Wiki FKKT - User contributions [en]

MBT seminarji 2021

2021-04-05T18:25:26Z

Peter Škrinjar:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih

2021-04-05T18:17:30Z

Peter Škrinjar:

Karotenoidi so hidrofobni organski pigmenti, ki se v naravi lahko sintetizirajo v rastlinah, algah, glivah in bakterijah. Njihov osrednji del predstavlja polienska veriga z 9 konjugiranimi dvojnimi vezmi, zaradi katerih so karotenoidi zmožni absorbirati svetlobo v vidnem spektru, kar jim daje značilno obarvanost1.

==Karotenoidi v rastlinah==
Pri rastlinah karotenoidi igrajo pomembno vlogo, saj sodelujejo pri absorbciji svetlobe za fotosintezo, učinkujejo antioksidativno in fotoprotekcijsko ter promovirajo rast rastlin2. Zato je za normalen razvoj rastlin pomemben tudi encim ζ-karoten desaturaza ('''ZDS'''), ki sodeluje v biosintezni poti karotenoidov, in sicer pri pretvorbi ζ-karotena v likopen3.

Avtorji članka4 so preučevali kakšen je učinek utišanja tega encima v gensko spremenjenih paradižnikih.

==Izvedba eksperimenta==
Za utišanje ZDS so uporabili metodo interferenčne RNA. To so izvedli tako, da so z metodo Gateaway kloniranja5 v regijo T-DNA binarnega vektorja pK7GWIWG2(I) vstavili zapis za smerno in protismerno zaporedje za ZDS. Zaporedji sta se nahajali pod promotorjem virusa mozaika cvetače in med njima je bil še intron4. Ta zapis se je tako znotraj rastlinske celice prepisal v lasnično RNA, iz katere so nastale kratke interferirajoče RNA (siRNAs), ki so se vezale na mRNA ζ-karoten desaturaze in povzročile njeno cepitev ter posledično utišanje tega encima6.

Transformacijo kličnih listov paradižnika so izvedli z bakterijami ''Agrobacterium tumefaciens''. Po dvodnevni kokultivaciji kličnih listov paradižnika z bakterijami, ki so vsebovale binarni in razoroženi vektor, so klične liste prenesli v regeneracijski medij. Nastale poganjke so nato odrezali in prenesli v nov medij, v katerem so rastline razvile korenine, tako da so jih nato lahko prenesli v lončke z zemljo in gojili pri 25°C. Za kvantitativno okarakterizacijo so uporabili liste in plodove paradižnika v treh stopnjah dozorelosti: nedozorel (''angl.'' mature green), srednje dozorel (''angl.'' breaker) in povsem dozorel (''angl.'' ripe)4.

Za določevanje nivoja izražanja posameznih genov v biosintezni poti karotenoidov je bil po izolaciji RNA in reverzni transkripciji v cDNA uporabljen qPCR, pri katerem je endogeno kontrolo predstavljal gen za β-aktin. Vsebnost posameznih karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov je bila po ekstrakciji določena s HPLC4.

==Rezultati==
===Uspešnost utišanja ζ-karoten desaturaze in morfološke spremembe pri transformiranih paradižnikih===
Po transformaciji so pri vseh dvanajstih uspešno transformiranih paradižnikih ugotovili nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo, ki je bila transformirana s praznim vektorjem. Za nadaljno analizo sta bili nato izbrani dve z RNA interferenco spremenjeni liniji ('''liniji RI'''), ki sta imeli za več kot 75% nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo4.

Poleg razlik v velikosti rastlin, kjer sta liniji RI zrastli za 2,4-krat višje kot kontrolna linija, so se morfološke razlike pokazale tudi na listih in plodovih paradižnika. Liniji RI sta imeli v primerjavi s kontrolo večje liste, ki so imeli bele lise, in večje plodove, ki so bili prav tako bele barve. To je posledica spremenjene vsebnosti karotenoidov in flavonoidov v listih in plodovih4.

===Spremembe v izražanju genov v biosintezni poti karotenoidov in spremembe v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov===
Kot je bilo pričakovano, je bila ekspresija gena za ZDS v linijah RI nižja v vseh treh stopnjah zorenja paradižnika v primerjavi s kontrolo. Prav tako se je v linijah RI v primerjavi s kontrolo pokazala nižja ekspresija genov za fitoen desaturazo (PDS) in fitoen sintazo (PSY), čeprav je bila eskpresija slednjega v nedozoreli stopnji višja kot v kontrolni liniji. Izražanje gena za likopen β-ciklazo (LYCB) v linijah RI je bilo v vseh treh stopnjah zorenja višje v primerjavi s kontrolo4.

Plodovi linij RI so vsebovali višji delež fitoena v primerjavi s plodovi kontrole, medtem ko se je vsebnost likopena in β-karotena v plodovih linij RI znižala pod mejo detekcije. Prav tako se je v listih in plodovih linij RI znižala vsebnost ksantofilov, klorofilov in flavonoidov v primerjavi z listi in plodovi kontrolne linije. Pri analizi vsebnosti fitohormonov je bilo ugotovljeno, da se je delež giberelinske kisline v linijah RI znatno povečal v primerjavi s kontrolo, medtem ko se je vsebnost abscizinske kisline znižala4.

==Zaključek==
Avtorji članka so z metodo interferenčne RNA uspešno utišali gen za ζ-karoten desaturazo (ZDS) v paradižniku. Rezultati eksperimentov so pokazali, da ima ZDS pomembno vlogo pri razvoju paradižnikov in da utišanje tega gena povzroči različne morfološke spremembe, ki so posledica sprememb v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov v gensko spremenjenih linijah. S to študijo je bilo dokazano, da ZDS predstavlja eno izmed osrednjih kontrolnih točk v biosintezni poti karotenoidov in da bi se lahko s spremenjenim izražanjem tega gena povečala vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih rastlinah, kar je eden izmed ciljev živilske industrije4.

==Literatura==
1. Barreiro, C. & Barredo, J. L. Carotenoids production: A healthy and profitable industry. ''Methods in Molecular Biology'' '''1852''', 45–55 (Humana Press Inc., 2018).

2. Kim, H. S. et al. Orange: a target gene for regulating carotenoid homeostasis and increasing plant tolerance to environmental stress in marginal lands. ''J. Exp. Bot.'' '''69''', 3393–3400 (2018).

3. Galpaz, N., Ronen, G., Khalfa, Z., Zamir, D. & Hirschberg, J. A chromoplast-specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed by cloning of the tomato white-flower locus. ''Plant Cell'' '''18''', 1947–1960 (2006).

4. Babu, M. A., Srinivasan, R., Subramanian, P. & Kodiveri Muthukaliannan, G. RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content. ''Plant Growth Regul.'' '''93''', 189–201 (2021).

5. Karimi, M., Depicker, A. & Hilson, P. Update on Recombinational Cloning with Plant Gateway Vectors. ''Plant Physiol.'' '''145''', 1144–1154 (2007).

6. Liu, Q., Hurlstone, C., Singh, S. & Green, A. Application of hpRNA-Mediated Gene Silencing Techniques to Modification of Fatty Acid Composition. ''Advanced Research on Plant Lipids'' '''407–410''' (Springer Netherlands, 2003). doi:10.1007/978-94-017-0159-4_95

Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih

2021-04-05T18:13:36Z

Peter Škrinjar:

Karotenoidi so hidrofobni organski pigmenti, ki se v naravi lahko sintetizirajo v rastlinah, algah, glivah in bakterijah. Njihov osrednji del predstavlja polienska veriga z 9 konjugiranimi dvojnimi vezmi, zaradi katerih so karotenoidi zmožni absorbirati svetlobo v vidnem spektru, kar jim daje značilno obarvanost1.

==Karotenoidi v rastlinah==
Pri rastlinah karotenoidi igrajo pomembno vlogo, saj sodelujejo pri absorbciji svetlobe za fotosintezo, učinkujejo antioksidativno in fotoprotekcijsko ter promovirajo rast rastlin2. Zato je za normalen razvoj rastlin pomemben tudi encim ζ-karoten desaturaza ('''ZDS'''), ki sodeluje v biosintezni poti karotenoidov, in sicer pri pretvorbi ζ-karotena v likopen3.

Avtorji članka4 so preučevali kakšen je učinek utišanja tega encima v gensko spremenjenih paradižnikih.

==Izvedba eksperimenta==
Za utišanje ZDS so uporabili metodo interferenčne RNA. To so izvedli tako, da so z metodo Gateaway kloniranja5 v regijo T-DNA binarnega vektorja pK7GWIWG2(I) vstavili zapis za smerno in protismerno zaporedje za ZDS. Zaporedji sta se nahajali pod promotorjem virusa mozaika cvetače in med njima je bil še intron4. Ta zapis se je tako znotraj rastlinske celice prepisal v lasnično RNA, iz katere so nastale kratke interferirajoče RNA (siRNAs), ki so se vezale na mRNA ζ-karoten desaturaze in povzročile njeno cepitev ter posledično utišanje tega encima6.

Transformacijo kličnih listov paradižnika so izvedli z bakterijami ''Agrobacterium tumefaciens''. Po dvodnevni kokultivaciji kličnih listov paradižnika z bakterijami, ki so vsebovale binarni in razoroženi vektor, so klične liste prenesli v regeneracijski medij. Nastale poganjke so nato odrezali in prenesli v nov medij, v katerem so rastline razvile korenine, tako da so jih nato lahko prenesli v lončke z zemljo in gojili pri 25°C. Za kvantitativno okarakterizacijo so uporabili liste in plodove paradižnika v treh stopnjah dozorelosti: nedozorel (''angl.'' mature green), srednje dozorel (''angl.'' breaker) in povsem dozorel (''angl.'' ripe)4.

Za določevanje nivoja izražanja posameznih genov v biosintezni poti karotenoidov je bil po izolaciji RNA in reverzni transkripciji v cDNA uporabljen qPCR, pri katerem je endogeno kontrolo predstavljal gen za β-aktin. Vsebnost posameznih karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov je bila po ekstrakciji določena s HPLC4.

==Rezultati==
===Uspešnost utišanja ζ-karoten desaturaze in morfološke spremembe pri transformiranih paradižnikih===
Po transformaciji so pri vseh dvanajstih uspešno transformiranih paradižnikih ugotovili nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo, ki je bila transformirana s praznim vektorjem. Za nadaljno analizo sta bili nato izbrani dve z RNA interferenco spremenjeni liniji ('''RI liniji'''), ki sta imeli za več kot 75% nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo4.

Poleg razlik v velikosti rastlin, kjer sta RI liniji zrastli za 2,4-krat višje kot kontrolna linija, so se morfološke razlike pokazale tudi na listih in plodovih paradižnika. RI liniji sta imeli v primerjavi s kontrolo večje liste, ki so imeli bele lise, in večje plodove, ki so bili prav tako bele barve. To je posledica spremenjene vsebnosti karotenoidov in flavonoidov v listih in plodovih4.

===Spremembe v izražanju genov v biosintezni poti karotenoidov in spremembe v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov===
Kot je bilo pričakovano, je bila ekspresija gena za ZDS v RI linijah nižja v vseh treh stopnjah zorenja paradižnika v primerjavi s kontrolo. Prav tako se je v RI linijah v primerjavi s kontrolo pokazala nižja ekspresija genov za fitoen desaturazo (PDS) in fitoen sintazo (PSY), čeprav je bila eskpresija slednjega v nedozoreli stopnji višja kot v kontrolni liniji. Izražanje gena za likopen β-ciklazo (LYCB) v RI linijah je bilo v vseh treh stopnjah zorenja višje v primerjavi s kontrolo4.

Plodovi RI linij so vsebovali višji delež fitoena v primerjavi s plodovi kontrole, medtem ko se je vsebnost likopena in β-karotena v plodovih RI linij znižala pod mejo detekcije. Prav tako se je v listih in plodovih RI linij znižala vsebnost ksantofilov, klorofilov in flavonoidov v primerjavi z listi in plodovi kontrolne linije. Pri analizi vsebnosti fitohormonov je bilo ugotovljeno, da se je delež giberelinske kisline v RI linijah znatno povečal v primerjavi s kontrolo, medtem ko se je vsebnost abscizinske kisline znižala4.

