnotežjem med izgubo vode in izmenjavo plinov, so rastline v krovnih tkivih razvile aktivno regulirane odprtine – reže. Reže so ključne za fiksacijo atmosferskega ogljika pri fotosintezi, hkrati pa rastline zaradi rež izgubijo 95 % vode v ozračje. Regulacija premikanja listnih rež je ključna za uspešno rast in razvoj rastline. Premikanje rež je tesno povezano z zaporedjem kompleksnih procesov zaznavanja, prenosa in uravnavanja signalov v celicah zapiralkah. Vodikov sulfid (H2S) uravnava premikanje celic zapiralk in sodeluje pri uravnavanju in prenosu signalov v organizmih ter tako sodeluje pri prilagajanju rastline na spremembe v okolju in odzivih na abiotski oziroma biotski stres. Novejše študije pri navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') so pokazale, da zunanji H2S spodbuja zapiranje listnih rež, pri čemer sodeluje s fitohormoni in signalnimi molekulami. Glavna signalna pot, pri kateri sodeluje, je persulfidacija proteinov – post-translacijska modifikacija pri kateri so tiolne skupine cisteinskih ostankov modificirane v persulfidne. Sodeluje tudi pri uravnavanju aktivnosti ionskih kanalčkov v celicah zapiralkah, ki so ključni pri nadzoru premikanja listnih rež in pomaga omiliti oksidativni stres z vplivom na koncentracijo reaktivnih kisikovih zvrsti v celicah zapiralkah.

== Andraž Rotar - Vloga signalne poti JAK/STAT in njeni inhibitorji pri človeških boleznih==
Signalna pot kinaze janus (angl. janus kinase-JAK) in signalnega prenašalca in aktivatorja transkripcije (angl. signal transducer and activator of transcription-STAT), krajše JAK/STAT, je prisotna v večini večceličnih organizmih. Mehanizem poti je eleganten in presenetljivo preprost način, s katerim zunajcelični faktorji povzročijo gensko izražanje. Prepisani geni so nujni pri bioloških procesih kot so celična rast, diferenciacija, apoptoza in imunskem odzivu. Signalizacija JAK/STAT je v celici močno regulirana. Primarni regulatorji spadajo v tri skupine, in sicer med zaviralce citokinske signalizacije (angl. suppressor of cytokine signaling-SOCS), proteinske inhibitorje aktiviranih STAT (angl. protein inhibitors of activated STAT-PIAS) in protein tirozinske fosfataze (angl. protein tyrosine phosphatase-PTP). Če se v organizmu pojavi okvara signalne poti ali njene regulacije to privede do raznih avtoimunih bolezni kot so revmatoidni artritis, Parkinsonova bolezen ter multipla skleroza. Ker pa pot nadzira tudi celični cikel, lahko mutacije genov, odgovornih za sintezo sestavnih delov poti, privedejo do rakavih obolenj. Da bi se z temi patološkimi stanji lahko spopadali, raziskovalci z veliko vnemo iščejo nove vedno boljše inhibitorje signale poti. Do ne daljnega smo poznali le inhibitorje za JAK, sedaj pa jih razvijajo tudi za STAT. V seminarski nalogi so predstavljeni vsi zgoraj našteti proteini, patološka stanja povezana z JAK/STAT, ter inhibitorji za njihovo zdravljenje.

== Pia Špehar - Integrini in njihova vloga pri vezikularnem transportu==
Integrini so adhezijski receptorski proteini, zgrajeni iz dveh podenot. Imajo mnogo različnih funkcij, in sicer povezujejo citoskelet in zunajcelični matriks, s tem posledično povežejo notranjost celice z njeno okolico. Delujejo kot prenašalci signalov in spodbujevalci celične proliferacije in preživetja. Sodelujejo pri imunskem odzivu, apoptozi, celični diferenciaciji, mnoge raziskave pa so pokazale, da so ključni tudi pri signalizaciji in regulaciji vezikularnega transporta. Ključno vlogo imajo pri eksocitozi biosintetskih in sekretornih veziklov, saj nase vežejo mikrotubule in preko njih usmerjajo vezikle do celične površine. Sodelujejo tudi pri procesu degranulacije v trombocitih in levkocitih, pri agregaciji trombocitov in posledično pri hemostazi, ki je prva stopnja celjenja ran. V citotoksičnih limfocitih prepoznava antigena na tarčni celici povzroči sidranje mikrotubulov na integrine. Ti se nato povežejo z medcelično adhezijsko molekulo in tako sprožijo prenos signala za celično smrt tarčne celice. V trombocitih pa integrin-posredovana degranulacija α-granul omogoči agregacijo trombocitov in s tem nastanek krvnega strdka, ki zaustavi krvavitev. Integrini sodelujejo tudi pri endocitozi, in sicer pri vnosu virusov in zunajceličnih veziklov v celico. V celico se lahko prenese virus, vsebina veziklov ali pa samo signal, ki sproži nadaljnje procese znotraj celice. Pomembni so tudi za prenos signalov pri endocitotskem recikliranju receptorjev tirozin kinaz (RTK).

==Tina Urh - Nevrotransmiterji, agonisti in antagonisti receptorjev kot tarča zdravljenja==
Nevrotransmiterji acetilholin, norepinefrin, dopamin, serotonin, subtanca P, GABA in glutamat posredujejo stimulatorne ali inhibitorne živčne funkcije preko vezave na specifične receptorje. Izločajo se iz avtonomnih živcev, ganglijev, nadledvične žleze, rakavih celic in celic imunskega sistema. Spremenjena komunikacija med živčnim in imunskim sistemom in uporaba receptorskih agonistov/antagonistov je vedno pogosteje tarča zdravljenja nevrodegenerativnih, imunopatoloških in avtoimunskih bolezni. E in NE sta stresna hormona in interagirata z α in β adrenergičnimi receptorji; aktivacija β2-AR (agonist izoprotenerol) spoodbuja rast tumorja. Blokira jo antagonist propranolol. GABA je pomirjevalo in antidiabetično sredstvo, stimulira rakavo proliferacijo preko GABAA; A receptorski agonist je muscimol. Vendar pa je vpliv GABA odvisen od tipa raka in receptorja. Serotonin (5-HT) ima vlogo vazokonstriktorja; proizvajajo ga imunske celice. Antagonisti 5-HT2AR imajo antipsihotične in antidepresivne lastnosti. Povečanje števila receptorjev 5-HT1A kaže na zaviranje izločanja serotonina in posledično povečano depresivnost. Dopamin oz. agonisti DA receptorjev izkazujejo inhibitorni efekt na rast tumorja. Neselektivni agonisti so učinkoviti za zdravljenje bolezni CŽS. Tudi vloge dopamin receptorjev so specifične glede na tip tumorja. Substanca P spada v družino nevropeptidov in spodbuja razvoj raka. Inhibicija receptorja NK-1 s specifičnimi antagonisti povzroči antitumorske učinke. Glutagonski agonisti lahko sprožijo smrt T celic, odvečni Glu vpliva na razvoj epilepsije in raka. Za zdravljenje bi se lahko uporabljalo inhibitorje mGluR1.

== Katja Resnik - Signalna omrežja, ki povzročajo raka ==
Normalno delovanje vsake posamezne celice in posledično organizma kot celote nam omogočajo številni procesi, kjer je ključnega pomena njihova regulacija. Tako lahko spremenjene signalne poti, ki v naših celicah uravnavajo predvsem procese celične proliferacije, diferenciacije, apoptoze in na splošno celičnega cikla privedejo do številnih bolezni, med drugim tudi do razvoja raka. Dve ključni poti, ki sta pri večini človeških oblik raka napačno regulirani sta signalni poti RAS in APC. RAS proteini so vrsta G proteinov, ki regulirajo normalen potek celičnega cikla preko povezovanja z efektorskimi proteini. Onkogene oblike RAS proteinov, ki so posledica mutacij, povzročijo njihovo nenehno aktivnost, kar vodi v transformacijo signalne poti. Ta se odraža v izražanju genov, ki se sicer naj ne bi izražali, kar lahko vodi v nenehno spodbujanje celične proliferacije. Po drugi strani pa do podobnega učinka pride tudi zaradi napak v signalni poti APC, ko okvarjen protein APC ne more več opravljati funkcije zmanjševanja koncentracije ključnega proteina za regulacijo in prehod iz faze celične proliferacije v fazo diferenciacije in staranja celic. Proučevanje takšnih signalnih poti nam omogoča spoznavanje vplivov določenih mutacij na posamezne procese in njihovo prispevanje k razvoju raka. Pomembno je le, da na signalne poti gledamo kot na prepletena omrežja, kar lahko ključno prispeva k razvoju uspešnih zdravil in metod zdravljenja omenjene bolezni.

== Nuša Kos Thaler - Motnje metabolizma glikogena in njihove posledice ==
Glikogen je makromolekula, sestavljena iz enot glukoze, ki jo najdemo predvsem v jetrih in mišicah. Njegov metabolizem je ključnega pomena za pridobivanje in shranjevanje energije v človeškem telesu. Če ne deluje pravilno, lahko povzroča različne bolezni, ki jim s skupnim imenom rečemo bolezni kopičenja glikogena (glycogen storage diseases – GSD). Te so praviloma genetske in povezane z mutacijami genov, ki kodirajo encime za sintezo, razgradnjo ali regulacijo dolžine glikogenskih verig. Pri bolezni kopičenja glikogena tipa I je mutiran encim α-glukoza-6-fosfataza, ki katalizira pretvorbo iz glukoze-6-fosfata v glukozo, kar lahko povzroči hipoglikemijo pacientov. Pri bolezni kopičenja glikogena tipa II je mutiran encim za razgradnjo glikogena v lizosomu (kisla α-glukozidaza). Zaradi neaktivnosti encima se glikogen ne more razgraditi in se nalaga v lizosomih. Če ti počijo, lahko poškodujejo celico, kar privede do mnogih okvar v telesu, predvsem do progresivne mišične oslabelosti. Zelo poseben tip bolezni je Laforina bolezen, kjer se pokaže pomembnost glikogena še v drugih organih, možganih. Pri njej se zgodijo mutacije na genih za laforin in malin, ki skupaj regulirata dolžine stranskih verig glikogena. Pogosta posledica so epileptični napadi. Kljub mnogim raziskavam na tem področju najučinkovitejših rešitev za zdravljenje omenjenih bolezni še nismo odkrili.

