https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Petra+Tav%C4%8Dar Wiki FKKT - User contributions [en] 2026-04-04T11:02:21Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12783 MBT seminarji 2017 2017-05-01T20:05:29Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> # The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017<br /> # High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017<br /> # Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> # Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017<br /> # Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo &quot;et al&quot;; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017<br /> # Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017<br /> # A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.<br /> # Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017<br /> # Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april<br /> # A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017 <br /> #Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> # Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec<br /> # Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić<br /> # Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017<br /> # Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017<br /> # CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) Metabolni inženiring ''E. coli'' za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi. Tajda Buh, 3. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017<br /> # Bine Tršavec<br /> # Simon Bolta<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> # Inge Sotlar<br /> # Anja Herceg<br /> # The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # Barbara Dušak<br /> # Tjaša Grum<br /> # Sara Kimm Fuhrmann<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> # A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> # Matjaž Ivanuša<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12779 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-05-01T20:00:56Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mehike so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic ''E.coli''.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Biosinteza resveratrola==<br /> <br /> Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina (L-Tyr) ali L-fenilalanina (L-Phe) v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) katalizira pretvorbo L-Tyr v p-kumarinsko kislino (p-CA), p-CA pa nastaja tudi iz L-Phe, pri čemer sodelujeta encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza). p-CA se nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).<br /> <br /> <br /> ==Razdelitev biosintezne poti resveratrola med dve populaciji celic ''E.coli''==<br /> <br /> Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu ''E.coli'' W3110. Ker izbrane celice nimajo vseh potrebnih komponent za biosintezo resveratrola, je bilo potrebno vanje vnesti tuje gene (iz rastlin ali drugih mikroorganizmov) za manjkajoče encime.<br /> <br /> Celice za proizvodnjo p-CA vsebujejo vektor z zapisom za TAL (iz kvasovke ''R.glutinis'') in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA. Pri izražanju teh dveh genov nastaneta DAHP-sintaza in transketolaza, ki nista občutljivi na povratno inhibicijo. Encima sodelujeta pri nastanku prekurzorja šikimatne poti, ki se stopenjsko pretvori v prefenat. Le-ta pa se pretvarja v L-Phe in L-Tyr. Zaželjeno je, da celice proizvajajo čim več L-Tyr, zato so celicam inaktivirali gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin). p-CA, ki nastane, se izloča v gojišče, od koder jo prevzemajo celice druge populacije (pretvarjajo p-CA v resveratrol). Te imajo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili gen za 4CL iz mikroorganizma ''S. coelicolor'', tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz ''A.hypogaea'' in ''V.vinifera'').<br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z genom za STS iz ''V.vinifera'', ki so rastle v gojišču z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz ''V.vinifera'' višja v primerjavi z STS iz ''A.hypogaea''. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v gojišču z glicerolom (v primerjavi z glukozo). Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.<br /> <br /> Kokultura omenjenih populaciji celic v razmerju 1:1 proizvede v enostavnem gojišču z dodanim glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v podobnem gojišču in primerljivem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo (tudi do 2340 mg/L), vendar je potrebno v gojišče dodajati kvasne ekstrakte, intermediate (npr. p-CA) in/ali inhibitorje encimov, ki usmerjajo celični metabolizem v želeno smer.<br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi s številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo zadostuje minimalno gojišče brez dodatkov. Avtorji članka so prepričani, da bi z nadaljno optimizacijo kokulture in pogojev še povečali proizvodnjo trans-resveratrola.<br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> #J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains fort he biosynthesis of resveratrol.” ''Microbial cell factories'' '''2016''', 15, 1-11.<br /> #A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered ''Escherichia coli''.” ''Microbial cell factories'' '''2015''', 14, 1-12.<br /> #J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans.” ''Oxidative medicine and cellular longevity'' '''2015''', 2015, 1-13.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12777 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-05-01T19:52:44Z <p>Petra Tavčar: /* Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic E.coli */</p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mehike so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic ''E.coli''.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Biosinteza resveratrola==<br /> <br /> Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina (L-Tyr) ali L-fenilalanina (L-Phe) v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) katalizira pretvorbo L-Tyr v p-kumarinsko kislino (p-CA), p-CA pa nastaja tudi iz L-Phe, pri čemer sodelujeta encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza). p-CA se nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).<br /> <br /> ==Razdelitev biosintezne poti resveratrola med dve populaciji celic ''E.coli''==<br /> <br /> Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu ''E.coli'' W3110. Ker izbrane celice nimajo vseh potrebnih komponent za biosintezo resveratrola, je bilo potrebno vanje vnesti tuje gene (iz rastlin ali drugih mikroorganizmov) za manjkajoče encime.<br /> <br /> Celice za proizvodnjo p-CA vsebujejo vektor z zapisom za TAL (iz kvasovke ''R.glutinis'') in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA. Pri izražanju teh dveh genov nastaneta DAHP-sintaza in transketolaza, ki nista občutljivi na povratno inhibicijo. Encima sodelujeta pri nastanku prekurzorja šikimatne poti, ki se stopenjsko pretvori v prefenat. Le-ta pa se pretvarja v L-Phe in L-Tyr. Zaželjeno je, da celice proizvajajo čim več L-Tyr, zato so celicam inaktivirali gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin). p-CA, ki nastane, se izloča v gojišče, od koder jo prevzemajo celice druge populacije (pretvarjajo p-CA v resveratrol). Te imajo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili gen za 4CL iz mikroorganizma ''S. coelicolor'', tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz ''A.hypogaea'' in ''V.vinifera'').<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz ''V.vinifera'', ki so rastle v gojišču z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz ''V.vinifera'' višja v primerjavi z STS iz ''A.hypogaea''. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v gojišču z glicerolom (v primerjavi z glukozo). Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.<br /> <br /> Kokultura omenjenih populaciji celic v razmerju 1:1 proizvede v enostavnem gojišču z dodanim glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v podobnem gojišču in primerljivem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo (tudi do 2340 mg/L), vendar je potrebno v gojišče dodajati kvasne ekstrakte, intermediate (npr. p-CA) in/ali inhibitorje encimov, ki usmerjajo celični metabolizem v želeno smer.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo zadostuje minimalno gojišče brez dodatkov. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo še povečali proizvodnjo trans-resveratrola.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> #J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains fort he biosynthesis of resveratrol.” ''Microbial cell factories'' '''2016''', 15, 1-11.<br /> #A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered ''Escherichia coli''.” ''Microbial cell factories'' '''2015''', 14, 1-12.<br /> #J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans.” ''Oxidative medicine and cellular longevity'' '''2015''', 2015, 1-13.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12776 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-05-01T19:48:22Z <p>Petra Tavčar: /* Viri */</p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mehike so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic ''E.coli''.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Biosinteza resveratrola==<br /> <br /> Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina (L-Tyr) ali L-fenilalanina (L-Phe) v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) katalizira pretvorbo L-Tyr v p-kumarinsko kislino (p-CA), p-CA pa nastaja tudi iz L-Phe, pri čemer sodelujeta encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza). p-CA se nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).<br /> <br /> ==Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic ''E.coli''==<br /> <br /> Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu ''E.coli'' W3110. Ker izbrane celice nimajo vseh potrebnih komponent za biosintezo resveratrola, je bilo potrebno vanje vnesti tuje gene (iz rastlin ali drugih mikroorganizmov) za manjkajoče encime.<br /> <br /> Celice za proizvodnjo p-CA vsebujejo vektor z zapisom za TAL (iz kvasovke ''R.glutinis'') in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA. Pri izražanju le-teh nastaneta DAHP-sintaza in transketolaza, ki nista občutljivi na povratno inhibicijo. Encima sodelujeta pri nastanku prekurzorja šikimatne poti, ki se stopenjsko pretvori pretvori v prefenat. Le-ta pa se pretvarja v L-Phe in L-Tyr. Zaželjeno je, da celice proizvajajo čim več L-Tyr, zato so celicam inaktivirali gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin). p-CA, ki nastane, se izloča v gojišče, od koder jo prevzemajo celice druge populacije (pretvarjajo p-CA v resveratrol). Te imajo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili zapis za 4CL iz mikroorganizma ''S. coelicolor'', tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz ''A.hypogaea'' in ''V.vinifera'').<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz ''V.vinifera'', ki so rastle v gojišču z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz ''V.vinifera'' višja v primerjavi z STS iz ''A.hypogaea''. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v gojišču z glicerolom (v primerjavi z glukozo). Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.<br /> <br /> Kokultura omenjenih populaciji celic v razmerju 1:1 proizvede v enostavnem gojišču z dodanim glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v podobnem gojišču in primerljivem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo (tudi do 2340 mg/L), vendar je potrebno v gojišče dodajati kvasne ekstrakte, intermediate (npr. p-CA) in/ali inhibitorje encimov, ki usmerjajo celični metabolizem v želeno smer.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo zadostuje minimalno gojišče brez dodatkov. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo še povečali proizvodnjo trans-resveratrola.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> #J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains fort he biosynthesis of resveratrol.” ''Microbial cell factories'' '''2016''', 15, 1-11.<br /> #A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered ''Escherichia coli''.” ''Microbial cell factories'' '''2015''', 14, 1-12.<br /> #J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans.” ''Oxidative medicine and cellular longevity'' '''2015''', 2015, 1-13.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12770 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-04-30T21:39:57Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mehike so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic ''E.coli''.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Biosinteza resveratrola==<br /> <br /> Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina (L-Tyr) ali L-fenilalanina (L-Phe) v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) katalizira pretvorbo L-Tyr v p-kumarinsko kislino (p-CA), p-CA pa nastaja tudi iz L-Phe, pri čemer sodelujeta encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza). p-CA se nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).<br /> <br /> ==Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic ''E.coli''==<br /> <br /> Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu ''E.coli'' W3110. Ker izbrane celice nimajo vseh potrebnih komponent za biosintezo resveratrola, je bilo potrebno vanje vnesti tuje gene (iz rastlin ali drugih mikroorganizmov) za manjkajoče encime.<br /> <br /> Celice za proizvodnjo p-CA vsebujejo vektor z zapisom za TAL (iz kvasovke ''R.glutinis'') in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA. Pri izražanju le-teh nastaneta DAHP-sintaza in transketolaza, ki nista občutljivi na povratno inhibicijo. Encima sodelujeta pri nastanku prekurzorja šikimatne poti, ki se stopenjsko pretvori pretvori v prefenat. Le-ta pa se pretvarja v L-Phe in L-Tyr. Zaželjeno je, da celice proizvajajo čim več L-Tyr, zato so celicam inaktivirali gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin). p-CA, ki nastane, se izloča v gojišče, od koder jo prevzemajo celice druge populacije (pretvarjajo p-CA v resveratrol). Te imajo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili zapis za 4CL iz mikroorganizma ''S. coelicolor'', tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz ''A.hypogaea'' in ''V.vinifera'').<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz ''V.vinifera'', ki so rastle v gojišču z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz ''V.vinifera'' višja v primerjavi z STS iz ''A.hypogaea''. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v gojišču z glicerolom (v primerjavi z glukozo). Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.<br /> <br /> Kokultura omenjenih populaciji celic v razmerju 1:1 proizvede v enostavnem gojišču z dodanim glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v podobnem gojišču in primerljivem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo (tudi do 2340 mg/L), vendar je potrebno v gojišče dodajati kvasne ekstrakte, intermediate (npr. p-CA) in/ali inhibitorje encimov, ki usmerjajo celični metabolizem v želeno smer.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo zadostuje minimalno gojišče brez dodatkov. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo še povečali proizvodnjo trans-resveratrola.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> #J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains fort he biosynthesis of resveratrol.” ''Microbial cell factories'' '''2016''', 15, 1-11.<br /> #A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered ''Escherichia coli''.” ''Microbial cell factories'' '''2015''', 14, 1-12.<br /> #J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans ” ''Oxidative medicine and cellular longevity'' '''2015''', 2015, 1-13.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12769 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-04-30T21:26:22Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mehike so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic ''E.coli''.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Biosinteza resveratrola==<br /> <br /> Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina (L-Tyr) ali L-fenilalanina (L-Phe) v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) katalizira pretvorbo L-Tyr v p-kumarinsko kislino (p-CA), p-CA pa nastaja tudi iz L-Phe, pri čemer sodelujeta encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza). p-CA se nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).<br /> <br /> ==Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic ''E.coli''==<br /> <br /> Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu ''E.coli'' W3110. Ker izbrane celice nimajo vseh potrebnih komponent za biosintezo resveratrola, je bilo potrebno vanje vnesti tuje gene (iz rastlin ali drugih mikroorganizmov) za manjkajoče encime.<br /> <br /> Celice za proizvodnjo p-CA vsebujejo vektor z zapisom za TAL (iz kvasovke ''R.glutinis'') in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA. Pri izražanju le-teh nastaneta DAHP-sintaza in transketolaza, ki nista občutljivi na povratno inhibicijo. Encima sodelujeta pri nastanku prekurzorja šikimatne poti, ki se stopenjsko pretvori pretvori v prefenat. Le-ta pa se pretvarja v L-Phe in L-Tyr. Zaželjeno je, da celice proizvajajo čim več L-Tyr, zato so celicam inaktivirali gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin). p-CA, ki nastane, se izloča v gojišče, od koder jo prevzemajo celice druge populacije (pretvarjajo p-CA v resveratrol). Te imajo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili zapis za 4CL iz mikroorganizma ''S. coelicolor'', tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz ''A.hypogaea'' in ''V.vinifera'').<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz ''V.vinifera'', ki so rastle v gojišču z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz ''V.vinifera'' višja v primerjavi z STS iz ''A.hypogaea''. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v gojišču z glicerolom (v primerjavi z glukozo). Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.<br /> <br /> Kokultura omenjenih populaciji celic v razmerju 1:1 proizvede v enostavnem gojišču z dodanim glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v podobnem gojišču in primerljivim času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo (tudi do 2340 mg/L), vendar je potrebno v gojišče dodajati kvasne ekstrakte, intermediate (npr. p-CA) in/ali inhibitorje encimov, ki usmerjajo celični metabolizem v želeno smer.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo zadostuje minimalno gojišče brez dodatkov. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo še povečali proizvodnjo trans-resveratrola.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> #J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains fort he biosynthesis of resveratrol.” ''Microbial cell factories'' '''2016''', 15, 1-11.<br /> #A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered ''Escherichia coli''.” ''Microbial cell factories'' '''2015''', 14, 1-12.<br /> #J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans ” ''Oxidative medicine and cellular longevity'' '''2015''', 2015, 1-13.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12768 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-04-30T21:15:39Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mehike so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic ''E.coli''.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Biosinteza resveratrola==<br /> <br /> Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina ali L-fenilalanina v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) katalizira pretvorbo L-tirozina v p-kumarinsko kislino (p-CA), p-CA pa nastaja tudi iz L-fenilalanina, pri čemer sodelujeta encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza). p-CA se nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).<br /> <br /> ==Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic ''E.coli''==<br /> <br /> Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu ''E.coli'' W3110. Ker bakterije ''E.coli'' nimajo vseh potrebnih komponent za biosintezo resveratrola, je bilo potrebno vanje vnesti tuje gene za manjkajoče encime. Ti so izvirali iz različnih rastlin ali tujih mikroorganizmov in so bili ustrezno modificirani za izražanje v ''E.coli''.<br /> <br /> Celice za proizvodnjo p-CA (sev W(pheA-)Rg) vsebujejo vektor zapisom za TAL (iz kvasovke ''R.glutinis'') in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA. Pri izražanju le-teh nastaneta DAHP-sintaza in transketolaza, ki nista občutljivi na povratno inhibicijo. Encima sta del osnovne metabolne mašinerije celic in sodelujeta pri nastanku prekurzorja šikimatne poti. Ta se pretvori v prefenat, ki je osnovni prekurzor L-fenialanina in L-tirozina. Cilj raziskovalne ekipe je bil, da celice proizvajajo čim več L-tirozina, zato so celicam inaktivirali gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin). p-CA, ki nastane, se izloča v gojišče, od koder jo prevzemajo celice druge populacije(sev W-Vv). Te imajo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili zapis za 4CL iz mikroorganizma ''S. coelicolor'', tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz ''A.hypogaea'' in ''V.vinifera'').<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz ''V.vinifera'', ki so rastle v gojišču z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz ''V.vinifera'' višja v primerjavi z STS iz ''A.hypogaea''. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v gojišču z glicerolom (v primerjavi z glukozo) . Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.<br /> <br /> Kokultura dveh populaciji celic ''E.coli'' (W(pheA-)Rg in W-Vv; razmerje 1:1) proizvede v enostavnem gojišču M9 z dodanim glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v enostavnem gojišču v podobnem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo (tudi do 2340 mg/L), vendar je potrebno v gojišče dodajati kvasne ekstrakte, intermediate (npr. p-CA) in/ali inhibitorje encimov, ki usmerjajo celični metabolizem v želeno smer.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo zadostuje minimalno gojišče brez dodatkov. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo lahko izboljšali pretok molekul med obema populacijama in tako še povečali proizvodnjo trans-resveratrola.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> #J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains fort he biosynthesis of resveratrol.” ''Microbial cell factories'' '''2016''', 15, 1-11.<br /> #A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered ''Escherichia coli''.” ''Microbial cell factories'' '''2015''', 14, 1-12.<br /> #J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans ” ''Oxidative medicine and cellular longevity'' '''2015''', 2015, 1-13.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12767 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-04-30T21:06:58Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mehike so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic ''E.coli''.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Biosinteza resveratrola==<br /> <br /> Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina ali L-fenilalanina v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) katalizira pretvorbo L-tirozina v p-kumarinsko kislino (p-CA), p-CA pa nastaja tudi iz L-fenilalanina, pri čemer sodelujeta encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza). p-CA se nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).<br /> <br /> ==Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic ''E.coli''==<br /> <br /> Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu ''E.coli'' W3110. Ker bakterije ''E.coli'' nimajo vseh potrebnih komponent za biosintezo resveratrola, je bilo potrebno vanje vnesti tuje gene za manjkajoče encime. Ti so večinoma izvirali iz različnih rastlinskih vrst, pa tudi iz nekaterih mikroorganizmov in so bili ustrezno modificirani za izražanje v ''E.coli''.<br /> <br /> Celice za proizvodnjo p-CA (sev W(pheA-)Rg) vsebujejo vektor zapisom za TAL (iz kvasovke ''R.glutinis'') in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA (iz ''E.coli''). Pri izražanju teh genov nastaneta DAHP-sintaza in transketolaza, ki nista občutljivi na povratno inhibicijo. Encima sta del osnovne metabolne mašinerije celic in sodelujeta pri nastanku prekurzorja šikimatne poti (DAHP). Intermediat šikimatne poti prefenat pa se v bakterijskih celicah pretvarja v L-fenialanin ali L-tirozin. Cilj raziskovalne ekipe je bil, da celice proizvajajo čim več L-tirozina, ki je substrat za encim TAL. Celicam so zato inaktivirali gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin). p-CA, ki nastane po delovanju TAL, se izloča v gojišče, od koder jo prevzemajo celice druge populacije. Celice za pretvorbo p-CA do resveratrola (sev W-Vv) nosijo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili zapis za 4CL iz mikroorganizma ''S. coelicolor'', tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz ''A.hypogaea'' in ''V.vinifera'').