==Zaključek==
Avtorji članka so z metodo interferenčne RNA uspešno utišali gen za ζ-karoten desaturazo (ZDS) v paradižniku. Rezultati eksperimentov so pokazali, da ima ZDS pomembno vlogo pri razvoju paradižnikov in da utišanje tega gena povzroči različne morfološke spremembe, ki so posledica sprememb v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov v gensko spremenjenih linijah. S to študijo je bilo dokazano, da ZDS predstavlja eno izmed osrednjih kontrolnih točk v biosintezni poti karotenoidov in da bi se lahko s spremenjenim izražanjem tega gena povečala vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih rastlinah, kar je eden izmed ciljev živilske industrije4.

==Literatura==
1. Barreiro, C. & Barredo, J. L. Carotenoids production: A healthy and profitable industry. ''Methods in Molecular Biology'' '''1852''', 45–55 (Humana Press Inc., 2018).

2. Kim, H. S. et al. Orange: a target gene for regulating carotenoid homeostasis and increasing plant tolerance to environmental stress in marginal lands. ''J. Exp. Bot.'' '''69''', 3393–3400 (2018).

3. Galpaz, N., Ronen, G., Khalfa, Z., Zamir, D. & Hirschberg, J. A chromoplast-specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed by cloning of the tomato white-flower locus. ''Plant Cell'' '''18''', 1947–1960 (2006).

4. Babu, M. A., Srinivasan, R., Subramanian, P. & Kodiveri Muthukaliannan, G. RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content. ''Plant Growth Regul.'' '''93''', 189–201 (2021).

5. Karimi, M., Depicker, A. & Hilson, P. Update on Recombinational Cloning with Plant Gateway Vectors. ''Plant Physiol.'' '''145''', 1144–1154 (2007).

6. Liu, Q., Hurlstone, C., Singh, S. & Green, A. Application of hpRNA-Mediated Gene Silencing Techniques to Modification of Fatty Acid Composition. ''Advanced Research on Plant Lipids'' '''407–410''' (Springer Netherlands, 2003). doi:10.1007/978-94-017-0159-4_95

Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih

2021-04-05T18:09:36Z

Peter Škrinjar:

Karotenoidi so hidrofobni organski pigmenti, ki se v naravi lahko sintetizirajo v rastlinah, algah, glivah in bakterijah. Njihov osrednji del predstavlja polienska veriga z 9 konjugiranimi dvojnimi vezmi, zaradi katerih so karotenoidi zmožni absorbirati svetlobo v vidnem spektru, kar jim daje značilno obarvanost1.

==Karotenoidi v rastlinah==
Pri rastlinah karotenoidi igrajo pomembno vlogo, saj sodelujejo pri absorbciji svetlobe za fotosintezo, učinkujejo antioksidativno in fotoprotekcijsko ter promovirajo rast rastlin2. Zato je za normalen razvoj rastlin pomemben tudi encim ζ-karoten desaturaza ('''ZDS'''), ki sodeluje v biosintezni poti karotenoidov, in sicer pri pretvorbi ζ-karotena v likopen3.

Avtorji članka4 so preučevali kakšen je učinek utišanja tega encima v gensko spremenjenih paradižnikih.

==Izvedba eksperimenta==
Za utišanje ZDS so uporabili metodo interferenčne RNA. To so izvedli tako, da so z metodo Gateaway kloniranja5 v regijo T-DNA binarnega vektorja pK7GWIWG2(I) vstavili zapis za smerno in protismerno zaporedje za ZDS. Zaporedji sta se nahajali pod promotorjem virusa mozaika cvetače in med njima je bil še intron4. Ta zapis se je tako znotraj rastlinske celice prepisal v lasnično RNA, iz katere so nastale kratke interferirajoče RNA (siRNAs), ki so se vezale na mRNA ζ-karoten desaturaze in povzročile njeno cepitev ter posledično utišanje tega encima6.

Transformacijo kličnih listov paradižnika so izvedli z bakterijami ''Agrobacterium tumefaciens''. Po dvodnevni kokultivaciji kličnih listov paradižnika z bakterijami, ki so vsebovale binarni in razoroženi vektor, so klične liste prenesli v regeneracijski medij. Nastale poganjke so nato odrezali in prenesli v nov medij, v katerem so rastline razvile korenine, tako da so jih nato lahko prenesli v lončke z zemljo in gojili pri 25 stopinjah. Za kvantitativno okarakterizacijo so uporabili liste in plodove paradižnika v treh stopnjah dozorelosti: nedozorel (''angl.'' mature green), srednje dozorel (''angl.'' breaker) in povsem dozorel (''angl.'' ripe)4.

Za določevanje nivoja izražanja posameznih genov v biosintezni poti karotenoidov je bil po izolaciji RNA in reverzni transkripciji v cDNA uporabljen qPCR, pri katerem je endogeno kontrolo predstavljal gen za β-aktin. Vsebnost posameznih karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov je bila po ekstrakciji določena s HPLC4.

==Rezultati==
===Uspešnost utišanja ζ-karoten desaturaze in morfološke spremembe pri transformiranih paradižnikih===
Po transformaciji so pri vseh dvanajstih uspešno transformiranih paradižnikih ugotovili nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo, ki je bila transformirana s praznim vektorjem. Za nadaljno analizo sta bili nato izbrani dve z RNA interferenco spremenjeni liniji ('''RI liniji'''), ki sta imeli za več kot 75% nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo4.

Poleg razlik v velikosti rastlin, kjer sta RI liniji zrastli za 2,4-krat višje kot kontrolna linija, so se morfološke razlike pokazale tudi na listih in plodovih paradižnika. RI liniji sta imeli v primerjavi s kontrolo večje liste, ki so imeli bele lise, in večje plodove, ki so bili prav tako bele barve. To je posledica spremenjene vsebnosti karotenoidov in flavonoidov v listih in plodovih4.

===Spremembe v izražanju genov v biosintezni poti karotenoidov in spremembe v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov===
Kot je bilo pričakovano, je bila ekspresija gena za ZDS v RI linijah nižja v vseh treh stopnjah zorenja paradižnika v primerjavi s kontrolo. Prav tako se je v RI linijah v primerjavi s kontrolo pokazala nižja ekspresija genov za fitoen desaturazo (PDS) in fitoen sintazo (PSY), čeprav je bila eskpresija slednjega v nedozoreli stopnji višja kot v kontrolni liniji. Izražanje gena za likopen β-ciklazo (LYCB) v RI linijah je bilo v vseh treh stopnjah zorenja višje v primerjavi s kontrolo4.

Plodovi RI linij so vsebovali višji delež fitoena v primerjavi s plodovi kontrole, medtem ko se je vsebnost likopena in β-karotena v plodovih RI linij znižala pod mejo detekcije. Prav tako se je v listih in plodovih RI linij znižala vsebnost ksantofilov, klorofilov in flavonoidov v primerjavi z listi in plodovi kontrolne linije. Pri analizi vsebnosti fitohormonov je bilo ugotovljeno, da se je delež giberelinske kisline v RI linijah znatno povečal v primerjavi s kontrolo, medtem ko se je vsebnost abscizinske kisline znižala4.

==Zaključek==
Avtorji članka so z metodo interferenčne RNA uspešno utišali gen za ζ-karoten desaturazo (ZDS) v paradižniku. Rezultati eksperimentov so pokazali, da ima ZDS pomembno vlogo pri razvoju paradižnikov in da utišanje tega gena povzroči različne morfološke spremembe, ki so posledica sprememb v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov v gensko spremenjenih linijah. S to študijo je bilo dokazano, da ZDS predstavlja eno izmed osrednjih kontrolnih točk v biosintezni poti karotenoidov in da bi se lahko s spremenjenim izražanjem tega gena povečala vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih rastlinah, kar je eden izmed ciljev živilske industrije4.

==Literatura==
1. Barreiro, C. & Barredo, J. L. Carotenoids production: A healthy and profitable industry. ''Methods in Molecular Biology'' '''1852''', 45–55 (Humana Press Inc., 2018).

2. Kim, H. S. et al. Orange: a target gene for regulating carotenoid homeostasis and increasing plant tolerance to environmental stress in marginal lands. ''J. Exp. Bot.'' '''69''', 3393–3400 (2018).

3. Galpaz, N., Ronen, G., Khalfa, Z., Zamir, D. & Hirschberg, J. A chromoplast-specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed by cloning of the tomato white-flower locus. ''Plant Cell'' '''18''', 1947–1960 (2006).

4. Babu, M. A., Srinivasan, R., Subramanian, P. & Kodiveri Muthukaliannan, G. RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content. ''Plant Growth Regul.'' '''93''', 189–201 (2021).

5. Karimi, M., Depicker, A. & Hilson, P. Update on Recombinational Cloning with Plant Gateway Vectors. ''Plant Physiol.'' '''145''', 1144–1154 (2007).

6. Liu, Q., Hurlstone, C., Singh, S. & Green, A. Application of hpRNA-Mediated Gene Silencing Techniques to Modification of Fatty Acid Composition. ''Advanced Research on Plant Lipids'' '''407–410''' (Springer Netherlands, 2003). doi:10.1007/978-94-017-0159-4_95

Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih

2021-04-05T18:07:55Z

Peter Škrinjar:

Karotenoidi so hidrofobni organski pigmenti, ki se v naravi lahko sintetizirajo v rastlinah, algah, glivah in bakterijah. Njihov osrednji del predstavlja polienska veriga z 9 konjugiranimi dvojnimi vezmi, zaradi katerih so karotenoidi zmožni absorbirati svetlobo v vidnem spektru, kar jim daje značilno obarvanost1.

==Karotenoidi v rastlinah==
Pri rastlinah karotenoidi igrajo pomembno vlogo, saj sodelujejo pri absorbciji svetlobe za fotosintezo, učinkujejo antioksidativno in fotoprotekcijsko ter promovirajo rast rastlin2. Zato je za normalen razvoj rastlin pomemben tudi encim ζ-karoten desaturaza ('''ZDS'''), ki sodeluje v biosintezni poti karotenoidov, in sicer pri pretvorbi ζ-karotena v likopen3.

Avtorji članka4 so preučevali kakšen je učinek utišanja tega encima v gensko spremenjenih paradižnikih.

==Izvedba eksperimenta==
Za utišanje ZDS so uporabili metodo interferenčne RNA. To so izvedli tako, da so z metodo Gateaway kloniranja5 v regijo T-DNA binarnega vektorja pK7GWIWG2(I) vstavili zapis za smerno in protismerno zaporedje za ZDS. Zaporedji sta se nahajali pod promotorjem virusa mozaika cvetače in med njima je bil še intron4. Ta zapis se je tako znotraj rastlinske celice prepisal v lasnično RNA, iz katere so nastale kratke interferirajoče RNA (siRNAs), ki so se vezale na mRNA ζ karoten desaturaze in povzročile njeno cepitev ter posledično utišanje tega encima6.

Transformacijo kličnih listov paradižnika so izvedli z bakterijami ''Agrobacterium tumefaciens''. Po dvodnevni kokultivaciji kličnih listov paradižnika z bakterijami, ki so vsebovale binarni in razoroženi vektor, so klične liste prenesli v regeneracijski medij. Nastale poganjke so nato odrezali in prenesli v nov medij, v katerem so rastline razvile korenine, tako da so jih nato lahko prenesli v lončke z zemljo in gojili pri 25 stopinjah. Za kvantitativno okarakterizacijo so uporabili liste in plodove paradižnika v treh stopnjah dozorelosti: nedozorel (''angl.'' mature green), srednje dozorel (''angl.'' breaker) in povsem dozorel (''angl.'' ripe)4.

Za določevanje nivoja izražanja posameznih genov v biosintezni poti karotenoidov je bil po izolaciji RNA in reverzni transkripciji v cDNA uporabljen qPCR, pri katerem je endogeno kontrolo predstavljal gen za β-aktin. Vsebnost posameznih karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov je bila po ekstrakciji določena s HPLC4.

==Rezultati==
===Uspešnost utišanja ζ-karoten desaturaze in morfološke spremembe pri transformiranih paradižnikih===
Po transformaciji so pri vseh dvanajstih uspešno transformiranih paradižnikih ugotovili nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo, ki je bila transformirana s praznim vektorjem. Za nadaljno analizo sta bili nato izbrani dve z RNA interferenco spremenjeni liniji ('''RI liniji'''), ki sta imeli za več kot 75% nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo4.

Poleg razlik v velikosti rastlin, kjer sta RI liniji zrastli za 2,4-krat višje kot kontrolna linija, so se morfološke razlike pokazale tudi na listih in plodovih paradižnika. RI liniji sta imeli v primerjavi s kontrolo večje liste, ki so imeli bele lise, in večje plodove, ki so bili prav tako bele barve. To je posledica spremenjene vsebnosti karotenoidov in flavonoidov v listih in plodovih4.