BIO2 Seminar 2021

2021-11-07T08:00:48Z

Nuša Kos Thaler: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''priimek, ime'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Valte, David||12||Jedrni hormonski receptorji in izražanje genov||Mitkov, Kostadin||Brdnik, Nuša||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Kolar, Alliana||12||Pomen upravljanja z agonisti, antagonisti in signalnimi modulatorji receptorjev abscizinske kisline (ABA) v agronomiji||Vukšinić, Ivana||Premrl, Petja||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Glavnik, Hana||12||S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida||Kovač, Ela||Kavčič, Ema||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Štefan, Urša||12||Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji||Vujović, Nataša||Zajec, Tina||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Butara, Tinkara||12||Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih||Sotlar, Špela||Žnidar, Žan||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Špehar, Pia||12||Integrini in njihova vloga pri vezikularnem transportu||Trošt, Pia||Rus, Metka||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Urh, Tina||12|| Nevrotransmiterji, agonisti in antagonisti kot tarča zdravljenja ||Maučec, Ana||Loborec, Mark||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Rotar, Andraž||12||Vloga signalne poti JAK/STAT in njeni inhibitorji pri človeških boleznih||Priveršek, Maj||Kastelic, Ana||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Starc, Gaja||12||Medsebojni vpliv vodikovega sulfida in drugih signalnih molekul pri uravnavanju signaliziranja celic zapiralk in odzivu na abiotski oziroma biotski stres||Spruk, Teja||Možina, Gašper||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Resnik, Katja||12||Signalna omrežja, ki povzročajo raka||Deutsch, Maja||Sotlar, Pia||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Bohte, Janja||14-15||Vloga in regulacija aerobne glikolize pri hepatocelularnem karcinomu||Valte, David||Mitkov, Kostadin||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Miklošič, Maja||14-15||||Kolar, Alliana||Vukšinić, Ivana||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kovačić, Marko||14-15||Vloga citokinov poddružine IL-1 pri regulaciji glikolize in njihov vpliv na bolezni, povezane z glikolizo||Glavnik, Hana||Kovač, Ela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kolbl, Karidia||14-15||||Štefan, Urša||Vujović, Nataša||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kos Thaler, Nuša||14-15||Motnje metabolizma glikogena in njihove posledice||Butara, Tinkara||Sotlar, Špela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Ažbe, Klara||16||Vpliv metabolitov Krebsovega cikla na fiziologijo in bolezni||Špehar, Pia||Trošt, Pia||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Jerič, Sara||16||||Urh, Tina||Maučec, Ana||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Mencin, Pia||16||||Rotar, Andraž||Priveršek, Maj||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Weingerl, Zarja||16||||Starc, Gaja||Spruk, Teja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Kartal, Ena||16||||Resnik, Katja||Deutsch, Maja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Struna, Gašper||17||||Bohte, Janja||Valte, David||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Špenko, Andrej||17||||Miklošič, Maja||Kolar, Alliana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Zevnik, Urša||17||Metabolizem možganskih celic med spanjem||Kovačić, Marko||Glavnik, Hana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Peternel, Neža||17||Vloga karnitina pri telesni aktivnosti in regeneraciji||Kolbl, Karidia||Štefan, Urša||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Vidmar, Nik||17||Delovanje in pomen ketonskih telesc||Kos Thaler, Nuša||Butara, Tinkara||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Trebušak, Jan||18||||Ažbe, Klara||Špehar, Pia||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kores, Lana||18||||Jerič, Sara||Urh, Tina||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Razdevšek, Miha||18||||Mencin, Pia||Rotar, Andraž||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Javeršek, Tina||18||||Weingerl, Zarja||Starc, Gaja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kočman, Klara||18||||Kartal, Ena||Resnik, Katja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Jošt, Lev||19||||Struna, Gašper||Bohte, Janja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Razboršek, Klara||19||Regulacija apoptoze v zdravju in bolezni: uravnoteženo delovanje BCL-2 proteinov ||Špenko, Andrej||Miklošič, Maja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Rapuš, Špela||19||||Zevnik, Urša||Kovačić, Marko||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Mencigar, Maša||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri rakavih obolenjih||Peternel, Neža||Kolbl, Karidia||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Ivošević, Vanja||19||||Vidmar, Nik||Kos Thaler, Nuša||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Kogovšek, Jan||20||Karbonska anhidraza in molekularna evolucija C4 fotosinteze||Trebušak, Jan||Ažbe, Klara||||||
|-
| Brdnik, Nuša||20||||Kores, Lana||Jerič, Sara||||||
|-
| Premrl, Petja||20||||Razdevšek, Miha||Mencin, Pia||||||
|-
| Kavčič, Ema||20||||Javeršek, Tina||Weingerl, Zarja||||||
|-
| Zajec, Tina||20||||Kočman, Klara||Kartal, Ena||||||
|-
| Žnidar, Žan||21||||Jošt, Lev||Struna, Gašper||||||
|-
| Rus, Metka||21||||Razboršek, Klara||Špenko, Andrej||||||
|-
| Loborec, Mark||21||||Rapuš, Špela||Zevnik, Urša||||||
|-
| Kastelic, Ana||21||||Mencigar, Maša||Peternel, Neža||||||
|-
| Možina, Gašper||21||||Ivošević, Vanja||Vidmar, Nik||||||
|-
| Sotlar, Pia||22||||Kogovšek, Jan||Trebušak, Jan||||||
|-
| Mitkov, Kostadin||22||||Brdnik, Nuša||Kores, Lana||||||
|-
| Vukšinić, Ivana||22||||Premrl, Petja||Razdevšek, Miha||||||
|-
| Kovač, Ela||22||||Kavčič, Ema||Javeršek, Tina||||||
|-
| Vujović, Nataša||22||||Zajec, Tina||Kočman, Klara||||||
|-
| Sotlar, Špela||23||||Žnidar, Žan||Jošt, Lev||||||
|-
| Trošt, Pia||23||||Rus, Metka||Razboršek, Klara||||||
|-
| Maučec, Ana||23||||Loborec, Mark||Rapuš, Špela||||||
|-
| Priveršek, Maj||23||||Kastelic, Ana||Mencigar, Maša||||||
|-
| Spruk, Teja||23||||Možina, Gašper||Ivošević, Vanja||||||
|-
| Deutsch, Maja||23||||Sotlar, Pia||Kogovšek, Jan||||||
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim, da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo, in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [https://libgen.is/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2021|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5–12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli, v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva, določenega v tabeli, določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20–25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji. Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili, vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate, poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.docx za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.docx za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.docx za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.pptx za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje ... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2021