<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz ''V.vinifera'', ki so rastle v gojišču z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz ''V.vinifera'' višja v primerjavi z STS iz ''A.hypogaea''. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v gojišču z glicerolom (v primerjavi z glukozo) . Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.<br /> <br /> Kokultura dveh populaciji celic ''E.coli'' (W(pheA-)Rg in W-Vv; razmerje 1:1) proizvede v enostavnem gojišču M9 z dodanim glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v enostavnem gojišču v podobnem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo (tudi do 2340 mg/L), vendar je potrebno v gojišče dodajati kvasne ekstrakte, intermediate (npr. p-CA) in/ali inhibitorje encimov, ki usmerjajo celični metabolizem v želeno smer.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo zadostuje minimalno gojišče brez dodatkov. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo lahko izboljšali pretok molekul med obema populacijama in tako še povečali proizvodnjo trans-resveratrola.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> #J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains fort he biosynthesis of resveratrol.” ''Microbial cell factories'' '''2016''', 15, 1-11.<br /> #A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered ''Escherichia coli''.” ''Microbial cell factories'' '''2015''', 14, 1-12.<br /> #J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans ” ''Oxidative medicine and cellular longevity'' '''2015''', 2015, 1-13.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12766 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-04-30T19:22:21Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mexica so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic ''E.coli''.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Biosinteza resveratrola==<br /> <br /> Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina ali L-fenilalanina v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) pretvarja L-tirozin v p-kumarinsko kislino (p-CA), encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza) pa katalizirata pretvorbo L-fenilalanina v p-CA. Le-ta se potem nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).<br /> <br /> ==Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic ''E.coli''==<br /> <br /> Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA in malonil-CoA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu ''E.coli'' W3110.<br /> <br /> Celice za proizvodnjo p-CA (W(pheA-)Rg) vsebujejo vektor z zapisom za TAL (iz kvasovke ''R.glutinis'') in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA, ki omogočata izražanje na povratno inhibicijo neobčutljivih encimov DAHP-sintaze in transketolaze. Celice imajo inaktiviran gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin), zato celice večino prefenata pretvorijo v L-tirozin, ki je substrat za encim TAL.<br /> <br /> Celice za pretvorbo p-CA do resveratrola (W-Vv) nosijo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili zapis za 4CL iz mikroorganizma ''S. coelicolor'', tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz ''A.hypogaea'' in ''V.vinifera'').<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz ''V.vinifera'', ki so rastle v mediju z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz ''V.vinifera'' višja v primerjavi z STS iz A.hypogaea. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v prisotnosti glicerola. Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.<br /> <br /> Kokultura iz dveh populaciji celic ''E.coli'' (W(pheA-)Rg in W-Vv, razmerje 1:1) proizvede v enostavnem gojišču z glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v enostavnem gojišču v podobnem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo, vendar je potrebno v gojišče dodajati intermediate (npr. p-CA), kvasni ekstrakt ali inhibitorje encimov.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo v gojišče ni potrebno dodajati kvasnih ekstraktov, specifičnih inhibitorjev in intermediatov biosintezne poti. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo lahko izboljšali pretok molekul med obema populacijama in tako še povečali proizvodnjo.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> #J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains fort he biosynthesis of resveratrol.” ''Microbial cell factories'' '''2016''', 15, 1-11.<br /> #A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered ''Escherichia coli''.” ''Microbial cell factories'' '''2015''', 14, 1-12.<br /> #J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans ” ''Oxidative medicine and cellular longevity'' '''2015''', 2015, 1-13.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12765 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-04-30T19:20:18Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> <br /> Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mexica so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic ''E.coli''.<br /> <br /> ==Biosinteza resveratrola==<br /> <br /> Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina ali L-fenilalanina v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) pretvarja L-tirozin v p-kumarinsko kislino (p-CA), encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza) pa katalizirata pretvorbo L-fenilalanina v p-CA. Le-ta se potem nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).<br /> <br /> ==Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic ''E.coli''==<br /> <br /> Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA in malonil-CoA v trans-resveratrol. <br /> Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu ''E.coli'' W3110. Celice za proizvodnjo p-CA (W(pheA-)Rg) vsebujejo vektor z zapisom za TAL (iz kvasovke ''R.glutinis'') in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA, ki omogočata izražanje na povratno inhibicijo neobčutljivih encimov DAHP-sintaze in transketolaze. Celice imajo inaktiviran gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin), zato celice večino prefenata pretvorijo v L-tirozin, ki je substrat za encim TAL.<br /> <br /> Celice za pretvorbo p-CA do resveratrola (W-Vv) nosijo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili zapis za 4CL iz mikroorganizma ''S. coelicolor'', tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz ''A.hypogaea'' in ''V.vinifera'').<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz ''V.vinifera'', ki so rastle v mediju z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz ''V.vinifera'' višja v primerjavi z STS iz A.hypogaea. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v prisotnosti glicerola. Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.<br /> <br /> Kokultura iz dveh populaciji celic ''E.coli'' (W(pheA-)Rg in W-Vv, razmerje 1:1) proizvede v enostavnem gojišču z glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v enostavnem gojišču v podobnem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo, vendar je potrebno v gojišče dodajati intermediate (npr. p-CA), kvasni ekstrakt ali inhibitorje encimov.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo v gojišče ni potrebno dodajati kvasnih ekstraktov, specifičnih inhibitorjev in intermediatov biosintezne poti. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo lahko izboljšali pretok molekul med obema populacijama in tako še povečali proizvodnjo.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> #J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of Escherichia coli strains fort he biosynthesis of resveratrol.” Microbial cell factories 2016, 15, 1-11.<br /> #A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered Escherichia coli.” Microbial cell factories 2015, 14, 1-12.<br /> #J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans ” Oxidative medicine and cellular longevity 2015, 2015, 1-13.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12762 MBT seminarji 2017 2017-04-30T09:02:20Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> # The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017<br /> # High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017<br /> # Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> # Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017<br /> # Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo &quot;et al&quot;; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017<br /> # Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017<br /> # A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.<br /> # Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017<br /> # Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april<br /> # A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017 <br /> #Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> # Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec<br /> # Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić<br /> # Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar,3. maj 2017<br /> # Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017<br /> # CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) Metabolni inženiring ''E. coli'' za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi. Tajda Buh, 3. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017<br /> # Bine Tršavec<br /> # Simon Bolta<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> # Inge Sotlar<br /> # Anja Herceg<br /> # The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # Barbara Dušak<br /> # Tjaša Grum<br /> # Sara Kimm Fuhrmann<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> # A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> # Matjaž Ivanuša<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12761 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-04-30T08:52:12Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol]<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola&diff=12760 Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola 2017-04-30T08:42:44Z <p>Petra Tavčar: New page: Rezultati Zaključek Viri</p> <hr /> <div><br /> <br /> <br /> <br /> Rezultati<br /> <br /> <br /> <br /> Zaključek<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Viri</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12756 MBT seminarji 2017 2017-04-28T07:10:14Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> # The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017<br /> # High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017<br /> # Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> # Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017<br /> # Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo &quot;et al&quot;; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017<br /> # Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017<br /> # A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.<br /> # Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017<br /> # Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april<br /> # A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017 <br /> #Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> # Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec<br /> # Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić<br /> # Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. maj 2017<br /> # Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017<br /> # CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) Metabolni inženiring ''E. coli'' za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi. Tajda Buh, 3. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017<br /> # Bine Tršavec<br /> # Simon Bolta<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> # Inge Sotlar<br /> # Anja Herceg<br /> # The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # Barbara Dušak<br /> # Tjaša Grum<br /> # Sara Kimm Fuhrmann<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> # A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> # Matjaž Ivanuša<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=2017-bionano-seminar&diff=12455 2017-bionano-seminar 2017-03-15T20:14:43Z <p>Petra Tavčar: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Bionanotehnologija- seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> ! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja<br /> |-<br /> ! Peter Prezelj<br /> | 22.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Boštjan Petrič<br /> | 22.03.17 || Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi<br /> |-<br /> ! Ema Guštin<br /> | 22.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tjaša Lapanja<br /> | 29.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Maruša Prolič Kalinšek<br /> | 29.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Domen Klofutar<br /> | 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula<br /> |-<br /> ! Simon Bolta<br /> | 05.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tomaž Rozmarič<br /> | 05.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Urša Kapš<br /> | 05.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Julija Mazej<br /> | 12.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Nataša Žigante<br /> | 12.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Anja Herceg<br /> | 12.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mirjam Kmetič<br /> | 19.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mojca Kostanjevec<br /> | 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (cepiva in si-RNA - EpCAM) z uporabo nanodiskov<br /> |-<br /> ! Jan Rozman<br /> | 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo<br /> |-<br /> ! Barbara Dušak<br /> | 03.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mateja Cigoj<br /> | 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten. <br /> |-<br /> ! Toni Nagode<br /> | 03.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tim Božič<br /> | 10.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Darja Božič<br /> | 10.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Petra Tavčar<br /> | 10.05.17 || Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov<br /> |-<br /> ! Marjeta Horvat<br /> | 17.05.17 || FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa<br /> |-<br /> ! Danijela Jošić<br /> | 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.<br /> |-<br /> ! Tina Kuhar<br /> | 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode. <br /> |-<br /> ! Nika Strašek<br /> | 24.05.17 || Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom<br /> |-<br /> ! Eva Vidak<br /> | 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''<br /> |-<br /> ! Alja Zgonc<br /> | 24.05.17 || Biosenzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni<br /> |-<br /> ! Zala Gluhić<br /> | 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.<br /> |-<br /> ! Judita Avbelj<br /> | 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.<br /> |-<br /> ! Vid Jazbec<br /> | 31.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Vita Vidmar<br /> | 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic<br /> |-<br /> ! Luka Kavčič<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mojca Juteršek<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Bojana Lazović<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Eva Korošec<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tajda Buh<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |}<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga je:&lt;br&gt;'''<br /> Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.<br /> Predlagana struktura:<br /> * Uvod<br /> * Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji<br /> * Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze<br /> * Literatura<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od &lt;font color=red&gt;2000 do 2500 besed &lt;/font&gt; (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt; Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx<br /> * 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=2017-bionano-seminar&diff=12454 2017-bionano-seminar 2017-03-15T20:12:24Z <p>Petra Tavčar: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Bionanotehnologija- seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> ! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja<br /> |-<br /> ! Peter Prezelj<br /> | 22.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Boštjan Petrič<br /> | 22.03.17 || Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi<br /> |-<br /> ! Ema Guštin<br /> | 22.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tjaša Lapanja<br /> | 29.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Maruša Prolič Kalinšek<br /> | 29.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Domen Klofutar<br /> | 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula<br /> |-<br /> ! Simon Bolta<br /> | 05.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tomaž Rozmarič<br /> | 05.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Urša Kapš<br /> | 05.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Julija Mazej<br /> | 12.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Nataša Žigante<br /> | 12.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Anja Herceg<br /> | 12.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mirjam Kmetič<br /> | 19.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mojca Kostanjevec<br /> | 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (cepiva in si-RNA - EpCAM) z uporabo nanodiskov<br /> |-<br /> ! Jan Rozman<br /> | 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo<br /> |-<br /> ! Barbara Dušak<br /> | 03.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mateja Cigoj<br /> | 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten. <br /> |-<br /> ! Toni Nagode<br /> | 03.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tim Božič<br /> | 10.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Darja Božič<br /> | 10.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Petra Tavčar<br /> | 10.05.17 || Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi protiteles in aptamerov<br /> |-<br /> ! Marjeta Horvat<br /> | 17.05.17 || FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa<br /> |-<br /> ! Danijela Jošić<br /> | 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.<br /> |-<br /> ! Tina Kuhar<br /> | 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode. <br /> |-<br /> ! Nika Strašek<br /> | 24.05.17 || Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom<br /> |-<br /> ! Eva Vidak<br /> | 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''<br /> |-<br /> ! Alja Zgonc<br /> | 24.05.17 || Biosenzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni<br /> |-<br /> ! Zala Gluhić<br /> | 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.<br /> |-<br /> ! Judita Avbelj<br /> | 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.<br /> |-<br /> ! Vid Jazbec<br /> | 31.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Vita Vidmar<br /> | 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic<br /> |-<br /> ! Luka Kavčič<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mojca Juteršek<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Bojana Lazović<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Eva Korošec<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tajda Buh<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |}<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga je:&lt;br&gt;'''<br /> Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.<br /> Predlagana struktura:<br /> * Uvod<br /> * Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji<br /> * Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze<br /> * Literatura<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od &lt;font color=red&gt;2000 do 2500 besed &lt;/font&gt; (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt; Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx<br /> * 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=2017-bionano-seminar&diff=12446 2017-bionano-seminar 2017-03-15T20:07:21Z <p>Petra Tavčar: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Bionanotehnologija- seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> ! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja<br /> |-<br /> ! Peter Prezelj<br /> | 22.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Boštjan Petrič<br /> | 22.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Ema Guštin<br /> | 22.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tjaša Lapanja<br /> | 29.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Maruša Prolič Kalinšek<br /> | 29.03.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Domen Klofutar<br /> | 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula<br /> |-<br /> ! Simon Bolta<br /> | 05.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tomaž Rozmarič<br /> | 05.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Urša Kapš<br /> | 05.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Julija Mazej<br /> | 12.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Nataša Žigante<br /> | 12.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Anja Herceg<br /> | 12.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mirjam Kmetič<br /> | 19.04.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mojca Kostanjevec<br /> | 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (EpCAM) z uporabo nanodiskov<br /> |-<br /> ! Jan Rozman<br /> | 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo<br /> |-<br /> ! Barbara Dušak<br /> | 03.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mateja Cigoj<br /> | 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten. <br /> |-<br /> ! Toni Nagode<br /> | 03.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tim Božič<br /> | 10.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Darja Božič<br /> | 10.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Petra Tavčar<br /> | 10.05.17 || Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz pijač na osnovi protiteles in aptamerov<br /> |-<br /> ! Marjeta Horvat<br /> | 17.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Danijela Jošić<br /> | 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.<br /> |-<br /> ! Tina Kuhar<br /> | 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode. <br /> |-<br /> ! Nika Strašek<br /> | 24.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Eva Vidak<br /> | 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''<br /> |-<br /> ! Alja Zgonc<br /> | 24.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Zala Gluhić<br /> | 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.<br /> |-<br /> ! Judita Avbelj<br /> | 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.<br /> |-<br /> ! Vid Jazbec<br /> | 31.05.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Vita Vidmar<br /> | 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic<br /> |-<br /> ! Luka Kavčič<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Mojca Juteršek<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Bojana Lazović<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Eva Korošec<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |-<br /> ! Tajda Buh<br /> | 07.06.17 || opis teme ali naslov<br /> |}<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga je:&lt;br&gt;'''<br /> Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.<br /> Predlagana struktura:<br /> * Uvod<br /> * Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji<br /> * Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze<br /> * Literatura<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od &lt;font color=red&gt;2000 do 2500 besed &lt;/font&gt; (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt; Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx<br /> * 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12292 MBT seminarji 2017 2017-03-01T07:41:23Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti ''Streptococcus pneumoniae'' v kloroplastih alge ''Chlamydomonas reinhardtii''. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) Bioinženiring rastlinske kulture ''Capsium frutescens'' z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Ana Cirnski<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # HIV antibodies for treatment of HIV infection (D. M. Margolis; Immunological reviews, 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imr.12506/full). Protitelesa HIV za zdravljenje okužbe s HIV. Ema Guštin, 5. april 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Tomaž Rozmarič<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12291 MBT seminarji 2017 2017-03-01T07:41:02Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti ''Streptococcus pneumoniae'' v kloroplastih alge ''Chlamydomonas reinhardtii''. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) Bioinženiring rastlinske kulture ''Capsium frutescens'' z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Ana Cirnski<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # HIV antibodies for treatment of HIV infection (D. M. Margolis; Immunological reviews, 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imr.12506/full). Protitelesa HIV za zdravljenje okužbe s HIV. Ema Guštin, 5. april 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Tomaž Rozmarič<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola . Petra Tavčar,3. marec 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12058 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-12T20:35:44Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah ''Xanthomonas''. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze ''Fok''I.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se ''Fok''I domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema ''Fok''I domenama, strukture ''Fok''I nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcij in ligacij. Sodobnejša različica je 'Golden Gate' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavne. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5'-koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma ''Xba''I in ''Bbs''I, na 3'-koncu pa z restrikcijskima mestoma ''Bsa''I in ''Bam''HI. To omogoča, da se po restrikciji z ''Bbs''I in ''Bsa''I z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3'-koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5'-koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z ''Bsa''I, pri čemer nastane na 3'-koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z ''Bbs''I, ki reže na 5'- koncu zapisov in ''Bam''HI, ki cepi za 3'-koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5'-koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec, režemo z ''Bsa''I, kar aktivira 3'-konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3'-koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z ''Bsa''I, ki ustvari na 3'-koncu unikaten lepljiv konec in z ''Bbs''I, ki odcepi fragment z nosilca ter ustvari primeren 5'-konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za izražanje TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo ''Bsm''BI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE-ponovitev in zapis za ''Fok''I domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so ekspresijske plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina (znano iz predhodnih raziskav). Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še ekspresijske plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE-ponovitev, ki ciljajo 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, je 88 % izbranih parov TALEN-ov kazalo aktivnost. To nakazuje, da je območje tarčenja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za vezavo TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov dokaj učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ D. Reyon, S.Q. Tsai, C. Khayter, J.A. Foden, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.” Nature biotechnology 2012, 30, 460-465.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ J.K. Joung, J.D. Sander. ‟ TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.” Nature reviews Molecular cell biology 2013, 14, 49-55.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3767754/ D. Reyon, M.L. Maeder, C. Khayter, S.Q. Tsai, , J.E. Foley, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ Engineering customized TALE nucleases (TALENs) and TALE transcription factors by fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) assembly.” Current protocols in molecular biology 2013, 103:12.16:12.16.1–12.16.18.]<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12057 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-12T20:29:31Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah ''Xanthomonas''. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze ''Fok''I.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se ''Fok''I domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema ''Fok''I domenama, strukture ''Fok''I nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcij in ligacij. Sodobnejša različica je 'Golden Gate' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavne. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5'-koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma ''Xba''I in ''Bbs''I, na 3'-koncu pa z restrikcijskima mestoma ''Bsa''I in ''Bam''HI. To omogoča, da se po restrikciji z ''Bbs''I in ''Bsa''I z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3'-koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5'-koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z ''Bsa''I, pri čemer nastane na 3'-koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z ''Bbs''I, ki reže na 5'- koncu zapisov in ''Bam''HI, ki cepi za 3'-koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5'-koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec, režemo z ''Bsa''I, kar aktivira 3'-konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3'-koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z ''Bsa''I, ki ustvari na 3'-koncu unikaten lepljiv konec in z ''Bbs''I, ki odcepi fragment z nosilca ter ustvari primeren 5'-konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za izražanje TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo ''Bsm''BI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE-ponovitev in zapis za ''Fok''I domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ D. Reyon, S.Q. Tsai, C. Khayter, J.A. Foden, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.” Nature biotechnology 2012, 30, 460-465.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ J.K. Joung, J.D. Sander. ‟ TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.” Nature reviews Molecular cell biology 2013, 14, 49-55.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3767754/ D. Reyon, M.L. Maeder, C. Khayter, S.Q. Tsai, , J.E. Foley, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ Engineering customized TALE nucleases (TALENs) and TALE transcription factors by fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) assembly.” Current protocols in molecular biology 2013, 103:12.16:12.16.1–12.16.18.]<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12056 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-12T20:20:06Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah ''Xanthomonas''. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze ''Fok''I.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se ''Fok''I domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema ''Fok''I domenama, strukture ''Fok''I nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcij in ligacij. Sodobnejša različica je 'Golden Gate' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ D. Reyon, S.Q. Tsai, C. Khayter, J.A. Foden, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.” Nature biotechnology 2012, 30, 460-465.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ J.K. Joung, J.D. Sander. ‟ TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.” Nature reviews Molecular cell biology 2013, 14, 49-55.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3767754/ D. Reyon, M.L. Maeder, C. Khayter, S.Q. Tsai, , J.E. Foley, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ Engineering customized TALE nucleases (TALENs) and TALE transcription factors by fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) assembly.” Current protocols in molecular biology 2013, 103:12.16:12.16.1–12.16.18.]<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12055 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-12T20:19:05Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah ''Xanthomonas''. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze ''Fok''I.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se ''Fok''I domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema ''Fok''I domenama, strukture ''Fok''I nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcij in ligacij. Sodobnejša različica je ''Golden Gate'' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ D. Reyon, S.Q. Tsai, C. Khayter, J.A. Foden, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.” Nature biotechnology 2012, 30, 460-465.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ J.K. Joung, J.D. Sander. ‟ TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.” Nature reviews Molecular cell biology 2013, 14, 49-55.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3767754/ D. Reyon, M.L. Maeder, C. Khayter, S.Q. Tsai, , J.E. Foley, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ Engineering customized TALE nucleases (TALENs) and TALE transcription factors by fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) assembly.” Current protocols in molecular biology 2013, 103:12.16:12.16.1–12.16.18.]<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12054 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-12T20:11:14Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah ''Xanthomonas''. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema FokI domenama, strukture FokI nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcije in ligacije. Sodobnejša različica je ''Golden Gate'' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ D. Reyon, S.Q. Tsai, C. Khayter, J.A. Foden, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.” Nature biotechnology 2012, 30, 460-465.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ J.K. Joung, J.D. Sander. ‟ TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.” Nature reviews Molecular cell biology 2013, 14, 49-55.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3767754/ D. Reyon, M.L. Maeder, C. Khayter, S.Q. Tsai, , J.E. Foley, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ Engineering customized TALE nucleases (TALENs) and TALE transcription factors by fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) assembly.” Current protocols in molecular biology 2013, 103:12.16:12.16.1–12.16.18.]<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12040 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T21:30:21Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema FokI domenama, strukture FokI nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcije in ligacije. Sodobnejša različica je ''Golden Gate'' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ D. Reyon, S.Q. Tsai, C. Khayter, J.A. Foden, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.” Nature biotechnology 2012, 30, 460-465.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ J.K. Joung, J.D. Sander. ‟ TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.” Nature reviews Molecular cell biology 2013, 14, 49-55.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3767754/ D. Reyon, M.L. Maeder, C. Khayter, S.Q. Tsai, , J.E. Foley, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ Engineering customized TALE nucleases (TALENs) and TALE transcription factors by fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) assembly.” Current protocols in molecular biology 2013, 103:12.16:12.16.1–12.16.18.]<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12039 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T21:29:32Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI.<br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema FokI domenama, strukture FokI nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcije in ligacije. Sodobnejša različica je ''Golden Gate'' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ D. Reyon, S.Q. Tsai, C. Khayter, J.A. Foden, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.” Nature biotechnology 2012, 30, 460-465.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ J.K. Joung, J.D. Sander. ‟ TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.” Nature reviews Molecular cell biology 2013, 14, 49-55.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3767754/ D. Reyon, M.L. Maeder, C. Khayter, S.Q. Tsai, , J.E. Foley, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ Engineering customized TALE nucleases (TALENs) and TALE transcription factors by fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) assembly.” Current protocols in molecular biology 2013, 103:12.16:12.16.1–12.16.18.]<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12038 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T21:24:40Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI.<br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema FokI domenama, strukture FokI nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcije in ligacije. Sodobnejša različica je ''Golden Gate'' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ D. Reyon, S.Q. Tsai, C. Khayter, J.A. Foden, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.” Nature biotechnology 2012, 30, 460-465.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ J.K. Joung, J.D. Sander. ‟ TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.” Nature reviews Molecular cell biology 2013, 14, 49-55.]<br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3767754/ D. Reyon, M.L. Maeder, C. Khayter, S.Q. Tsai, , J.E. Foley, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ Engineering customized TALE nucleases (TALENs) and TALE transcription factors by fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) assembly.” Current protocols in molecular biology 2013, poglavje 12, enota 12.16.]<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12037 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T21:23:21Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI.<br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema FokI domenama, strukture FokI nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcije in ligacije. Sodobnejša različica je ''Golden Gate'' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> # [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ D. Reyon, S.Q. Tsai, C. Khayter, J.A. Foden, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.” Nature biotechnology 2012, 30, 460-465.]<br /> <br /> J.K. Joung, J.D. Sander. ‟ TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.” Nature reviews Molecular cell biology 2013, 14, 49-55.<br /> D. Reyon, M.L. Maeder, C. Khayter, S.Q. Tsai, , J.E. Foley, J.D. Sander, J.K. Joung. ‟ Engineering customized TALE nucleases (TALENs) and TALE transcription factors by fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) assembly.” Current protocols in molecular biology 2013, poglavje 12, enota 12.16.<br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12036 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T20:50:28Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI.<br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema FokI domenama, strukture FokI nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcije in ligacije. Sodobnejša različica je ''Golden Gate'' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12035 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T20:49:07Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==UVOD==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI.<br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema FokI domenama, strukture FokI nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcije in ligacije. Sodobnejša različica je ''Golden Gate'' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv.<br /> Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12034 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T20:42:44Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih. <br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje konstruktov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in podrobno opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> <br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL. To so sekrecijski proteini pri bakterijah iz rodu Xanthomonas, ki se ob napadu bakterij na gostiteljsko rastlino izločajo v notranjost rastlinskih celic, v jedru se vežejo na DNA in vplivajo na transkripcijo gostiteljevih genov, kar poveča patogenost bakterij. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Število TALE-ponovitev znotraj domene določa dolžino zaporedja, ki ga DNA-vezavna domena prepozna. Zadnja TALE ponovitev je polovične dolžine in vsebuje variabilen dipeptidni motiv. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov izvira iz endonukleaze FokI in se nahaja na C-koncu proteinov. V tehnologiji TALEN se pogosto uporablja FokI domena divjega tipa, obstajajo pa tudi mutirane variante, ki omogočajo boljšo specifičnost in/ali nukleazno aktivnost.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> <br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata, katero zaporedje na DNA bo TALEN prepoznal. Nespecifična FokI nukleazna domena pa omogoča cepitev verige DNA. Posamezen TALEN cepi le eno verigo DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo DNA-verigo tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Da je prišlo do dvojnega zloma DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi, ki skušajo napako popraviti. Mehanizem popravljanja lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ običajno vodi do uvedbe delecij ali insercij na mestu dvojnega zloma DNA, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12033 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T20:40:11Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih.<br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI.<br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema FokI domenama, strukture FokI nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).<br /> <br /> Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcije in ligacije. Sodobnejša različica je ''Golden Gate'' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.<br /> <br /> ===Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev===<br /> <br /> Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavni. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za sintezo TALEN-ov.<br /> <br /> Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv. Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5' koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3' koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3' koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.<br /> Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*). <br /> <br /> Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5' koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3' koncu značilen lepljiv konec.<br /> Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5' koncu fragmentov in BamHI, ki cepi za 3' koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. <br /> Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5' koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec režemo z BsaI, kar aktivira 3' konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3' koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3' koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment od nosilca ter ustvari primeren 5' konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.<br /> <br /> Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.<br /> <br /> ===Priprava ekspresijskih vektorjev za sintezo TALEN-ov===<br /> <br /> Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE- ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> <br /> Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.<br /> <br /> Pripravili so plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina. Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.<br /> <br /> V drugem delu eksperimenta so pripravili še plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE ponovitev, ki so ciljali 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, so izbrani pari TALEN-ov kazali aktivnost v 88 %. To nakazuje, da je območje ciljanja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za približanje TALEN-ov.<br /> <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. <br /> Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.<br />  <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12032 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T19:20:53Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih. <br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje konstruktov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in podrobno opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> <br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL. To so sekrecijski proteini pri bakterijah iz rodu Xanthomonas, ki se ob napadu bakterij na gostiteljsko rastlino izločajo v notranjost rastlinskih celic, v jedru se vežejo na DNA in vplivajo na transkripcijo gostiteljevih genov, kar poveča patogenost bakterij. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Število TALE-ponovitev znotraj domene določa dolžino zaporedja, ki ga DNA-vezavna domena prepozna. Zadnja TALE ponovitev je polovične dolžine in vsebuje variabilen dipeptidni motiv. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov izvira iz endonukleaze FokI in se nahaja na C-koncu proteinov. V tehnologiji TALEN se pogosto uporablja FokI domena divjega tipa, obstajajo pa tudi mutirane variante, ki omogočajo boljšo specifičnost in/ali nukleazno aktivnost.<br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> <br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata, katero zaporedje na DNA bo TALEN prepoznal. Nespecifična FokI nukleazna domena pa omogoča cepitev verige DNA. Posamezen TALEN cepi le eno verigo DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo DNA-verigo tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Da je prišlo do dvojnega zloma DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi, ki skušajo napako popraviti. Mehanizem popravljanja lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ običajno vodi do uvedbe delecij ali insercij na mestu dvojnega zloma DNA, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> # [[Seminarji SB 2016/17]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12031 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T19:18:12Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> <br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih. <br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje konstruktov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in podrobno opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> <br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL. To so sekrecijski proteini pri bakterijah iz rodu Xanthomonas, ki se ob napadu bakterij na gostiteljsko rastlino izločajo v notranjost rastlinskih celic, v jedru se vežejo na DNA in vplivajo na transkripcijo gostiteljevih genov, kar poveča patogenost bakterij. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Število TALE-ponovitev znotraj domene določa dolžino zaporedja, ki ga DNA-vezavna domena prepozna. Zadnja TALE ponovitev je polovične dolžine in vsebuje variabilen dipeptidni motiv. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov izvira iz endonukleaze FokI in se nahaja na C-koncu proteinov. V tehnologiji TALEN se pogosto uporablja FokI domena divjega tipa, obstajajo pa tudi mutirane variante, ki omogočajo boljšo specifičnost in/ali nukleazno aktivnost.<br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> <br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata, katero zaporedje na DNA bo TALEN prepoznal. Nespecifična FokI nukleazna domena pa omogoča cepitev verige DNA. Posamezen TALEN cepi le eno verigo DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo DNA-verigo tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Da je prišlo do dvojnega zloma DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi, ki skušajo napako popraviti. Mehanizem popravljanja lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ običajno vodi do uvedbe delecij ali insercij na mestu dvojnega zloma DNA, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2016/17&diff=12030 Seminarji SB 2016/17 2016-12-11T19:17:08Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI&lt;br&gt;<br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)<br /> # [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)<br /> # [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)<br /> # [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)<br /> # [[Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema]]. Tomaž Rozmarič (6.12.2016)<br /> # [[Robusten oscilator sinteznih genov z različnimi nastavitvami periode]]. Domen Klofutar (13.12.2016)<br /> # [[Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov]]. Petra Tavčar (13.12.2016)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI&lt;br&gt;<br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> #[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]<br /> #[[&quot;Training protein&quot; - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)<br /> #[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)<br /> #[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)<br /> #[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)<br /> #[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)<br /> #[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)<br /> #[[InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov]]. Alja Zgonc (6. 