===Spremembe v izražanju genov v biosintezni poti karotenoidov in spremembe v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov===
Kot je bilo pričakovano, je bila ekspresija gena za ZDS v RI linijah nižja v vseh treh stopnjah zorenja paradižnika v primerjavi s kontrolo. Prav tako se je v RI linijah v primerjavi s kontrolo pokazala nižja ekspresija genov za fitoen desaturazo (PDS) in fitoen sintazo (PSY), čeprav je bila eskpresija slednjega v nedozoreli stopnji višja kot v kontrolni liniji. Izražanje gena za likopen β-ciklazo (LYCB) v RI linijah je bilo v vseh treh stopnjah zorenja višje v primerjavi s kontrolo4.

Plodovi RI linij so vsebovali višji delež fitoena v primerjavi s plodovi kontrole, medtem ko se je vsebnost likopena in β-karotena v plodovih RI linij znižala pod mejo detekcije. Prav tako se je v listih in plodovih RI linij znižala vsebnost ksantofilov, klorofilov in flavonoidov v primerjavi z listi in plodovi kontrolne linije. Pri analizi vsebnosti fitohormonov je bilo ugotovljeno, da se je delež giberelinske kisline v RI linijah znatno povečal v primerjavi s kontrolo, medtem ko se je vsebnost abscizinske kisline znižala4.

==Zaključek==
Avtorji članka so z metodo interferenčne RNA uspešno utišali gen za ζ-karoten desaturazo (ZDS) v paradižniku. Rezultati eksperimentov so pokazali, da ima ZDS pomembno vlogo pri razvoju paradižnikov in da utišanje tega gena povzroči različne morfološke spremembe, ki so posledica sprememb v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov v gensko spremenjenih linijah. S to študijo je bilo dokazano, da ZDS predstavlja eno izmed osrednjih kontrolnih točk v biosintezni poti karotenoidov in da bi se lahko s spremenjenim izražanjem tega gena povečala vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih rastlinah, kar je eden izmed ciljev živilske industrije4.

==Literatura==
1. Barreiro, C. & Barredo, J. L. Carotenoids production: A healthy and profitable industry. ''Methods in Molecular Biology'' '''1852''', 45–55 (Humana Press Inc., 2018).

2. Kim, H. S. et al. Orange: a target gene for regulating carotenoid homeostasis and increasing plant tolerance to environmental stress in marginal lands. ''J. Exp. Bot.'' '''69''', 3393–3400 (2018).

3. Galpaz, N., Ronen, G., Khalfa, Z., Zamir, D. & Hirschberg, J. A chromoplast-specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed by cloning of the tomato white-flower locus. ''Plant Cell'' '''18''', 1947–1960 (2006).

4. Babu, M. A., Srinivasan, R., Subramanian, P. & Kodiveri Muthukaliannan, G. RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content. ''Plant Growth Regul.'' '''93''', 189–201 (2021).

5. Karimi, M., Depicker, A. & Hilson, P. Update on Recombinational Cloning with Plant Gateway Vectors. ''Plant Physiol.'' '''145''', 1144–1154 (2007).

6. Liu, Q., Hurlstone, C., Singh, S. & Green, A. Application of hpRNA-Mediated Gene Silencing Techniques to Modification of Fatty Acid Composition. ''Advanced Research on Plant Lipids'' '''407–410''' (Springer Netherlands, 2003). doi:10.1007/978-94-017-0159-4_95

Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih

2021-04-05T18:05:45Z

Peter Škrinjar: New page: Karotenoidi so hidrofobni organski pigmenti, ki se v naravi lahko sintetizirajo v rastlinah, algah, glivah in bakterijah. Njihov osrednji del predstavlja polienska veriga z 9 konjugiranimi...

Karotenoidi so hidrofobni organski pigmenti, ki se v naravi lahko sintetizirajo v rastlinah, algah, glivah in bakterijah. Njihov osrednji del predstavlja polienska veriga z 9 konjugiranimi dvojnimi vezmi, zaradi katerih so karotenoidi zmožni absorbirati svetlobo v vidnem spektru, kar jim daje značilno obarvanost1.

==Karotenoidi v rastlinah==
Pri rastlinah karotenoidi igrajo pomembno vlogo, saj sodelujejo pri absorbciji svetlobe za fotosintezo, učinkujejo antioksidativno in fotoprotekcijsko ter promovirajo rast rastlin2. Zato je za normalen razvoj rastlin pomemben tudi encim ζ-karoten desaturaza ('''ZDS'''), ki sodeluje v biosintezni poti karotenoidov, in sicer pri pretvorbi ζ-karotena v likopen3.
Avtorji članka4 so preučevali kakšen je učinek utišanja tega encima v gensko spremenjenih paradižnikih.

==Izvedba eksperimenta==
Za utišanje ZDS so uporabili metodo interferenčne RNA. To so izvedli tako, da so z metodo Gateaway kloniranja5 v regijo T-DNA binarnega vektorja pK7GWIWG2(I) vstavili zapis za smerno in protismerno zaporedje za ZDS. Zaporedji sta se nahajali pod promotorjem virusa mozaika cvetače in med njima je bil še intron4. Ta zapis se je tako znotraj rastlinske celice prepisal v lasnično RNA, iz katere so nastale kratke interferirajoče RNA (siRNAs), ki so se vezale na mRNA ζ karoten desaturaze in povzročile njeno cepitev ter posledično utišanje tega encima6.
Transformacijo kličnih listov paradižnika so izvedli z bakterijami ''Agrobacterium tumefaciens''. Po dvodnevni kokultivaciji kličnih listov paradižnika z bakterijami, ki so vsebovale binarni in razoroženi vektor, so klične liste prenesli v regeneracijski medij. Nastale poganjke so nato odrezali in prenesli v nov medij, v katerem so rastline razvile korenine, tako da so jih nato lahko prenesli v lončke z zemljo in gojili pri 25 stopinjah. Za kvantitativno okarakterizacijo so uporabili liste in plodove paradižnika v treh stopnjah dozorelosti: nedozorel (''angl.'' mature green), srednje dozorel (''angl.'' breaker) in povsem dozorel (''angl.'' ripe)4.
Za določevanje nivoja izražanja posameznih genov v biosintezni poti karotenoidov je bil po izolaciji RNA in reverzni transkripciji v cDNA uporabljen qPCR, pri katerem je endogeno kontrolo predstavljal gen za β-aktin. Vsebnost posameznih karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov je bila po ekstrakciji določena s HPLC4.

==Rezultati==
===Uspešnost utišanja ζ-karoten desaturaze in morfološke spremembe pri transformiranih paradižnikih===
Po transformaciji so pri vseh dvanajstih uspešno transformiranih paradižnikih ugotovili nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo, ki je bila transformirana s praznim vektorjem. Za nadaljno analizo sta bili nato izbrani dve z RNA interferenco spremenjeni liniji ('''RI liniji'''), ki sta imeli za več kot 75% nižjo izražanje gena za ZDS v primerjavi s kontrolo4.
Poleg razlik v velikosti rastlin, kjer sta RI liniji zrastli za 2,4-krat višje kot kontrolna linija, so se morfološke razlike pokazale tudi na listih in plodovih paradižnika. RI liniji sta imeli v primerjavi s kontrolo večje liste, ki so imeli bele lise, in večje plodove, ki so bili prav tako bele barve. To je posledica spremenjene vsebnosti karotenoidov in flavonoidov v listih in plodovih4.

===Spremembe v izražanju genov v biosintezni poti karotenoidov in spremembe v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov===
Kot je bilo pričakovano, je bila ekspresija gena za ZDS v RI linijah nižja v vseh treh stopnjah zorenja paradižnika v primerjavi s kontrolo. Prav tako se je v RI linijah v primerjavi s kontrolo pokazala nižja ekspresija genov za fitoen desaturazo (PDS) in fitoen sintazo (PSY), čeprav je bila eskpresija slednjega v nedozoreli stopnji višja kot v kontrolni liniji. Izražanje gena za likopen β-ciklazo (LYCB) v RI linijah je bilo v vseh treh stopnjah zorenja višje v primerjavi s kontrolo4.
Plodovi RI linij so vsebovali višji delež fitoena v primerjavi s plodovi kontrole, medtem ko se je vsebnost likopena in β-karotena v plodovih RI linij znižala pod mejo detekcije. Prav tako se je v listih in plodovih RI linij znižala vsebnost ksantofilov, klorofilov in flavonoidov v primerjavi z listi in plodovi kontrolne linije. Pri analizi vsebnosti fitohormonov je bilo ugotovljeno, da se je delež giberelinske kisline v RI linijah znatno povečal v primerjavi s kontrolo, medtem ko se je vsebnost abscizinske kisline znižala4.

==Zaključek==
Avtorji članka so z metodo interferenčne RNA uspešno utišali gen za ζ-karoten desaturazo (ZDS) v paradižniku. Rezultati eksperimentov so pokazali, da ima ZDS pomembno vlogo pri razvoju paradižnikov in da utišanje tega gena povzroči različne morfološke spremembe, ki so posledica sprememb v vsebnosti karotenoidov, klorofilov, flavonoidov in fitohormonov v gensko spremenjenih linijah. S to študijo je bilo dokazano, da ZDS predstavlja eno izmed osrednjih kontrolnih točk v biosintezni poti karotenoidov in da bi se lahko s spremenjenim izražanjem tega gena povečala vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih rastlinah, kar je eden izmed ciljev živilske industrije4.

==Literatura==
1. Barreiro, C. & Barredo, J. L. Carotenoids production: A healthy and profitable industry. ''Methods in Molecular Biology'' '''1852''', 45–55 (Humana Press Inc., 2018).
2. Kim, H. S. et al. Orange: a target gene for regulating carotenoid homeostasis and increasing plant tolerance to environmental stress in marginal lands. ''J. Exp. Bot.'' '''69''', 3393–3400 (2018).
3. Galpaz, N., Ronen, G., Khalfa, Z., Zamir, D. & Hirschberg, J. A chromoplast-specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed by cloning of the tomato white-flower locus. ''Plant Cell'' '''18''', 1947–1960 (2006).
4. Babu, M. A., Srinivasan, R., Subramanian, P. & Kodiveri Muthukaliannan, G. RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content. ''Plant Growth Regul.'' '''93''', 189–201 (2021).
5. Karimi, M., Depicker, A. & Hilson, P. Update on Recombinational Cloning with Plant Gateway Vectors. ''Plant Physiol.'' '''145''', 1144–1154 (2007).
6. Liu, Q., Hurlstone, C., Singh, S. & Green, A. Application of hpRNA-Mediated Gene Silencing Techniques to Modification of Fatty Acid Composition. ''Advanced Research on Plant Lipids'' '''407–410''' (Springer Netherlands, 2003). doi:10.1007/978-94-017-0159-4_95

MBT seminarji 2021

2021-03-15T19:02:11Z

Peter Škrinjar:

Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami

2020-05-05T09:59:38Z

Peter Škrinjar:

''Povzeto po'': [https://www.nature.com/articles/nature23271 Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017)]

Sintezna biologija z vpeljavo inženirskih pristopov v biološke sisteme rešuje različne težave na področju biotehnologije in medicine. S pomočjo sintetičnih bioloških vezij so namreč znanstveniki sposobni ustvariti biološke naprave oz. sisteme, ki omogočajo najrazličnejše celične funkcije z uravnavanjem prisotnosti specifičnih komponent. Biološka vezja so večinoma osnovana na proteinskih regulatorjih, vendar ker je takšna vezja težavno nadgrajevati v bolj kompleksne sisteme, so se pojavile potrebe po alternativnih pristopih [1,2].

Eno izmed možnih rešitev predstavljajo biološka vezja na osnovi molekul RNA, ki posedujejo številne prednosti za uporabo v sintezni biologiji. Poleg visoke modularnosti in predvidljivega parjenja baz, s čimer je omogočeno učinkovito ''in silico'' načrtovanje molekul RNA, imajo takšna vezja tudi kolokalizirano senzorsko domeno z izhodnim signalom, s čimer se zmanjša izguba signala [2].