2021-11-06T18:22:07Z

Nuša Kos Thaler: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''priimek, ime'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Valte, David||12||Jedrni hormonski receptorji in izražanje genov||Mitkov, Kostadin||Brdnik, Nuša||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Kolar, Alliana||12||Pomen upravljanja z agonisti, antagonisti in signalnimi modulatorji receptorjev abscizinske kisline (ABA) v agronomiji||Vukšinić, Ivana||Premrl, Petja||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Glavnik, Hana||12||S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida||Kovač, Ela||Kavčič, Ema||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Štefan, Urša||12||Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji||Vujović, Nataša||Zajec, Tina||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Butara, Tinkara||12||Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih||Sotlar, Špela||Žnidar, Žan||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Špehar, Pia||12||Integrini in njihova vloga pri vezikularnem transportu||Trošt, Pia||Rus, Metka||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Urh, Tina||12|| Nevrotransmiterji, agonisti in antagonisti kot tarča zdravljenja ||Maučec, Ana||Loborec, Mark||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Rotar, Andraž||12||Vloga signalne poti JAK/STAT in njeni inhibitorji pri človeških boleznih||Priveršek, Maj||Kastelic, Ana||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Starc, Gaja||12||Medsebojni vpliv vodikovega sulfida in drugih signalnih molekul pri uravnavanju signaliziranja celic zapiralk in odzivu na abiotski oziroma biotski stres||Spruk, Teja||Možina, Gašper||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Resnik, Katja||12||Signalna omrežja, ki povzročajo raka||Deutsch, Maja||Sotlar, Pia||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Bohte, Janja||14-15||Vloga in regulacija aerobne glikolize pri hepatocelularnem karcinomu||Valte, David||Mitkov, Kostadin||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Miklošič, Maja||14-15||||Kolar, Alliana||Vukšinić, Ivana||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kovačić, Marko||14-15||Vloga citokinov poddružine IL-1 pri regulaciji glikolize in njihov vpliv na bolezni, povezane z glikolizo||Glavnik, Hana||Kovač, Ela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kolbl, Karidia||14-15||||Štefan, Urša||Vujović, Nataša||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kos Thaler, Nuša||14-15||Bolezni kopičenja glikogena||Butara, Tinkara||Sotlar, Špela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Ažbe, Klara||16||Vpliv metabolitov Krebsovega cikla na fiziologijo in bolezni||Špehar, Pia||Trošt, Pia||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Jerič, Sara||16||||Urh, Tina||Maučec, Ana||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Mencin, Pia||16||||Rotar, Andraž||Priveršek, Maj||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Weingerl, Zarja||16||||Starc, Gaja||Spruk, Teja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Kartal, Ena||16||||Resnik, Katja||Deutsch, Maja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Struna, Gašper||17||||Bohte, Janja||Valte, David||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Špenko, Andrej||17||||Miklošič, Maja||Kolar, Alliana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Zevnik, Urša||17||Metabolizem možganskih celic med spanjem||Kovačić, Marko||Glavnik, Hana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Peternel, Neža||17||Vloga karnitina pri telesni aktivnosti in regeneraciji||Kolbl, Karidia||Štefan, Urša||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Vidmar, Nik||17||Delovanje in pomen ketonskih telesc||Kos Thaler, Nuša||Butara, Tinkara||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Trebušak, Jan||18||||Ažbe, Klara||Špehar, Pia||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kores, Lana||18||||Jerič, Sara||Urh, Tina||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Razdevšek, Miha||18||||Mencin, Pia||Rotar, Andraž||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Javeršek, Tina||18||||Weingerl, Zarja||Starc, Gaja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kočman, Klara||18||||Kartal, Ena||Resnik, Katja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Jošt, Lev||19||||Struna, Gašper||Bohte, Janja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Razboršek, Klara||19||Regulacija apoptoze v zdravju in bolezni: uravnoteženo delovanje BCL-2 proteinov ||Špenko, Andrej||Miklošič, Maja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Rapuš, Špela||19||||Zevnik, Urša||Kovačić, Marko||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Mencigar, Maša||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri rakavih obolenjih||Peternel, Neža||Kolbl, Karidia||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Ivošević, Vanja||19||||Vidmar, Nik||Kos Thaler, Nuša||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Kogovšek, Jan||20||Karbonska anhidraza in molekularna evolucija C4 fotosinteze||Trebušak, Jan||Ažbe, Klara||||||
|-
| Brdnik, Nuša||20||||Kores, Lana||Jerič, Sara||||||
|-
| Premrl, Petja||20||||Razdevšek, Miha||Mencin, Pia||||||
|-
| Kavčič, Ema||20||||Javeršek, Tina||Weingerl, Zarja||||||
|-
| Zajec, Tina||20||||Kočman, Klara||Kartal, Ena||||||
|-
| Žnidar, Žan||21||||Jošt, Lev||Struna, Gašper||||||
|-
| Rus, Metka||21||||Razboršek, Klara||Špenko, Andrej||||||
|-
| Loborec, Mark||21||||Rapuš, Špela||Zevnik, Urša||||||
|-
| Kastelic, Ana||21||||Mencigar, Maša||Peternel, Neža||||||
|-
| Možina, Gašper||21||||Ivošević, Vanja||Vidmar, Nik||||||
|-
| Sotlar, Pia||22||||Kogovšek, Jan||Trebušak, Jan||||||
|-
| Mitkov, Kostadin||22||||Brdnik, Nuša||Kores, Lana||||||
|-
| Vukšinić, Ivana||22||||Premrl, Petja||Razdevšek, Miha||||||
|-
| Kovač, Ela||22||||Kavčič, Ema||Javeršek, Tina||||||
|-
| Vujović, Nataša||22||||Zajec, Tina||Kočman, Klara||||||
|-
| Sotlar, Špela||23||||Žnidar, Žan||Jošt, Lev||||||
|-
| Trošt, Pia||23||||Rus, Metka||Razboršek, Klara||||||
|-
| Maučec, Ana||23||||Loborec, Mark||Rapuš, Špela||||||
|-
| Priveršek, Maj||23||||Kastelic, Ana||Mencigar, Maša||||||
|-
| Spruk, Teja||23||||Možina, Gašper||Ivošević, Vanja||||||
|-
| Deutsch, Maja||23||||Sotlar, Pia||Kogovšek, Jan||||||
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim, da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo, in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [https://libgen.is/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2021|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5–12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli, v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva, določenega v tabeli, določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20–25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji. Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili, vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate, poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.docx za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.docx za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.docx za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.pptx za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje ... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK 2022 Povzetki seminarjev

2021-03-12T09:47:59Z

Nuša Kos Thaler: /* Nuša Kos Thaler: Hitra evolucija litičnih genov v enoverižnih RNA bakteriofagih */

=== Ime in priimek: Naslov seminarja ===

Sed ut perspiciatis unde omnis iste natus error sit voluptatem accusantium doloremque laudantium, totam rem aperiam, eaque ipsa quae ab illo inventore veritatis et quasi architecto beatae vitae dicta sunt explicabo. Nemo enim ipsam voluptatem quia voluptas sit aspernatur aut odit aut fugit, sed quia consequuntur magni dolores eos qui ratione voluptatem sequi nesciunt. Neque porro quisquam est, qui dolorem ipsum quia dolor sit amet, consectetur, adipisci velit, sed quia non numquam eius modi tempora incidunt ut labore et dolore magnam aliquam quaerat voluptatem. Ut enim ad minima veniam, quis nostrum exercitationem ullam corporis suscipit laboriosam, nisi ut aliquid ex ea commodi consequatur? Quis autem vel eum iure reprehenderit qui in ea voluptate velit esse quam nihil molestiae consequatur, vel illum qui dolorem eum fugiat quo voluptas nulla pariatur?

=== Živa Urh: Zmanjšanje transkripcijske aktivnosti povzroči stresno pogojena jedrna kondenzacija NELF ===

V stresnih razmerah celice preklopijo iz običajnega v bolj omejen način delovanja, da se zaščitijo pred poškodbami. Pri tem si pomagajo na različne načine. Eden od načinov je varnostni program imenovan toplotni šok, ki je povezan s hitro regulacijo genske aktivnosti (zmanjšanjem transkripcije) v stresnih situacijah. Stres povzroči nastanek jedrnih kondenzatov NELF, ki nastanejo, ko NELF tvori kapljice. NELF ali negativni podaljševalni dejavnik, je proteinski kompleks iz več podenot, ki se ob jedrnem signalu oblikuje v kondenzate oz. kapljice. Vezava kompleksa NELF na promotorje vzdrževalnih genov je tista, ki povzroči slabšo mobilnost RNA polimeraze II in posledično slabše prepisovanje genov ter tako zmanjša proizvodnjo proteinov, ki niso nujni v stresnih razmerah. Mehanizem nastanka jedrnih kondenzatov je povezan z defosforilacijo NELF in nadaljnjo SUMOilacijo. Ta dva procesa spadata pod posebne post-translacijske modifikacije (PTM), ki so bistvene za kondenzacijo NELF. Pomembno vlogo pri formaciji kondenzatov NELF imajo tudi neurejene regije (IDR), ki jih najdemo pri posameznih podenotah tega proteinskega kompleksa. IDR so deli proteinov brez fiksne strukture in delujejo kot lovke. Povezave med lovkami podenot A in E med so bistvenega pomena za tvorbo kapljic oz. kondenzatov. Celice, ki zaradi pomanjkanja lovk pri podenotah ne tvorijo kondenzatov NELF tudi ne zmanjšajo transkripcije. Posledično take celice normalno prepisujejo gene in so tako bolj dovzetne za celično smrt.

=== Tinkara Butara: Kako rastline zaznajo napad herbivorov ===

Rastline niso nemočni opazovalci dogajanja okoli njih, ampak se na okoliške dražljaje tudi odzivajo. Skozi evolucijo so razvile posebne obrambne mehanizme, ki se sprožijo kot odgovor na elicitorje. Elicitorji so kemijske zvrsti, ki jih lahko izločajo herbivori ali pa rastline same. Te kemijske zvrsti se vežejo na proteinske receptorje na celični membrani in tako sprožijo odziv, na primer na objedanje. Sporočilo o nevarnosti se nato širi do lokalno poškodovanih delov rastline in sistemsko opozarja celotno rastlino na poškodbo. Rastlini lastni elicitorji so najpreprostejši tip, med katerimi je najbolj univerzalen zunajcelični ATP. Primerni elicitorji herbivorov so prebavni encimi v njihovi slini ter konjugati maščobnih kislin in aminokislin. Odziv rastline na napad herbivora pa je lahko povezan tudi s simbiotskimi organizmi herbivora. Ti lahko izločajo snovi s katerimi omogočijo lažji razvoj insekta ali pa s tem pomagajo rastlini. Pomemben sprožilec rastlinskega odziva na herbivore so tudi fizični dražljaji, ki jih ti povzročajo. Pri tem se sproščajo hlapne snovi, ki lahko služijo privabljanju naravnih sovražnikov herbivora ali pa širijo sporočilo o nevarnosti do drugih rastlin. Kot odziv na elicitorje se v večini primerov tvorita rastlinska hormona jasmonska in salicilna kislina, ki sta del obrambnih mehanizmov rastlin. Karakterizacija rastlinskih elicitorjev nam ponuja orodje za razvoj agrokemikalij, ki bodo odganjale herbivore in hkrati ščitile rastline.