12. 2016)<br /> #[[Mos(kit)o]]. Judita Avbelj (6. 12. 2016)<br /> #[[BioSynthAge - Kvalitetno staranje]]. Tina Kuhar (6.12.2016)<br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12029 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T18:18:25Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih. <br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje konstruktov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in podrobno opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> <br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL. To so sekrecijski proteini pri bakterijah iz rodu Xanthomonas, ki se ob napadu bakterij na gostiteljsko rastlino izločajo v notranjost rastlinskih celic, v jedru se vežejo na DNA in vplivajo na transkripcijo gostiteljevih genov, kar poveča patogenost bakterij. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Število TALE-ponovitev znotraj domene določa dolžino zaporedja, ki ga DNA-vezavna domena prepozna. Zadnja TALE ponovitev je polovične dolžine in vsebuje variabilen dipeptidni motiv. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov izvira iz endonukleaze FokI in se nahaja na C-koncu proteinov. V tehnologiji TALEN se pogosto uporablja FokI domena divjega tipa, obstajajo pa tudi mutirane variante, ki omogočajo boljšo specifičnost in/ali nukleazno aktivnost.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> <br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata, katero zaporedje na DNA bo TALEN prepoznal. Nespecifična FokI nukleazna domena pa omogoča cepitev verige DNA. Posamezen TALEN cepi le eno verigo DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo DNA-verigo tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Da je prišlo do dvojnega zloma DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi, ki skušajo napako popraviti. Mehanizem popravljanja lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ običajno vodi do uvedbe delecij ali insercij na mestu dvojnega zloma DNA, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> <br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12028 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T18:01:28Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih. <br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje konstruktov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in podrobno opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> <br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL. To so sekrecijski proteini pri bakterijah iz rodu Xanthomonas, ki se ob napadu bakterij na gostiteljsko rastlino izločajo v notranjost rastlinskih celic, v jedru se vežejo na DNA in vplivajo na transkripcijo gostiteljevih genov, kar poveča patogenost bakterij. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Število TALE-ponovitev znotraj domene določa dolžino zaporedja, ki ga DNA-vezavna domena prepozna. Zadnja TALE ponovitev je polovične dolžine in vsebuje variabilen dipeptidni motiv. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov izvira iz endonukleaze FokI in se nahaja na C-koncu proteinov. V tehnologiji TALEN se pogosto uporablja FokI domena divjega tipa, obstajajo pa tudi mutirane variante, ki omogočajo boljšo specifičnost in/ali nukleazno aktivnost.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> <br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata, katero zaporedje na DNA bo TALEN prepoznal. Nespecifična FokI nukleazna domena pa omogoča cepitev verige DNA. Posamezen TALEN cepi le eno verigo DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo DNA-verigo tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Da je prišlo do dvojnega zloma DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi, ki skušajo napako popraviti. Mehanizem popravljanja lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ običajno vodi do uvedbe delecij ali insercij na mestu dvojnega zloma DNA, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.<br /> <br /> ==Sinteza TALEN-ov==</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12027 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T17:59:44Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih. <br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje konstruktov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in podrobno opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.<br /> <br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> ===Zgradba TALEN-ov===<br /> <br /> TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL. To so sekrecijski proteini pri bakterijah iz rodu Xanthomonas, ki se ob napadu bakterij na gostiteljsko rastlino izločajo v notranjost rastlinskih celic, v jedru se vežejo na DNA in vplivajo na transkripcijo gostiteljevih genov, kar poveča patogenost bakterij. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Število TALE-ponovitev znotraj domene določa dolžino zaporedja, ki ga DNA-vezavna domena prepozna. Zadnja TALE ponovitev je polovične dolžine in vsebuje variabilen dipeptidni motiv. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov izvira iz endonukleaze FokI in se nahaja na C-koncu proteinov. V tehnologiji TALEN se pogosto uporablja FokI domena divjega tipa, obstajajo pa tudi mutirane variante, ki omogočajo boljšo specifičnost in/ali nukleazno aktivnost.<br /> <br /> <br /> ===Delovanje TALEN-ov===<br /> <br /> Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata, katero zaporedje na DNA bo TALEN prepoznal. Nespecifična FokI nukleazna domena pa omogoča cepitev verige DNA. Posamezen TALEN cepi le eno verigo DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo DNA-verigo tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Da je prišlo do dvojnega zloma DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi, ki skušajo napako popraviti. Mehanizem popravljanja lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ običajno vodi do uvedbe delecij ali insercij na mestu dvojnega zloma DNA, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestavljanje_TALEN-ov_z_metodo_FLASH_za_visoko_zmogljivostno_urejanje_genomov&diff=12026 Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov 2016-12-11T17:40:06Z <p>Petra Tavčar: New page: [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing] Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so po...</p> <hr /> <div>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558947/ FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing]<br /> <br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih. <br /> Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje konstruktov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in podrobno opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov&diff=9431 Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov 2014-05-08T18:16:22Z <p>Petra Tavčar: /* MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Evkariontski genom je zapakiran v periodično nukleoproteinsko strukturo imenovano kromatin. Ponavljajoče se enote kromatina-nukleosomi, so sestavljene iz DNA, ki je navita okoli histonov. Za tako pakiranje DNA je potrebna mobilizacija in preoblikovanje nukleosomov, to pa omogočajo strojčki za preoblikovanje.<br /> Strojčki za preoblikovanje so proteini, ki za svoje delovanje potrebujejo ATP, tako je vsem strojčkom skupna ATPazna podenota in modulacija interakcij med histoni in DNA. Z svojim delovanjem pospešujejo(katalizirajo) mobilizacijo in prestavljanje nukleosomov.<br /> Kljub temu, da so znani številni raznoliki kompleksi preoblikovalnih strojčkov, ki vsebujejo motorno podenoto, ki pripada družini SNF-2 ATPaz. Posamezne poddružine se medseboj razlikujejo v proteinskih motivih izven ATPazne regije.<br /> Najbolj preučen je kompleks SWI/SNF, ki vsebuje Swi2/Snf2 ATPazno podenoto. Ta kompleks je prisoten v številnih organizmih, tudi pri človeku in pri kvaskovkah.<br /> <br /> == VEZAVA PREUREJEVALNIH STROJČKOV == <br /> <br /> Kako se bo preurejevalni kompleks vezal na substrat (nukleosom ali DNA), je odvisno od posameznega kompleksa. Kompleks NURF, se na substrat ne veže direktno, vendar preko histonskih repkov. Nekateri drugi kompleksi, ki vsebujejo ISWI ATPazno podenoto pa se na substrat vežejo le prehodno.<br /> Medtem pa se ravno nasprotno kompleks SWI/SNF jasno veže na DNA in nukleosome z zelo močno afiniteto. Zelo verjetno je, da interakcije potekajo preko malega žleba, saj se kompleks odcepi z DNA molekule preko distamicina A ali kromomicina A3 (vezavna reagenta v malem žlebu). Predpostavljeno je tudi, da se kompleksi vežejo na DNA preko HMGbox (proteinska domena, vključena pri vezavi DNA).<br /> Afiniteta SWI/SNF do nukleosomov je rahlo večja kot do DNA. Razlog za to so interakcije med komplesom in jedernimi histoni.<br /> <br /> == MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Ločimo encime, ki modificirajo histone in tiste, ki spreminjajo strukturo kromatina. K slednjim uvrščamo različne družine encimov, vsem pa je skupna ATPazna domena. Preurejevalni strojčki sodelujejo pri podvojevanju DNA, transkripciji, popravljanju napak na DNA, homologni rekombinaciji in spreminjanju strukture kromatina. (1)<br /> Točni mehanizmi delovanja še niso povsem jasni, znano pa je, da lahko preurejevalni strojčki delujejo na naslednje načine (1,2):<br /> <br /> -Katalizirajo premik nukleosomov po DNA verigi.<br /> <br /> -Katalizirajo prenos histonov iz nukleosoma na prosto DNA verigo (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Nukleazam olajšajo dostop do DNA.<br /> <br /> -Katalizirajo nastanek dinukleosomov iz mononukleosomov (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Uravnavajo vijačno zvitje DNA okrog hisnskega oktamera.<br /> <br /> -Omogočajo kontrolirano razgradnjo nukleosomov.<br /> <br /> Značilno je, da DNA, ki je bila najprej tesno ovita okrog histonskega oktamera, tvori zanko ali izboklino, ki štrli ven iz nukleosoma. Zanka lahko nastane zaradi encimsko kataliziranega zasuka DNA, zaradi česar se del DNA odvije od oktamera. Nastanek zanke je lahko tudi posledica translokazne aktivnosti preurejevalnih strojčkov (1).<br /> Raziskave in vitro kažejo na to, da poddružini SWI2/SNF2 in ISWI različno interagirata z nukleosomi ali DNA in zato preoblikujeta kromatin po različnih mehanizmih.<br /> <br /> === Poddružina ISWI: ===<br /> Za to poddružino je najverjetnejši translokacijski mehanizem delovanja, številni preurejevalni strojčki imajo namreč DNA translokazno aktivnost.<br /> Kompleksi ISWI prenašajo nukleosome v več stopnjah po 1 bazni par naprej, za vsak korak pa se porabi 1 ATP. Pri tem prenosu prihaja do torzije DNA. Posledica translokacije in torzije so oslabljene interakcije med histoni in DNA. Translokazna domena preurejevalnih kompleksov interagira z DNA, ki se nahaja na nukleosomski sredici, pomembne so tudi interakcije C-terminalnih domen kompleksa z DNA(3).<br /> Nedavne raziskave članov te poddružine so pokazale, da vzporedno potekata dve reakciji. Translokazna aktivnost pripomore k potiskanju DNA iz histonskega oktamera, hkrati pa se na drugi strani nukleosoma vanj vključuje DNA po 3 bazne pare hkrati. Preden začne DNA vstopati v nukleosom, pride do sedmih zaporednih reakcij, v katerih se 7 baznih parov DNA izloči iz nukleosoma. Ta korak nato preko neznanih mehanizmov spodbudi vleko DNA v nukleosom z druge strani. Ker se je izločilo več DNA, kot jo je vstopilo na drugi strani, pride do spremembe konformacija histonskega oktamera ali zvitja DNA na oktameru ali pa pride do kombinacije teh dveh pojavov. Ko z zadnje strani vstopa DNA, se nukleosom posledično premakne z 3 bazne pare po verigi. (3) Takšnemu mehanizmu rečemo tudi cis mehanizem, saj gre za premik nukleosoma po verigi DNA, ne da bi se pri tem kateri izmed histonov odcepil. (Shematični prikaz si lahko ogledate na povezavi: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3781322/figure/fig2/)<br /> <br /> === Poddružina SWI/SNF: ===<br /> Za ti poddružini je značilen tako cis kot tudi trans mehanizem prenosa nukleosomov (za slikovni prikaz klikni na naslednjo povezavo: http://mcb.asm.org/content/20/6/1899/F1.expansion.html). Pri slednjem pride do prenosa histonov na drugo DNA. V tem procesu sodelujejo akceptorji histonov, prednostno pa poteče ob vezavi transkripcijskih faktorjev na nukleosomsko DNA, ker se s tem interakcije med histoni in DNA še dodatno destabilizirajo.<br /> <br /> V celici večinoma poteka prenos nukleosomov po cis mehanizmu. Kadar pa zaradi raznih dejavnikov tak način prenosa ni mogoč, lahko preurejevalni kompleksi iz SWI/SNF in RSC poddružin še vedno preoblikujejo kromatin po trans mehanizmu. To jim najverjetneje omogočajo močne interakcije z DNA (v primerjavi z ISWI), ki destabilizirajo vezi med histoni in DNA in olajšajo prenos histonov na drugo DNA ali na histonske šaperone.<br /> Tako cis kot trans mehanizem povzročita spremembo v strukturi ali položaju nukleosoma, zaradi česar postane del DNA lažje dostopen transkripcijskim faktorjem in restrikcijskim encimom.<br /> <br /> == REGULACIJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Podenote v kromatin preurejevalnih kompleksih so lahko katalitične (ATPazne podenote) ali nekatalitične. Nekatalitične podenote imajo različne funkcije, ena izmed njih je tudi regulacija ATPaznih podent. Npr. V SWI/SNF poddružini sta ATPazni podenoti BRG1 in hBRM stimulirani s strani treh neATPaznih podenot; INI1, BAF155 in BAF170, v poddružini ISIW aktivnost kromatin preurejevalnih kompleksov uravnava podenota Acf1, ki olajša in izboljša drsenje med nukleosomi ter vpliva na smer njihovega gibanja (1). <br /> <br /> S podenotami kromatin preurejevalnih kompleksov je v poddružinah SWI/SNF, RSC in INO80 povezan tudi aktin in nekateri ARPji (actin-related proteins). Vendar tu ne govorimo o citoplazemskih ARPjih in aktinu temveč o jedrnih. Citoplazemski ARPji imajo vlogo pri nukleaciji aktinskih filamentov, ter pri ureditvi citoskeleta, jedrni ARPji (Arp 4,5,6,7,8 in Arp 9) so pa povezani izključno s kromatin preurejevalnimi kompleksi (4).<br /> Pri kvasovkah, v poddružini SWI/SNF, delujeta Arp 7 in Arp 9 kot heterodimera in se vežeta na katalitično podenoto Snf2. Pri ljudeh pa, za primerjavo, v poddružini SWI/SNF deluje aktin in se veže na BRG1 podenoto. V raziskavah so dokazali, da zdravila, ki vplivajo na delovanje aktina, posledično tudi zmanjšajo SWI/SNF ATPazno aktivnost, kar dokazuje, da aktin in ARPji pozitivno regulirajo kromatin preurejevalne aktivnosti (4,5).<br /> Aktin in Arpji se vežejo neposredno na eno izmed dveh domen preurejevalne podenote ATPaze; na domeno HSA (helicase-SANT–associated domain). HSA domene torej selektivno vežejo večino Arpjev in aktina v kromatin preurejevalni kompleks. Raziskave v poddružini INO80 so pokazale da vezava ARPjev na HSA domeno spodbuja aktivnost ATPazne podenote, vezavo DNA in mobilizacijo nukleosomov (5).<br /> <br /> == VIRI ==<br /> <br /> 1 Lusser A., Kadonaga J.T. Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines, BioEssays, 2003, letn. 25, str. 1192-1200.<br /> <br /> 2 Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., Workman J.L. ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Complexes, Molecular and cellular biology, 2000, letn. 20, str. 1899-1910.<br /> <br /> 3 Narlikar G.J., Sundaramoorthy R., Owen-Hughes T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes, 2013, Cell, letn.154, str. 490-503.<br /> <br /> 4 H. Szerlong, K. Hinata, R. Viswanathan, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst in B. R. Cairns. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. 2008. Nat. Struct. Mol. Biol. 15(5): 469–476.<br /> <br /> 5 C. R. Clapier in B. R. Cairns. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. 2009. Annu. Rev. Biochem. 78:273-304<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov&diff=9407 Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov 2014-05-03T15:23:17Z <p>Petra Tavčar: /* MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Evkariontski genom je zapakiran v periodično nukleoproteinsko strukturo imenovano kromatin. Ponavljajoče se enote kromatina-nukleosomi, so sestavljene iz DNA, ki je navita okoli histonov. Za tako pakiranje DNA je potrebna mobilizacija in preoblikovanje nukleosomov, to pa omogočajo strojčki za preoblikovanje.<br /> Strojčki za preoblikovanje so proteini, ki za svoje delovanje potrebujejo ATP, tako je vsem strojčkom skupna ATPazna podenota in modulacija interakcij med histoni in DNA. Z svojim delovanjem pospešujejo(katalizirajo) mobilizacijo in prestavljanje nukleosomov.<br /> Kljub temu, da so znani številni raznoliki kompleksi preoblikovalnih strojčkov, ki vsebujejo motorno podenoto, ki pripada družini SNF-2 ATPaz. Posamezne poddružine se medseboj razlikujejo v proteinskih motivih izven ATPazne regije.<br /> Najbolj preučen je kompleks SWI/SNF, ki vsebuje Swi2/Snf2 ATPazno podenoto. Ta kompleks je prisoten v številnih organizmih, tudi pri človeku in pri kvaskovkah.<br /> <br /> == VEZAVA PREUREJEVALNIH STROJČKOV == <br /> <br /> Kako se bo preurejevalni kompleks vezal na substrat (nukleosom ali DNA), je odvisno od posameznega kompleksa. Kompleks NURF, se na substrat ne veže direktno, vendar preko histonskih repkov. Nekateri drugi kompleksi, ki vsebujejo ISWI ATPazno podenoto pa se na substrat vežejo le prehodno.<br /> Medtem pa se ravno nasprotno kompleks SWI/SNF jasno veže na DNA in nukleosome z zelo močno afiniteto. Zelo verjetno je, da interakcije potekajo preko malega žleba, saj se kompleks odcepi z DNA molekule preko distamicina A ali kromomicina A3 (vezavna reagenta v malem žlebu). Predpostavljeno je tudi, da se kompleksi vežejo na DNA preko HMGbox (proteinska domena, vključena pri vezavi DNA).<br /> Afiniteta SWI/SNF do nukleosomov je rahlo večja kot do DNA. Razlog za to so interakcije med komplesom in jedernimi histoni.<br /> <br /> == MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Ločimo encime, ki modificirajo histone in tiste, ki spreminjajo strukturo kromatina. K slednjim uvrščamo različne družine encimov, vsem pa je skupna ATPazna domena. Preurejevalni strojčki sodelujejo pri podvojevanju DNA, transkripciji, popravljanju napak na DNA, homologni rekombinaciji in spreminjanju strukture kromatina. (1)<br /> Točni mehanizmi delovanja še niso povsem jasni, znano pa je, da lahko preurejevalni strojčki delujejo na naslednje načine (1,2):<br /> <br /> -Katalizirajo premik nukleosomov po DNA verigi.<br /> <br /> -Katalizirajo prenos histonov iz nukleosoma na prosto DNA verigo (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Nukleazam olajšajo dostop do DNA.<br /> <br /> -Katalizirajo nastanek dinukleosomov iz mononukleosomov (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Omogočajo vijačno zvitje DNA.<br /> <br /> -Omogočajo kontrolirano razgradnjo nukleosomov.<br /> <br /> Značilno je, da DNA, ki je bila najprej tesno ovita okrog histonskega oktamera, tvori zanko ali izboklino, ki štrli ven iz nukleosoma. Zanka lahko nastane zaradi encimsko kataliziranega zasuka DNA, zaradi česar se del DNA odvije od oktamera. Nastanek zanke je lahko tudi posledica translokazne aktivnosti preurejevalnih strojčkov (1).<br /> Raziskave in vitro kažejo na to, da poddružini SWI2/SNF2 in ISWI različno interagirata z nukleosomi ali DNA in zato preoblikujeta kromatin po različnih mehanizmih.<br /> <br /> === Poddružina ISWI: ===<br /> Za to poddružino je najverjetnejši translokacijski mehanizem delovanja, številni preurejevalni strojčki imajo namreč DNA translokazno aktivnost.<br /> Kompleksi ISWI prenašajo nukleosome v več stopnjah po 1 bazni par naprej, za vsak korak pa se porabi 1 ATP. Pri tem prenosu prihaja do torzije DNA. Posledica translokacije in torzije so oslabljene interakcije med histoni in DNA. Translokazna domena preurejevalnih kompleksov interagira z DNA, ki se nahaja na nukleosomski sredici. (3)<br /> Nedavne raziskave članov te poddružine so pokazale, da vzporedno potekata dve reakciji. Translokazna aktivnost pripomore k potiskanju DNA iz histonskega oktamera, hkrati pa se na drugi strani nukleosoma vanj vključuje DNA po 3 bazne pare hkrati. Preden začne DNA vstopati v nukleosom, pride do sedmih zaporednih reakcij, v katerih se 7 baznih parov DNA izloči iz nukleosoma. Ta korak nato preko neznanih mehanizmov spodbudi vleko DNA v nukleosom z druge strani. Ker se je izločilo več DNA, kot jo je vstopilo na drugi strani, pride do spremembe konformacija histonskega oktamera ali zvitja DNA na oktameru ali pa pride do kombinacije teh dveh pojavov (v nasprotnem primeru je znotraj nukleosoma pomankanje DNA, zato se nemore tvoriti zanka). Ko z zadnje strani vstopa DNA, se nukleosom posledično premakne z 3 bazne pare po verigi. (3) Takšnemu mehanizmu rečemo tudi cis mehanizem, saj gre za premik nukleosoma po verigi DNA, ne da bi se pri tem kateri izmed histonov odcepil. (Shematični prikaz si lahko ogledate na povezavi: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3781322/figure/fig2/)<br /> <br /> === Poddružini SWI/SNF in RSC: ===<br /> Za ti poddružini je značilen tako cis kot tudi trans mehanizem prenosa nukleosomov (za slikovni prikaz klikni na naslednjo povezavo: http://mcb.asm.org/content/20/6/1899/F1.expansion.html). Pri slednjem pride do prenosa histonov na drugo DNA. V tem procesu sodelujejo akceptorji histonov, prednostno pa poteče ob vezavi transkripcijskih faktorjev na nukleosomsko DNA, ker se s tem interakcije med histoni in DNA še dodatno destabilizirajo.<br /> <br /> V celici večinoma poteka prenos nukleosomov po cis mehanizmu. Kadar pa zaradi raznih dejavnikov tak način prenosa ni mogoč, lahko preurejevalni kompleksi iz SWI/SNF in RSC poddružin še vedno preoblikujejo kromatin po trans mehanizmu. To jim najverjetneje omogočajo močne interakcije z DNA (v primerjavi z ISWI), ki destabilizirajo vezi med histoni in DNA in olajšajo prenos histonov na drugo DNA ali na histonske šaperone.<br /> Tako cis kot trans mehanizem povzročita spremembo v strukturi ali položaju nukleosoma, zaradi česar postane del DNA lažje dostopen transkripcijskim faktorjem in restrikcijskim encimom.<br /> <br /> == REGULACIJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Podenote v kromatin preurejevalnih kompleksih so lahko katalitične (ATPazne podenote) ali nekatalitične. Nekatalitične podenote imajo različne funkcije, ena izmed njih je tudi regulacija ATPaznih podent. Npr. V SWI/SNF poddružini sta ATPazni podenoti BRG1 in hBRM stimulirani s strani treh neATPaznih podenot; INI1, BAF155 in BAF170, v poddružini ISIW aktivnost kromatin preurejevalnih kompleksov uravnava podenota Acf1, ki olajša in izboljša drsenje med nukleosomi ter vpliva na smer njihovega gibanja (1). <br /> <br /> S podenotami kromatin preurejevalnih kompleksov je v poddružinah SWI/SNF, RSC in INO80 povezan tudi aktin in nekateri ARPji (actin-related proteins). Vendar tu ne govorimo o citoplazemskih ARPjih in aktinu temveč o jedrnih. Citoplazemski ARPji imajo vlogo pri nukleaciji aktinskih filamentov, ter pri ureditvi citoskeleta, jedrni ARPji (Arp 4,5,6,7,8 in Arp 9) so pa povezani izključno s kromatin preurejevalnimi kompleksi (4).<br /> Pri kvasovkah, v poddružini SWI/SNF, delujeta Arp 7 in Arp 9 kot heterodimera in se vežeta na katalitično podenoto Snf2. Pri ljudeh pa, za primerjavo, v poddružini SWI/SNF deluje aktin in se veže na BRG1 podenoto. V raziskavah so dokazali, da zdravila, ki vplivajo na delovanje aktina, posledično tudi zmanjšajo SWI/SNF ATPazno aktivnost, kar dokazuje, da aktin in ARPji pozitivno regulirajo kromatin preurejevalne aktivnosti (4,5).<br /> Aktin in Arpji se vežejo neposredno na eno izmed dveh domen preurejevalne podenote ATPaze; na domeno HSA (helicase-SANT–associated domain). HSA domene torej selektivno vežejo večino Arpjev in aktina v kromatin preurejevalni kompleks. Raziskave v poddružini INO80 so pokazale da vezava ARPjev na HSA domeno spodbuja aktivnost ATPazne podenote, vezavo DNA in mobilizacijo nukleosomov (5).