== Ribonukleinska biološka vezja ==

Pri bioloških vezjih, ki so sestavljena izključno iz molekul RNA, celotna regulacija poteka na posttranskripcijski ravni, kar zmanjša časovni zamik med sprožitvijo in zaznavo signala ter prav tako izboljša zanesljivost prenosa signala. Osrednjo komponento ribonukleinskih vezij predstavljajo vrata RNA, ki so sestavljena iz zaznavne domene in reporterskega gena. V članku, ki ga povzemam, je reporterski gen predstavljal zapis za zelen fluorescenčni protein z mutacijama S65G in S72A ter degradacijsko oznako ASV (GFPmut3b-ASV) [3], medtem ko zaznavno domeno vrat RNA predstavljajo stikala 'toehold'. Ta stikala tvorijo sekundarno strukturo lasnice, ki vsebuje ribosom vezavno mesto (RBS) in START kodon. Struktura lasnice onemogoča translacijo reporterskega gena, ki se omogoči šele po vezavi sprožilne molekule RNA, saj ta z vezavo na komplementarno zaporedje na stikalu 'toehold' poruši njegovo sekundarno strukturo. Vhodni signal torej tudi predstavljajo molekule RNA [2].

Na podlagi poznavanja interakcij med dušikovimi bazami je torej moč skonstruirati vhodne molekule RNA in vrata RNA tako, da se med seboj povezujejo na različne načine in s tem omogočajo izvrševanje logičnih operacij ALI, IN ter IN-NE, prav tako pa jih je možno združiti v kompleksnejša vezja.

== Logične operacije ==

Z natančnim ''in silico'' načrtovanjem konstruktov RNA je možno izvajanje različnih logičnih operacij z RNA-napravami. Večino poskusov s temi napravami so avtorji članka izvedli v celicah ''Escherichia coli'' seva BL21 Star DE3, ki vsebuje mutacijo v genu, ki zapisuje za RNazo E, zato so RNA molekule v celicah tega seva bolj stabilne. Zapisi za vrata RNA in vhodne molekule RNA so se večinoma nahajali pod T7 promotorjem, njihova transkripcija pa je bila inducirana z IPTG [2].

Pri izvedbi poskusa za logično operacijo IN-NE so bile uporabljene celice ''E. coli'' seva MG1655Pro. V tem primeru je bila transkripcija vrat RNA konstitutivna, saj se je zapis nahajal pod promotorjem proD, medtem ko je bila transkripcija sprožilne in deaktivirajoče molekule RNA inducirana z anhidrotetraciklinom (aTc) in IPTG [2].

Poskuse so izvedli v prisotnosti (1) in odsotnosti (0) posameznih sprožilnih molekul RNA ter pri tem merili nivo izhodne fluorescence s pretočno citometrijo. Na podlagi razmerja izhodne fluorescence so okarakterizirali izhodni signal kot VKLOP (1) ali IZKLOP (0) za posamezna logična vrata [2].

=== Logična vrata ALI ===

Pri logičnih vratih ALI dobimo izhodni signal VKLOP že v prisotnosti enega izmed ustreznih vhodnih signalov. To za celično računanje z RNA-napravami pomeni, da je potrebno vrata RNA za izvedbo te logične operacije načrtati tako, da poleg reporterskega gena vsebujejo stikalo 'toehold' za vsako posamezno sprožilno RNA. Delovanje takšnih logičnih vrat ALI je namreč možno zaradi sposobnosti ribosoma, da lahko, ko se enkrat veže na že aktivirano stikalo 'toehold', izvede translacijo tudi preko nerazvitih lasnic. Torej bo prišlo do translacije reporterskega gena tudi v primeru, ko bo prisotna le sprožilna RNA prvega stikala 'toehold' in bo drugo stikalo ostalo nerazvito. Zato je tudi pomembno, da so posamezna stikala in zapis za GFP v istem bralnem okvirju [2].

Najprej so delovanje logičnih vrat ALI (tabela 1) preverili na primeru dveh vhodnih signalov. Signala A in B sta predstavljala molekuli RNA, ki sta bili komplementarni zaporedjema A* in B* na stikalih 'toehold'. Kot nesprožilni molekuli RNA so uporabili signala X in Y. Tako so izvedli 4 poskuse v prisotnosti različnih kombinacij vhodnih molekul RNA [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 1:''' Pravilnostna tabela ALI.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A+Y</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>B+X</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A+B</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali najmanj 400-kratno povečanje signala ob prisotnosti vsaj ene izmed sprožilnih RNA v primerjavi z odsotnostjo obeh [2].

Nato so izvedli poskuse z ALI logičnimi vrati tudi na primeru večih (4, 5 in 6) vhodnih signalov. Pri povečevanju števila vhodnih signalov so opazili, da kljub močnemu GFP signalu za logično pravilno stanje, se ta znatno razlikuje med posameznimi sprožilnimi molekulami RNA. Opaziti je bilo namreč višji signal pri sprožilnih RNA, ki so se vezale na stikalo 'toehold' bližje reporterskemu genu, v primerjavi s tistimi, pri katerih se je stikalo 'toehold' z njihovim komplementarnim zaporedjem nahajalo dlje od reporterskega gena. Te variacije je moč pripisati vplivu nerazvitih lasnic na translacijo ribosoma. Prav tako je možno, da se razlika v jakosti signala pojavi zaradi dodanih aminokislinskih ostankov na N-koncu reporterskega proteina [2].

=== Logična vrata IN ===

Pri logičnih vratih IN z dvema vhodoma dobimo izhodni signal VKLOP le ob prisotnosti obeh ustreznih signalov. Za izvedbo takšne logične operacije je pri RNA vratih potrebno le eno stikalo 'toehold', ki pa mora omogočiti vezavo obeh sprožilnih RNA, zato je vezavno zaporedje na tem stikalu razdeljeno na dva dela, ki sta komplementarna posamezni sprožilni molekuli RNA. Prav tako so sprožilne RNA za uporabo pri logični operaciji IN razdeljene na dva dela. En del omogoča vezavo na stikalo 'toehold', medtem ko je drugi del zadolžen za vezavo na drugo sprožilno molekulo RNA. Tako se po transkripciji obe sprožilni molekuli RNA med seboj povežeta in se skupaj vežeta na stikalo, s čimer ga aktivirata in povzročita translacijo reporterskega gena [2].

Da se prepreči aktivacija stikala in translacija v prisotnosti le ene sprožilne RNA molekule, so stikala 'toehold' v logičnih vratih IN skonstuirana na način, da se po vezavi obeh sprožilnih RNA razvije le spodnji del RNA lasnice. Tako se po razvitju spodnjega debla lasnice RBS še vedno nahaja znotraj zanke, vendar je zaradi šibke vezave zgornjega dela debla omogočena vezava ribosoma in začetek translacije [2].

Delovanje logičnih RNA vrat IN (tabela 2) so najprej preizkusili na primeru dveh vhodnih signalov. Sprožilni molekuli RNA sta predstavljala signala A1 in A2, medtem ko so kot nekomplementarni molekuli RNA uporabili signala X in Y [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 2:''' Pravilnostna tabela IN.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A1</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A2</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A1+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A2+X</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A1+A2</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali 900-kratno povečanje signala ob prisotnosti obeh sprožilnih molekul v primerjavi z ostalimi tremi, logično nepravilnimi stanji [2].

Tako kot pri logični operaciji ALI so tudi z logičnim vrati IN izvedli poskuse z več (3, 4 in 5) vhodnimi signali. Pri teh poskusih se sprožilne molekule RNA med seboj povežejo v večje strukture, ki se nato skupaj vežejo na eno stikalo 'toehold'. Tudi pri poskusih z več vhodnimi signali se je pojavila znatna razlika v izhodni fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji [2].

=== Logična vrata IN-NE ===

Pri logičnih vratih IN-NE dobimo izhodni signal VKLOP le v primeru enega določenega vhodnega signala. Pri RNA-napravah je zato v primeru te logične operacije potrebno poleg sprožilne molekule RNA v sistem vpeljati tudi deaktivirajočo RNA, ki je komplementarna sprožilni RNA in bo s hibridizacijo preprečila vezavo sprožilne RNA na stikalo 'toehold'. Deaktivirajoča molekula RNA je zmožna, poleg vezave na prosto sprožilno RNA, tudi odstraniti že vezano sprožilno RNA s stikala, saj ima ta na 5'- in 3'-koncu podaljšani domeni, ki ne tvorita interakcij s stikalom in sta namenjeni tvorbi interakcij z deaktivirajočo RNA [2].

Pri izvedbi poskusa z logičnimi vrati IN-NE (tabela 3) so transkripcijo sprožilne RNA (vhodni signal A) inducirali z anhidrotetraciklinom (aTc), medtem ko so transkripcijo deaktivirajoče RNA (vhodni signal B) sprožili z IPTG [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 3:''' Pravilnostna tabela IN-NE.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A (aTc)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B (IPTG)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
</table>
</center>

GFP fluorescenca je pokazala znatno razliko med logično pravilnim in nepravilnimi stanji [2].

=== Kompleksne logične operacije ===

V članku so prav tako sestavili kompleksnejša biološka vezja z RNA-napravami, ki so kombinirale logične operacije NE, IN ter ALI. Najkompleksnejše vezje, ki so ga konstruirali, je vsebovalo 12 vhodnih RNA signalov in je pri poskuskih ''in vivo'' delovalo robustno ter kazalo znatne razlike v fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji. Ta računska operacija je bila:

<center>(A1 IN A2 IN (NE A1*)) ALI (B1 IN B2 IN (NE B1*)) ALI (C1 IN C2) ALI (D1 IN D2) ALI (E1 IN E2),</center>

kjer molekuli A1* in B1* predstavljata komplementarni zaporedji molekulama A1 in B1 [2].

== Zaključek ==

Omenjeni poskusi nakazujejo na to, da lahko funkcionalno kompleksno biološko vezje tvorimo tudi z uporabo RNA-naprav. Te imajo pred klasičnimi biološkimi vezji, ki so osnovana na podlagi proteinskih regulatorjev, kar nekaj prednosti, med njimi predvsem visoko modularnost in nizek genetski odtis [2]. Biološka vezja z RNA-napravami imajo širok spekter možnih aplikacij, med drugim bi se lahko uporabljala v diagnostične namene za zaznavo različnih RNA molekul [4,5].

== Literatura ==

[1] Cameron, D. E., Bashor, C. J. & Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. ''Nature Reviews Microbiology'' '''12''', 381–390 (2014).

[2] Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017).

[3] Andersen, J. B. ''et al.'' New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. ''Appl. Environ. Microbiol.'' '''64''', 2240–2246 (1998).

[4] Pardee, K. ''et al.'' Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. ''Cell'' '''165''', 1255–1266 (2016).

[5] Pardee, K. ''et al.'' Paper-based synthetic gene networks. ''Cell'' '''159''', 940–954 (2014).

Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami

2020-05-05T09:40:25Z

Peter Škrinjar:

''Povzeto po'': [https://www.nature.com/articles/nature23271 Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017)]

Sintezna biologija z vpeljavo inženirskih pristopov v biološke sisteme rešuje različne težave na področju biotehnologije in medicine. S pomočjo sintetičnih bioloških vezij so namreč znanstveniki sposobni ustvariti biološke naprave oz. sisteme, ki omogočajo najrazličnejše celične funkcije z uravnavanjem prisotnosti specifičnih komponent. Biološka vezja so večinoma osnovana na proteinskih regulatorjih, vendar jih je zaradi omejenega števila le-teh in specifičnih potreb takšnega vezja težavno nadgrajevati v bolj kompleksne sisteme, zato so se pojavile potrebe po alternativnih pristopih [1,2].

Eno izmed možnih rešitev predstavljajo biološka vezja na osnovi molekul RNA, ki posedujejo številne prednosti za uporabo v sintezni biologiji. Poleg visoke modularnosti in predvidljivega parjenja baz, s čimer je omogočeno učinkovito ''in silico'' načrtovanje molekul RNA, imajo takšna vezja tudi kolokalizirano senzorsko domeno z izhodnim signalom, s čimer se zmanjša izguba signala [2].

== Ribonukleinska biološka vezja ==

Pri bioloških vezjih, ki so sestavljena izključno iz molekul RNA, celotna regulacija poteka na posttranskripcijski ravni, kar zmanjša časovni zamik med sprožitvijo in zaznavo signala ter prav tako izboljša zanesljivost prenosa signala. Osrednjo komponento ribonukleinskih vezij predstavljajo vrata RNA, ki so sestavljena iz zaznavne domene in reporterskega gena. V članku, ki ga povzemam, je reporterski gen predstavljal zapis za zelen fluorescenčni protein z mutacijama S65G in S72A ter degradacijsko oznako ASV (GFPmut3b-ASV) [3], medtem ko zaznavno domeno vrat RNA predstavljajo stikala 'toehold'. Ta stikala tvorijo sekundarno strukturo lasnice, ki vsebuje ribosom vezavno mesto (RBS) in START kodon. Struktura lasnice onemogoča translacijo reporterskega gena, ki se omogoči šele po vezavi sprožilne molekule RNA, saj ta z vezavo na komplementarno zaporedje na stikalu 'toehold' poruši njegovo sekundarno strukturo. Vhodni signal torej tudi predstavljajo molekule RNA [2].