=== Pia Špehar: Mehanizem delovanja proteina omogoča odpornost na zdravila proti raku ===

Leta 1986 je celični biokemik Kazumitsu Ueda odkril, da ima protein ABCB1 zmožnost, da iz rakavih celic transportira mnoge kemoterapevtike in tako telesu omogoči odpornost na kemoterapijo. ABCB1 spada med ABC-prenašalce, in sicer je eden izmed tistih prenašalcev, ki iz celic izločajo toksične hidrofobne komponente. Najdemo ga v membranah celic v jetrih, možganih, testisih in placenti. Skoraj 30 let po odkritju funkcije proteina, je Ueda s svojo ekipo lahko določil še mehanizem njegovega delovanja, in sicer z izvedbo več raziskav. Sprva so protein kristalizirali v stanju pred in po transportu substrata ter primerjali stanji med seboj, izvedli pa so tudi analizo s FRET tehniko. Ugotovili so, da substrat vstopi v osrednjo votlino skozi del proteina v notranjosti celice. Nato se veže na vrh osrednje votline proteina, kjer se nahaja hidrofobno aromatsko omrežje, ki ima pomembno vlogo pri prepoznavanju substratov. Vezava substrata na to omrežje sproži konformacijsko spremembo proteina. Za spremembo je potrebna tudi energija, ki jo priskrbi molekula ATP. Vezava ATP-ja sproži tudi nastanek omrežja, ki povzroči, da se protein začne zvijati in obračati, skrči se tudi osrednja votlina proteina. Ko se osrednja votlina skrči, se substrat izloči v zunajcelični prostor. Pri celotnem procesu je pomembna tudi hidroliza ATP, ki služi temu, da se protein vrne nazaj v prvotno stanje.

=== Pia Trošt: Barvna povezava v sposobnosti korale, da preživi višje temperature ===

Zaradi naraščajočega vpliva antropogenih dejavnikov koralni grebeni hitro propadajo in korale se morajo prilagoditi vse bolj stresnemu okolju. Acropora tenuis je ena glavnih vrst koral ob obali Okinave na Japonskem in se pojavlja v treh barvnih različicah (N, G in P), med katerimi je bila opažena različna stopnja beljenja pri povišani temperaturi. Korale živijo v sožitju z algami iz družine Symbiodiniaceae. Pri različicah N in P je bila zaznana zmanjšana fotosintetska aktivnost simbiontov, medtem ko je različica G ohranila aktivnost tudi pri povišani temperaturi. Raziskava je pokazala, da vse barvne različice gostijo isti klad simbiontov, torej različne temperaturne odpornosti ni mogoče pripisati razliki v Symbiodiniaceae. Ker je bil genom A. tenuis dekodiran, je bilo mogoče identificirati gene za fluorescenčne proteine (GFP, CFP, RFP in ChrP). Poletna raziskava profilov izražanja posameznih proteinov je pokazala, da je bilo izražanje CFP in RFP pri vseh različicah nizko, različica P je pokazala višje izražanje ChrP, različica G pa višje izražanje GFP, ki se je ohranilo tudi pri višji temperaturi. Rezultati kažejo, da imajo vse različice enak nabor genov za fluorescenco, torej so barvne različice vzrok različnega izražanja genov FP, ki povečajo odpornost koral proti beljenju.

=== Gašper Struna: Kako sistem toksin-antitoksin vpliva na odpornost bakterij na antibiotike ===

Sistemi toksin-antitoksin (TA) imajo pomembno vlogo v bakterijah. Vplivajo na stabilnost plazmida in imajo pomembno vlogo pri postsegregacijskem propadu. Če plazmida ni, antitoksin ne prepreči delovanja toksina in toksin povzroči propad celice. Poznamo sedem tipov TA sistemov, med katerimi je najpogostejši tip II. Pri tem tipu antitoksin prepreči delovanje toksina tako, da se močno veže nanj in s tem inhibira njegovo delovanje. TA sistem tipa II najdemo tudi v bakteriji Pseudoaltermonas rubra, in sicer je ta TA sistem predstavnik para ParE/PF03693. V raziskavi so ugotovili, da antitoksin (PrpA) iz tega para zmanjša delovanje toksina na več načinov, in sicer tako da se neposredno veže na toksin ali pa se veže na promotor TA operona in deluje kot represor. PrpA ima pomembno vlogo tudi pri replikaciji, saj se lahko veže na podobno mesto kot iniciatorski protein RepB in s tem onemogoči začetek replikacije. PrpA ima na N-koncu vezavno mesto za DNA, s C-koncem pa interagira s toksinom, je tudi labilen, vezava na toksin pa ga stabilizira. Pari ParE/PF03693 so tudi v nekaterih virulentnih bakterijah in njihova nadaljnja študija bi lahko pripomogla k boljšemu razumevanju odpornosti bakterij na antibiotike in njihovem virulentnem delovanju.

=== Nuša Kos Thaler: Hitra evolucija litičnih genov v enoverižnih RNA bakteriofagih ===

Levivirusi so bakteriofagi z majhnim enoverižnim RNA genomom, ki ga sestavljajo 3–4 geni. Eden od njih je gen ''sgl'' (ang. single gene lysis), ki kodira protein za sprožitev avtolize gostiteljske celice in sprostitev virionov. Za razliko od dvoverižnih DNA bakteriofagov, ki encimsko razgradijo peptidoglikan (glavno enoto celične stene bakterijskih celic), protein Sgl pri lizi po navadi deluje kot nekompetitivni inhibitor in preprečuje njegov nastanek. Geni ''sgl'' so zelo majhni, raznoliki in pogosto vstavljeni v druge gene, zaradi česar jih težko odkrijemo. V nedavnih raziskavah so našli več deset tisoč genomov levivirusov, ki jih pred kratkim še nismo poznali. V določenih so odkrili gene ''sgl'' in preizkušali njihovo aktivnost na ''E. coli'' ter ugotovili, da lahko hitro ustvarijo gen ''sgl''. Bazna zaporedja najdenih genov ''sgl'' imajo zelo malo ali celo nobene podobnosti z baznimi zaporedji že preučevanih genov ''sgl''. V genomu posameznega bakteriofaga se lahko pojavlja več genov ''sgl'', kar pomeni, da bi lahko levivirusi hkrati okužili in lizirali celice evolucijsko oddaljenih bakterijskih vrst. Zaradi svoje raznolikosti, hitre evolucije in zmožnosti spreminjanja so potencialni vir za razvoj proteinskih antibiotikov in fagne terapije.

TBK 2022 Povzetki seminarjev

2021-03-12T09:46:14Z

Nuša Kos Thaler:

=== Ime in priimek: Naslov seminarja ===

Sed ut perspiciatis unde omnis iste natus error sit voluptatem accusantium doloremque laudantium, totam rem aperiam, eaque ipsa quae ab illo inventore veritatis et quasi architecto beatae vitae dicta sunt explicabo. Nemo enim ipsam voluptatem quia voluptas sit aspernatur aut odit aut fugit, sed quia consequuntur magni dolores eos qui ratione voluptatem sequi nesciunt. Neque porro quisquam est, qui dolorem ipsum quia dolor sit amet, consectetur, adipisci velit, sed quia non numquam eius modi tempora incidunt ut labore et dolore magnam aliquam quaerat voluptatem. Ut enim ad minima veniam, quis nostrum exercitationem ullam corporis suscipit laboriosam, nisi ut aliquid ex ea commodi consequatur? Quis autem vel eum iure reprehenderit qui in ea voluptate velit esse quam nihil molestiae consequatur, vel illum qui dolorem eum fugiat quo voluptas nulla pariatur?

=== Živa Urh: Zmanjšanje transkripcijske aktivnosti povzroči stresno pogojena jedrna kondenzacija NELF ===

V stresnih razmerah celice preklopijo iz običajnega v bolj omejen način delovanja, da se zaščitijo pred poškodbami. Pri tem si pomagajo na različne načine. Eden od načinov je varnostni program imenovan toplotni šok, ki je povezan s hitro regulacijo genske aktivnosti (zmanjšanjem transkripcije) v stresnih situacijah. Stres povzroči nastanek jedrnih kondenzatov NELF, ki nastanejo, ko NELF tvori kapljice. NELF ali negativni podaljševalni dejavnik, je proteinski kompleks iz več podenot, ki se ob jedrnem signalu oblikuje v kondenzate oz. kapljice. Vezava kompleksa NELF na promotorje vzdrževalnih genov je tista, ki povzroči slabšo mobilnost RNA polimeraze II in posledično slabše prepisovanje genov ter tako zmanjša proizvodnjo proteinov, ki niso nujni v stresnih razmerah. Mehanizem nastanka jedrnih kondenzatov je povezan z defosforilacijo NELF in nadaljnjo SUMOilacijo. Ta dva procesa spadata pod posebne post-translacijske modifikacije (PTM), ki so bistvene za kondenzacijo NELF. Pomembno vlogo pri formaciji kondenzatov NELF imajo tudi neurejene regije (IDR), ki jih najdemo pri posameznih podenotah tega proteinskega kompleksa. IDR so deli proteinov brez fiksne strukture in delujejo kot lovke. Povezave med lovkami podenot A in E med so bistvenega pomena za tvorbo kapljic oz. kondenzatov. Celice, ki zaradi pomanjkanja lovk pri podenotah ne tvorijo kondenzatov NELF tudi ne zmanjšajo transkripcije. Posledično take celice normalno prepisujejo gene in so tako bolj dovzetne za celično smrt.

=== Tinkara Butara: Kako rastline zaznajo napad herbivorov ===

Rastline niso nemočni opazovalci dogajanja okoli njih, ampak se na okoliške dražljaje tudi odzivajo. Skozi evolucijo so razvile posebne obrambne mehanizme, ki se sprožijo kot odgovor na elicitorje. Elicitorji so kemijske zvrsti, ki jih lahko izločajo herbivori ali pa rastline same. Te kemijske zvrsti se vežejo na proteinske receptorje na celični membrani in tako sprožijo odziv, na primer na objedanje. Sporočilo o nevarnosti se nato širi do lokalno poškodovanih delov rastline in sistemsko opozarja celotno rastlino na poškodbo. Rastlini lastni elicitorji so najpreprostejši tip, med katerimi je najbolj univerzalen zunajcelični ATP. Primerni elicitorji herbivorov so prebavni encimi v njihovi slini ter konjugati maščobnih kislin in aminokislin. Odziv rastline na napad herbivora pa je lahko povezan tudi s simbiotskimi organizmi herbivora. Ti lahko izločajo snovi s katerimi omogočijo lažji razvoj insekta ali pa s tem pomagajo rastlini. Pomemben sprožilec rastlinskega odziva na herbivore so tudi fizični dražljaji, ki jih ti povzročajo. Pri tem se sproščajo hlapne snovi, ki lahko služijo privabljanju naravnih sovražnikov herbivora ali pa širijo sporočilo o nevarnosti do drugih rastlin. Kot odziv na elicitorje se v večini primerov tvorita rastlinska hormona jasmonska in salicilna kislina, ki sta del obrambnih mehanizmov rastlin. Karakterizacija rastlinskih elicitorjev nam ponuja orodje za razvoj agrokemikalij, ki bodo odganjale herbivore in hkrati ščitile rastline.