<br /> <br /> == VIRI ==<br /> <br /> 1 Lusser A., Kadonaga J.T. Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines, BioEssays, 2003, letn. 25, str. 1192-1200.<br /> <br /> 2 Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., Workman J.L. ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Complexes, Molecular and cellular biology, 2000, letn. 20, str. 1899-1910.<br /> <br /> 3 Narlikar G.J., Sundaramoorthy R., Owen-Hughes T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes, 2013, Cell, letn.154, str. 490-503.<br /> <br /> 4 H. Szerlong, K. Hinata, R. Viswanathan, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst in B. R. Cairns. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. 2008. Nat. Struct. Mol. Biol. 15(5): 469–476.<br /> <br /> 5 C. R. Clapier in B. R. Cairns. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. 2009. Annu. Rev. Biochem. 78:273-304<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov&diff=9248 Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov 2014-04-20T17:44:21Z <p>Petra Tavčar: /* Poddružini SWI/SNF in RSC: */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Evkariontski genom je zapakiran v periodično nukleoproteinsko strukturo imenovano kromatin. Ponavljajoče se enote kromatina-nukleosomi, so sestavljene iz DNA, ki je navita okoli histonov. Za tako pakiranje DNA je potrebna mobilizacija in preoblikovanje nukleosomov, to pa omogočajo strojčki za preoblikovanje.<br /> Strojčki za preoblikovanje so proteini, ki za svoje delovanje potrebujejo ATP, tako je vsem strojčkom skupna ATPazna podenota in modulacija interakcij med histoni in DNA. Z svojim delovanjem pospešujejo(katalizirajo) mobilizacijo in prestavljanje nukleosomov.<br /> Kljub temu, da so znani številni raznoliki kompleksi preoblikovalnih strojčkov, ki vsebujejo motorno podenoto, ki pripada družini SNF-2 ATPaz. Posamezne poddružine se medseboj razlikujejo v proteinskih motivih izven ATPazne regije.<br /> Najbolj preučen je kompleks SWI/SNF, ki vsebuje Swi2/Snf2 ATPazno podenoto. Ta kompleks je prisoten v številnih organizmih, tudi pri človeku in pri kvaskovkah.<br /> <br /> == VEZAVA PREUREJEVALNIH STROJČKOV == <br /> <br /> Kako se bo preurejevalni kompleks vezal na substrat (nukleosom ali DNA), je odvisno od posameznega kompleksa. Kompleks NURF, se na substrat ne veže direktno, vendar preko histonskih repkov. Nekateri drugi kompleksi, ki vsebujejo ISWI ATPazno podenoto pa se na substrat vežejo le prehodno.<br /> Medtem pa se ravno nasprotno kompleks SWI/SNF jasno veže na DNA in nukleosome z zelo močno afiniteto. Zelo verjetno je, da interakcije potekajo preko malega žleba, saj se kompleks odcepi z DNA molekule preko distamicina A ali kromomicina A3 (vezavna reagenta v malem žlebu). Predpostavljeno je tudi, da se kompleksi vežejo na DNA preko HMGbox (proteinska domena, vključena pri vezavi DNA).<br /> Afiniteta SWI/SNF do nukleosomov je rahlo večja kot do DNA. Razlog za to so interakcije med komplesom in jedernimi histoni.<br /> <br /> == MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Ločimo encime, ki modificirajo histone in tiste, ki spreminjajo strukturo kromatina. K slednjim uvrščamo različne družine encimov, vsem pa je skupna ATPazna domena. Preurejevalni strojčki sodelujejo pri podvojevanju DNA, transkripciji, popravljanju napak na DNA, homologni rekombinaciji in spreminjanju strukture kromatina. (1)<br /> Točni mehanizmi delovanja še niso povsem jasni, znano pa je, da lahko preurejevalni strojčki delujejo na naslednje načine (1,2):<br /> <br /> -Katalizirajo premik nukleosomov po DNA verigi.<br /> <br /> -Katalizirajo prenos histonov iz nukleosoma na prosto DNA verigo (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Nukleazam olajšajo dostop do DNA.<br /> <br /> -Katalizirajo nastanek dinukleosomov iz mononukleosomov (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Povzročajo torzijo dodatno zvite vijačnice.<br /> <br /> -Omogočajo kontrolirano razgradnjo nukleosomov.<br /> <br /> Značilno je, da DNA, ki je bila najprej tesno ovita okrog histonskega oktamera, tvori zanko ali izboklino, ki štrli ven iz nukleosoma. Zanka lahko nastane zaradi encimsko kataliziranega zasuka DNA, zaradi česar se del DNA odvije od oktamera. Nastanek zanke je lahko tudi posledica translokazne aktivnosti preurejevalnih strojčkov (1).<br /> Raziskave in vitro kažejo na to, da poddružini SWI2/SNF2 in ISWI različno interagirata z nukleosomi ali DNA in zato preoblikujeta kromatin po različnih mehanizmih.<br /> <br /> === Poddružina ISWI: ===<br /> Za to poddružino je najverjetnejši translokacijski mehanizem delovanja, številni preurejevalni strojčki imajo namreč DNA translokazno aktivnost.<br /> Kompleksi ISWI prenašajo nukleosome v več stopnjah po 1 bazni par naprej, za vsak korak pa se porabi 1 ATP. Pri tem prenosu prihaja do torzije DNA. Posledica translokacije in torzije so oslabljene interakcije med histoni in DNA. Translokazna domena preurejevalnih kompleksov interagira z DNA, ki se nahaja na nukleosomski sredici. (3)<br /> Nedavne raziskave članov te poddružine so pokazale, da vzporedno potekata dve reakciji. Translokazna aktivnost pripomore k potiskanju DNA iz histonskega oktamera, hkrati pa se na drugi strani nukleosoma vanj vključuje DNA po 3 bazne pare hkrati. Preden začne DNA vstopati v nukleosom, pride do sedmih zaporednih reakcij, v katerih se 7 baznih parov DNA izloči iz nukleosoma. Ta korak nato preko neznanih mehanizmov spodbudi vleko DNA v nukleosom z druge strani. Ker se je izločilo več DNA, kot jo je vstopilo na drugi strani, pride do spremembe konformacija histonskega oktamera ali zvitja DNA na oktameru ali pa pride do kombinacije teh dveh pojavov (v nasprotnem primeru je znotraj nukleosoma pomankanje DNA, zato se nemore tvoriti zanka). Ko z zadnje strani vstopa DNA, se nukleosom posledično premakne z 3 bazne pare po verigi. (3) Takšnemu mehanizmu rečemo tudi cis mehanizem, saj gre za premik nukleosoma po verigi DNA, ne da bi se pri tem kateri izmed histonov odcepil. (Shematični prikaz si lahko ogledate na povezavi: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3781322/figure/fig2/)<br /> <br /> === Poddružini SWI/SNF in RSC: ===<br /> Za ti poddružini je značilen tako cis kot tudi trans mehanizem prenosa nukleosomov (za slikovni prikaz klikni na naslednjo povezavo: http://mcb.asm.org/content/20/6/1899/F1.expansion.html). Pri slednjem pride do prenosa histonov na drugo DNA. V tem procesu sodelujejo akceptorji histonov, prednostno pa poteče ob vezavi transkripcijskih faktorjev na nukleosomsko DNA, ker se s tem interakcije med histoni in DNA še dodatno destabilizirajo.<br /> <br /> V celici večinoma poteka prenos nukleosomov po cis mehanizmu. Kadar pa zaradi raznih dejavnikov tak način prenosa ni mogoč, lahko preurejevalni kompleksi iz SWI/SNF in RSC poddružin še vedno preoblikujejo kromatin po trans mehanizmu. To jim najverjetneje omogočajo močne interakcije z DNA (v primerjavi z ISWI), ki destabilizirajo vezi med histoni in DNA in olajšajo prenos histonov na drugo DNA ali na histonske šaperone.<br /> Tako cis kot trans mehanizem povzročita spremembo v strukturi ali položaju nukleosoma, zaradi česar postane del DNA lažje dostopen transkripcijskim faktorjem in restrikcijskim encimom.<br /> <br /> == REGULACIJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Podenote v kromatin preurejevalnih kompleksih so lahko katalitične (ATPazne podenote) ali nekatalitične. Nekatalitične podenote imajo različne funkcije, ena izmed njih je tudi regulacija ATPaznih podent. Npr. V SWI/SNF poddružini sta ATPazni podenoti BRG1 in hBRM stimulirani s strani treh neATPaznih podenot; INI1, BAF155 in BAF170, v poddružini ISIW aktivnost kromatin preurejevalnih kompleksov uravnava podenota Acf1, ki olajša in izboljša drsenje med nukleosomi ter vpliva na smer njihovega gibanja (1). <br /> <br /> S podenotami kromatin preurejevalnih kompleksov je v poddružinah SWI/SNF, RSC in INO80 povezan tudi aktin in nekateri ARPji (actin-related proteins). Vendar tu ne govorimo o citoplazemskih ARPjih in aktinu temveč o jedrnih. Citoplazemski ARPji imajo vlogo pri nukleaciji aktinskih filamentov, ter pri ureditvi citoskeleta, jedrni ARPji (Arp 4,5,6,7,8 in Arp 9) so pa povezani izključno s kromatin preurejevalnimi kompleksi (4).<br /> Pri kvasovkah, v poddružini SWI/SNF, delujeta Arp 7 in Arp 9 kot heterodimera in se vežeta na katalitično podenoto Snf2. Pri ljudeh pa, za primerjavo, v poddružini SWI/SNF deluje aktin in se veže na BRG1 podenoto. V raziskavah so dokazali, da zdravila, ki vplivajo na delovanje aktina, posledično tudi zmanjšajo SWI/SNF ATPazno aktivnost, kar dokazuje, da aktin in ARPji pozitivno regulirajo kromatin preurejevalne aktivnosti (4,5).<br /> Aktin in Arpji se vežejo neposredno na eno izmed dveh domen preurejevalne podenote ATPaze; na domeno HSA (helicase-SANT–associated domain). HSA domene torej selektivno vežejo večino Arpjev in aktina v kromatin preurejevalni kompleks. Raziskave v poddružini INO80 so pokazale da vezava ARPjev na HSA domeno spodbuja aktivnost ATPazne podenote, vezavo DNA in mobilizacijo nukleosomov (5).<br /> <br /> == VIRI ==<br /> <br /> 1 Lusser A., Kadonaga J.T. Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines, BioEssays, 2003, letn. 25, str. 1192-1200.<br /> <br /> 2 Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., Workman J.L. ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Complexes, Molecular and cellular biology, 2000, letn. 20, str. 1899-1910.<br /> <br /> 3 Narlikar G.J., Sundaramoorthy R., Owen-Hughes T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes, 2013, Cell, letn.154, str. 490-503.<br /> <br /> 4 H. Szerlong, K. Hinata, R. Viswanathan, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst in B. R. Cairns. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. 2008. Nat. Struct. Mol. Biol. 15(5): 469–476.<br /> <br /> 5 C. R. Clapier in B. R. Cairns. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. 2009. Annu. Rev. Biochem. 78:273-304<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov&diff=9247 Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov 2014-04-20T17:41:54Z <p>Petra Tavčar: /* Poddružini SWI/SNF in RSC: */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Evkariontski genom je zapakiran v periodično nukleoproteinsko strukturo imenovano kromatin. Ponavljajoče se enote kromatina-nukleosomi, so sestavljene iz DNA, ki je navita okoli histonov. Za tako pakiranje DNA je potrebna mobilizacija in preoblikovanje nukleosomov, to pa omogočajo strojčki za preoblikovanje.<br /> Strojčki za preoblikovanje so proteini, ki za svoje delovanje potrebujejo ATP, tako je vsem strojčkom skupna ATPazna podenota in modulacija interakcij med histoni in DNA. Z svojim delovanjem pospešujejo(katalizirajo) mobilizacijo in prestavljanje nukleosomov.<br /> Kljub temu, da so znani številni raznoliki kompleksi preoblikovalnih strojčkov, ki vsebujejo motorno podenoto, ki pripada družini SNF-2 ATPaz. Posamezne poddružine se medseboj razlikujejo v proteinskih motivih izven ATPazne regije.<br /> Najbolj preučen je kompleks SWI/SNF, ki vsebuje Swi2/Snf2 ATPazno podenoto. Ta kompleks je prisoten v številnih organizmih, tudi pri človeku in pri kvaskovkah.<br /> <br /> == VEZAVA PREUREJEVALNIH STROJČKOV == <br /> <br /> Kako se bo preurejevalni kompleks vezal na substrat (nukleosom ali DNA), je odvisno od posameznega kompleksa. Kompleks NURF, se na substrat ne veže direktno, vendar preko histonskih repkov. Nekateri drugi kompleksi, ki vsebujejo ISWI ATPazno podenoto pa se na substrat vežejo le prehodno.<br /> Medtem pa se ravno nasprotno kompleks SWI/SNF jasno veže na DNA in nukleosome z zelo močno afiniteto. Zelo verjetno je, da interakcije potekajo preko malega žleba, saj se kompleks odcepi z DNA molekule preko distamicina A ali kromomicina A3 (vezavna reagenta v malem žlebu). Predpostavljeno je tudi, da se kompleksi vežejo na DNA preko HMGbox (proteinska domena, vključena pri vezavi DNA).<br /> Afiniteta SWI/SNF do nukleosomov je rahlo večja kot do DNA. Razlog za to so interakcije med komplesom in jedernimi histoni.<br /> <br /> == MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Ločimo encime, ki modificirajo histone in tiste, ki spreminjajo strukturo kromatina. K slednjim uvrščamo različne družine encimov, vsem pa je skupna ATPazna domena. Preurejevalni strojčki sodelujejo pri podvojevanju DNA, transkripciji, popravljanju napak na DNA, homologni rekombinaciji in spreminjanju strukture kromatina. (1)<br /> Točni mehanizmi delovanja še niso povsem jasni, znano pa je, da lahko preurejevalni strojčki delujejo na naslednje načine (1,2):<br /> <br /> -Katalizirajo premik nukleosomov po DNA verigi.<br /> <br /> -Katalizirajo prenos histonov iz nukleosoma na prosto DNA verigo (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Nukleazam olajšajo dostop do DNA.<br /> <br /> -Katalizirajo nastanek dinukleosomov iz mononukleosomov (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Povzročajo torzijo dodatno zvite vijačnice.<br /> <br /> -Omogočajo kontrolirano razgradnjo nukleosomov.<br /> <br /> Značilno je, da DNA, ki je bila najprej tesno ovita okrog histonskega oktamera, tvori zanko ali izboklino, ki štrli ven iz nukleosoma. Zanka lahko nastane zaradi encimsko kataliziranega zasuka DNA, zaradi česar se del DNA odvije od oktamera. Nastanek zanke je lahko tudi posledica translokazne aktivnosti preurejevalnih strojčkov (1).<br /> Raziskave in vitro kažejo na to, da poddružini SWI2/SNF2 in ISWI različno interagirata z nukleosomi ali DNA in zato preoblikujeta kromatin po različnih mehanizmih.<br /> <br /> === Poddružina ISWI: ===<br /> Za to poddružino je najverjetnejši translokacijski mehanizem delovanja, številni preurejevalni strojčki imajo namreč DNA translokazno aktivnost.<br /> Kompleksi ISWI prenašajo nukleosome v več stopnjah po 1 bazni par naprej, za vsak korak pa se porabi 1 ATP. Pri tem prenosu prihaja do torzije DNA. Posledica translokacije in torzije so oslabljene interakcije med histoni in DNA. Translokazna domena preurejevalnih kompleksov interagira z DNA, ki se nahaja na nukleosomski sredici. (3)<br /> Nedavne raziskave članov te poddružine so pokazale, da vzporedno potekata dve reakciji. Translokazna aktivnost pripomore k potiskanju DNA iz histonskega oktamera, hkrati pa se na drugi strani nukleosoma vanj vključuje DNA po 3 bazne pare hkrati. Preden začne DNA vstopati v nukleosom, pride do sedmih zaporednih reakcij, v katerih se 7 baznih parov DNA izloči iz nukleosoma. Ta korak nato preko neznanih mehanizmov spodbudi vleko DNA v nukleosom z druge strani. Ker se je izločilo več DNA, kot jo je vstopilo na drugi strani, pride do spremembe konformacija histonskega oktamera ali zvitja DNA na oktameru ali pa pride do kombinacije teh dveh pojavov (v nasprotnem primeru je znotraj nukleosoma pomankanje DNA, zato se nemore tvoriti zanka). Ko z zadnje strani vstopa DNA, se nukleosom posledično premakne z 3 bazne pare po verigi. (3) Takšnemu mehanizmu rečemo tudi cis mehanizem, saj gre za premik nukleosoma po verigi DNA, ne da bi se pri tem kateri izmed histonov odcepil. (Shematični prikaz si lahko ogledate na povezavi: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3781322/figure/fig2/)<br /> <br /> === Poddružini SWI/SNF in RSC: ===<br /> Za ti poddružini je značilen tako cis kot tudi trans mehanizem prenosa nukleosomov (za slikovni prikaz klikni na naslednjo povazavo: http://mcb.asm.org/content/20/6/1899/F1.expansion.html). Pri slednjem pride do prenosa histonov na drugo DNA. V tem procesu sodelujejo akceptorji histonov, prednostno pa poteče ob vezavi transkripcijskih faktorjev na nukleosomsko DNA, saj se s tem interakcije med histoni in DNA še dodatno destabilizirajo.<br /> V celici večinoma poteka prenos nukleosomov po cis mehanizmu. Kadar pa zaradi raznih dejavnikov tak način prenosa ni mogoč, lahko preurejevalni kompleksi iz SWI/SNF in RSC poddružin še vedno preoblikujejo kromatin po trans mehanizmu. To jim najverjetneje omogočajo močne interakcije z DNA (v primerjavi z ISWI), ki destabilizirajo vezi med histoni in DNA in olajšajo prenos histonov na drugo DNA ali na histonske šaperone.<br /> Tako cis kot trans mehanizem povzročita spremembo v strukturi ali položaju nukleosoma, zaradi česar postane del DNA lažje dostopen transkripcijskim faktorjem in restrikcijskim encimom.<br /> <br /> == REGULACIJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Podenote v kromatin preurejevalnih kompleksih so lahko katalitične (ATPazne podenote) ali nekatalitične. Nekatalitične podenote imajo različne funkcije, ena izmed njih je tudi regulacija ATPaznih podent. Npr. V SWI/SNF poddružini sta ATPazni podenoti BRG1 in hBRM stimulirani s strani treh neATPaznih podenot; INI1, BAF155 in BAF170, v poddružini ISIW aktivnost kromatin preurejevalnih kompleksov uravnava podenota Acf1, ki olajša in izboljša drsenje med nukleosomi ter vpliva na smer njihovega gibanja (1). <br /> <br /> S podenotami kromatin preurejevalnih kompleksov je v poddružinah SWI/SNF, RSC in INO80 povezan tudi aktin in nekateri ARPji (actin-related proteins). Vendar tu ne govorimo o citoplazemskih ARPjih in aktinu temveč o jedrnih. Citoplazemski ARPji imajo vlogo pri nukleaciji aktinskih filamentov, ter pri ureditvi citoskeleta, jedrni ARPji (Arp 4,5,6,7,8 in Arp 9) so pa povezani izključno s kromatin preurejevalnimi kompleksi (4).<br /> Pri kvasovkah, v poddružini SWI/SNF, delujeta Arp 7 in Arp 9 kot heterodimera in se vežeta na katalitično podenoto Snf2. Pri ljudeh pa, za primerjavo, v poddružini SWI/SNF deluje aktin in se veže na BRG1 podenoto. V raziskavah so dokazali, da zdravila, ki vplivajo na delovanje aktina, posledično tudi zmanjšajo SWI/SNF ATPazno aktivnost, kar dokazuje, da aktin in ARPji pozitivno regulirajo kromatin preurejevalne aktivnosti (4,5).<br /> Aktin in Arpji se vežejo neposredno na eno izmed dveh domen preurejevalne podenote ATPaze; na domeno HSA (helicase-SANT–associated domain). HSA domene torej selektivno vežejo večino Arpjev in aktina v kromatin preurejevalni kompleks. Raziskave v poddružini INO80 so pokazale da vezava ARPjev na HSA domeno spodbuja aktivnost ATPazne podenote, vezavo DNA in mobilizacijo nukleosomov (5).<br /> <br /> == VIRI ==<br /> <br /> 1 Lusser A., Kadonaga J.T. Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines, BioEssays, 2003, letn. 25, str. 1192-1200.<br /> <br /> 2 Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., Workman J.L. ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Complexes, Molecular and cellular biology, 2000, letn. 20, str. 1899-1910.<br /> <br /> 3 Narlikar G.J., Sundaramoorthy R., Owen-Hughes T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes, 2013, Cell, letn.154, str. 490-503.<br /> <br /> 4 H. Szerlong, K. Hinata, R. Viswanathan, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst in B. R. Cairns. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. 2008. Nat. Struct. Mol. Biol. 15(5): 469–476.<br /> <br /> 5 C. R. Clapier in B. R. Cairns. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. 2009. Annu. Rev. Biochem. 78:273-304<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov&diff=9245 Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov 2014-04-20T17:36:32Z <p>Petra Tavčar: /* Poddružini SWI/SNF in RSC: */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Evkariontski genom je zapakiran v periodično nukleoproteinsko strukturo imenovano kromatin. Ponavljajoče se enote kromatina-nukleosomi, so sestavljene iz DNA, ki je navita okoli histonov. Za tako pakiranje DNA je potrebna mobilizacija in preoblikovanje nukleosomov, to pa omogočajo strojčki za preoblikovanje.<br /> Strojčki za preoblikovanje so proteini, ki za svoje delovanje potrebujejo ATP, tako je vsem strojčkom skupna ATPazna podenota in modulacija interakcij med histoni in DNA. Z svojim delovanjem pospešujejo(katalizirajo) mobilizacijo in prestavljanje nukleosomov.<br /> Kljub temu, da so znani številni raznoliki kompleksi preoblikovalnih strojčkov, ki vsebujejo motorno podenoto, ki pripada družini SNF-2 ATPaz. Posamezne poddružine se medseboj razlikujejo v proteinskih motivih izven ATPazne regije.<br /> Najbolj preučen je kompleks SWI/SNF, ki vsebuje Swi2/Snf2 ATPazno podenoto. Ta kompleks je prisoten v številnih organizmih, tudi pri človeku in pri kvaskovkah.<br /> <br /> == VEZAVA PREUREJEVALNIH STROJČKOV == <br /> <br /> Kako se bo preurejevalni kompleks vezal na substrat (nukleosom ali DNA), je odvisno od posameznega kompleksa. Kompleks NURF, se na substrat ne veže direktno, vendar preko histonskih repkov. Nekateri drugi kompleksi, ki vsebujejo ISWI ATPazno podenoto pa se na substrat vežejo le prehodno.<br /> Medtem pa se ravno nasprotno kompleks SWI/SNF jasno veže na DNA in nukleosome z zelo močno afiniteto. Zelo verjetno je, da interakcije potekajo preko malega žleba, saj se kompleks odcepi z DNA molekule preko distamicina A ali kromomicina A3 (vezavna reagenta v malem žlebu). Predpostavljeno je tudi, da se kompleksi vežejo na DNA preko HMGbox (proteinska domena, vključena pri vezavi DNA).<br /> Afiniteta SWI/SNF do nukleosomov je rahlo večja kot do DNA. Razlog za to so interakcije med komplesom in jedernimi histoni.<br /> <br /> == MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Ločimo encime, ki modificirajo histone in tiste, ki spreminjajo strukturo kromatina. K slednjim uvrščamo različne družine encimov, vsem pa je skupna ATPazna domena. Preurejevalni strojčki sodelujejo pri podvojevanju DNA, transkripciji, popravljanju napak na DNA, homologni rekombinaciji in spreminjanju strukture kromatina. (1)<br /> Točni mehanizmi delovanja še niso povsem jasni, znano pa je, da lahko preurejevalni strojčki delujejo na naslednje načine (1,2):<br /> <br /> -Katalizirajo premik nukleosomov po DNA verigi.<br /> <br /> -Katalizirajo prenos histonov iz nukleosoma na prosto DNA verigo (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Nukleazam olajšajo dostop do DNA.<br /> <br /> -Katalizirajo nastanek dinukleosomov iz mononukleosomov (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Povzročajo torzijo dodatno zvite vijačnice.<br /> <br /> -Omogočajo kontrolirano razgradnjo nukleosomov.<br /> <br /> Značilno je, da DNA, ki je bila najprej tesno ovita okrog histonskega oktamera, tvori zanko ali izboklino, ki štrli ven iz nukleosoma. Zanka lahko nastane zaradi encimsko kataliziranega zasuka DNA, zaradi česar se del DNA odvije od oktamera. Nastanek zanke je lahko tudi posledica translokazne aktivnosti preurejevalnih strojčkov (1).<br /> Raziskave in vitro kažejo na to, da poddružini SWI2/SNF2 in ISWI različno interagirata z nukleosomi ali DNA in zato preoblikujeta kromatin po različnih mehanizmih.<br /> <br /> === Poddružina ISWI: ===<br /> Za to poddružino je najverjetnejši translokacijski mehanizem delovanja, številni preurejevalni strojčki imajo namreč DNA translokazno aktivnost.<br /> Kompleksi ISWI prenašajo nukleosome v več stopnjah po 1 bazni par naprej, za vsak korak pa se porabi 1 ATP. Pri tem prenosu prihaja do torzije DNA. Posledica translokacije in torzije so oslabljene interakcije med histoni in DNA. Translokazna domena preurejevalnih kompleksov interagira z DNA, ki se nahaja na nukleosomski sredici. (3)<br /> Nedavne raziskave članov te poddružine so pokazale, da vzporedno potekata dve reakciji. Translokazna aktivnost pripomore k potiskanju DNA iz histonskega oktamera, hkrati pa se na drugi strani nukleosoma vanj vključuje DNA po 3 bazne pare hkrati. Preden začne DNA vstopati v nukleosom, pride do sedmih zaporednih reakcij, v katerih se 7 baznih parov DNA izloči iz nukleosoma. Ta korak nato preko neznanih mehanizmov spodbudi vleko DNA v nukleosom z druge strani. Ker se je izločilo več DNA, kot jo je vstopilo na drugi strani, pride do spremembe konformacija histonskega oktamera ali zvitja DNA na oktameru ali pa pride do kombinacije teh dveh pojavov (v nasprotnem primeru je znotraj nukleosoma pomankanje DNA, zato se nemore tvoriti zanka). Ko z zadnje strani vstopa DNA, se nukleosom posledično premakne z 3 bazne pare po verigi. (3) Takšnemu mehanizmu rečemo tudi cis mehanizem, saj gre za premik nukleosoma po verigi DNA, ne da bi se pri tem kateri izmed histonov odcepil. (Shematični prikaz si lahko ogledate na povezavi: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3781322/figure/fig2/)<br /> <br /> === Poddružini SWI/SNF in RSC: ===<br /> Za ti poddružini je značilen tako cis kot tudi trans mehanizem prenosa nukleosomov. Pri slednjem pride do prenosa histonov na drugo DNA. V tem procesu sodelujejo akceptorji histonov, prednostno pa poteče ob vezavi transkripcijskih faktorjev na nukleosomsko DNA, saj se s tem interakcije med histoni in DNA še dodatno destabilizirajo.