Na podlagi poznavanja interakcij med dušikovimi bazami je torej moč skonstruirati vhodne molekule RNA in vrata RNA tako, da se med seboj povezujejo na različne načine in s tem omogočajo izvrševanje logičnih operacij ALI, IN ter IN-NE, prav tako pa jih je možno združiti v kompleksnejša vezja.

== Logične operacije ==

Z natančnim ''in silico'' načrtovanjem konstruktov RNA je možno izvajanje različnih logičnih operacij z RNA-napravami. Večino poskusov s temi napravami so avtorji članka izvedli v celicah ''Escherichia coli'' seva BL21 Star DE3, ki vsebuje mutacijo v genu, ki zapisuje za RNazo E, zato so RNA molekule v celicah tega seva bolj stabilne. Zapisi za vrata RNA in vhodne molekule RNA so se večinoma nahajali pod T7 promotorjem, njihova transkripcija pa je bila inducirana z IPTG [2].

Pri izvedbi poskusa za logično operacijo IN-NE so bile uporabljene celice ''E. coli'' seva MG1655Pro. V tem primeru je bila transkripcija vrat RNA konstitutivna, saj se je zapis nahajal pod promotorjem proD, medtem ko je bila transkripcija sprožilne in deaktivirajoče molekule RNA inducirana z anhidrotetraciklinom (aTc) in IPTG [2].

Poskuse so izvedli v prisotnosti (1) in odsotnosti (0) posameznih sprožilnih molekul RNA ter pri tem merili nivo izhodne fluorescence s pretočno citometrijo. Na podlagi razmerja izhodne fluorescence so okarakterizirali izhodni signal kot VKLOP (1) ali IZKLOP (0) za posamezna logična vrata [2].

=== Logična vrata ALI ===

Pri logičnih vratih ALI dobimo izhodni signal VKLOP že v prisotnosti enega izmed ustreznih vhodnih signalov. To za celično računanje z RNA-napravami pomeni, da je potrebno vrata RNA za izvedbo te logične operacije načrtati tako, da poleg reporterskega gena vsebujejo stikalo 'toehold' za vsako posamezno sprožilno RNA. Delovanje takšnih logičnih vrat ALI je namreč možno zaradi sposobnosti ribosoma, da lahko, ko se enkrat veže na že aktivirano stikalo 'toehold', izvede translacijo tudi preko nerazvitih lasnic. Torej bo prišlo do translacije reporterskega gena tudi v primeru, ko bo prisotna le sprožilna RNA prvega stikala 'toehold' in bo drugo stikalo ostalo nerazvito. Zato je tudi pomembno, da so posamezna stikala in zapis za GFP v istem bralnem okvirju [2].

Najprej so delovanje logičnih vrat ALI (tabela 1) preverili na primeru dveh vhodnih signalov. Signala A in B sta predstavljala molekuli RNA, ki sta bili komplementarni zaporedjema A* in B* na stikalih 'toehold'. Kot nesprožilni molekuli RNA so uporabili signala X in Y. Tako so izvedli 4 poskuse v prisotnosti različnih kombinacij vhodnih molekul RNA [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 1:''' Pravilnostna tabela ALI.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A+Y</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>B+X</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A+B</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali najmanj 400-kratno povečanje signala ob prisotnosti vsaj ene izmed sprožilnih RNA v primerjavi z odsotnostjo obeh [2].

Nato so izvedli poskuse z ALI logičnimi vrati tudi na primeru večih (4, 5 in 6) vhodnih signalov. Pri povečevanju števila vhodnih signalov so opazili, da kljub močnemu GFP signalu za logično pravilno stanje, se ta znatno razlikuje med posameznimi sprožilnimi molekulami RNA. Opaziti je bilo namreč višji signal pri sprožilnih RNA, ki so se vezale na stikalo 'toehold' bližje reporterskemu genu, v primerjavi s tistimi, pri katerih se je stikalo 'toehold' z njihovim komplementarnim zaporedjem nahajalo dlje od reporterskega gena. Te variacije je moč pripisati vplivu nerazvitih lasnic na translacijo ribosoma. Prav tako je možno, da se razlika v jakosti signala pojavi zaradi dodanih aminokislinskih ostankov na N-koncu reporterskega proteina [2].

=== Logična vrata IN ===

Pri logičnih vratih IN z dvema vhodoma dobimo izhodni signal VKLOP le ob prisotnosti obeh ustreznih signalov. Za izvedbo takšne logične operacije je pri RNA vratih potrebno le eno stikalo 'toehold', ki pa mora omogočiti vezavo obeh sprožilnih RNA, zato je vezavno zaporedje na tem stikalu razdeljeno na dva dela, ki sta komplementarna posamezni sprožilni molekuli RNA. Prav tako so sprožilne RNA za uporabo pri logični operaciji IN razdeljene na dva dela. En del omogoča vezavo na stikalo 'toehold', medtem ko je drugi del zadolžen za vezavo na drugo sprožilno molekulo RNA. Tako se po transkripciji obe sprožilni molekuli RNA med seboj povežeta in se skupaj vežeta na stikalo, s čimer ga aktivirata in povzročita translacijo reporterskega gena [2].

Da se prepreči aktivacija stikala in translacija v prisotnosti le ene sprožilne RNA molekule, so stikala 'toehold' v logičnih vratih IN skonstuirana na način, da se po vezavi obeh sprožilnih RNA razvije le spodnji del RNA lasnice. Tako se po razvitju spodnjega debla lasnice RBS še vedno nahaja znotraj zanke, vendar je zaradi šibke vezave zgornjega dela debla omogočena vezava ribosoma in začetek translacije [2].

Delovanje logičnih RNA vrat IN (tabela 2) so najprej preizkusili na primeru dveh vhodnih signalov. Sprožilni molekuli RNA sta predstavljala signala A1 in A2, medtem ko so kot nekomplementarni molekuli RNA uporabili signala X in Y [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 2:''' Pravilnostna tabela IN.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A1</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A2</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A1+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A2+X</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A1+A2</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali 900-kratno povečanje signala ob prisotnosti obeh sprožilnih molekul v primerjavi z ostalimi tremi, logično nepravilnimi stanji [2].

Tako kot pri logični operaciji ALI so tudi z logičnim vrati IN izvedli poskuse z več (3, 4 in 5) vhodnimi signali. Pri teh poskusih se sprožilne molekule RNA med seboj povežejo v večje strukture, ki se nato skupaj vežejo na eno stikalo 'toehold'. Tudi pri poskusih z več vhodnimi signali se je pojavila znatna razlika v izhodni fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji [2].

=== Logična vrata IN-NE ===

Pri logičnih vratih IN-NE dobimo izhodni signal VKLOP le v primeru enega določenega vhodnega signala. Pri RNA-napravah je zato v primeru te logične operacije potrebno poleg sprožilne molekule RNA v sistem vpeljati tudi deaktivirajočo RNA, ki je komplementarna sprožilni RNA in bo s hibridizacijo preprečila vezavo sprožilne RNA na stikalo 'toehold'. Deaktivirajoča molekula RNA je zmožna, poleg vezave na prosto sprožilno RNA, tudi odstraniti že vezano sprožilno RNA s stikala, saj ima ta na 5'- in 3'-koncu podaljšani domeni, ki ne tvorita interakcij s stikalom in sta namenjeni tvorbi interakcij z deaktivirajočo RNA [2].

Pri izvedbi poskusa z logičnimi vrati IN-NE (tabela 3) so transkripcijo sprožilne RNA (vhodni signal A) inducirali z anhidrotetraciklinom (aTc), medtem ko so transkripcijo deaktivirajoče RNA (vhodni signal B) sprožili z IPTG [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 3:''' Pravilnostna tabela IN-NE.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A (aTc)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B (IPTG)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
</table>
</center>

GFP fluorescenca je pokazala znatno razliko med logično pravilnim in nepravilnimi stanji [2].

=== Kompleksne logične operacije ===

V članku so prav tako sestavili kompleksnejša biološka vezja z RNA-napravami, ki so kombinirale logične operacije NE, IN ter ALI. Najkompleksnejše vezje, ki so ga konstruirali, je vsebovalo 12 vhodnih RNA signalov in je pri poskuskih ''in vivo'' delovalo robustno ter kazalo znatne razlike v fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji. Ta računska operacija je bila:

<center>(A1 IN A2 IN (NE A1*)) ALI (B1 IN B2 IN (NE B1*)) ALI (C1 IN C2) ALI (D1 IN D2) ALI (E1 IN E2),</center>

kjer molekuli A1* in B1* predstavljata komplementarni zaporedji molekulama A1 in B1 [2].

== Zaključek ==

Omenjeni poskusi nakazujejo na to, da lahko funkcionalno kompleksno biološko vezje tvorimo tudi z uporabo RNA-naprav. Te imajo pred klasičnimi biološkimi vezji, ki so osnovana na podlagi proteinskih regulatorjev, kar nekaj prednosti, med njimi predvsem visoko modularnost in nizek genetski odtis [2]. Biološka vezja z RNA-napravami imajo širok spekter možnih aplikacij, med drugim bi se lahko uporabljala v diagnostične namene za zaznavo različnih RNA molekul [4,5].

== Literatura ==

[1] Cameron, D. E., Bashor, C. J. & Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. ''Nature Reviews Microbiology'' '''12''', 381–390 (2014).

[2] Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017).

[3] Andersen, J. B. ''et al.'' New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. ''Appl. Environ. Microbiol.'' '''64''', 2240–2246 (1998).

[4] Pardee, K. ''et al.'' Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. ''Cell'' '''165''', 1255–1266 (2016).

[5] Pardee, K. ''et al.'' Paper-based synthetic gene networks. ''Cell'' '''159''', 940–954 (2014).

Kompleksno celično računanje z RNA-napravami

2020-05-04T09:46:48Z

Peter Škrinjar:

''Povzeto po'': [https://www.nature.com/articles/nature23271 Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017)]

Sintezna biologija z vpeljavo inženirskih pristopov v biološke sisteme rešuje različne težave na področju biotehnologije in medicine. S pomočjo sintetičnih bioloških vezij so namreč znanstveniki sposobni ustvariti biološke naprave oz. sisteme, ki omogočajo najrazličnejše celične funkcije z uravnavanjem prisotnosti specifičnih komponent. Biološka vezja so večinoma osnovana na proteinskih regulatorjih, vendar jih je zaradi omejenega števila le-teh in specifičnih potreb takšnega vezja težavno nadgrajevati v bolj kompleksne sisteme, zato so se pojavile potrebe po alternativnih pristopih [1,2].

Eno izmed možnih rešitev predstavljajo biološka vezja na osnovi molekul RNA, ki posedujejo številne prednosti za uporabo v sintezni biologiji. Poleg visoke modularnosti in predvidljivega parjenja baz, s čimer je omogočeno učinkovito ''in silico'' načrtovanje molekul RNA, imajo takšna vezja tudi kolokalizirano senzorsko domeno z izhodnim signalom, s čimer se zmanjša izguba signala [2].

== Ribonukleinska biološka vezja ==

Pri bioloških vezjih, ki so sestavljena izključno iz molekul RNA, celotna regulacija poteka na posttranskripcijski ravni, kar zmanjša časovni zamik med sprožitvijo in zaznavo signala ter prav tako izboljša zanesljivost prenosa signala. Osrednjo komponento ribonukleinskih vezij predstavljajo vrata RNA, ki so sestavljena iz zaznavne domene in reporterskega gena. V članku, ki ga povzemam, je reporterski gen predstavljal zapis za zelen fluorescirajoči protein z mutacijama S65G in S72A ter degradacijsko oznako ASV (GFPmut3b-ASV) [3], medtem ko zaznavno domeno vrat RNA predstavljajo stikala 'toehold'. Ta stikala tvorijo sekundarno strukturo lasnice, ki vsebuje ribosom vezavno mesto (RBS) in START kodon. Struktura lasnice onemogoča translacijo reporterskega gena, ki se omogoči šele po vezavi sprožilne molekule RNA, saj ta z vezavo na komplementarno zaporedje na stikalu 'toehold' poruši njegovo sekundarno strukturo. Vhodni signal torej tudi predstavljajo molekule RNA [2].