=== Pia Špehar: Mehanizem delovanja proteina omogoča odpornost na zdravila proti raku ===

Leta 1986 je celični biokemik Kazumitsu Ueda odkril, da ima protein ABCB1 zmožnost, da iz rakavih celic transportira mnoge kemoterapevtike in tako telesu omogoči odpornost na kemoterapijo. ABCB1 spada med ABC-prenašalce, in sicer je eden izmed tistih prenašalcev, ki iz celic izločajo toksične hidrofobne komponente. Najdemo ga v membranah celic v jetrih, možganih, testisih in placenti. Skoraj 30 let po odkritju funkcije proteina, je Ueda s svojo ekipo lahko določil še mehanizem njegovega delovanja, in sicer z izvedbo več raziskav. Sprva so protein kristalizirali v stanju pred in po transportu substrata ter primerjali stanji med seboj, izvedli pa so tudi analizo s FRET tehniko. Ugotovili so, da substrat vstopi v osrednjo votlino skozi del proteina v notranjosti celice. Nato se veže na vrh osrednje votline proteina, kjer se nahaja hidrofobno aromatsko omrežje, ki ima pomembno vlogo pri prepoznavanju substratov. Vezava substrata na to omrežje sproži konformacijsko spremembo proteina. Za spremembo je potrebna tudi energija, ki jo priskrbi molekula ATP. Vezava ATP-ja sproži tudi nastanek omrežja, ki povzroči, da se protein začne zvijati in obračati, skrči se tudi osrednja votlina proteina. Ko se osrednja votlina skrči, se substrat izloči v zunajcelični prostor. Pri celotnem procesu je pomembna tudi hidroliza ATP, ki služi temu, da se protein vrne nazaj v prvotno stanje.

=== Pia Trošt: Barvna povezava v sposobnosti korale, da preživi višje temperature ===

Zaradi naraščajočega vpliva antropogenih dejavnikov koralni grebeni hitro propadajo in korale se morajo prilagoditi vse bolj stresnemu okolju. Acropora tenuis je ena glavnih vrst koral ob obali Okinave na Japonskem in se pojavlja v treh barvnih različicah (N, G in P), med katerimi je bila opažena različna stopnja beljenja pri povišani temperaturi. Korale živijo v sožitju z algami iz družine Symbiodiniaceae. Pri različicah N in P je bila zaznana zmanjšana fotosintetska aktivnost simbiontov, medtem ko je različica G ohranila aktivnost tudi pri povišani temperaturi. Raziskava je pokazala, da vse barvne različice gostijo isti klad simbiontov, torej različne temperaturne odpornosti ni mogoče pripisati razliki v Symbiodiniaceae. Ker je bil genom A. tenuis dekodiran, je bilo mogoče identificirati gene za fluorescenčne proteine (GFP, CFP, RFP in ChrP). Poletna raziskava profilov izražanja posameznih proteinov je pokazala, da je bilo izražanje CFP in RFP pri vseh različicah nizko, različica P je pokazala višje izražanje ChrP, različica G pa višje izražanje GFP, ki se je ohranilo tudi pri višji temperaturi. Rezultati kažejo, da imajo vse različice enak nabor genov za fluorescenco, torej so barvne različice vzrok različnega izražanja genov FP, ki povečajo odpornost koral proti beljenju.

=== Gašper Struna: Kako sistem toksin-antitoksin vpliva na odpornost bakterij na antibiotike ===

Sistemi toksin-antitoksin (TA) imajo pomembno vlogo v bakterijah. Vplivajo na stabilnost plazmida in imajo pomembno vlogo pri postsegregacijskem propadu. Če plazmida ni, antitoksin ne prepreči delovanja toksina in toksin povzroči propad celice. Poznamo sedem tipov TA sistemov, med katerimi je najpogostejši tip II. Pri tem tipu antitoksin prepreči delovanje toksina tako, da se močno veže nanj in s tem inhibira njegovo delovanje. TA sistem tipa II najdemo tudi v bakteriji Pseudoaltermonas rubra, in sicer je ta TA sistem predstavnik para ParE/PF03693. V raziskavi so ugotovili, da antitoksin (PrpA) iz tega para zmanjša delovanje toksina na več načinov, in sicer tako da se neposredno veže na toksin ali pa se veže na promotor TA operona in deluje kot represor. PrpA ima pomembno vlogo tudi pri replikaciji, saj se lahko veže na podobno mesto kot iniciatorski protein RepB in s tem onemogoči začetek replikacije. PrpA ima na N-koncu vezavno mesto za DNA, s C-koncem pa interagira s toksinom, je tudi labilen, vezava na toksin pa ga stabilizira. Pari ParE/PF03693 so tudi v nekaterih virulentnih bakterijah in njihova nadaljnja študija bi lahko pripomogla k boljšemu razumevanju odpornosti bakterij na antibiotike in njihovem virulentnem delovanju.

=== Nuša Kos Thaler: Hitra evolucija litičnih genov v enoverižnih RNA bakteriofagih ===

Levivirusi so bakteriofagi z majhnim enoverižnim RNA genomom, ki ga sestavljajo 3–4 geni. Eden od njih je gen sgl (ang. single gene lysis), ki kodira protein za sprožitev avtolize gostiteljske celice in sprostitev virionov. Za razliko od dvoverižnih DNA bakteriofagov, ki encimsko razgradijo peptidoglikan (glavno enoto celične stene bakterijskih celic), protein Sgl pri lizi po navadi deluje kot nekompetitivni inhibitor in preprečuje njegov nastanek. Geni sgl so zelo majhni, raznoliki in pogosto vstavljeni v druge gene, zaradi česar jih težko odkrijemo. V nedavnih raziskavah so našli več deset tisoč genomov levivirusov, ki jih pred kratkim še nismo poznali. V določenih so odkrili gene sgl in preizkušali njihovo aktivnost na E. coli ter ugotovili, da lahko hitro ustvarijo gen sgl. Bazna zaporedja najdenih genov sgl imajo zelo malo ali celo nobene podobnosti z baznimi zaporedji že preučevanih genov sgl. V genomu posameznega bakteriofaga se lahko pojavlja več genov sgl, kar pomeni, da bi lahko levivirusi hkrati okužili in lizirali celice evolucijsko oddaljenih bakterijskih vrst. Zaradi svoje raznolikosti, hitre evolucije in zmožnosti spreminjanja so potencialni vir za razvoj proteinskih antibiotikov in fagne terapije.