<br /> V celici večinoma poteka prenos nukleosomov po cis mehanizmu. Kadar pa zaradi raznih dejavnikov tak način prenosa ni mogoč, lahko preurejevalni kompleksi iz SWI/SNF in RSC poddružin še vedno preoblikujejo kromatin po trans mehanizmu. To jim najverjetneje omogočajo močne interakcije z DNA (v primerjavi z ISWI), ki destabilizirajo vezi med histoni in DNA in olajšajo prenos histonov na drugo DNA ali na histonske šaperone.<br /> Tako cis kot trans mehanizem povzročita spremembo v strukturi ali položaju nukleosoma, zaradi česar postane del DNA lažje dostopen transkripcijskim faktorjem in restrikcijskim encimom.<br /> <br /> == REGULACIJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Podenote v kromatin preurejevalnih kompleksih so lahko katalitične (ATPazne podenote) ali nekatalitične. Nekatalitične podenote imajo različne funkcije, ena izmed njih je tudi regulacija ATPaznih podent. Npr. V SWI/SNF poddružini sta ATPazni podenoti BRG1 in hBRM stimulirani s strani treh neATPaznih podenot; INI1, BAF155 in BAF170, v poddružini ISIW aktivnost kromatin preurejevalnih kompleksov uravnava podenota Acf1, ki olajša in izboljša drsenje med nukleosomi ter vpliva na smer njihovega gibanja (1). <br /> <br /> S podenotami kromatin preurejevalnih kompleksov je v poddružinah SWI/SNF, RSC in INO80 povezan tudi aktin in nekateri ARPji (actin-related proteins). Vendar tu ne govorimo o citoplazemskih ARPjih in aktinu temveč o jedrnih. Citoplazemski ARPji imajo vlogo pri nukleaciji aktinskih filamentov, ter pri ureditvi citoskeleta, jedrni ARPji (Arp 4,5,6,7,8 in Arp 9) so pa povezani izključno s kromatin preurejevalnimi kompleksi (4).<br /> Pri kvasovkah, v poddružini SWI/SNF, delujeta Arp 7 in Arp 9 kot heterodimera in se vežeta na katalitično podenoto Snf2. Pri ljudeh pa, za primerjavo, v poddružini SWI/SNF deluje aktin in se veže na BRG1 podenoto. V raziskavah so dokazali, da zdravila, ki vplivajo na delovanje aktina, posledično tudi zmanjšajo SWI/SNF ATPazno aktivnost, kar dokazuje, da aktin in ARPji pozitivno regulirajo kromatin preurejevalne aktivnosti (4,5).<br /> Aktin in Arpji se vežejo neposredno na eno izmed dveh domen preurejevalne podenote ATPaze; na domeno HSA (helicase-SANT–associated domain). HSA domene torej selektivno vežejo večino Arpjev in aktina v kromatin preurejevalni kompleks. Raziskave v poddružini INO80 so pokazale da vezava ARPjev na HSA domeno spodbuja aktivnost ATPazne podenote, vezavo DNA in mobilizacijo nukleosomov (5).<br /> <br /> == VIRI ==<br /> <br /> 1 Lusser A., Kadonaga J.T. Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines, BioEssays, 2003, letn. 25, str. 1192-1200.<br /> <br /> 2 Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., Workman J.L. ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Complexes, Molecular and cellular biology, 2000, letn. 20, str. 1899-1910.<br /> <br /> 3 Narlikar G.J., Sundaramoorthy R., Owen-Hughes T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes, 2013, Cell, letn.154, str. 490-503.<br /> <br /> 4 H. Szerlong, K. Hinata, R. Viswanathan, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst in B. R. Cairns. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. 2008. Nat. Struct. Mol. Biol. 15(5): 469–476.<br /> <br /> 5 C. R. Clapier in B. R. Cairns. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. 2009. Annu. Rev. Biochem. 78:273-304<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov&diff=9237 Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov 2014-04-20T17:21:42Z <p>Petra Tavčar: /* Poddružina ISWI: */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Evkariontski genom je zapakiran v periodično nukleoproteinsko strukturo imenovano kromatin. Ponavljajoče se enote kromatina-nukleosomi, so sestavljene iz DNA, ki je navita okoli histonov. Za tako pakiranje DNA je potrebna mobilizacija in preoblikovanje nukleosomov, to pa omogočajo strojčki za preoblikovanje.<br /> Strojčki za preoblikovanje so proteini, ki za svoje delovanje potrebujejo ATP, tako je vsem strojčkom skupna ATPazna podenota in modulacija interakcij med histoni in DNA. Z svojim delovanjem pospešujejo(katalizirajo) mobilizacijo in prestavljanje nukleosomov.<br /> Kljub temu, da so znani številni raznoliki kompleksi preoblikovalnih strojčkov, ki vsebujejo motorno podenoto, ki pripada družini SNF-2 ATPaz. Posamezne poddružine se medseboj razlikujejo v proteinskih motivih izven ATPazne regije.<br /> Najbolj preučen je kompleks SWI/SNF, ki vsebuje Swi2/Snf2 ATPazno podenoto. Ta kompleks je prisoten v številnih organizmih, tudi pri človeku in pri kvaskovkah.<br /> <br /> == VEZAVA PREUREJEVALNIH STROJČKOV == <br /> <br /> Kako se bo preurejevalni kompleks vezal na substrat (nukleosom ali DNA), je odvisno od posameznega kompleksa. Kompleks NURF, se na substrat ne veže direktno, vendar preko histonskih repkov. Nekateri drugi kompleksi, ki vsebujejo ISWI ATPazno podenoto pa se na substrat vežejo le prehodno.<br /> Medtem pa se ravno nasprotno kompleks SWI/SNF jasno veže na DNA in nukleosome z zelo močno afiniteto. Zelo verjetno je, da interakcije potekajo preko malega žleba, saj se kompleks odcepi z DNA molekule preko distamicina A ali kromomicina A3 (vezavna reagenta v malem žlebu). Predpostavljeno je tudi, da se kompleksi vežejo na DNA preko HMGbox (proteinska domena, vključena pri vezavi DNA).<br /> Afiniteta SWI/SNF do nukleosomov je rahlo večja kot do DNA. Razlog za to so interakcije med komplesom in jedernimi histoni.<br /> <br /> == MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Ločimo encime, ki modificirajo histone in tiste, ki spreminjajo strukturo kromatina. K slednjim uvrščamo različne družine encimov, vsem pa je skupna ATPazna domena. Preurejevalni strojčki sodelujejo pri podvojevanju DNA, transkripciji, popravljanju napak na DNA, homologni rekombinaciji in spreminjanju strukture kromatina. (1)<br /> Točni mehanizmi delovanja še niso povsem jasni, znano pa je, da lahko preurejevalni strojčki delujejo na naslednje načine (1,2):<br /> <br /> -Katalizirajo premik nukleosomov po DNA verigi.<br /> <br /> -Katalizirajo prenos histonov iz nukleosoma na prosto DNA verigo (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Nukleazam olajšajo dostop do DNA.<br /> <br /> -Katalizirajo nastanek dinukleosomov iz mononukleosomov (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Povzročajo torzijo dodatno zvite vijačnice.<br /> <br /> -Omogočajo kontrolirano razgradnjo nukleosomov.<br /> <br /> Značilno je, da DNA, ki je bila najprej tesno ovita okrog histonskega oktamera, tvori zanko ali izboklino, ki štrli ven iz nukleosoma. Zanka lahko nastane zaradi encimsko kataliziranega zasuka DNA, zaradi česar se del DNA odvije od oktamera. Nastanek zanke je lahko tudi posledica translokazne aktivnosti preurejevalnih strojčkov (1).<br /> Raziskave in vitro kažejo na to, da poddružini SWI2/SNF2 in ISWI različno interagirata z nukleosomi ali DNA in zato preoblikujeta kromatin po različnih mehanizmih.<br /> <br /> === Poddružina ISWI: ===<br /> Za to poddružino je najverjetnejši translokacijski mehanizem delovanja, številni preurejevalni strojčki imajo namreč DNA translokazno aktivnost.<br /> Kompleksi ISWI prenašajo nukleosome v več stopnjah po 1 bazni par naprej, za vsak korak pa se porabi 1 ATP. Pri tem prenosu prihaja do torzije DNA. Posledica translokacije in torzije so oslabljene interakcije med histoni in DNA. Translokazna domena preurejevalnih kompleksov interagira z DNA, ki se nahaja na nukleosomski sredici. (3)<br /> Nedavne raziskave članov te poddružine so pokazale, da vzporedno potekata dve reakciji. Translokazna aktivnost pripomore k potiskanju DNA iz histonskega oktamera, hkrati pa se na drugi strani nukleosoma vanj vključuje DNA po 3 bazne pare hkrati. Preden začne DNA vstopati v nukleosom, pride do sedmih zaporednih reakcij, v katerih se 7 baznih parov DNA izloči iz nukleosoma. Ta korak nato preko neznanih mehanizmov spodbudi vleko DNA v nukleosom z druge strani. Ker se je izločilo več DNA, kot jo je vstopilo na drugi strani, pride do spremembe konformacija histonskega oktamera ali zvitja DNA na oktameru ali pa pride do kombinacije teh dveh pojavov (v nasprotnem primeru je znotraj nukleosoma pomankanje DNA, zato se nemore tvoriti zanka). Ko z zadnje strani vstopa DNA, se nukleosom posledično premakne z 3 bazne pare po verigi. (3) Takšnemu mehanizmu rečemo tudi cis mehanizem, saj gre za premik nukleosoma po verigi DNA, ne da bi se pri tem kateri izmed histonov odcepil. (Shematični prikaz si lahko ogledate na povezavi: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3781322/figure/fig2/)<br /> <br /> === Poddružini SWI/SNF in RSC: ===<br /> Za ti poddružini je značilen tako cis kot tudi trans mehanizem prenosa nukleosomov. Pri slednjem pride do prenosa histonov na drugo DNA. V tem procesu sodelujejo akceptorji histonov, prednostno pa poteče ob vezavi transkripcijskih faktorjev na nukleosomsko DNA, saj se s tem interakcije med histoni in DNA še dodatno destabilizirajo.<br /> V celici večinoma poteka prenos nukleosomov po cis mehanizmu. Kadar pa zaradi raznih dejavnikov tak način prenosa ni mogoč, lahko preurejevalni kompleksi iz SWI/SNF in RSC poddružin še vedno preoblikujejo kromatin po trans mehanizmu. To jim najverjetneje omogočajo močne interakcije z DNA (v primerjavi z ISWI), ki destabilizirajo vezi med histoni in DNA in olajšajo prenos histonov na drugo DNA ali na histonske šaperone.<br /> Tako cis kot trans mehanizem povzročita spremembo v strukturi nukleosoma, zaradi česar postane DNA lažje dostopna transkripcijskim faktorjem in restrikcijskim encimom.<br /> <br /> == REGULACIJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Podenote v kromatin preurejevalnih kompleksih so lahko katalitične (ATPazne podenote) ali nekatalitične. Nekatalitične podenote imajo različne funkcije, ena izmed njih je tudi regulacija ATPaznih podent. Npr. V SWI/SNF poddružini sta ATPazni podenoti BRG1 in hBRM stimulirani s strani treh neATPaznih podenot; INI1, BAF155 in BAF170, v poddružini ISIW aktivnost kromatin preurejevalnih kompleksov uravnava podenota Acf1, ki olajša in izboljša drsenje med nukleosomi ter vpliva na smer njihovega gibanja (1). <br /> <br /> S podenotami kromatin preurejevalnih kompleksov je v poddružinah SWI/SNF, RSC in INO80 povezan tudi aktin in nekateri ARPji (actin-related proteins). Vendar tu ne govorimo o citoplazemskih ARPjih in aktinu temveč o jedrnih. Citoplazemski ARPji imajo vlogo pri nukleaciji aktinskih filamentov, ter pri ureditvi citoskeleta, jedrni ARPji (Arp 4,5,6,7,8 in Arp 9) so pa povezani izključno s kromatin preurejevalnimi kompleksi (4).<br /> Pri kvasovkah, v poddružini SWI/SNF, delujeta Arp 7 in Arp 9 kot heterodimera in se vežeta na katalitično podenoto Snf2. Pri ljudeh pa, za primerjavo, v poddružini SWI/SNF deluje aktin in se veže na BRG1 podenoto. V raziskavah so dokazali, da zdravila, ki vplivajo na delovanje aktina, posledično tudi zmanjšajo SWI/SNF ATPazno aktivnost, kar dokazuje, da aktin in ARPji pozitivno regulirajo kromatin preurejevalne aktivnosti (4,5).<br /> Aktin in Arpji se vežejo neposredno na eno izmed dveh domen preurejevalne podenote ATPaze; na domeno HSA (helicase-SANT–associated domain). HSA domene torej selektivno vežejo večino Arpjev in aktina v kromatin preurejevalni kompleks. Raziskave v poddružini INO80 so pokazale da vezava ARPjev na HSA domeno spodbuja aktivnost ATPazne podenote, vezavo DNA in mobilizacijo nukleosomov (5).<br /> <br /> == VIRI ==<br /> <br /> 1 Lusser A., Kadonaga J.T. Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines, BioEssays, 2003, letn. 25, str. 1192-1200.<br /> <br /> 2 Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., Workman J.L. ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Complexes, Molecular and cellular biology, 2000, letn. 20, str. 1899-1910.<br /> <br /> 3 Narlikar G.J., Sundaramoorthy R., Owen-Hughes T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes, 2013, Cell, letn.154, str. 490-503.<br /> <br /> 4 H. Szerlong, K. Hinata, R. Viswanathan, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst in B. R. Cairns. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. 2008. Nat. Struct. Mol. Biol. 15(5): 469–476.<br /> <br /> 5 C. R. Clapier in B. R. Cairns. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. 2009. Annu. Rev. Biochem. 78:273-304<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov&diff=9230 Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov 2014-04-20T17:13:48Z <p>Petra Tavčar: /* MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Evkariontski genom je zapakiran v periodično nukleoproteinsko strukturo imenovano kromatin. Ponavljajoče se enote kromatina-nukleosomi, so sestavljene iz DNA, ki je navita okoli histonov. Za tako pakiranje DNA je potrebna mobilizacija in preoblikovanje nukleosomov, to pa omogočajo strojčki za preoblikovanje.<br /> Strojčki za preoblikovanje so proteini, ki za svoje delovanje potrebujejo ATP, tako je vsem strojčkom skupna ATPazna podenota in modulacija interakcij med histoni in DNA. Z svojim delovanjem pospešujejo(katalizirajo) mobilizacijo in prestavljanje nukleosomov.<br /> Kljub temu, da so znani številni raznoliki kompleksi preoblikovalnih strojčkov, ki vsebujejo motorno podenoto, ki pripada družini SNF-2 ATPaz. Posamezne poddružine se medseboj razlikujejo v proteinskih motivih izven ATPazne regije.<br /> Najbolj preučen je kompleks SWI/SNF, ki vsebuje Swi2/Snf2 ATPazno podenoto. Ta kompleks je prisoten v številnih organizmih, tudi pri človeku in pri kvaskovkah.<br /> <br /> == VEZAVA PREUREJEVALNIH STROJČKOV == <br /> <br /> Kako se bo preurejevalni kompleks vezal na substrat (nukleosom ali DNA), je odvisno od posameznega kompleksa. Kompleks NURF, se na substrat ne veže direktno, vendar preko histonskih repkov. Nekateri drugi kompleksi, ki vsebujejo ISWI ATPazno podenoto pa se na substrat vežejo le prehodno.<br /> Medtem pa se ravno nasprotno kompleks SWI/SNF jasno veže na DNA in nukleosome z zelo močno afiniteto. Zelo verjetno je, da interakcije potekajo preko malega žleba, saj se kompleks odcepi z DNA molekule preko distamicina A ali kromomicina A3 (vezavna reagenta v malem žlebu). Predpostavljeno je tudi, da se kompleksi vežejo na DNA preko HMGbox (proteinska domena, vključena pri vezavi DNA).<br /> Afiniteta SWI/SNF do nukleosomov je rahlo večja kot do DNA. Razlog za to so interakcije med komplesom in jedernimi histoni.<br /> <br /> == MEHANIZMI DELOVANJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Ločimo encime, ki modificirajo histone in tiste, ki spreminjajo strukturo kromatina. K slednjim uvrščamo različne družine encimov, vsem pa je skupna ATPazna domena. Preurejevalni strojčki sodelujejo pri podvojevanju DNA, transkripciji, popravljanju napak na DNA, homologni rekombinaciji in spreminjanju strukture kromatina. (1)<br /> Točni mehanizmi delovanja še niso povsem jasni, znano pa je, da lahko preurejevalni strojčki delujejo na naslednje načine (1,2):<br /> <br /> -Katalizirajo premik nukleosomov po DNA verigi.<br /> <br /> -Katalizirajo prenos histonov iz nukleosoma na prosto DNA verigo (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Nukleazam olajšajo dostop do DNA.<br /> <br /> -Katalizirajo nastanek dinukleosomov iz mononukleosomov (značilno za poddružino SNF2).<br /> <br /> -Povzročajo torzijo dodatno zvite vijačnice.<br /> <br /> -Omogočajo kontrolirano razgradnjo nukleosomov.<br /> <br /> Značilno je, da DNA, ki je bila najprej tesno ovita okrog histonskega oktamera, tvori zanko ali izboklino, ki štrli ven iz nukleosoma. Zanka lahko nastane zaradi encimsko kataliziranega zasuka DNA, zaradi česar se del DNA odvije od oktamera. Nastanek zanke je lahko tudi posledica translokazne aktivnosti preurejevalnih strojčkov (1).<br /> Raziskave in vitro kažejo na to, da poddružini SWI2/SNF2 in ISWI različno interagirata z nukleosomi ali DNA in zato preoblikujeta kromatin po različnih mehanizmih.<br /> <br /> === Poddružina ISWI: ===<br /> Za to poddružino je najverjetnejši translokacijski mehanizem delovanja, številni preurejevalni strojčki imajo namreč DNA translokazno aktivnost.<br /> Kompleksi ISWI prenašajo nukleosome v več stopnjah po 1 bazni par naprej, za vsak korak pa se porabi 1 ATP. Pri tem prenosu prihaja do torzije DNA. Posledica translokacije in torzije so oslabljene interakcije med histoni in DNA. Translokazna domena preurejevalnih kompleksov interagira z DNA, ki se nahaja na nukleosomski sredici. (3)<br /> Nedavne raziskave določenih pripadnikov te poddružine so pokazale, da vzporedno potekata dve reakciji. Translokazna aktivnost pripomore k potiskanju DNA iz histonskega oktamera, hkrati pa se na drugi strani nukleosoma vanj vključuje DNA po 3 bazne pare hkrati. Preden začne DNA vstopati v nukleosom, pride do sedmih zaporednih reakcij in se 7 baznih parov DNA izloči iz nukleosoma. Ta korak nato preko neznanih mehanizmov spodbudi vleko DNA v nukleosom z druge strani. Ker se je izločilo več DNA, kot jo je vstopilo na drugi strani, se mora spremeniti konformacija histonskega oktamera, lahko se spremeni zvitje DNA na oktameru ali pa pride do kombinacije teh dveh pojavov. Ko z zadnje strani vstopa DNA, se nukleosom posledično premakne z 3bp po verigi. (3) Takšnemu mehanizmu rečemo tudi cis mehanizem, saj gre za premik nukleosoma po verigi DNA, ne da bi se pri tem kateri izmed histonov odcepil.<br /> <br /> === Poddružini SWI/SNF in RSC: ===<br /> Za ti poddružini je značilen tako cis kot tudi trans mehanizem prenosa nukleosomov. Pri slednjem pride do prenosa histonov na drugo DNA. V tem procesu sodelujejo akceptorji histonov, prednostno pa poteče ob vezavi transkripcijskih faktorjev na nukleosomsko DNA, saj se s tem interakcije med histoni in DNA še dodatno destabilizirajo.<br /> V celici večinoma poteka prenos nukleosomov po cis mehanizmu. Kadar pa zaradi raznih dejavnikov tak način prenosa ni mogoč, lahko preurejevalni kompleksi iz SWI/SNF in RSC poddružin še vedno preoblikujejo kromatin po trans mehanizmu. To jim najverjetneje omogočajo močne interakcije z DNA (v primerjavi z ISWI), ki destabilizirajo vezi med histoni in DNA in olajšajo prenos histonov na drugo DNA ali na histonske šaperone.<br /> Tako cis kot trans mehanizem povzročita spremembo v strukturi nukleosoma, zaradi česar postane DNA lažje dostopna transkripcijskim faktorjem in restrikcijskim encimom.<br /> <br /> == REGULACIJA KROMATIN PREUREJEVALNIH KOMPLEKSOV ==<br /> <br /> Podenote v kromatin preurejevalnih kompleksih so lahko katalitične (ATPazne podenote) ali nekatalitične. Nekatalitične podenote imajo različne funkcije, ena izmed njih je tudi regulacija ATPaznih podent. Npr. V SWI/SNF poddružini sta ATPazni podenoti BRG1 in hBRM stimulirani s strani treh neATPaznih podenot; INI1, BAF155 in BAF170, v poddružini ISIW aktivnost kromatin preurejevalnih kompleksov uravnava podenota Acf1, ki olajša in izboljša drsenje med nukleosomi ter vpliva na smer njihovega gibanja (1). <br /> <br /> S podenotami kromatin preurejevalnih kompleksov je v poddružinah SWI/SNF, RSC in INO80 povezan tudi aktin in nekateri ARPji (actin-related proteins). Vendar tu ne govorimo o citoplazemskih ARPjih in aktinu temveč o jedrnih. Citoplazemski ARPji imajo vlogo pri nukleaciji aktinskih filamentov, ter pri ureditvi citoskeleta, jedrni ARPji (Arp 4,5,6,7,8 in Arp 9) so pa povezani izključno s kromatin preurejevalnimi kompleksi (4).<br /> Pri kvasovkah, v poddružini SWI/SNF, delujeta Arp 7 in Arp 9 kot heterodimera in se vežeta na katalitično podenoto Snf2. Pri ljudeh pa, za primerjavo, v poddružini SWI/SNF deluje aktin in se veže na BRG1 podenoto. V raziskavah so dokazali, da zdravila, ki vplivajo na delovanje aktina, posledično tudi zmanjšajo SWI/SNF ATPazno aktivnost, kar dokazuje, da aktin in ARPji pozitivno regulirajo kromatin preurejevalne aktivnosti (4,5).<br /> Aktin in Arpji se vežejo neposredno na eno izmed dveh domen preurejevalne podenote ATPaze; na domeno HSA (helicase-SANT–associated domain). HSA domene torej selektivno vežejo večino Arpjev in aktina v kromatin preurejevalni kompleks. Raziskave v poddružini INO80 so pokazale da vezava ARPjev na HSA domeno spodbuja aktivnost ATPazne podenote, vezavo DNA in mobilizacijo nukleosomov (5).<br /> <br /> == VIRI ==<br /> <br /> 1 Lusser A., Kadonaga J.T. Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines, BioEssays, 2003, letn. 25, str. 1192-1200.<br /> <br /> 2 Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., Workman J.L. ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Complexes, Molecular and cellular biology, 2000, letn. 20, str. 1899-1910.<br /> <br /> 3 Narlikar G.J., Sundaramoorthy R., Owen-Hughes T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes, 2013, Cell, letn.154, str. 490-503.<br /> <br /> 4 H. Szerlong, K. Hinata, R. Viswanathan, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst in B. R. Cairns. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. 2008. Nat. Struct. Mol. Biol. 15(5): 469–476.<br /> <br /> 5 C. R. Clapier in B. R. Cairns. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. 2009. Annu. Rev. Biochem. 78:273-304<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_kromatina&diff=9069 Struktura kromatina 2014-03-22T16:59:30Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2013/14 namenjeni obravnavi strukture kromosomov oziroma kromatina, od strukturnih do regulatornih tem. Čeprav osnovno strukturo kromosomov že poznate, je sodobna molekularna biologija ves čas na sledi novim spoznanjem, ki nam omogočajo bolj podroben vpogled v delovanje in fleksibilnost kromatina.<br /> <br /> V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli predvidoma konec aprila in v začetku maja. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj. <br /> <br /> Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici. <br /> <br /> Čeprav tema do neke mere sega na področje celične biologije, je predvsem molekularnobiološka. Zato izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere biološke molekule sodelujejo pri vzpostavljanju strukture kromatina, njegovi plastičnosti (kondenzacija, dekondenzacija) in dinamičnosti (aktivni/neaktivni kromatin) ter uravnavanju transkripcije. Če se srečate z zanimivimi molekularnobiološkimi tehnikami, jih poskusite na kratko razložiti, predvsem če so ključne za spoznanja, ki jih boste predstavili. Izhodišče, ki ga ni treba ponovno razlagati, je nukleosomska struktura evkariontskega kromatina ter osnovne stopnje kompaktiranja kromatina in razumevanje osnov dodatnega zvitja pri bakterijskem kromosomu.<br /> <br /> Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 17.4. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 23.4., 5 - 8 25.4., 9 - 12 7.5. in 13 - 16 9.5.2014. Vsaka skupina ima za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion'). <br /> <br /> # Značilnosti bakterijskih kromosomov<br /> # Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov<br /> # Značilnosti kromosomskih ogrodij<br /> # Kompaktiranje kromosomov<br /> # Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome<br /> # Biokemijska struktura centromerov in njihove interakcije<br /> # Biokemijska struktura telomerov<br /> # Telomeraze<br /> # Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo<br /> # Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR) <br /> # Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen<br /> # Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen<br /> # Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov<br /> # Ponavljajoča se zaporedja v genomu<br /> # Organizacija genov v kromatinu<br /> # Posebnosti kromosomov X in Y / bolezni, povezane s tema dvema kromosomoma<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ===Skupine=== <br /> <br /> Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (skupine oblikujte do 31.3. opolnoči - imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):<br /> <br /> <br /> npr.: 1. Biokemijske značilnosti bakterijskih kromosomov (Janez Gorenc, Petra Novak)<br /> <br /> # Značilnosti bakterijskih kromosomov (Matic Kovačič, Marjeta Horvat, Rok Ipšek)<br /> # Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov (Boštjan Petrič, Vita Vidmar)<br /> # Značilnosti kromosomskih ogrodij<br /> # Kompaktiranje kromosomov<br /> # Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome (Toni Nagode, Simon Bolta)<br /> # Biokemijska struktura centromerov in njihove interakcije (Maja Zupančič, Alja Zgonc)<br /> # Biokemijska struktura telomerov (Tim Božič, Ema Guštin, Luka Kavčič)<br /> # Telomeraze (Urša Kapš, Mojca Kostanjevec, Katjuša Triplat)<br /> # Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo (Jure Fabjan, Vid Jazbec, Mojca Juteršek)<br /> # Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR) (Jakob Rupert, Jan Rozman, Domen Klofutar)<br /> # Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen (Peter Prezelj, Filip Mihalič) <br /> # Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen (Rok Ferenc, Ana Cirnski, Vesna Radić)<br /> # Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov (Petra Tavčar, Helena Jakše, Nika Strašek)<br /> # Ponavljajoča se zaporedja v genomu (Eva Vidak)<br /> # Organizacija genov v kromatinu<br /> # Posebnosti kromosomov X in Y / bolezni, povezane s tema dvema kromosomoma (Sara Košenina, Ana Krišelj, Sabina Štukelj)<br /> <br /> <br /> <br /> Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: <br /> <br /> <br /> Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Povzetki_seminarjev_2013&diff=8679 BIO2 Povzetki seminarjev 2013 2013-12-24T21:16:58Z <p>Petra Tavčar: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2013/2014 */</p> <hr /> <div>== Biokemija- Povzetki seminarjev 2013/2014 ==<br /> Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2013 stran]<br /> <br /> ===Petra Tavčar: Sestavine plastike vplivajo na endokrini sistem===<br /> <br /> Endokrini sistem je sestavljen iz žlez, ki sproščajo hormone in receptorjev, ki so razporejeni po različnih tkivih in prepoznajo zanje specifične hormone. Hormoni potujejo po krvi do tarčnih celic (celice z ustreznimi receptorji na membrani celic ali v notranjosti celice). Endokrini sistem ima ključno vlogo pri regulaciji rasti in diferenciaciji celic ter pri metaboličnih procesih. Zelo pomembno vlogo v endokrinem sistemu imajo steroidni hormoni. Njim podobno zgradbo imajo tako imenovani hormonski motilci, k katerim prištevamo vse snovi, ki vplivajo na sintezo, transport, metabolizem, vezavo in eliminacijo naravnih hormonov. Zaradi podobne zgradbe se lahko vežejo na steroidne receptorje, kar povzroča motnje v delovanju endokrinega sistema.