Na podlagi poznavanja interakcij med dušikovimi bazami je torej moč skonstruirati vhodne molekule RNA in vrata RNA tako, da se med seboj povezujejo na različne načine in s tem omogočajo izvrševanje logičnih operacij ALI, IN ter IN-NE, prav tako pa jih je možno združiti v kompleksnejša vezja.

== Logične operacije ==

Z natančnim ''in silico'' načrtovanjem konstruktov RNA je možno izvajanje različnih logičnih operacij z RNA-napravami. Večino poskusov s temi napravami so avtorji članka izvedli v celicah ''Escherichia coli'' seva BL21 Star DE3, ki vsebuje mutacijo v genu, ki zapisuje za RNazo E, zato so RNA molekule v celicah tega seva bolj stabilne. Zapisi za vrata RNA in vhodne molekule RNA so se večinoma nahajali pod T7 promotorjem, njihova transkripcija pa je bila inducirana z IPTG [2].

Pri izvedbi poskusa za logično operacijo IN-NE so bile uporabljene celice ''E. coli'' seva MG1655Pro. V tem primeru je bila transkripcija vrat RNA konstitutivna, saj se je zapis nahajal pod promotorjem proD, medtem ko je bila transkripcija sprožilne in deaktivirajoče molekule RNA inducirana z anhidrotetraciklinom (aTc) in IPTG [2].

Poskuse so izvedli v prisotnosti (1) in odsotnosti (0) posameznih sprožilnih molekul RNA ter pri tem merili nivo izhodne fluorescence s pretočno citometrijo. Na podlagi razmerja izhodne fluorescence so okarakterizirali izhodni signal kot VKLOP (1) ali IZKLOP (0) za posamezna logična vrata [2].

=== Logična vrata ALI ===

Pri logičnih vratih ALI dobimo izhodni signal VKLOP že v prisotnosti enega izmed ustreznih vhodnih signalov. To za celično računanje z RNA-napravami pomeni, da je potrebno vrata RNA za izvedbo te logične operacije načrtati tako, da poleg reporterskega gena vsebujejo stikalo 'toehold' za vsako posamezno sprožilno RNA. Delovanje takšnih logičnih vrat ALI je namreč možno zaradi sposobnosti ribosoma, da lahko, ko se enkrat veže na že aktivirano stikalo 'toehold', izvede translacijo tudi preko nerazvitih lasnic. Torej bo prišlo do translacije reporterskega gena tudi v primeru, ko bo prisotna le sprožilna RNA prvega stikala 'toehold' in bo drugo stikalo ostalo nerazvito. Zato je tudi pomembno, da so posamezna stikala in zapis za GFP v istem bralnem okvirju [2].

Najprej so delovanje logičnih vrat ALI (tabela 1) preverili na primeru dveh vhodnih signalov. Signala A in B sta predstavljala molekuli RNA, ki sta bili komplementarni zaporedjema A* in B* na stikalih 'toehold'. Kot nesprožilni molekuli RNA so uporabili signala X in Y. Tako so izvedli 4 poskuse v prisotnosti različnih kombinacij vhodnih molekul RNA [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 1:''' Pravilnostna tabela ALI.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A+Y</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>B+X</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A+B</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali najmanj 400-kratno povečanje signala ob prisotnosti vsaj ene izmed sprožilnih RNA v primerjavi z odsotnostjo obeh [2].

Nato so izvedli poskuse z ALI logičnimi vrati tudi na primeru večih (4, 5 in 6) vhodnih signalov. Pri povečevanju števila vhodnih signalov so opazili, da kljub močnemu GFP signalu za logično pravilno stanje, se ta znatno razlikuje med posameznimi sprožilnimi molekulami RNA. Opaziti je bilo namreč višji signal pri sprožilnih RNA, ki so se vezale na stikalo 'toehold' bližje reporterskemu genu, v primerjavi s tistimi, pri katerih se je stikalo 'toehold' z njihovim komplementarnim zaporedjem nahajalo dlje od reporterskega gena. Te variacije je moč pripisati vplivu nerazvitih lasnic na translacijo ribosoma. Prav tako je možno, da se razlika v jakosti signala pojavi zaradi dodanih aminokislinskih ostankov na N-koncu reporterskega proteina [2].

=== Logična vrata IN ===

Pri logičnih vratih IN z dvema vhodoma dobimo izhodni signal VKLOP le ob prisotnosti obeh ustreznih signalov. Za izvedbo takšne logične operacije je pri RNA vratih potrebno le eno stikalo 'toehold', ki pa mora omogočiti vezavo obeh sprožilnih RNA, zato je vezavno zaporedje na tem stikalu razdeljeno na dva dela, ki sta komplementarna posamezni sprožilni molekuli RNA. Prav tako so sprožilne RNA za uporabo pri logični operaciji IN razdeljene na dva dela. En del omogoča vezavo na stikalo 'toehold', medtem ko je drugi del zadolžen za vezavo na drugo sprožilno molekulo RNA. Tako se po transkripciji obe sprožilni molekuli RNA med seboj povežeta in se skupaj vežeta na stikalo, s čimer ga aktivirata in povzročita translacijo reporterskega gena [2].

Da se prepreči aktivacija stikala in translacija v prisotnosti le ene sprožilne RNA molekule, so stikala 'toehold' v logičnih vratih IN skonstuirana na način, da se po vezavi obeh sprožilnih RNA razvije le spodnji del RNA lasnice. Tako se po razvitju spodnjega debla lasnice RBS še vedno nahaja znotraj zanke, vendar je zaradi šibke vezave zgornjega dela debla omogočena vezava ribosoma in začetek translacije [2].

Delovanje logičnih RNA vrat IN (tabela 2) so najprej preizkusili na primeru dveh vhodnih signalov. Sprožilni molekuli RNA sta predstavljala signala A1 in A2, medtem ko so kot nekomplementarni molekuli RNA uporabili signala X in Y [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 2:''' Pravilnostna tabela IN.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A1</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A2</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A1+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A2+X</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A1+A2</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali 900-kratno povečanje signala ob prisotnosti obeh sprožilnih molekul v primerjavi z ostalimi tremi, logično nepravilnimi stanji [2].

Tako kot pri logični operaciji ALI so tudi z logičnim vrati IN izvedli poskuse z več (3, 4 in 5) vhodnimi signali. Pri teh poskusih se sprožilne molekule RNA med seboj povežejo v večje strukture, ki se nato skupaj vežejo na eno stikalo 'toehold'. Tudi pri poskusih z več vhodnimi signali se je pojavila znatna razlika v izhodni fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji [2].

=== Logična vrata IN-NE ===

Pri logičnih vratih IN-NE dobimo izhodni signal VKLOP le v primeru enega določenega vhodnega signala. Pri RNA-napravah je zato v primeru te logične operacije potrebno poleg sprožilne molekule RNA v sistem vpeljati tudi deaktivirajočo RNA, ki je komplementarna sprožilni RNA in bo s hibridizacijo preprečila vezavo sprožilne RNA na stikalo 'toehold'. Deaktivirajoča molekula RNA je zmožna, poleg vezave na prosto sprožilno RNA, tudi odstraniti že vezano sprožilno RNA s stikala, saj ima ta na 5'- in 3'-koncu podaljšani domeni, ki ne tvorita interakcij s stikalom in sta namenjeni tvorbi interakcij z deaktivirajočo RNA [2].

Pri izvedbi poskusa z logičnimi vrati IN-NE (tabela 3) so transkripcijo sprožilne RNA (vhodni signal A) inducirali z anhidrotetraciklinom (aTc), medtem ko so transkripcijo deaktivirajoče RNA (vhodni signal B) sprožili z IPTG [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 3:''' Pravilnostna tabela IN-NE.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A (aTc)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B (IPTG)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
</table>
</center>

GFP fluorescenca je pokazala znatno razliko med logično pravilnim in nepravilnimi stanji [2].

=== Kompleksne logične operacije ===

V članku so prav tako sestavili kompleksnejša biološka vezja z RNA-napravami, ki so kombinirale logične operacije NE, IN ter ALI. Najkompleksnejše vezje, ki so ga konstruirali, je vsebovalo 12 vhodnih RNA signalov in je pri poskuskih ''in vivo'' delovalo robustno ter kazalo znatne razlike v fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji. Ta računska operacija je bila:

<center>(A1 IN A2 IN (NE A1*)) ALI (B1 IN B2 IN (NE B1*)) ALI (C1 IN C2) ALI (D1 IN D2) ALI (E1 IN E2),</center>

kjer molekuli A1* in B1* predstavljata komplementarni zaporedji molekulama A1 in B1 [2].

== Zaključek ==

Omenjeni poskusi nakazujejo na to, da lahko funkcionalno kompleksno biološko vezje tvorimo tudi z uporabo RNA-naprav. Te imajo pred klasičnimi biološkimi vezji, ki so osnovana na podlagi proteinskih regulatorjev, kar nekaj prednosti, med njimi predvsem visoko modularnost in nizek genetski odtis [2]. Biološka vezja z RNA-napravami imajo širok spekter možnih aplikacij, med drugim bi se lahko uporabljala v diagnostične namene za zaznavo različnih RNA molekul [4,5].

== Literatura ==

[1] Cameron, D. E., Bashor, C. J. & Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. ''Nature Reviews Microbiology'' '''12''', 381–390 (2014).

[2] Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017).

[3] Andersen, J. B. ''et al.'' New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. ''Appl. Environ. Microbiol.'' '''64''', 2240–2246 (1998).

[4] Pardee, K. ''et al.'' Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. ''Cell'' '''165''', 1255–1266 (2016).

[5] Pardee, K. ''et al.'' Paper-based synthetic gene networks. ''Cell'' '''159''', 940–954 (2014).

Kompleksno celično računanje z RNA-napravami

2020-05-04T09:44:54Z

Peter Škrinjar: Removing all content from page

Seminarji SB 2019/20

2020-05-04T09:42:27Z

Peter Škrinjar:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_brezcelično_sintezno_biologijo_na_osnovi_E.coli Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''] (Ajda Lenardič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Engineering_Customized_Cell_Sensing_and_Response_Behaviors_Using_Synthetic_Notch_Receptors Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors] (Jelena Štrbac) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kompleksno_celi%C4%8Dno_logi%C4%8Dno_ra%C4%8Dunanje_z_RNA-napravami Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami] (Peter Škrinjar) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Kompleksno celično računanje z RNA-napravami

2020-05-04T09:36:25Z

Peter Škrinjar: Kompleksno celično računanje z RNA-napravami moved to Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami

#REDIRECT [[Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami]]

Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami

2020-05-04T09:36:25Z

Peter Škrinjar: Kompleksno celično računanje z RNA-napravami moved to Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami

''Povzeto po'': [https://www.nature.com/articles/nature23271 Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017)]

Sintezna biologija z vpeljavo inženirskih pristopov v biološke sisteme rešuje različne težave na področju biotehnologije in medicine. S pomočjo sintetičnih bioloških vezij so namreč znanstveniki sposobni ustvariti biološke naprave oz. sisteme, ki omogočajo najrazličnejše celične funkcije z uravnavanjem prisotnosti specifičnih komponent. Biološka vezja so večinoma osnovana na proteinskih regulatorjih, vendar jih je zaradi omejenega števila le-teh in specifičnih potreb takšnega vezja težavno nadgrajevati v bolj kompleksne sisteme, zato so se pojavile potrebe po alternativnih pristopih [1,2].

Eno izmed možnih rešitev predstavljajo biološka vezja na osnovi molekul RNA, ki posedujejo številne prednosti za uporabo v sintezni biologiji. Poleg visoke modularnosti in predvidljivega parjenja baz, s čimer je omogočeno učinkovito ''in silico'' načrtovanje molekul RNA, imajo takšna vezja tudi kolokalizirano senzorsko domeno z izhodnim signalom, s čimer se zmanjša izguba signala [2].

== Ribonukleinska biološka vezja ==

Pri bioloških vezjih, ki so sestavljena izključno iz molekul RNA, celotna regulacija poteka na posttranskripcijski ravni, kar zmanjša časovni zamik med sprožitvijo in zaznavo signala ter prav tako izboljša zanesljivost prenosa signala. Osrednjo komponento ribonukleinskih vezij predstavljajo vrata RNA, ki so sestavljena iz zaznavne domene in reporterskega gena. V članku, ki ga povzemam, je reporterski gen predstavljal zapis za zelen fluorescirajoči protein z mutacijama S65G in S72A ter degradacijsko oznako ASV (GFPmut3b-ASV) [3], medtem ko zaznavno domeno vrat RNA predstavljajo stikala 'toehold'. Ta stikala tvorijo sekundarno strukturo lasnice, ki vsebuje ribosom vezavno mesto (RBS) in START kodon. Struktura lasnice onemogoča translacijo reporterskega gena, ki se omogoči šele po vezavi sprožilne molekule RNA, saj ta z vezavo na komplementarno zaporedje na stikalu 'toehold' poruši njegovo sekundarno strukturo. Vhodni signal torej tudi predstavljajo molekule RNA [2].