Temelji biokemije 2023 - seminar

2021-03-07T11:20:04Z

Nuša Kos Thaler: /* Seznam seminarjev */

[http://www.example.com link title]= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||05.03.||08.03.||11.03.||r1||r2||r3
|-
| Gašper Struna||Kako sistem toksin-antitoksin vpliva na odpornost bakterij na antibiotike ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210201144911.htm||05.03.||08.03.||11.03.||David Valte||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger
|-
| Pia Špehar||Mehanizem delovanja proteina omogoča odpornost na zdravila proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201229080253.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Sofija Stevanović||Gaja Starc||Nuša Brdnik
|-
| Tinkara Butara||Kako rastline zaznajo napad herbivorov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210216133437.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Klara Ažbe||Mark Loborec||Ema Kavčič
|-
| Pia Trošt||Barvna povezava v sposobnosti korale, da preživi višje temperature||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210221154616.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Mia Kobal||Vanja Ivošević||Urša Štefan
|-
| Živa Urh||Zmanjšanje transkripcijske aktivnosti povzroči stresno pogojena jedrna kondenzacija NELF ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210210170104.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Andraž Rotar||Petja Premrl||Maj Priveršek
|-
| Urša Zevnik||Gen za dolgoživost ščiti možganske matične celice pred stresom||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210219155903.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Gašper Struna||David Valte||Klara Kolenc
|-
| Nika Ferk||Formulacije in površine na osnovi biomaterialov za boj proti virusnim nalezljivim boleznim||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210209113902.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Špehar||Sofija Stevanović||Gaja Starc
|-
| Nataša Vujović||Nov mehanizem odpornosti celica raka dojke HER2 na T-celična bispecifična protitelesa in CAR-T||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210223135516.htm
||12.03.||15.03.||18.03.||Tinkara Butara||Klara Ažbe||Mark Loborec
|-
| Thaler Nuša Kos||Hitra evolucija litičnih genov v enoverižnih RNA bakteriofagih||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210205121236.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Trošt||Mia Kobal||Vanja Ivošević
|-
| Sara Borišek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210302075358.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Živa Urh||Andraž Rotar||Petja Premrl
|-
| Lana Bajec||||||19.03.||22.03.||25.03.||Urša Zevnik||Gašper Struna||David Valte
|-
| Leila Bohorč||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210208134421.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nika Ferk||Pia Špehar||Sofija Stevanović
|-
| Špela Rapuš||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/01/210114163907.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nataša Vujović||Tinkara Butara||Klara Ažbe
|-
| Pavletič Primož Šenica||||||19.03.||22.03.||25.03.||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt||Mia Kobal
|-
| Ivana Vukšinić||Vpliv metabolizma žvepla na razvoj mnogoceličnih organizmov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210224143527.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Ela Kovač||Živa Urh||Andraž Rotar
|-
| Zarja Weingerl||||||26.03.||29.03.||01.04.||Lana Bajec||Urša Zevnik||Gašper Struna
|-
| Teja Spruk||||||26.03.||29.03.||01.04.||Leila Bohorč||Nika Ferk||Pia Špehar
|-
| Magdalena Ilievska||||||26.03.||29.03.||01.04.||Špela Rapuš||Nataša Vujović||Tinkara Butara
|-
| Metka Rus||||||26.03.||29.03.||01.04.||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt
|-
| Pia Sotlar||Zdravljenje s sistemom za urejanje genoma, ki temelji na metodi CRISPR, uničuje rakave celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201118161129.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Ivana Vukšinić||Ela Kovač||Živa Urh
|-
| Nik Vidmar||||||02.04.||05.04.||08.04.||Zarja Weingerl||Lana Bajec||Urša Zevnik
|-
| Ana Maučec||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210226103805.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Teja Spruk||Leila Bohorč||Nika Ferk
|-
| Neža Peternel||||||02.04.||05.04.||08.04.||Magdalena Ilievska||Špela Rapuš||Nataša Vujović
|-
| Zoran Džon Ivanić||Reprogramiranje za povrnitev mladostne epigenetske informacije in povrnitev vida||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201202114531.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos
|-
| Pia Mencin||||||02.04.||05.04.||08.04.||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić||Ela Kovač
|-
| Marko Kovačić||Vpliv avtofagije na prilagajanje celic drugačnim okoljskim razmeram||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201210112157.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Nik Vidmar||Zarja Weingerl||Lana Bajec
|-
| Karidia Kolbl||||||09.04.||12.04.||15.04.||Ana Maučec||Teja Spruk||Leila Bohorč
|-
| Klara Razboršek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201111122815.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Neža Peternel||Magdalena Ilievska||Sara Borišek
|-
| Katja Resnik||||||09.04.||12.04.||15.04.||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica
|-
| Simona Kocheva||||||09.04.||12.04.||15.04.||Pia Mencin||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić
|-
| Miha Razdevšek||Epigenetske spremembe povezane z Alzheimerjevo boleznijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/09/200928152907.htm||16.04.||19.04.||22.04.||Marko Kovačić||Nik Vidmar||Zarja Weingerl
|-
| Janja Bohte||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210305123802.htm||16.04.||19.04.||22.04.||Karidia Kolbl||Ana Maučec||Teja Spruk
|-
| Tea Amidović||||||16.04.||19.04.||22.04.||Klara Razboršek||Neža Peternel||Magdalena Ilievska
|-
| Patricija Kolander||||||16.04.||19.04.||22.04.||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus
|-
| Lev Jošt||||||16.04.||19.04.||22.04.||Simona Kocheva||Pia Mencin||Pia Sotlar
|-
| Tina Zajec||||||30.04.||03.05.||06.05.||Miha Razdevšek||Marko Kovačić||Nik Vidmar
|-
| Tina Urh||||||30.04.||03.05.||06.05.||Janja Bohte||Karidia Kolbl||Ana Maučec
|-
| Žan Žnidar||||||30.04.||03.05.||06.05.||Tea Amidović||Klara Razboršek||Neža Peternel
|-
| Boštjan Kramberger||||https://www.nature.com/articles/s41467-021-21185-5?fbclid=IwAR2jbjZ3amUYlXu2j8l94OQTS7ram6kTx9ZRekmN6ncmNCUyjsRuV3DF0mk||30.04.||03.05.||06.05.||Patricija Kolander||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić
|-
| Nuša Brdnik||||||30.04.||03.05.||06.05.||Lev Jošt||Simona Kocheva||Pia Mencin
|-
| Ema Kavčič||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Zajec||Miha Razdevšek||Marko Kovačić
|-
| Urša Štefan||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Urh||Janja Bohte||Karidia Kolbl
|-
| Maj Priveršek||||||07.05.||10.05.||13.05.||Žan Žnidar||Tea Amidović||Klara Razboršek
|-
| Klara Kolenc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander||Katja Resnik
|-
| Gaja Starc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Nuša Brdnik||Lev Jošt||Simona Kocheva
|-
| Mark Loborec||||||14.05.||17.05.||20.05.||Ema Kavčič||Tina Zajec||Miha Razdevšek
|-
| Vanja Ivošević||||||14.05.||17.05.||20.05.||Urša Štefan||Tina Urh||Janja Bohte
|-
| Petja Premrl||||||14.05.||17.05.||20.05.||Maj Priveršek||Žan Žnidar||Tea Amidović
|-
| David Valte||||||14.05.||17.05.||20.05.||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander
|-
| Sofija Stevanović||||||14.05.||17.05.||20.05.||Gaja Starc||Nuša Brdnik||Lev Jošt
|-
| Klara Ažbe||||||21.05.||24.05.||27.05.||Mark Loborec||Ema Kavčič||Tina Zajec
|-
| Mia Kobal||||||21.05.||24.05.||27.05.||Vanja Ivošević||Urša Štefan||Tina Urh
|-
| Andraž Rotar||||||21.05.||24.05.||27.05.||Petja Premrl||Maj Priveršek||Žan Žnidar
|-
| Ela Kovač||||||21.05.||24.05.||27.05.||Sara Borišek||Špela Rapuš||Tinkara Butara
|-}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2020. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2021 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2021_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2021_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2021_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2021_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2021_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2021_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Temelji biokemije 2023 - seminar

2021-03-06T08:23:30Z

Nuša Kos Thaler: /* Seznam seminarjev */

[http://www.example.com link title]= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||05.03.||08.03.||11.03.||r1||r2||r3
|-
| Gašper Struna||Kako sistem toksin-antitoksin vpliva na odpornost bakterij na antibiotike ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210201144911.htm||05.03.||08.03.||11.03.||David Valte||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger
|-
| Pia Špehar||Mehanizem delovanja proteina omogoča odpornost na zdravila proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201229080253.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Sofija Stevanović||Gaja Starc||Nuša Brdnik
|-
| Tinkara Butara||Kako rastline zaznajo napad herbivorov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210216133437.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Klara Ažbe||Mark Loborec||Ema Kavčič
|-
| Pia Trošt||Barvna povezava v sposobnosti korale, da preživi višje temperature||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210221154616.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Mia Kobal||Vanja Ivošević||Urša Štefan
|-
| Živa Urh||Zmanjšanje transkripcijske aktivnosti povzroči stresno pogojena jedrna kondenzacija NELF ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210210170104.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Andraž Rotar||Petja Premrl||Maj Priveršek
|-
| Urša Zevnik||Gen za dolgoživost ščiti možganske matične celice pred stresom||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210219155903.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Gašper Struna||David Valte||Klara Kolenc
|-
| Nika Ferk||Formulacije in površine na osnovi biomaterialov za boj proti virusnim nalezljivim boleznim||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210209113902.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Špehar||Sofija Stevanović||Gaja Starc
|-
| Nataša Vujović||Nov mehanizem odpornosti celica raka dojke HER2 na T-celična bispecifična protitelesa in CAR-T||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210223135516.htm
||12.03.||15.03.||18.03.||Tinkara Butara||Klara Ažbe||Mark Loborec
|-
| Thaler Nuša Kos||Evolucija litičnih genov v enoverižnih RNA bakteriofagih||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210205121236.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Trošt||Mia Kobal||Vanja Ivošević
|-
| Sara Borišek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210302075358.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Živa Urh||Andraž Rotar||Petja Premrl
|-
| Lana Bajec||||||19.03.||22.03.||25.03.||Urša Zevnik||Gašper Struna||David Valte
|-
| Leila Bohorč||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210208134421.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nika Ferk||Pia Špehar||Sofija Stevanović
|-
| Špela Rapuš||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/01/210114163907.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nataša Vujović||Tinkara Butara||Klara Ažbe
|-
| Pavletič Primož Šenica||||||19.03.||22.03.||25.03.||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt||Mia Kobal
|-
| Ivana Vukšinić||Vpliv metabolizma žvepla na razvoj mnogoceličnih organizmov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210224143527.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Ela Kovač||Živa Urh||Andraž Rotar
|-
| Zarja Weingerl||||||26.03.||29.03.||01.04.||Lana Bajec||Urša Zevnik||Gašper Struna
|-
| Teja Spruk||||||26.03.||29.03.||01.04.||Leila Bohorč||Nika Ferk||Pia Špehar
|-
| Magdalena Ilievska||||||26.03.||29.03.||01.04.||Špela Rapuš||Nataša Vujović||Tinkara Butara
|-
| Metka Rus||||||26.03.||29.03.||01.04.||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt
|-
| Pia Sotlar||Zdravljenje s sistemom za urejanje genoma, ki temelji na metodi CRISPR, uničuje rakave celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201118161129.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Ivana Vukšinić||Ela Kovač||Živa Urh
|-
| Nik Vidmar||||||02.04.||05.04.||08.04.||Zarja Weingerl||Lana Bajec||Urša Zevnik
|-
| Ana Maučec||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210226103805.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Teja Spruk||Leila Bohorč||Nika Ferk
|-
| Neža Peternel||||||02.04.||05.04.||08.04.||Magdalena Ilievska||Špela Rapuš||Nataša Vujović
|-
| Zoran Džon Ivanić||Reprogramiranje za povrnitev mladostne epigenetske informacije in povrnitev vida||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201202114531.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos
|-
| Pia Mencin||||||02.04.||05.04.||08.04.||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić||Ela Kovač
|-
| Marko Kovačić||||||09.04.||12.04.||15.04.||Nik Vidmar||Zarja Weingerl||Lana Bajec
|-
| Karidia Kolbl||||||09.04.||12.04.||15.04.||Ana Maučec||Teja Spruk||Leila Bohorč
|-
| Klara Razboršek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201111122815.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Neža Peternel||Magdalena Ilievska||Sara Borišek
|-
| Katja Resnik||||||09.04.||12.04.||15.04.||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica
|-
| Simona Kocheva||||||09.04.||12.04.||15.04.||Pia Mencin||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić
|-
| Miha Razdevšek||||||16.04.||19.04.||22.04.||Marko Kovačić||Nik Vidmar||Zarja Weingerl
|-
| Janja Bohte||||||16.04.||19.04.||22.04.||Karidia Kolbl||Ana Maučec||Teja Spruk
|-
| Tea Amidović||||||16.04.||19.04.||22.04.||Klara Razboršek||Neža Peternel||Magdalena Ilievska
|-
| Patricija Kolander||||||16.04.||19.04.||22.04.||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus
|-
| Lev Jošt||||||16.04.||19.04.||22.04.||Simona Kocheva||Pia Mencin||Pia Sotlar
|-
| Tina Zajec||||||30.04.||03.05.||06.05.||Miha Razdevšek||Marko Kovačić||Nik Vidmar
|-
| Tina Urh||||||30.04.||03.05.||06.05.||Janja Bohte||Karidia Kolbl||Ana Maučec
|-
| Žan Žnidar||||||30.04.||03.05.||06.05.||Tea Amidović||Klara Razboršek||Neža Peternel
|-
| Boštjan Kramberger||||https://www.nature.com/articles/s41467-021-21185-5?fbclid=IwAR2jbjZ3amUYlXu2j8l94OQTS7ram6kTx9ZRekmN6ncmNCUyjsRuV3DF0mk||30.04.||03.05.||06.05.||Patricija Kolander||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić
|-
| Nuša Brdnik||||||30.04.||03.05.||06.05.||Lev Jošt||Simona Kocheva||Pia Mencin
|-
| Ema Kavčič||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Zajec||Miha Razdevšek||Marko Kovačić
|-
| Urša Štefan||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Urh||Janja Bohte||Karidia Kolbl
|-
| Maj Priveršek||||||07.05.||10.05.||13.05.||Žan Žnidar||Tea Amidović||Klara Razboršek
|-
| Klara Kolenc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander||Katja Resnik
|-
| Gaja Starc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Nuša Brdnik||Lev Jošt||Simona Kocheva
|-
| Mark Loborec||||||14.05.||17.05.||20.05.||Ema Kavčič||Tina Zajec||Miha Razdevšek
|-
| Vanja Ivošević||||||14.05.||17.05.||20.05.||Urša Štefan||Tina Urh||Janja Bohte
|-
| Petja Premrl||||||14.05.||17.05.||20.05.||Maj Priveršek||Žan Žnidar||Tea Amidović
|-
| David Valte||||||14.05.||17.05.||20.05.||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander
|-
| Sofija Stevanović||||||14.05.||17.05.||20.05.||Gaja Starc||Nuša Brdnik||Lev Jošt
|-
| Klara Ažbe||||||21.05.||24.05.||27.05.||Mark Loborec||Ema Kavčič||Tina Zajec
|-
| Mia Kobal||||||21.05.||24.05.||27.05.||Vanja Ivošević||Urša Štefan||Tina Urh
|-
| Andraž Rotar||||||21.05.||24.05.||27.05.||Petja Premrl||Maj Priveršek||Žan Žnidar
|-
| Ela Kovač||||||21.05.||24.05.||27.05.||Sara Borišek||Špela Rapuš||Tinkara Butara
|-}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2020. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2021 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2021_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2021_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2021_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2021_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2021_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2021_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Temelji biokemije 2023 - seminar