<br /> Hormonske motilce vnesemo v telo z zaužitjem, vdihavanjem in preko stika s kožo (kozmetični izdelki, čistila). Najpogosteje smo izpostavljeni bifenilu A (BPA) in ftalatom, ki so ene izmed sestavin plastike. Raziskave na živalih kažejo, da kronična izpostavljenost manjšim dozam hormonskih motilcev povzroča številne razvojne napake (motnje v razvoju spolnih žlez in organov, motnje v razvoju živčnega sistema) in bolezni (rak na prostati, rak na dojkah, neplodnost). <br /> Večina mehanizmov delovanja teh snovi je še neznanih. S poznavanjem mehanizmov bi lahko dokazali njihovo škodljivost in jih odstranili iz vsakodnevne uporabe. Poleg tega bi lahko preprečili njihovo vezavo na steroidne receptorje, ne da bi pri tem inhibirali naravne interakcije receptorjev s steroidnimi hormoni. Razvoj tega področja bi torej omogočil preprečitev zgoraj naštetih bolezni.<br /> <br /> <br /> ===Jakob Rupert: &quot;Lačen si ful drugačen&quot;: Grelin in njegovi vplivi na telo===<br /> <br /> Grelin je edini znani hormon, ki spodbuja apetit in s tem vnos hrane v telo (deluje oreksigenično). Sestavlja 28 aminokislinskih ostankov, sintetizirajo pa ga predvsem grelinske celice v membrani želodca, v manjši meri pa tudi v hipotalamusu, hipofizi, pankreasu idr. Za njegovo aktivnost je ključen encim GOAT (grelin o-aciltransferaza), ki prenese oktanojsko kislino z oktanoil-CoA na -OH skupino serina 3. Tako aktiviran grelin je edini naravni ligand GHS-R1a (ang. growth hormone secretagogue receptor) receptorja, ki spada med GPCR receptorje. Največ teh receptorjev je v adenohipofizi, hipotalamusu, možganskem deblu in ob živcu klatežu. Grelin je zelo močan stimulans, ki sproži intenziven občutek lakote, njegova raven pa se močno spreminja čez dan, načeloma je največja tik pred obrokom, nato močno pade. Ker imajo osebe z motnjami pri hranjenju velikokrat zmeden odziv na grelin, se ta pojavlja kot možno zdravilo za te težave. Prav tako pa grelin vpliva na razvoj možganov, stres, občutek strahu in tesnobe in še mnogo drugih stvari. Zadnje raziskave pa so odkrile receptorje za grelin tudi na nevronih dopaminske mreže, kar nakazuje na možnost povezave občutekom zadovoljstva ob prehranjevanju z priljubljenimi priboljški z ravnijo grelina v telesu in pa povezave med slabim počutjem ob občutku lakote in hitrim izboljšanjem po obroku. Raziskave na tem področju intenzivno potekajo prav zaradi možnosti zdravil za ene najpogostejših bolezenskih stanj v sodobni družbi: debelosti in drugih motenj hranjenja. <br /> <br /> ===Eva Oblak Zvonar: Leptin in kognicija===<br /> <br /> Leptin je peptidni hormon, ki ga v večini sintetizirajo celice belega maščobnega tkiva. V glavnem je znan kot signalizator za hipotalamus in je hormon, ki zavira apetit in pospešuje porabo energijskih zalog. Vse bolj očitno pa je, da hipotalamus ni edino mesto signalizacije za leptin. Leptinski receptorji so izraženi tudi v drugih delih možganov kot sta hipokampus, kjer poteka pretvorba kratkoročnega spomina v dolgoročni in možganska skorja oziroma korteks, kjer poteka sprejem in integracija informacij. Različne raziskave so potrdile, da je leptin hormon, ki ima mnogo bioloških vplivov kot so preživetje nevronov, njihova struktura in plastičnost ter delovanje sinaps. Če je leptina v telesu premalo ali pa ga sploh ni, so možgani do določene mere manj razviti, vse to odraža tudi v kognicijskih sposobnostih živali oziroma osebe. Pojavljajo se vprašanja ali se rezistenca na leptin, ki se večinoma obravnava kot zmanjšana občutljivost leptinskih receptorjev hipotalamusa, kaže tudi v drugih delih možganov in ali lahko vpliva tudi na razvoj možganov in delovanje nevronov ter ali lahko na tak način vpliva na kognicijo.<br /> <br /> ===Mojca Kostanjevec: Mitohondrijske reaktivne kisikove spojine===<br /> <br /> Mitohondrij je celični organel, v katerem potekajo poglavitni metabolični procesi v celici. Med celično oksidacijo molekul elektroni v elektronski prenašalni verigi omogočajo prenos protonov skozi proteinske komplekse, ta pa zagotavlja ATP sintezo in redukcijo molekularnega kisika v vodo. Med temi procesi pa nastajajo tudi stranski produkti – reaktivne kisikove spojine. To so visoko reaktivni prosti radikali, ki vsebujejo kisikove ione ali perokside. Te spojine so dolgo časa veljale le za škodljive in toksične, novejše raziskave pa dokazujejo, da so ob primerno visokih koncentracijah v celici lahko tudi pomembni intermediati in signalne molekule. Med okoljskim stresom ali preko zunanjih dejavnikov (npr. ionizirajoče sevanje) koncentracije teh spojin močno narastejo. To povzroči obsežne poškodbe celičnih struktur – tovrstno stanje imenujemo oksidativni stres, kar pa lahko vodi v celično smrt oziroma apoptozo. Toda reaktivne kisikove spojine kljub vsemu še vedno ostajajo nepogrešljiv del mnogih celičnih funkcij. V primeru hipoksije so npr. ravno te kisikove spojine tiste, ki v največji meri regulirajo primeren celični odziv. Reaktivne kisikove spojine inhibirajo aktivnost encima PHD2, kar omogoča stabilizacijo HIF-α podenot in ustrezno transkripcijsko aktivacijo. Te spojine obenem nadzorujejo tudi aktivnost AMPK. AMPK fosforilira enega izmed največjih porabnikov energije v celici – Na/K črpalko, to pa v vodi v endocitozo in deaktivacijo omenjenega proteinskega kompleksa. S tem se posledično zmanjša poraba energije v celici. Reaktivne kisikove spojine, ki nastajajo v mitohondrijih, tako na različne načine prispevajo k metabolizmu celic.<br /> <br /> ===Tajda Buh: Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku===<br /> <br /> IDH sodeluje pri pomembnih presnovnih poteh. IDH je asimetričen homodimer, ki lahko prehaja iz neaktivne odprte v aktivno zaprto konformacijo. Poznamo tri vrste izocitrat dehidrogenaz. IDH3 se nahaja v mitohondriju in katalizira prehod izocitrata v α-ketoglutarat, hkrati poteče redukcija NAD+ v NADH. IDH2 se prav tako nahaja v mitohondriju, IDH1 pa najdemo v citosolu in peroksisomih. Obliki 1 in 2 reducirata NADP+ v NADPH. Mutacije se pojavljajo samo pri IDH1/2, ne pa tudi pri IDH3. Mutirana IDH lahko pridobi novo aktivnost, to je kataliziranje pretvorbe α-ketoglutarata v 2-hidroksiglutarat, aktivnost encima pa se lahko tudi močno zmanjša. Nova aktivnost povzroči prekomerno sintezo 2-hidroksiglutarata. Povečanje koncentracije slednjega pa vpliva na α-ketoglutaratno odvisne presnovne encime, kot sta prolil hidroksilaza in histonska demetilaza. Študije so do tega trenutka potrdile prisotnost mutirane IDH1 in IDH2 v nižjih stopnjah glioma, v sekundarnem glioblastomu in v akutni mieloični levkemiji.<br /> <br /> ===Vid Jazbec: Vpliv mašobnih kislin na rakave celice===<br /> <br /> <br /> Celice ob tvorbi rakastega obolenja spremenijo svoje delovanje. Predvsem je to vidno v metabolizmu, ki je v rakastih celicah spremenjen. Novejše raziskave dokazujejo, da je odvisnost metabolima odvisna od maščobnih kislin v večji meri, kot je bilo domnevano do sedaj. Metabolizem maščobnih kislin, predvsem beta oksidacijo, rakave celice izkoristijo ob pomanjkanju ATP, kot je pokazano pri celicah z igubo stika t izvenceličnim matriksom. Proces beta oksidacije je prav tako pomemben tudi kot proces, ki vodi v nastanek NADPH, ki se potrebuje za soočanje celice z metabolnim stresom reaktivnih kisikovih zvrsti ter rast in razvoj. Za v uvodu naštete značilnosti rakavih celic pa so poleg samega procea beta oksidacije in produktov tega procesa pomembni tudi proteini, ki spremljajo ta proces. Ti so ob nastopu rakavega obolenja deregulirani in večinoma preprečujejo prehod obolele celice v apoptozo.<br /> Raziskave pa so pokazale tudi problem dosedajšnje dogme, pri kateri sta beta oksidacija maščobnih kislin in njihova sinteza med seboj izključujoča procesa odvisna od ACC. To zavračajo raziskave rakavih celic, pri katerih se oba procesa vršita istočasno in sta enako pomemba za delovaje in ravoj celice.<br /> Nove raziskave na področju rakavih obolenj pa so pomembne predvsem za zdravljenje bolezni.<br /> <br /> <br /> ===Rok Ferenc: Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis===<br /> <br /> Večina proteinov živih celic deluje v kompleksih, ne posamično. Poleg stalnih proteinskih kompleksov znanstveniki po zaslugi naprednejših eksperimentalnih tehnik odkrivajo tudi medproteinske interakcije bolj prehodne narave, značilne predvsem za metabolične poti. V raziskavi se osredotočijo na formacijo metabolona (skupka proteinov) v citratnem ciklu Bacillus subtilis, ki je zelo pomemben modelni organizem in vir proizvodnje vitaminov in encimov za pralne praške. Ta bi pripomogel k organiziranosti metabolnih poti v sicer kaotični notranjosti prokariontskih celic brez organelov.<br /> Dokazan je bil obstoj metabolona v ciklu trikarboksilnih kislin, v katerega se povezuje tudi nekaj encimov anabolizma, katerih substrati so intermediati TCA cikla (citratni cikel). V metabolonu obstaja jedro iz treh encimov: citrat sintetaze, malat dehidrogenaze in izocitrat dehidrogenaze. Interakcija med encimi glukoneogeneze, bolj natančno med malat dehidrogenazo in fosfoenol piruvat karboksikinazo je uravnavana s strani razlik v koncentracijah intermediatov glikolize in TCA cikla, torej za formacijo metabolona ni potreben noben zunanji signal, le povečana koncentracija ustreznih substratov.<br /> <br /> <br /> ===Sara Košenina: Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla===<br /> <br /> Hipoksija je stanje, ko celice in tkiva ne dobijo dovolj kisika, zato pride do motenj v delovanju organa ali pa celo celotnega organizma. Ljudje smo za prilagoditev na hipoksijo razvili mehanizem, ki je reguliran preko heterodimernega proteinskega kompleksa HIF-1. Glavna podenota je HIF-1α, saj je občutljiva na kisik. Aktivnost HIF-1 je regulirana z različnimi mehanizmi, eni so odvisni od hipoksije, drugi pa so od nje neodvisni. Slednji so pomembni pri razvoju in napredovanju tomorjev. Eden od hipoksije neodvisnih regulatorjev je tudi piruvat, ki je začetni substrat cikla citronske kisline. V hipoksičnih pogojih pride do motenj v elektronskem transportu, zato je proizvodnja ROS (reaktivnega kisika) povečana. To je kompenzira z uravnavanjem piruvat dehidrogenaznega kompleksa (PDH) s piruvat dehidrogenazo kinazo (PDK1). Raziskave so pokazale, da etil piruvat poveča stabilnost HIF-1 s stimulacijo proizvodnje ROS v mitohondriju in blokira s pVHL regulirano razgradnjo HIF-1. Indukcija HIF-1 z etil piruvatom je povezana s pospeševanjem citratnega cikla. Etil piruvat pospeši tako citratni cikel kot tudi proizvodnjo ROS v mitohondriju. Rezultati raziskav podpirajo obstoj regulatornega mehanizma za prilagoditev na hipoksijo, pri katerem PDK1 deaktivira PDH kompleks in inhibira cikel citronske kisline in na ta način zmanjša proizvodnjo ROS. Vse te ugotovitve bi lahko pripomogle k zdravljenju hipoksije in z njo povezanega razvoja raka. Potrebnih bo še veliko raziskav, preden se bo lahko etil piruvat uporabljalo v klinične namene. <br /> <br /> ===Tjaša Bensa: α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni===<br /> <br /> α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks (KGDHC) je en izmed encimov v Krebsovem ciklu. V procesu oksidativne dekarboksilacije katalizira reakcijo α-ketoglutarat + NAD+ + CoA-SH -&gt; sukcinil-CoA + NADH + H+ + CO2. <br /> Sestavljen je iz 3 podenot: α -ketoglutarat dehidrogenaze (E1), dihidrolipoil sukcinil transferaze (E2) in dihidrolipoil dehidrogenaze (E3). E3 podenota oksidira NADH v NAD+.<br /> Reaktivne kisikove spojine oziroma reaktivne kisikove zvrsti (ROS) so zelo reaktivni prosti radikali, snovi ali molekule s kisikom. Najpogostejši ROS sta O2- (superoksid) in H2O2 (vodikov peroksid). ROS lahko reagirajo s sestavinami celice, zelo radi pa napadejo tudi KGDHC. Oksidativni stres se pojavi v našem telesu zaradi povečane koncentracije ROS. Povzroča različne bolezni, naprimer Alzheimerjevo bolezen, Parkinsonovo bolezen, diabetes, revmatoidni artritis in nevrodegeneracijo. Po drugi strani pa tudi sam KGDHC proizvaja kisikove spojine in tako se ustvari začarn krog. Ker je vse regulirano, že ob najmanjši spremembi v metabolizmu pride do proizvodnje ROS in povzročitve oksidativnega stresa.<br /> <br /> ===Filip Mihalič: Pomen MicroRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih===<br /> <br /> MicroRNA molekule, so vrsta nekodirajočih RNA molekul dolgih približno 22 nukleotidov, in imajo celo vrsto zelo pomembnih funkcij za razvoj organizma, ter za ohranjanje metabolne homeostaze v le tem. Primarno delujejo kot zaviralec transkripcije mRNA, s tem da se nanjo vežejo, in s tem ribosomu ne pustijo prepisovanja v proteine. Prve miRNA molekule so odkrili okoli leta 1990 v glisti Caenorhabditis elegans vendar njihove vloge kot enega pomembnejših metabolnih regulatorjev niso prepoznali do začetka dvajsetega stoletja. Najdemo jih v skoraj vseh bioloških procesih povezanih z ekspresijo mRNA, od metabolizma lipidov in holesterola do inzulinske signalizacije. Njihov vpliv je velikokrat povezan z transkripcijskimi faktorji, s katerimi sodelujejo v težnji po ravno pravšnji ekspresiji genov. So dokaj pred kratkim odkrita skupina molekul, zato še niso dobro raziskane, in mehanizmi njihovega delovanja še niso povsem pojasnjeni. Najbolje sta raziskana prav vpliva na lipidno in inzulinsko homeostazo, na kateri se bom osredotočil v seminarju. Do sedanje raziskave miRNA pa so predlagale njihovo veliko uporabnost v farmaciji ter kasneje medicini, saj njihovo nepravilno delovanje privede do bolezni kot so huda predebelost, inzulinska neodzivnost (diabetes tipa 2), zamaščena jetra itd.<br /> <br /> ===Vita Vidmar: Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic===<br /> <br /> Pentozafosfatna pot v celicah zagotavlja NADPH, ki je potreben za ohranjanje redukcijskega okolja v celici in za redukcijske biosinteze, ter riboza 5-fosfat, ki je prekurzor za sintezo nukleotidov in se po potrebi lahko reciklira nazaj v glukoza 6-fosftat. Ta v celicah poteka v majhnem obsegu, saj je skrbno regulirana, predvsem z negativnimi regulatorji.<br /> V rakavo spremenjenih celicah zaradi poslabšane regulacije pentozafosfatna pot poteka v povečanem obsegu, kar jim omogoča pomembne prednosti. Ker proizvedejo velike količine NADPH in riboza 5-fosfata, jim to omogoča preživetje in hitrejše razmnoževanje, vpliva pa tudi na širjenje metastaz in angiogenezo (rast novih krvnih žil proti tumorju).<br /> Poznavanje vloge pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic lahko pripomore k odkritju učinkovitejšega načina zdravljenja rakavih obolenj.<br /> <br /> <br /> ===Gregor Gunčar: Do what you want, but post your abstract here!===<br /> <br /> <br /> Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Suspendisse sed justo congue, faucibus metus in, sodales tellus. Nulla nec erat in mauris condimentum rutrum. Maecenas vel scelerisque velit, at tincidunt massa. Praesent molestie euismod diam quis iaculis. Etiam non diam malesuada, pellentesque massa id, feugiat nulla. Integer eget euismod purus. Sed dignissim lectus quis fermentum ultrices. Nunc quis scelerisque ligula, nec laoreet justo. Morbi vitae felis in nibh commodo iaculis quis ac turpis. Nam feugiat a dui a faucibus.<br /> <br /> Cras et elementum urna. Proin vel tortor sit amet urna facilisis ultrices lobortis sit amet neque. Sed luctus convallis urna, pulvinar ullamcorper sem adipiscing sit amet. Nullam fringilla ante est. Praesent viverra tortor vel felis convallis, non placerat enim condimentum. Suspendisse rutrum fermentum odio, in molestie risus consectetur ac. Sed interdum neque ultricies, fermentum tortor quis, consequat est. Sed vel faucibus felis.<br /> <br /> <br /> ===Ema Guštin: Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka===<br /> <br /> Otto Heinrich Warburg je bil začetnik kvantitativnih raziskav metabolizma rakavih celic, ukvarjal pa se je tudi s fotosintezo in s celičnim dihanjem. Okoli leta 1920 je s sodelavci pokazal, da v aerobnih pogojih tumorska tkiva v mlečno kislino oz. laktat pretvorijo približno desetkrat več glukoze kot celice normalnega tkiva. Ta pojav danes imenujemo Warburgov efekt. Vendar pa je za to povečanje aerobne glikolize v rakavih celicah pogosto napačno mišljeno, da se zgodi namesto mitohondrijskega dihanja, in je bilo napačno interpretirano kot dokaz za poškodbe dihanja, čeprav gre v resnici za poškodbe v regulaciji glikolize. Pravzaprav mnoge vrste rakov kažejo Warburgov efekt in pri tem ohranijo mitohondrijsko dihanje. Warburgova opažanja v povezavi s sedanjimi koncepti metabolizma raka tesno povezujejo s spremembami na mitohondrijski DNK, onkogeni in zaviralci tumorjev, torej bi njegovo hipotezo lahko izkoristili za zdravljenje raka.<br /> <br /> ===Maja Zupančič: Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje eksoresijo genov in celično signalizacijo===<br /> <br /> Z razrešitvijo kristalne strukture proteina menina, sta Huang in Murai ugotovila, da spada v skupino ogrodnih proteinov. Nahaja se v jedru, v manjših koncentracijah pa ga lahko najdemo tudi v citoplami, izražen pa je v vseh tkivih. Kristalno strukturo jedrnega proteina menina lahko opišemo z obliko zavite leve roke, kjer N-domena predstavlja β-lasnično zanko, zgornja domena palec in osrednja domena predstavlja dlan. Ko menin reagira z peptidom MLL1 ali transkripcijskim faktorjem JunD, se povežeta v globoki žep, ki ga oblikuje struktura menina. Menin reagira s številnimi proteini (JunD, MLL1, TGFβ, SUMO, β-katenin,…) in tako vpliva na espresijo genov in celično signalizacijo. Menin sodeluje tudi pri številnih signalnih poteh,, kot so signalna pot transformirajočega rastnega faktorja β, kostnega morfogenetskega proteina, kanonične poti Wnt in signalizacija jedrnega receptorja. Pri ljudeh je protein menin kodiran z genom MEN1. Če pride do mutacije tega gena, se pojavi dedna bolezen multipla endokrina neoplazija ali Wermerjev sindrom, za katerim vsako leto zboli 1 na 30 000 ljudi. Pri multipli endokrini neoplaziji pride do tvorbe številnih tumorjev v različnih endokrinih organih. Bolezen ni ozdravljiva, lahko pa zdravimo tumorje, ki nastanejo. Z zgodnjim odkritjem bolezni in primernim ter efektivnim zdravljenjem, se prognoza lahko izboljša.<br /> <br /> ===Vesna Radić: Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa===<br /> <br /> Uveljavljen način zdravljenja sladkorne bolezni tipa 2 je dnevni vnos inzulina v telo z injekcijami in do nedavnega je prevladovalo mnenje, da alternative temu ni. Nova študija o delovanju beta celic trebušne slinavke pod vplivom hormona betatrofina namiguje, da so temu šteti dnevi. <br /> Na Harvard Stem Cell Institute so z uporabo peptida, ki se veže na inzulinske receptorje spodbudili odpornost na inzulin in tako identificirali hormon betatrofin. Je peptidni hormon, najden v jetrih in maščevju miši, pri človeku pa le v jetrih. Pri ljudeh se ga da izslediti z metodo western blottinga. Posredno naj bi zvišal stopnjo razmnoževanja beta celic pankreasa v procesu celične delitve. <br /> Za ugotovitev, ali betatrofin res vpliva na stopnjo razmnoževanja beta celic, so uporabili injekcijo v veno repa, da bi prenesli izražanje betatrofina v jetra – eno od običajnih mest njegovega delovanja - povišana stopnja pomnoževanja je bila tako drastična, da so lahko zlahka prepoznali otočke in beta celice pri majhni povečavi<br /> Pomembna lastnost zdravljenja s tem hormonom je ta, da je betatrofin zelo specifičen; ne vpliva na druga tkiva in tako bi prišlo do manj zapletov, saj bi telo proizvajalo lasten inzulin. Poleg tega prednost tudi ta, da je ta študija podlaga za razvoj klinično uporabnih celic z reprogramiranjem odraslih beta celic trebušne slinavke brez uporabe izvornih celic.<br /> <br /> ===Luka Kavčič: Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice===<br /> <br /> Piruvat kinaza (PK) je encim, ki katalizira zadnjo stopnjo glikolize, pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat in s tem fosforilacijo ADP v ATP. Izocimska oblika M2 je pomembna v metabolizmu rakavih celic, saj zaradi manjše aktivnosti v primerjavi z M1 obliko omogoča manjši pretok skozi glikolizo ob enaki absorpciji glukoze iz krvi, kar vodi do akumulacije glikoliznih intermediatov. Ti so tako bolj dostopni biosinteznim potem v celici, kar ji omogoča hitro celično delitev ter razvoj tumorja. Prav tako je pomemben pri odzivu na oksidativni stres, saj z svojo oksidacijo posredno omogoča aktivacijo pentoza-fosfate poti, v kateri nastaja NADPH, kar predstavlja zadosten redukcijski potencial za vzpostavitev homeostaze. <br /> Pod določenimi pogoji se lahko PKM2 translocira v jedro, kjer deluje kot transkripcijski regulator s svojo protein kinazno aktivnostjo ter fosforilira transkripcijske faktorje, kot so Stat3, histon 1 in histon 3. Ugotovljeno je bilo, da lahko fosforilacijo proteinov izvaja le v dimerni obliki, katera je najbolj zastopana oligomerna oblika PKM2 v jedru. Zaradi svoje prisotnosti v skoraj vseh rakavih celicah, je PKM2 atraktivna tarča zdravljenja. Zadnje raziskave kažejo na testiranje različnih aktivatorjev, ki bi z povečano aktivnostjo encima preprečile kopičenje surovin za izgradnjo ter s tem zmanjšale rast tumorja.<br /> <br /> ===Ana Krišelj: Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih===<br /> <br /> Sfingozin-1-fosfat (S1P) je signalna molekula, ključna za regulacijo mnogih celičnih procesov, med katere spadajo tudi celična rast in diferenciacija, apoptoza, migracija celic in mitoza. Nastane s fosforilacijo sfingozina, proces pa je reguliran preko sfingozin kinaze (SK), ki v celicah nastopa v dveh izooblikah – SK1 in SK2. <br /> S1P lahko deluje znotraj ali zunajcelično - lahko se veže na proteine v celicah (HDAC1/2, TRAF2..) ali na membranske receptorje S1PR1-5, ki spadajo v družino z G-proteini sklopljenih receptorjev. Zaradi kompleksne regulacije je S1P možen povzročitelj bolezni, ki se kot le-te izrazijo zaradi napak v mehanizmu delovanja same signalne poti, bodisi zaradi SK ali S1PR receptorjev. Napake se izrazijo kot vrsta kardiovaskularnih (ateroskleroza), vnetnih (astma, multipla skleroza), rakavih in nekaterih drugih obolenjih (diabetes, ishemija).<br /> Vloga S1P in razumevanje molekularnega mehanizma teh bolezni torej ponuja nova področja in možnost raziskovanja v smeri odkrivanja potencialnih zdravil.<br /> <br /> ===Katjuša Triplat:Signalizacija s člani TGF –ß pri žilni morfogenezi in boleznih===<br /> TGF-β je vrsta citokina, ki uravnava proliferacijo, celično diferenciacijo in druge funkcije v večini celic. Transformirajoči rastni faktor – ß (TGF–ß) naddružina je velika skupina beljakovin, ki jo sestavlja 33 različnih članov, ki vključujejo: TGFß – proteine, kostne morfogenetične proteine (BMP), rastne diferenciacijske faktorje (GDF), aktivine, inhibine, nodalne in »lefty« proteine ter Müllerjevo inhibitorno substanco (MIS). Člani družine transformirajočih rastnih faktorjev – ß (TGF–ß) igrajo pomembno vlogo pri razvoju zarodka, homeostazi odraslega in pri različnih boleznih. Ti citokini izzovejo svoje učinke na celice preko specifičnih serin/treonin kinaznih receptorjev tipa I in II ter intracelularnih transkripcijskih foktorjev Smad in s tem povzročijo signalno kaskado. Prenos signalov lahko poteka po Smad – odvisni ali Smad – neodvisni poti. TGF-ß signalna pot kontrolira celično proliferacijo, prepoznavanje, diferenciacijo, apoptozo in specifikacijo razvojne usode med embriogenezo in v zrelih tkivih. Inaktivacija te poti tako prispeva k tumorogenezi. Genetske študije na miših in ljudeh so pokazale pomembno vlogo TGF-β signalnih elementov v žilni morfogenezi in njeni disfunkciji. Izguba TGF-β signalnih elementov privede, zaradi nepravilnega nastanka kapilar ali okvarjene diferenciacije in pridobivanja gladko mišičnih celic, do nenormalnega nastanka primitivnega žilnega pleteža in zmanjšane integritete žilnih sten.