Na podlagi poznavanja interakcij med dušikovimi bazami je torej moč skonstruirati vhodne molekule RNA in vrata RNA tako, da se med seboj povezujejo na različne načine in s tem omogočajo izvrševanje logičnih operacij ALI, IN ter IN-NE, prav tako pa jih je možno združiti v kompleksnejša vezja.

== Logične operacije ==

Z natančnim ''in silico'' načrtovanjem konstruktov RNA je možno izvajanje različnih logičnih operacij z RNA-napravami. Večino poskusov s temi napravami so avtorji članka izvedli v celicah ''Escherichia coli'' seva BL21 Star DE3, ki vsebuje mutacijo v genu, ki zapisuje za RNazo E, zato so RNA molekule v celicah tega seva bolj stabilne. Zapisi za vrata RNA in vhodne molekule RNA so se večinoma nahajali pod T7 promotorjem, njihova transkripcija pa je bila inducirana z IPTG [2].

Pri izvedbi poskusa za logično operacijo IN-NE so bile uporabljene celice ''E. coli'' seva MG1655Pro. V tem primeru je bila transkripcija vrat RNA konstitutivna, saj se je zapis nahajal pod promotorjem proD, medtem ko je bila transkripcija sprožilne in deaktivirajoče molekule RNA inducirana z anhidrotetraciklinom (aTc) in IPTG [2].

Poskuse so izvedli v prisotnosti (1) in odsotnosti (0) posameznih sprožilnih molekul RNA ter pri tem merili nivo izhodne fluorescence s pretočno citometrijo. Na podlagi razmerja izhodne fluorescence so okarakterizirali izhodni signal kot VKLOP (1) ali IZKLOP (0) za posamezna logična vrata [2].

=== Logična vrata ALI ===

Pri logičnih vratih ALI dobimo izhodni signal VKLOP že v prisotnosti enega izmed ustreznih vhodnih signalov. To za celično računanje z RNA-napravami pomeni, da je potrebno vrata RNA za izvedbo te logične operacije načrtati tako, da poleg reporterskega gena vsebujejo stikalo 'toehold' za vsako posamezno sprožilno RNA. Delovanje takšnih logičnih vrat ALI je namreč možno zaradi sposobnosti ribosoma, da lahko, ko se enkrat veže na že aktivirano stikalo 'toehold', izvede translacijo tudi preko nerazvitih lasnic. Torej bo prišlo do translacije reporterskega gena tudi v primeru, ko bo prisotna le sprožilna RNA prvega stikala 'toehold' in bo drugo stikalo ostalo nerazvito. Zato je tudi pomembno, da so posamezna stikala in zapis za GFP v istem bralnem okvirju [2].

Najprej so delovanje logičnih vrat ALI (tabela 1) preverili na primeru dveh vhodnih signalov. Signala A in B sta predstavljala molekuli RNA, ki sta bili komplementarni zaporedjema A* in B* na stikalih 'toehold'. Kot nesprožilni molekuli RNA so uporabili signala X in Y. Tako so izvedli 4 poskuse v prisotnosti različnih kombinacij vhodnih molekul RNA [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 1:''' Pravilnostna tabela ALI.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A+Y</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>B+X</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A+B</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali najmanj 400-kratno povečanje signala ob prisotnosti vsaj ene izmed sprožilnih RNA v primerjavi z odsotnostjo obeh [2].

Nato so izvedli poskuse z ALI logičnimi vrati tudi na primeru večih (4, 5 in 6) vhodnih signalov. Pri povečevanju števila vhodnih signalov so opazili, da kljub močnemu GFP signalu za logično pravilno stanje, se ta znatno razlikuje med posameznimi sprožilnimi molekulami RNA. Opaziti je bilo namreč višji signal pri sprožilnih RNA, ki so se vezale na stikalo 'toehold' bližje reporterskemu genu, v primerjavi s tistimi, pri katerih se je stikalo 'toehold' z njihovim komplementarnim zaporedjem nahajalo dlje od reporterskega gena. Te variacije je moč pripisati vplivu nerazvitih lasnic na translacijo ribosoma. Prav tako je možno, da se razlika v jakosti signala pojavi zaradi dodanih aminokislinskih ostankov na N-koncu reporterskega proteina [2].

=== Logična vrata IN ===

Pri logičnih vratih IN z dvema vhodoma dobimo izhodni signal VKLOP le ob prisotnosti obeh ustreznih signalov. Za izvedbo takšne logične operacije je pri RNA vratih potrebno le eno stikalo 'toehold', ki pa mora omogočiti vezavo obeh sprožilnih RNA, zato je vezavno zaporedje na tem stikalu razdeljeno na dva dela, ki sta komplementarna posamezni sprožilni molekuli RNA. Prav tako so sprožilne RNA za uporabo pri logični operaciji IN razdeljene na dva dela. En del omogoča vezavo na stikalo 'toehold', medtem ko je drugi del zadolžen za vezavo na drugo sprožilno molekulo RNA. Tako se po transkripciji obe sprožilni molekuli RNA med seboj povežeta in se skupaj vežeta na stikalo, s čimer ga aktivirata in povzročita translacijo reporterskega gena [2].

Da se prepreči aktivacija stikala in translacija v prisotnosti le ene sprožilne RNA molekule, so stikala 'toehold' v logičnih vratih IN skonstuirana na način, da se po vezavi obeh sprožilnih RNA razvije le spodnji del RNA lasnice. Tako se po razvitju spodnjega debla lasnice RBS še vedno nahaja znotraj zanke, vendar je zaradi šibke vezave zgornjega dela debla omogočena vezava ribosoma in začetek translacije [2].

Delovanje logičnih RNA vrat IN (tabela 2) so najprej preizkusili na primeru dveh vhodnih signalov. Sprožilni molekuli RNA sta predstavljala signala A1 in A2, medtem ko so kot nekomplementarni molekuli RNA uporabili signala X in Y [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 2:''' Pravilnostna tabela IN.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A1</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A2</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A1+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A2+X</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A1+A2</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali 900-kratno povečanje signala ob prisotnosti obeh sprožilnih molekul v primerjavi z ostalimi tremi, logično nepravilnimi stanji [2].

Tako kot pri logični operaciji ALI so tudi z logičnim vrati IN izvedli poskuse z več (3, 4 in 5) vhodnimi signali. Pri teh poskusih se sprožilne molekule RNA med seboj povežejo v večje strukture, ki se nato skupaj vežejo na eno stikalo 'toehold'. Tudi pri poskusih z več vhodnimi signali se je pojavila znatna razlika v izhodni fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji [2].

=== Logična vrata IN-NE ===

Pri logičnih vratih IN-NE dobimo izhodni signal VKLOP le v primeru enega določenega vhodnega signala. Pri RNA-napravah je zato v primeru te logične operacije potrebno poleg sprožilne molekule RNA v sistem vpeljati tudi deaktivirajočo RNA, ki je komplementarna sprožilni RNA in bo s hibridizacijo preprečila vezavo sprožilne RNA na stikalo 'toehold'. Deaktivirajoča molekula RNA je zmožna, poleg vezave na prosto sprožilno RNA, tudi odstraniti že vezano sprožilno RNA s stikala, saj ima ta na 5'- in 3'-koncu podaljšani domeni, ki ne tvorita interakcij s stikalom in sta namenjeni tvorbi interakcij z deaktivirajočo RNA [2].

Pri izvedbi poskusa z logičnimi vrati IN-NE (tabela 3) so transkripcijo sprožilne RNA (vhodni signal A) inducirali z anhidrotetraciklinom (aTc), medtem ko so transkripcijo deaktivirajoče RNA (vhodni signal B) sprožili z IPTG [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 3:''' Pravilnostna tabela IN-NE.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A (aTc)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B (IPTG)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
</table>
</center>

GFP fluorescenca je pokazala znatno razliko med logično pravilnim in nepravilnimi stanji [2].

=== Kompleksne logične operacije ===

V članku so prav tako sestavili kompleksnejša biološka vezja z RNA-napravami, ki so kombinirale logične operacije NE, IN ter ALI. Najkompleksnejše vezje, ki so ga konstruirali, je vsebovalo 12 vhodnih RNA signalov in je pri poskuskih ''in vivo'' delovalo robustno ter kazalo znatne razlike v fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji. Ta računska operacija je bila:

<center>(A1 IN A2 IN (NE A1*)) ALI (B1 IN B2 IN (NE B1*)) ALI (C1 IN C2) ALI (D1 IN D2) ALI (E1 IN E2),</center>

kjer molekuli A1* in B1* predstavljata komplementarni zaporedji molekulama A1 in B1 [2].

== Zaključek ==

Omenjeni poskusi nakazujejo na to, da lahko funkcionalno kompleksno biološko vezje tvorimo tudi z uporabo RNA-naprav. Te imajo pred klasičnimi biološkimi vezji, ki so osnovana na podlagi proteinskih regulatorjev, kar nekaj prednosti, med njimi predvsem visoko modularnost in nizek genetski odtis [2]. Biološka vezja z RNA-napravami imajo širok spekter možnih aplikacij, med drugim bi se lahko uporabljala v diagnostične namene za zaznavo različnih RNA molekul [4,5].

== Literatura ==

[1] Cameron, D. E., Bashor, C. J. & Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. ''Nature Reviews Microbiology'' '''12''', 381–390 (2014).

[2] Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017).

[3] Andersen, J. B. ''et al.'' New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. ''Appl. Environ. Microbiol.'' '''64''', 2240–2246 (1998).

[4] Pardee, K. ''et al.'' Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. ''Cell'' '''165''', 1255–1266 (2016).

[5] Pardee, K. ''et al.'' Paper-based synthetic gene networks. ''Cell'' '''159''', 940–954 (2014).

Seminarji SB 2019/20

2020-05-04T09:34:31Z

Peter Škrinjar:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_brezcelično_sintezno_biologijo_na_osnovi_E.coli Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''] (Ajda Lenardič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Engineering_Customized_Cell_Sensing_and_Response_Behaviors_Using_Synthetic_Notch_Receptors Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors] (Jelena Štrbac) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kompleksno_celi%C4%8Dno_ra%C4%8Dunanje_z_RNA-napravami Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami] (Peter Škrinjar) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami

2020-05-04T09:30:04Z

Peter Škrinjar: New page: ''Povzeto po'': [https://www.nature.com/articles/nature23271 Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017)]...

''Povzeto po'': [https://www.nature.com/articles/nature23271 Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017)]

Sintezna biologija z vpeljavo inženirskih pristopov v biološke sisteme rešuje različne težave na področju biotehnologije in medicine. S pomočjo sintetičnih bioloških vezij so namreč znanstveniki sposobni ustvariti biološke naprave oz. sisteme, ki omogočajo najrazličnejše celične funkcije z uravnavanjem prisotnosti specifičnih komponent. Biološka vezja so večinoma osnovana na proteinskih regulatorjih, vendar jih je zaradi omejenega števila le-teh in specifičnih potreb takšnega vezja težavno nadgrajevati v bolj kompleksne sisteme, zato so se pojavile potrebe po alternativnih pristopih [1,2].

Eno izmed možnih rešitev predstavljajo biološka vezja na osnovi molekul RNA, ki posedujejo številne prednosti za uporabo v sintezni biologiji. Poleg visoke modularnosti in predvidljivega parjenja baz, s čimer je omogočeno učinkovito ''in silico'' načrtovanje molekul RNA, imajo takšna vezja tudi kolokalizirano senzorsko domeno z izhodnim signalom, s čimer se zmanjša izguba signala [2].

== Ribonukleinska biološka vezja ==

Pri bioloških vezjih, ki so sestavljena izključno iz molekul RNA, celotna regulacija poteka na posttranskripcijski ravni, kar zmanjša časovni zamik med sprožitvijo in zaznavo signala ter prav tako izboljša zanesljivost prenosa signala. Osrednjo komponento ribonukleinskih vezij predstavljajo vrata RNA, ki so sestavljena iz zaznavne domene in reporterskega gena. V članku, ki ga povzemam, je reporterski gen predstavljal zapis za zelen fluorescirajoči protein z mutacijama S65G in S72A ter degradacijsko oznako ASV (GFPmut3b-ASV) [3], medtem ko zaznavno domeno vrat RNA predstavljajo stikala 'toehold'. Ta stikala tvorijo sekundarno strukturo lasnice, ki vsebuje ribosom vezavno mesto (RBS) in START kodon. Struktura lasnice onemogoča translacijo reporterskega gena, ki se omogoči šele po vezavi sprožilne molekule RNA, saj ta z vezavo na komplementarno zaporedje na stikalu 'toehold' poruši njegovo sekundarno strukturo. Vhodni signal torej tudi predstavljajo molekule RNA [2].