2021-03-06T08:05:31Z

Nuša Kos Thaler: /* Seznam seminarjev */

[http://www.example.com link title]= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||05.03.||08.03.||11.03.||r1||r2||r3
|-
| Gašper Struna||Kako sistem toksin-antitoksin vpliva na odpornost bakterij na antibiotike ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210201144911.htm||05.03.||08.03.||11.03.||David Valte||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger
|-
| Pia Špehar||Mehanizem delovanja proteina omogoča odpornost na zdravila proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201229080253.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Sofija Stevanović||Gaja Starc||Nuša Brdnik
|-
| Tinkara Butara||Kako rastline zaznajo napad herbivorov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210216133437.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Klara Ažbe||Mark Loborec||Ema Kavčič
|-
| Pia Trošt||Barvna povezava v sposobnosti korale, da preživi višje temperature||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210221154616.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Mia Kobal||Vanja Ivošević||Urša Štefan
|-
| Živa Urh||Zmanjšanje transkripcijske aktivnosti povzroči stresno pogojena jedrna kondenzacija NELF ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210210170104.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Andraž Rotar||Petja Premrl||Maj Priveršek
|-
| Urša Zevnik||Gen za dolgoživost ščiti možganske matične celice pred stresom||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210219155903.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Gašper Struna||David Valte||Klara Kolenc
|-
| Nika Ferk||Formulacije in površine na osnovi biomaterialov za boj proti virusnim nalezljivim boleznim||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210209113902.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Špehar||Sofija Stevanović||Gaja Starc
|-
| Nataša Vujović||Nov mehanizem odpornosti celica raka dojke HER2 na T-celična bispecifična protitelesa in CAR-T||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210223135516.htm
||12.03.||15.03.||18.03.||Tinkara Butara||Klara Ažbe||Mark Loborec
|-
| Thaler Nuša Kos||Evolucija genov za lizo v enoverižnih RNA bakteriofagih||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210205121236.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Trošt||Mia Kobal||Vanja Ivošević
|-
| Sara Borišek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210302075358.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Živa Urh||Andraž Rotar||Petja Premrl
|-
| Lana Bajec||||||19.03.||22.03.||25.03.||Urša Zevnik||Gašper Struna||David Valte
|-
| Leila Bohorč||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210208134421.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nika Ferk||Pia Špehar||Sofija Stevanović
|-
| Špela Rapuš||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/01/210114163907.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nataša Vujović||Tinkara Butara||Klara Ažbe
|-
| Pavletič Primož Šenica||||||19.03.||22.03.||25.03.||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt||Mia Kobal
|-
| Ivana Vukšinić||Vpliv metabolizma žvepla na razvoj mnogoceličnih organizmov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210224143527.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Ela Kovač||Živa Urh||Andraž Rotar
|-
| Zarja Weingerl||||||26.03.||29.03.||01.04.||Lana Bajec||Urša Zevnik||Gašper Struna
|-
| Teja Spruk||||||26.03.||29.03.||01.04.||Leila Bohorč||Nika Ferk||Pia Špehar
|-
| Magdalena Ilievska||||||26.03.||29.03.||01.04.||Špela Rapuš||Nataša Vujović||Tinkara Butara
|-
| Metka Rus||||||26.03.||29.03.||01.04.||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt
|-
| Pia Sotlar||Zdravljenje s sistemom za urejanje genoma, ki temelji na metodi CRISPR, uničuje rakave celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201118161129.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Ivana Vukšinić||Ela Kovač||Živa Urh
|-
| Nik Vidmar||||||02.04.||05.04.||08.04.||Zarja Weingerl||Lana Bajec||Urša Zevnik
|-
| Ana Maučec||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210226103805.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Teja Spruk||Leila Bohorč||Nika Ferk
|-
| Neža Peternel||||||02.04.||05.04.||08.04.||Magdalena Ilievska||Špela Rapuš||Nataša Vujović
|-
| Zoran Džon Ivanić||Reprogramiranje za povrnitev mladostne epigenetske informacije in povrnitev vida||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201202114531.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos
|-
| Pia Mencin||||||02.04.||05.04.||08.04.||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić||Ela Kovač
|-
| Marko Kovačić||||||09.04.||12.04.||15.04.||Nik Vidmar||Zarja Weingerl||Lana Bajec
|-
| Karidia Kolbl||||||09.04.||12.04.||15.04.||Ana Maučec||Teja Spruk||Leila Bohorč
|-
| Klara Razboršek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201111122815.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Neža Peternel||Magdalena Ilievska||Sara Borišek
|-
| Katja Resnik||||||09.04.||12.04.||15.04.||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica
|-
| Simona Kocheva||||||09.04.||12.04.||15.04.||Pia Mencin||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić
|-
| Miha Razdevšek||||||16.04.||19.04.||22.04.||Marko Kovačić||Nik Vidmar||Zarja Weingerl
|-
| Janja Bohte||||||16.04.||19.04.||22.04.||Karidia Kolbl||Ana Maučec||Teja Spruk
|-
| Tea Amidović||||||16.04.||19.04.||22.04.||Klara Razboršek||Neža Peternel||Magdalena Ilievska
|-
| Patricija Kolander||||||16.04.||19.04.||22.04.||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus
|-
| Lev Jošt||||||16.04.||19.04.||22.04.||Simona Kocheva||Pia Mencin||Pia Sotlar
|-
| Tina Zajec||||||30.04.||03.05.||06.05.||Miha Razdevšek||Marko Kovačić||Nik Vidmar
|-
| Tina Urh||||||30.04.||03.05.||06.05.||Janja Bohte||Karidia Kolbl||Ana Maučec
|-
| Žan Žnidar||||||30.04.||03.05.||06.05.||Tea Amidović||Klara Razboršek||Neža Peternel
|-
| Boštjan Kramberger||||https://www.nature.com/articles/s41467-021-21185-5?fbclid=IwAR2jbjZ3amUYlXu2j8l94OQTS7ram6kTx9ZRekmN6ncmNCUyjsRuV3DF0mk||30.04.||03.05.||06.05.||Patricija Kolander||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić
|-
| Nuša Brdnik||||||30.04.||03.05.||06.05.||Lev Jošt||Simona Kocheva||Pia Mencin
|-
| Ema Kavčič||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Zajec||Miha Razdevšek||Marko Kovačić
|-
| Urša Štefan||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Urh||Janja Bohte||Karidia Kolbl
|-
| Maj Priveršek||||||07.05.||10.05.||13.05.||Žan Žnidar||Tea Amidović||Klara Razboršek
|-
| Klara Kolenc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander||Katja Resnik
|-
| Gaja Starc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Nuša Brdnik||Lev Jošt||Simona Kocheva
|-
| Mark Loborec||||||14.05.||17.05.||20.05.||Ema Kavčič||Tina Zajec||Miha Razdevšek
|-
| Vanja Ivošević||||||14.05.||17.05.||20.05.||Urša Štefan||Tina Urh||Janja Bohte
|-
| Petja Premrl||||||14.05.||17.05.||20.05.||Maj Priveršek||Žan Žnidar||Tea Amidović
|-
| David Valte||||||14.05.||17.05.||20.05.||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander
|-
| Sofija Stevanović||||||14.05.||17.05.||20.05.||Gaja Starc||Nuša Brdnik||Lev Jošt
|-
| Klara Ažbe||||||21.05.||24.05.||27.05.||Mark Loborec||Ema Kavčič||Tina Zajec
|-
| Mia Kobal||||||21.05.||24.05.||27.05.||Vanja Ivošević||Urša Štefan||Tina Urh
|-
| Andraž Rotar||||||21.05.||24.05.||27.05.||Petja Premrl||Maj Priveršek||Žan Žnidar
|-
| Ela Kovač||||||21.05.||24.05.||27.05.||Sara Borišek||Špela Rapuš||Tinkara Butara
|-}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2020. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2021 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2021_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2021_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2021_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2021_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2021_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2021_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Temelji biokemije 2023 - seminar