Na podlagi poznavanja interakcij med dušikovimi bazami je torej moč skonstruirati vhodne molekule RNA in vrata RNA tako, da se med seboj povezujejo na različne načine in s tem omogočajo izvrševanje logičnih operacij ALI, IN ter IN-NE, prav tako pa jih je možno združiti v kompleksnejša vezja.

== Logične operacije ==

Z natančnim ''in silico'' načrtovanjem konstruktov RNA je možno izvajanje različnih logičnih operacij z RNA-napravami. Večino poskusov s temi napravami so avtorji članka izvedli v celicah ''Escherichia coli'' seva BL21 Star DE3, ki vsebuje mutacijo v genu, ki zapisuje za RNazo E, zato so RNA molekule v celicah tega seva bolj stabilne. Zapisi za vrata RNA in vhodne molekule RNA so se večinoma nahajali pod T7 promotorjem, njihova transkripcija pa je bila inducirana z IPTG [2].

Pri izvedbi poskusa za logično operacijo IN-NE so bile uporabljene celice ''E. coli'' seva MG1655Pro. V tem primeru je bila transkripcija vrat RNA konstitutivna, saj se je zapis nahajal pod promotorjem proD, medtem ko je bila transkripcija sprožilne in deaktivirajoče molekule RNA inducirana z anhidrotetraciklinom (aTc) in IPTG [2].

Poskuse so izvedli v prisotnosti (1) in odsotnosti (0) posameznih sprožilnih molekul RNA ter pri tem merili nivo izhodne fluorescence s pretočno citometrijo. Na podlagi razmerja izhodne fluorescence so okarakterizirali izhodni signal kot VKLOP (1) ali IZKLOP (0) za posamezna logična vrata [2].

=== Logična vrata ALI ===

Pri logičnih vratih ALI dobimo izhodni signal VKLOP že v prisotnosti enega izmed ustreznih vhodnih signalov. To za celično računanje z RNA-napravami pomeni, da je potrebno vrata RNA za izvedbo te logične operacije načrtati tako, da poleg reporterskega gena vsebujejo stikalo 'toehold' za vsako posamezno sprožilno RNA. Delovanje takšnih logičnih vrat ALI je namreč možno zaradi sposobnosti ribosoma, da lahko, ko se enkrat veže na že aktivirano stikalo 'toehold', izvede translacijo tudi preko nerazvitih lasnic. Torej bo prišlo do translacije reporterskega gena tudi v primeru, ko bo prisotna le sprožilna RNA prvega stikala 'toehold' in bo drugo stikalo ostalo nerazvito. Zato je tudi pomembno, da so posamezna stikala in zapis za GFP v istem bralnem okvirju [2].

Najprej so delovanje logičnih vrat ALI (tabela 1) preverili na primeru dveh vhodnih signalov. Signala A in B sta predstavljala molekuli RNA, ki sta bili komplementarni zaporedjema A* in B* na stikalih 'toehold'. Kot nesprožilni molekuli RNA so uporabili signala X in Y. Tako so izvedli 4 poskuse v prisotnosti različnih kombinacij vhodnih molekul RNA [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 1:''' Pravilnostna tabela ALI.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A+Y</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>B+X</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A+B</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali najmanj 400-kratno povečanje signala ob prisotnosti vsaj ene izmed sprožilnih RNA v primerjavi z odsotnostjo obeh [2].

Nato so izvedli poskuse z ALI logičnimi vrati tudi na primeru večih (4, 5 in 6) vhodnih signalov. Pri povečevanju števila vhodnih signalov so opazili, da kljub močnemu GFP signalu za logično pravilno stanje, se ta znatno razlikuje med posameznimi sprožilnimi molekulami RNA. Opaziti je bilo namreč višji signal pri sprožilnih RNA, ki so se vezale na stikalo 'toehold' bližje reporterskemu genu, v primerjavi s tistimi, pri katerih se je stikalo 'toehold' z njihovim komplementarnim zaporedjem nahajalo dlje od reporterskega gena. Te variacije je moč pripisati vplivu nerazvitih lasnic na translacijo ribosoma. Prav tako je možno, da se razlika v jakosti signala pojavi zaradi dodanih aminokislinskih ostankov na N-koncu reporterskega proteina [2].

=== Logična vrata IN ===

Pri logičnih vratih IN z dvema vhodoma dobimo izhodni signal VKLOP le ob prisotnosti obeh ustreznih signalov. Za izvedbo takšne logične operacije je pri RNA vratih potrebno le eno stikalo 'toehold', ki pa mora omogočiti vezavo obeh sprožilnih RNA, zato je vezavno zaporedje na tem stikalu razdeljeno na dva dela, ki sta komplementarna posamezni sprožilni molekuli RNA. Prav tako so sprožilne RNA za uporabo pri logični operaciji IN razdeljene na dva dela. En del omogoča vezavo na stikalo 'toehold', medtem ko je drugi del zadolžen za vezavo na drugo sprožilno molekulo RNA. Tako se po transkripciji obe sprožilni molekuli RNA med seboj povežeta in se skupaj vežeta na stikalo, s čimer ga aktivirata in povzročita translacijo reporterskega gena [2].

Da se prepreči aktivacija stikala in translacija v prisotnosti le ene sprožilne RNA molekule, so stikala 'toehold' v logičnih vratih IN skonstuirana na način, da se po vezavi obeh sprožilnih RNA razvije le spodnji del RNA lasnice. Tako se po razvitju spodnjega debla lasnice RBS še vedno nahaja znotraj zanke, vendar je zaradi šibke vezave zgornjega dela debla omogočena vezava ribosoma in začetek translacije [2].

Delovanje logičnih RNA vrat IN (tabela 2) so najprej preizkusili na primeru dveh vhodnih signalov. Sprožilni molekuli RNA sta predstavljala signala A1 in A2, medtem ko so kot nekomplementarni molekuli RNA uporabili signala X in Y [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 2:''' Pravilnostna tabela IN.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A1</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A2</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>kombinacija RNA molekul</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>X+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>A1+Y</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A2+X</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>A1+A2</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
</table>
</center>

Rezultati so pokazali 900-kratno povečanje signala ob prisotnosti obeh sprožilnih molekul v primerjavi z ostalimi tremi, logično nepravilnimi stanji [2].

Tako kot pri logični operaciji ALI so tudi z logičnim vrati IN izvedli poskuse z več (3, 4 in 5) vhodnimi signali. Pri teh poskusih se sprožilne molekule RNA med seboj povežejo v večje strukture, ki se nato skupaj vežejo na eno stikalo 'toehold'. Tudi pri poskusih z več vhodnimi signali se je pojavila znatna razlika v izhodni fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji [2].

=== Logična vrata IN-NE ===

Pri logičnih vratih IN-NE dobimo izhodni signal VKLOP le v primeru enega določenega vhodnega signala. Pri RNA-napravah je zato v primeru te logične operacije potrebno poleg sprožilne molekule RNA v sistem vpeljati tudi deaktivirajočo RNA, ki je komplementarna sprožilni RNA in bo s hibridizacijo preprečila vezavo sprožilne RNA na stikalo 'toehold'. Deaktivirajoča molekula RNA je zmožna, poleg vezave na prosto sprožilno RNA, tudi odstraniti že vezano sprožilno RNA s stikala, saj ima ta na 5'- in 3'-koncu podaljšani domeni, ki ne tvorita interakcij s stikalom in sta namenjeni tvorbi interakcij z deaktivirajočo RNA [2].

Pri izvedbi poskusa z logičnimi vrati IN-NE (tabela 3) so transkripcijo sprožilne RNA (vhodni signal A) inducirali z anhidrotetraciklinom (aTc), medtem ko so transkripcijo deaktivirajoče RNA (vhodni signal B) sprožili z IPTG [2].

<center>
<table border=1 cellpadding=5 cellspacing=0>
<caption>'''Tabela 3:''' Pravilnostna tabela IN-NE.</caption>
<tr>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal A (aTc)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>signal B (IPTG)</th>
<th bgcolor=#A0E0A0>GFPmut3b-ASV</th>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>0</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
<tr>
<td><center>1</center></td>
<td><center>1</center></td>
<td><center>0</center></td>
</tr>
</table>
</center>

GFP fluorescenca je pokazala znatno razliko med logično pravilnim in nepravilnimi stanji [2].

=== Kompleksne logične operacije ===

V članku so prav tako sestavili kompleksnejša biološka vezja z RNA-napravami, ki so kombinirale logične operacije NE, IN ter ALI. Najkompleksnejše vezje, ki so ga konstruirali, je vsebovalo 12 vhodnih RNA signalov in je pri poskuskih ''in vivo'' delovalo robustno ter kazalo znatne razlike v fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji. Ta računska operacija je bila:

<center>(A1 IN A2 IN (NE A1*)) ALI (B1 IN B2 IN (NE B1*)) ALI (C1 IN C2) ALI (D1 IN D2) ALI (E1 IN E2),</center>

kjer molekuli A1* in B1* predstavljata komplementarni zaporedji molekulama A1 in B1 [2].

== Zaključek ==

Omenjeni poskusi nakazujejo na to, da lahko funkcionalno kompleksno biološko vezje tvorimo tudi z uporabo RNA-naprav. Te imajo pred klasičnimi biološkimi vezji, ki so osnovana na podlagi proteinskih regulatorjev, kar nekaj prednosti, med njimi predvsem visoko modularnost in nizek genetski odtis [2]. Biološka vezja z RNA-napravami imajo širok spekter možnih aplikacij, med drugim bi se lahko uporabljala v diagnostične namene za zaznavo različnih RNA molekul [4,5].

== Literatura ==

[1] Cameron, D. E., Bashor, C. J. & Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. ''Nature Reviews Microbiology'' '''12''', 381–390 (2014).

[2] Green, A. A. ''et al.'' Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. ''Nature'' '''548''', 117–121 (2017).

[3] Andersen, J. B. ''et al.'' New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. ''Appl. Environ. Microbiol.'' '''64''', 2240–2246 (1998).

[4] Pardee, K. ''et al.'' Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. ''Cell'' '''165''', 1255–1266 (2016).

[5] Pardee, K. ''et al.'' Paper-based synthetic gene networks. ''Cell'' '''159''', 940–954 (2014).

Molekularna biologija virusov

2018-03-16T16:07:00Z

Peter Škrinjar:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2017/18 obravnavajo področje virusov, saj v naslednjem letu ne boste imeli možnosti vpisa izbirnega predmeta Virologija. Tematika je razdeljena na 16 poglavij. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu.

Vsako temo obdelata praviloma dva študenta, nekatere teme pa omogočajo tudi razdelitev snovi na tri dele (to je označeno na prvem seznamu). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili.
Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov!

Predstavitve seminarjev po datumih so razvidne iz spletne učilnice.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev sta običajno dve vprašanji od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (lahko 3) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (lahko 3) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi (lahko 3) 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Virusi in rak 
13. Rastlinski virusi (lahko 3) 
14. Protivirusna zdravila (lahko 3) 
15. Protivirusna cepiva 
16. Diagnostika virusnih okužb 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (Ines Medved, Veronika Razpotnik) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi (Milica Jankovic) 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi (Anže Jenko, Ana Maklin) 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi (Andreja Habič, Uroš Prešern) 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi (Anja Černe, Špela Deučman) 
6. Retrovirusi (Katja Doberšek, Špela Supej, Barbara Slapnik) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) (Nika Zaveršek, Nika Goršek) 
8. Nitasti fagi (Ajda Krč, Tanja Zupan) 
9. Ikozaedrični fagi (Urban Hribar, Luka Gregorič) 
10. Viroidi in satelitski virusi(Ivanovski) 
11. Evolucija virusov (Polona Skrt) 
12. Virusi in rak (Ana Obaha, Lija Srnovršnik) 
13. Rastlinski virusi (Katja Dolenc, Martin Špendl) 
14. Protivirusna zdravila (Tina Turel, Maja Vrabec) 
15. Protivirusna cepiva (Daria Latysheva, Jerneja Nimac) 
16. Diagnostika virusnih okužb (Samo Purič, Peter Škrinjar) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, ki vsebuje povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]
Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).