2021-03-05T16:42:25Z

Nuša Kos Thaler: /* Seznam seminarjev */

[http://www.example.com link title]= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||05.03.||08.03.||11.03.||r1||r2||r3
|-
| Gašper Struna||Kako sistem toksin-antitoksin vpliva na odpornost bakterij na antibiotike ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210201144911.htm||05.03.||08.03.||11.03.||David Valte||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger
|-
| Pia Špehar||Mehanizem delovanja proteina omogoča odpornost na zdravila proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201229080253.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Sofija Stevanović||Gaja Starc||Nuša Brdnik
|-
| Tinkara Butara||Kako rastline zaznajo napad herbivorov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210216133437.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Klara Ažbe||Mark Loborec||Ema Kavčič
|-
| Pia Trošt||Barvna povezava v sposobnosti korale, da preživi višje temperature||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210221154616.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Mia Kobal||Vanja Ivošević||Urša Štefan
|-
| Živa Urh||Zmanjšanje transkripcijske aktivnosti povzroči stresno pogojena jedrna kondenzacija NELF ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210210170104.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Andraž Rotar||Petja Premrl||Maj Priveršek
|-
| Urša Zevnik||Gen za dolgoživost ščiti možganske matične celice pred stresom||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210219155903.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Gašper Struna||David Valte||Klara Kolenc
|-
| Nika Ferk||Formulacije in površine na osnovi biomaterialov za boj proti virusnim nalezljivim boleznim||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210209113902.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Špehar||Sofija Stevanović||Gaja Starc
|-
| Nataša Vujović||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210223135516.htm
||12.03.||15.03.||18.03.||Tinkara Butara||Klara Ažbe||Mark Loborec
|-
| Thaler Nuša Kos||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210205121236.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Trošt||Mia Kobal||Vanja Ivošević
|-
| Sara Borišek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210302075358.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Živa Urh||Andraž Rotar||Petja Premrl
|-
| Lana Bajec||||||19.03.||22.03.||25.03.||Urša Zevnik||Gašper Struna||David Valte
|-
| Leila Bohorč||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210208134421.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nika Ferk||Pia Špehar||Sofija Stevanović
|-
| Špela Rapuš||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/01/210114163907.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nataša Vujović||Tinkara Butara||Klara Ažbe
|-
| Pavletič Primož Šenica||||||19.03.||22.03.||25.03.||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt||Mia Kobal
|-
| Ivana Vukšinić||Vpliv metabolizma žvepla na razvoj mnogoceličnih organizmov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210224143527.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Ela Kovač||Živa Urh||Andraž Rotar
|-
| Zarja Weingerl||||||26.03.||29.03.||01.04.||Lana Bajec||Urša Zevnik||Gašper Struna
|-
| Teja Spruk||||||26.03.||29.03.||01.04.||Leila Bohorč||Nika Ferk||Pia Špehar
|-
| Magdalena Ilievska||||||26.03.||29.03.||01.04.||Špela Rapuš||Nataša Vujović||Tinkara Butara
|-
| Metka Rus||||||26.03.||29.03.||01.04.||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt
|-
| Pia Sotlar||Zdravljenje s sistemom za urejanje genoma, ki temelji na metodi CRISPR, uničuje rakave celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201118161129.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Ivana Vukšinić||Ela Kovač||Živa Urh
|-
| Nik Vidmar||||||02.04.||05.04.||08.04.||Zarja Weingerl||Lana Bajec||Urša Zevnik
|-
| Ana Maučec||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210226103805.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Teja Spruk||Leila Bohorč||Nika Ferk
|-
| Neža Peternel||||||02.04.||05.04.||08.04.||Magdalena Ilievska||Špela Rapuš||Nataša Vujović
|-
| Zoran Džon Ivanić||Reprogramiranje za povrnitev mladostne epigenetske informacije in povrnitev vida||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201202114531.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos
|-
| Pia Mencin||||||02.04.||05.04.||08.04.||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić||Ela Kovač
|-
| Marko Kovačić||||||09.04.||12.04.||15.04.||Nik Vidmar||Zarja Weingerl||Lana Bajec
|-
| Karidia Kolbl||||||09.04.||12.04.||15.04.||Ana Maučec||Teja Spruk||Leila Bohorč
|-
| Klara Razboršek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201111122815.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Neža Peternel||Magdalena Ilievska||Sara Borišek
|-
| Katja Resnik||||||09.04.||12.04.||15.04.||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica
|-
| Simona Kocheva||||||09.04.||12.04.||15.04.||Pia Mencin||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić
|-
| Miha Razdevšek||||||16.04.||19.04.||22.04.||Marko Kovačić||Nik Vidmar||Zarja Weingerl
|-
| Janja Bohte||||||16.04.||19.04.||22.04.||Karidia Kolbl||Ana Maučec||Teja Spruk
|-
| Tea Amidović||||||16.04.||19.04.||22.04.||Klara Razboršek||Neža Peternel||Magdalena Ilievska
|-
| Patricija Kolander||||||16.04.||19.04.||22.04.||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus
|-
| Lev Jošt||||||16.04.||19.04.||22.04.||Simona Kocheva||Pia Mencin||Pia Sotlar
|-
| Tina Zajec||||||30.04.||03.05.||06.05.||Miha Razdevšek||Marko Kovačić||Nik Vidmar
|-
| Tina Urh||||||30.04.||03.05.||06.05.||Janja Bohte||Karidia Kolbl||Ana Maučec
|-
| Žan Žnidar||||||30.04.||03.05.||06.05.||Tea Amidović||Klara Razboršek||Neža Peternel
|-
| Boštjan Kramberger||||https://www.nature.com/articles/s41467-021-21185-5?fbclid=IwAR2jbjZ3amUYlXu2j8l94OQTS7ram6kTx9ZRekmN6ncmNCUyjsRuV3DF0mk||30.04.||03.05.||06.05.||Patricija Kolander||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić
|-
| Nuša Brdnik||||||30.04.||03.05.||06.05.||Lev Jošt||Simona Kocheva||Pia Mencin
|-
| Ema Kavčič||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Zajec||Miha Razdevšek||Marko Kovačić
|-
| Urša Štefan||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Urh||Janja Bohte||Karidia Kolbl
|-
| Maj Priveršek||||||07.05.||10.05.||13.05.||Žan Žnidar||Tea Amidović||Klara Razboršek
|-
| Klara Kolenc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander||Katja Resnik
|-
| Gaja Starc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Nuša Brdnik||Lev Jošt||Simona Kocheva
|-
| Mark Loborec||||||14.05.||17.05.||20.05.||Ema Kavčič||Tina Zajec||Miha Razdevšek
|-
| Vanja Ivošević||||||14.05.||17.05.||20.05.||Urša Štefan||Tina Urh||Janja Bohte
|-
| Petja Premrl||||||14.05.||17.05.||20.05.||Maj Priveršek||Žan Žnidar||Tea Amidović
|-
| David Valte||||||14.05.||17.05.||20.05.||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander
|-
| Sofija Stevanović||||||14.05.||17.05.||20.05.||Gaja Starc||Nuša Brdnik||Lev Jošt
|-
| Klara Ažbe||||||21.05.||24.05.||27.05.||Mark Loborec||Ema Kavčič||Tina Zajec
|-
| Mia Kobal||||||21.05.||24.05.||27.05.||Vanja Ivošević||Urša Štefan||Tina Urh
|-
| Andraž Rotar||||||21.05.||24.05.||27.05.||Petja Premrl||Maj Priveršek||Žan Žnidar
|-
| Ela Kovač||||||21.05.||24.05.||27.05.||Sara Borišek||Špela Rapuš||Tinkara Butara
|-}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2020. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2021 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2021_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2021_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2021_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2021_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2021_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2021_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.