<br /> <br /> ===Urša Kapš: Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni===<br /> <br /> Za življenje je pomembno uravnavanje metabolične energije. V mnogih organizmih so celične lipidne kapljice in trigliceridi največji shranjevalci energije. Preobilica zalog ali pomanjkanje tvorjenja in obnavljanja maščob vodijo do številnih človeških bolezni, kot so lipodistrofija (genetske okvare v lipidnih zalogah), rakava kaheksija (kompleksen metabolični sindrom, povezan z nenadno izgubo zaloge lipidov), prekomerna debelost, steatoza jeter (bolezen zamaščenih jeter) in kardiovaskularne bolezni (bolezni srca in ožilja, najpogostejša je ateroskleroza = poapnenje žil). Nevaren je tudi nastanek penastih celic (makrofagi, ki imajo nakopičeno veliko količino holesterolnih estrov), ki zamašijo žilo. Maščoba je shranjena v lipidnih kapljicah, vendar je, kljub njihovi pomembnosti za celico in fiziologijo organizma, relativno malo znano o njihovih mnogih osnovnih procesih v različnih tkivih. Pomembni proteini, ki regulirajo zalogo lipidov in številni geni, ki kodirajo proteine lipidnih kapljic, ki so povezani z metaboličnimi boleznimi, so že identificirani. Na primer BSCL2 so geni, ki kodirajo transmembranski protein seipin, katerega funkcija je izražena v lipidni biosintetski poti. V zadnjem času se je zanimanje in število raziskav na področju zalog lipidov, raznih novih pristopov za zdravljenje bolezni, povezanih s premalo ali preveliko zalogo maščob, drastično povečalo, kar nas bo pripeljalo do novih dognanj in boljšega znanja na tem področju znanosti.<br /> <br /> ===Tim Božič: Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje ===<br /> <br /> Hormon serotonin nastane iz triptofana s pomočjo triptofan hidroksilaze in aktivira serotoninske receptorje, ki se nahajajo v živčnih celicah. Aktivirani, regulirajo številne druge nevrotransmitorje in hormone, ki vplivajo na naše razpoloženje. Serotoninski receptorji pravilno funkcionirajo le, kadar so izraženi na površini živčnih celic. Površinsko izražanje teh je pogojeno z motoričnimi proteini, kinezini, ki so sestavljeni iz glave, pecljatega dela in repa. Ti najprej vežejo vezikel serotoninskih receptorjev na svojo FHA domeno, nato pa se s tristopenjskim procesom, pri katerem je potrebna energija (v obliki ATP), pomikajo po mikrotubulih do plazmaleme. V primeru okvare kinezinskih transporterjev se vezikli s serotoninskimi receptorji akumulirajo v citoplazmi. Posledica je abnormalno vedenje osebkov, ki kaže na simptome tesnobe. Simptome je mogoče zdraviti z antidepresivi SSRI, kot so Prozac, Celexa, Luvox, Zoloft, Paxil, Lexapro in drugi. Ti z vezanjem na serotoninski transporter povečajo raven serotonina izven celice. Kljub temu mehanizem delovanja SSRI antidepresivov v celoti še ni poznan.<br /> <br /> ===Domen Klofutar: Lipoliza - reguliran multiencimski kompleks, ki vpliva na katabolizem zalog maščobe===<br /> <br /> Maščobne kisline, ki v našem telesu služijo kot zaloga energije, se s pomočjo različnih encimov in transporterjev prenesejo do maščobnega tkiva, kjer se shranijo v obliki maščobnih kapljic. Maščobne kapljice so strukture obdane z enojnim lipidnim slojem, v katerih so shranjeni trigliceridi. Ko telo prejme signal, da primanjkuje energije, se njihove zaloge začnejo sproščati iz maščobnih kapljic v kri, nato pa se s serumskim albuminom prenesejo do oksidativnih tkiv, kjer se z β-oksidacijo pretvorijo v acetil CoA. Proces razgradnje trigliceridov in njihovo skladiščenje je močno reguliran proces. Njihovo razgradnjo katalizirajo različni encimi. Najpomembnejši so maščobna triglicerid lipaza, od hormonov odvisna lipaza in monoglicerid lipaza. Maščobna triglicerid lipaza ATGL je regulirana z aktivatorjem CGI-58 in inhibitorjem G0S2, aktivnost od hormonov odvisne lipaze HSL pa se uravnava s fosforilacijo. Monoglicerid lipaza MGL ima vlogo v katabolizmu trigliceridov in tudi pri endokanabinoidni signalizaciji. Če v telesu nastopi kakršnakoli okvara tega regulatornega sistema lipaz, nastopijo različne bolezni. Te bolezni so posledica kopičenja trigliceridov v celicah oziroma pomanjkanja prostih maščobnih kislin, ki se lahko prenesejo v kri.<br /> <br /> ===Aneja Tahirovič: Omega-3 maščobne kisline in njihov vpliv na človeško telo===<br /> <br /> Esencialne maščobne kisline so tiste, ki so za telo pomembne, vendar jih ni sposobno sintetizirati samo. Mednje spadajo tudi omega-3 maščobne kisline in omega-6 maščobne kisline.<br /> Omega-3 maščobne kisline se nahajajo v morskih živalih, školjkah in nekaterih suho-zemnih rastlinah.<br /> Omega-6 maščobne kisline pa najdemo v oljih in hrani živalskega izvora. Pomembno je uravnavanje ravnotežja, obeh maščobnih kislin, v telesu. <br /> V primeru presežka omega-6 maščobnih kislin, pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo provnetno. V tem primeru pride do večjega tveganja za razvoj bolezni, kot so rak, kardiovaskularne in avtoimunske bolezni.<br /> Ob presežku omega-3 maščobnih kislin pa pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo protivnetno in zavirajo bolezenske procese. Ugotovljeno je bilo, da omega-3 maščobne kisline dobro delujejo kot preventiva za nastanek srčno-žilnih bolezni, rakavih obolenj, za preprečitev razvoja Alzheimerjeve bolezni ter drugih nevrodegenerativnih bolezni, zmanjšajo možnost za razvoj depresije ter povečajo absorbcijo kalcija in s tem zmanjšajo možnosti za nastanek revmatoidnega artritisa in parodontitisa.<br /> Kolikšna količina omega-3 maščobnih kislin je za telo zdrava, je odvisno od starosti. Novorojenčki in otroci do prvega leta starosti, maščobnih kislin omega-3 še ne smejo uživati, zato je pomembno, da jih toliko več, uživajo matere že med nosečnostjo.<br /> <br /> ===Jure Fabjan: Oksidativni in nitrozativni stres v nevrotoksičnosti amonijaka===<br /> <br /> Hiperamoniemija je stanje povišane koncentracije amonijaka v krvi. Korelacija med koncentracijo amonijaka v krvi in stopnjo HA ni dobro raziskana, saj so simptomi pri obolelih z isto koncentracijo amonijaka različni. Zdravi se jo z različnimi zdravili, odvisno od njenega vzroka. Zdravljenje deluje na principu omejevanja vnosa amonijaka ter povečanja njegovega izločanja. HA lahko nato preide v možganski edem ali hepatično encefalopatijo. Hepatična encefalopatija se zdravi z antibiotiki, intermediati cikla uree in drugimi substancami, vendar so zdravila bodisi dokaj neučinkovita, ali pa imajo stranske učinke. Pri bolnikih, katerih hepatična encefalopatija je posledica akutne odpovedi jeter, je že v začetnih stopnjah potrebna presaditev jeter.<br /> Kakšne so poti na molekulski ravni, ki vodijo do takih posledic, je še vedno v veliki meri misterij, vendar je sedaj vsaj znano, da povišana koncentracija amonijaka povzroči tvorbo reaktivnih kisikovih in dušikovih zvrsti, te pa v veliki meri povzročajo simptome, ki so enaki simptomom hepatične encefalopatije.<br /> <br /> ===Maruša Prolič-Kalinšek: Vloga PPAR pri razgradnji maščobnih kislin===<br /> <br /> Receptorji aktivirani s proliferatorjem periksosomov ( PPARs ) so del družine z ligandom aktiviranimi transkripcijskimi faktorji. Prvotno so jih identifirali kot receptorje, ki inducirajo proliferacijo peroksisomov v celici, od tod tudi ime. PPARs imajo pomembno vlogo pri regulaciji celične diferenciacije, razvoja, metabolizma ( maščob, ogljikovih hidratov in proteinov ), karcinogeneze in vnetja. Njihovi naravno nastopajoi ligandi so maščobne kislini in razni derivati maščobnih kislin, obstaja pa tudi že več sintetičnih ligandov. Poznamo PPAR alfa, PPAR beta in PPAR gama in imajo enak osnoven mehanizem delovanja, so aktivirani z maščobnimi kislinami in njihovimi derivati ter si delijo veliko tarčnih genov. V jedru reagirajo tako, da tvorijo heterodimerje z drugimi jedrnimi receptorji RXR ( retinoid X receptor ) in se nato vežejo na regulatorne regije DNA v bližini genov, katerim potem spremenijo hitrost transkripicije ( povečajo ali zmanjšajo ). Podtipi PPARs se razlikujejo v in vivo funkcijah. PPAR gama je največ v adipocitnem tkivu in jetrih. Ima vlogo pri vklopitvi genov potrebnih za diferenciacijo adipocitov in genov za proteine, ki so potrebni pri sintezi in shrambi lipidov. PPAR alfa je izražen v jetrih, ledvicah, srcu, skeletni mišici in BAT. V jetrih PPAR vklopi gene za vnos in beta oksidacijo maščobnih kislin ter formacijo ketonskih telesc med stradanjem. PPAR beta se odziva na spremembe v prehranskih lipidih. PPAR beta je aktiven v jetrih in mišicah in stimulira veliko genov, ki kodirajo proteine za beta oksidacijo. Povzroči kurjenje maščob, izgubo teže in termogenezo.<br /> <br /> <br /> ===Jan Rozman: Proteini - alternativni vir energije rastlin ob pomanjkanju ogljikovih hidratov===<br /> <br /> Ker je celica najmanjša gradbena enota, ki kaže znake življenja, morajo biti procesi znotraj nje kar najbolj optimizirani in dobro regulirani. Poleg tega, mora celica ves čas izvajati regulacijo procesov glede na stanje metabolitov v njej sami in glede na okolje, hranila, ki jih pridobiva iz njega. Za množico teh procesov skrbi TOR omrežje. Običajno je vir energije glukoza, ki jo rastlina proizvede s fotosintezo, a če nastopi obdobje, ko je ni, se mora celica zateči k alternativnim substratom. V tem seminarju sem se najbolj osredotočil na proteine, sicer pa so lahko nadomestek še lipidi in klorofil. Proteini se lahko razgradijo na dva načina, z avtofagijo ali v proteosomu. S tem celica pridobi aminokisline, ki jih lahko porabi za sintezo novih proteinov, ali pa jih razgradi v mitohondriju in na ta način pridobi elektrone za dihalno verigo in energijo v obliki ATP. V primerjavi z energijo, ki se jo lahko pridobi z razkrojem saharoze, je ta pri degradaciji proteinov pičla, a zadostuje, da celica in z njo rastlina preživi temno obdobje, ko primanjkuje ogljika v obliki CO2 iz zraka.<br /> <br /> <br /> ===Peter Prezelj: Aminokisline in regulacija proteinske sinteze v skeletnem mišičnem tkivu===<br /> <br /> Proteinska sinteza v skeletni muskulaturi je reguliran kompleksen proces, katerega natančne signalne poti se še vedno raziskuje. Termin proteinska sinteza v mišičnem tkivu, oz. mišična proteinska Sinteza opredeljuje nastanek (novih) kontraktilnih proteinov v sarkomerah, najmanjših krčjivih enotah prečno progastega mišičevja. Na to sintezo vplivajo trije pomembni faktorji: mehanski stres (predvsem v smislu dela ali treninga z obremenitvijo), rastni faktorji oz. hormoni ter aminokisline. V seminarju sem se dodeljenemu poglavju ustrezno osredotočil na aminokisline kot tip primarnega sporočevalca, ki signalizira zagon mišične proteinske sinteze. Že zaradi samih človeških kapacitet sinteze aminokislin, je logično, da so pomembne predvsem esencialne aminokisline. Človeška prebavila ter jetra sta pr imetabolzimu beljakovin kot dva selektivna filtra, ki določata kakšna količinska sestava aminokislin bo prispela do mišičnega tkiva, in esencialne, posebej razvejane aminokisline, so tu dominantne. Študije so pokazale, da je za mišično proteinsko sintezo najpomembnejša aminokislina levcin, saj izven- ter znotrajcelična koncentracija le-te aminokisline pozitivno regulira sintezo novih kontraktilnih proteinov. Kar precej raziskav je odkrilo, da levcin stimulira proteinsko sintezo v skeletnem mišičevju prek celičnega kompleksa mTOR, h kateremu konvergirajo tudi drugi signali. Raziskave ne mTOR singalizacijski poti pa kažejo precej potenciala pri preprečevanju mišične atrofije pri starejših ter obolelih. <br /> <br /> ===Simon Bolta: C4 fotosinteza===<br /> <br /> V splošnem poznamo 3 različne fotosintetske poti, ki potekajo v različnih rastlinah. To so C3, C4 in CAM fotosinteza. Najbolj razširjena je C3 fotosinteza. Pri tej se pojavi problem zaradi nespecifičnosti encima rubisko. Ta načeloma veže CO2 na ribulozo-1,5-bisfosfat. Zaradi svoje nespecifičnosti pa lahko namesto CO2 veže O2. Posledično ne pride do fiksacije ogljika, produkt 2-fosfoglikolat pa je škodljiv za celico, in je metabolni odpadek. Temu procesu pravimo fotorespiracija. Tako prihaja do velikih energetskih izgub, prav tako pa tudi do manjše učinkovitosti izrabe dušika ter vode. Zato se je razvila C4 fotosinteza. Pri tej je vzpostavljen mehanizem, preko katerega je CO2 zelo koncentriran ob rubisku. To učinkovito zavira fotorespiracijo, ter izboljšuje efektivnost rastlin pri fiksaciji dušika in porabi vode. Dandanes so je vse večja problematika glede prehrane svetovnega prebivalstva. Če bi nam uspelo inducirati C4 fotosintezo v C3 rastlinah, bi to povečalo hektarski donos, zato se v zadnjih letih precej dela na tovrstnem inženiringu. Poleg tega bi bila zadeva koristna za uporabo biogoriv. Zaenkrat znanstveniki še niso uspeli ugotoviti uspešne metode, preko katerih bi lahko potem ustvarili korist za širše množice ljudi.<br /> <br /> <br /> ===Aljaž Omahna: Sinteza melanina v celicah===<br /> <br /> Melanin je vrsta polimernih spojin, ki da koži, lasem in očem barvo, najdemo pa ga tudi v možganih. Melanin se v tvori v posebnih celicah imenovanih melanociti. Poznamo več tipov melanina to so evmelanin, fevmelanin in nevromelanin. Evmelanin in fevmelanin nastajata v lizosomskih veziklih poimenovanih melanosomi. Med seboj se razlikujeta po strukturi. Evmelanin je izgrajen le iz aminokisline tirozin, fevmelanin pa je poleg tirozina izgrajen tudi iz cisteina. Tvorba spojin melanina pa je katalizirana preko encima tirozinaze, ki je ključna za nastanek teh pigmentov, tirozinazi sorodnem encimu (TRYP1) in dopakrom tavtomeraza (DCT). Melaninski pigmenti ščitijo celice bazalne plasti kože pred poškodbami in mutacijami. Melanom je kožna oblika raka, ki lahko nastaja v katerem koli melanocitu. Za to obliko raka umre največ ljudi, ki trpi za kožnim rakom. Albinizem je genska bolezen ali motnja, pri kateri gre za pomanjkanje pigmenta melanina. Največkrat je okvarjen genski zapis za encim tirozinazo, ki je glavni encim pri sintezi melanina.<br /> <br /> <br /> ===Taškar Jan: Zgodnje napake pri oksidativni fosforilaciji v odpovedujočem človeškem srcu===<br /> <br /> V današnji dobi je odpoved srca eden najpogostejših vzrokov smrti. Do odpovedi pride ko srce ni več zmožno dovolj dobro črpati kri po telesu za zadostovanje metaboličnih potreb organizma. Srce za svoje nemoteno delovanje stalno potrebuje ogromne količine ATP-ja, ki služi kot vir energije v našem telesu. Delovanje srca lahko ovirajo kardiovaskularne bolezni, virusne okužbe ali zloraba drog in alkohola, saj onemogočijo srčnim celicam, da bi proizvajale dovolj velike količine ATP molekul, kar privede do oslabitve srčnih funkcij in sčasoma do njegovega zastoja. Raziskave v preteklosti so že pokazale kakšne so posledice na procese oksidativne fosforilacije v srcih, ki so že odpovedala. Nova raziskava pa želi spremljati stanja srčnih celih v različnih stopnjah srčnih bolezni, da bi odkrili in razumeli kje se začnejo napake pri oksidativni fosforilaciji in zakaj, ter s tem mogoče nudili nove opcije za zdravljenje ali lajšanje srčnih obolenj.<br /> <br /> <br /> ===Mojca Juteršek: Regulacija sinteze peptidoglikanske celične stene===<br /> <br /> Peptidoglikanska celična stena bakterij, imenovana tudi mureinski sakulus, obdaja plazmalemo Gram negativnih in pozitivnih bakterij. Pri Gram negativnih bakterijah celično steno obdaja še zunanja membrana. Sinteza celične stene poteka v treh stopnjah, pri teh reakcijah sodelujejo PBP (penicillin binding proteins). Ker je celična stena toga struktura, a mora hkrati omogočati celično rast, delitev in specifično oblikovanost, mora biti sinteza časovno in prostorsko regulirana. Posledično se je pojavila hipoteza, da obstajajo multiencimski kompleksi, ki združujejo PBP z encimi, ki sintetizirajo lipid II, encimi, ki razgrajujejo celično steno in drugimi regulatorji. Znano je, da citoskeletna polimera proteinov FtsZ in MreB združujeta proteine v takšne komplekse s citoplazemske strani in tako regulirata lokalizacijo teh kompleksov v celici. V zadnjem času, pa so se pojavili dokazi, da regulacija v Gram negativnih bakterijah poteka tudi iz zunanje membrane preko dveh lipoproteinskih kofaktorjev LpoA in LpoB, ki regulirata PBP1A in PBP1B, ter s tem predstavljata nove potencialne tarče za antibiotike.<br /> <br /> ===Luka Krmpotić: Vpliv Ca2+ na metabolično homeostazo===<br /> Celica vzdržuje konstantno koncentracijo ATP, ADP, Pi, kljub spremembam v porabi energije, kar imenujemo metabolična homeostaza. Ker je kalcijev ion signalna molekula pri mnogih energijsko (ATP) potrošnih procesih (e.g. skrčitev mišic, nevrosignalizacija) postane kanditat za regulatorja metabolične homeostaze. Saj bi lahko ob signalizaciji za proces ki porablja energijo, hkrati dal, predvidoma v mitohondriju, posredni signal za sintezo ATP-ja in tako prispeval k vzdrževanju metabolične homeostaze. To hipotezo podpira dejsto velikega Ca2+ gradienta na notranji mitohondrijski membrani, kar omogoča hitro signalizacijo potrebno za ohranitev ravnotežja; pozitivni vpliv Ca2+ na sposobnost PDC-ja (piruvat dehidrogenaznega kompleksa, encim katabolizma) da pretvori piruvat v acetil-CoA [pozitivno vpliva tudi na druge dehidrogenaze NAD-IDH (NAD vodena izocitrat dehidrogenaza), alpha-KDH (alpha-ketoglutarat DH)]... to so kazale prve raziskave. Ampak regulacija dehidrogenaz ni edin način Ca2+ prispevka k metabolični homeostazi. Razne metode ki so podrobneje opazovala razmere v celici so pokazale še druge prispevke kalcije k homeostazi, med drugim njegov vpliv na F1FO-ATPazo.<br /> <br /> ===Eva Vidak: Fotosintetska plastičnost CAM fotosinteze: evolucijska novost za trajnostno proizvodnjo===<br /> Rastline so avtotrofni organizmi, torej so sposobne fiksirati atmosferski CO2 in ga uporabiti kot vir ogljika za sintezo glukoze. To lahko počnejo s C3 ali C4 karboksilacijo. Nekatere rastline pa lahko uporabijo tudi CAM (ang. crassulacean acid metabolism) fotosintezo, ki je veliko bolj varčna pri porabi vode kot ostali dve karboksilaciji. Poleg tega CAM fotosinteza, s slovensko sopomenko kisli metabolizem tolstičevk, izraža veliko fotosintetsko plastičnost in se zlahka prilagaja na spremenljive razmere v okolju. To je posledica tega, da obstaja več tipov CAM fotosinteze in da je njen potek razčlenjen v 4 faze, ki se lahko krajšajo ali podaljšujejo v odvisnosti od okoljskih razmer. Ravno zaradi varčne porabe vode in zaradi velike prilagodljivosti lahko CAM-rastline uspevajo tudi na degradiranih tleh ali celo puščavskih tleh. Njihove prednost,i v primerjavi s C3- in C4-rastlinami, ponekod po svetu že izkoriščajo predvsem za pogozditev in za izboljšanje degradirane zemlje. Poleg tega dodatne raziskave kažejo, da bi njihovo prilagodljivost lahko izkoristili tudi za pridelavo teh rastlin na bolj severnih območjih, kjer zaradi omejene osvetlitve v naravi ne morejo uspevati. CAM-rastline bi torej lahko postale pomemben vir za pridelavo bioenergije v času vse pogostejših suš in vse težjih okoljskih razmer.<br /> <br /> ===Boštjan Petrič: Regulacija in inhibicija citokrom c oksidaze===<br /> Citokrom c oksidaza (CcO) je dobro znana kot zadnji encim dihalne verige, prek katerega se elektroni prenesejo na kisik in nastane voda. Marsikomu je znana tudi kot mesto, kamor se veže cianid, ko zaide v človeško telo. Izkaže se, da gre le za enega od številnih načinov, kako molekule povečajo ali zmanjšajo aktivnost tega encima. V seminarju je govora najprej o alosteričnih mestih, na katera se vežeta ATP in ADP, na nekatera pa tudi posamezni proteini in hormoni. Sledi opis funkcije, ki jo opravljajo v telesu štiri molekule plinov, ki se radi vežejo na CcO, ter načina, kako se vežejo nanjo. Na kratko je omenjena tudi vezava nekaterih zdravil na CcO in pa vezava kovinskih kationov na rob enega od protonskih kanalčkov. Nazadnje je prisoten še obsežnejši opis fosforilacij, prek katerih je regulirano delovanje CcO, ter nekaj drugih načinov, kako jo reguliramo oz. odstranimo določene podenote s tvorbo dodatnih vezi. Skupna točka vseh teh reakcij je, da je potrebno delovanje CcO ob zadostni količini energije omejiti in zmanjšati bodisi pretočnost elektronov po njej bodisi črpanje protonov skoznjo, ob pomanjkanju energije pa rabimo njeno delovanje pospešiti in prekiniti vse metode inhibicije. Pretirano delovanje tega encima namreč pretirano poveča membranski potencial, to pa vodi k pretirani tvorbi reaktivnih kisikovih spojin – to pa je nevarnost, tveganje katere mora biti upravičeno.<br /> <br /> ===Rok Ipšek: Glutation - celični antioksidant===<br /> Cistein je amino kislina, ki se nahaja v vseh celicah in je potrebna za sintezo proteinov. Tiolna skupina (-SH) ima to značilnost, da je podvržena oksidaciji, kar je verjetno postalo pomembno s pojavom kisika v atmosferi pred okoli 2, 4 milijardami let. Je veliko manj stabilna molekula kot npr. koencim A, povrhu pa se pri njeni oksidaciji sproščajo razne reaktivne kisikove zvrsti. Ta problem celice rešujejo tako, da ohranjajo nizek nivo cisteina in ga »zapakirajo« v bolj stabilne oblike, kot je glutation. Njegova glavna in najbolj znana funkcija je antioksidantska aktivnost, kjer donira redukcijski ekvivalent (proton in elektron) nestabilnim molekulam, sam pa se pri tem oksidira in spremeni v dimer. V seminarski nalogi sem poleg te vloge opisal še nekatere druge. Ne manjka niti zgodovina odkrivanja te zanimive snovi, sledi opis sinteze s pomočjo dveh encimov in transsulfuracijske poti ter bolezni, povezanih s tem. Omenim tudi terapevtski potencial, ki je še dokaj neizkoriščen, v zadnjem poglavju pa substance, ki nadomeščajo njegovo vlogo pri prokariontih, skupini veliko bolj raznolikih živih bitij, kot so evkarionti.<br /> <br /> ===Toni Nagode: Encimi in snovi ključne pri vključevanju uracila v DNA===<br /> Rast rakavih celic ni kontrolirana na enak način kot je rast v normalnih celicah. Rakave celice rastejo hitreje in imajo zato tudi drugačne potrebe po osnovnih celičnih komponentah in hranilih. Ker hitra rast pomeni večje število delitev, so za sintezo nove DNA zahteve po nukleotidih večje. Posledično so takšne celice bolj občutljive na inhibicijo biosinteznih poti nukleotidov. V medicini je poznanih veliko pomembnih kemoterapevtikov, ki inhibirajo enega ali več encimov na tej biosintezni poti. Timidilat sintaza je encim, ki pretvori uracil v timin in je zato ena glavnih tarč snovi, ki inhibirajo njen mehanizem. Inhibicija TS privede do izčrpanja dTTP, bistvenega prekurzorja za sestavo DNA, namesto njega pa se v DNA začne vključevati dUTP. Celice imajo razvite mehanizme, ki so zmožni popraviti določene nepravilnosti. V primeru, da je potrebno izrezati več nepravilno vstavljenih nukleotidov, to vpliva na funkcije in regulacijo DNA, kar privede do zlomov DNA verige, mutacij-karcinogeneze ali celične smrti. Njen pomemben kofaktor in donor metilne skupine je metilen H4folat, ki se med reakcijo oksidira do H2folata. To je tesno povezano z opažanji, da ima folat oz. folna kislina ključno vlogo pri DNA hipometilaciji in prekomernemu vključevanju uracilnih enot v DNA. V seminarju sem predstavil več možnih vzrokov in poti, ki privedejo do pojavljanja uracila v DNA in vključil še nekaj razlag inhibicij mehanizmov ključnih encimov.<br /> <br /> ===Sabina Štukelj: Sfingolipidi in vloga sfingolipidnega metabolizma pri raku===<br /> Sfingolipidi so kompleksne spojine zaradi svoje kombinatorne biosinteze in zato, ker jih sestavlja veliko različnih fosfo- in glikolipidov. Za njih je značilna prisotnost amino-lipidnega ogrodja na katerega je vezana amidna maščobna kislina ali pa različne druge na hidroksilno skupino vezane skupine. Pri njihovi biosintezi so pomembne predvsem: sinteza ceramida, sinteza glukozilceramida in pa sinteza sfingomielina. Encimske reakcije v sfingolipidnemmetabolizmu so porazdeljene po različnih celičnih kompartmentih. Bolj kompleksna sinteza sfingolipidov, kot sta svingomielin in glikozilceramid, se odvija v Golgiju. Spremenjen sfingolipidni metabolizem prispeva h kancerogenezi, progresiji raka in rezistenci na kemoterapevtike. Disregulacija sfingolipidov je kompleksna pot, saj bi dugače bil ceramid negativno reguliran v vseh tipih raka. Proces vključuje anabolne in katabolne metabolizme večih sfingolipidnih metabolitov. Odkritja novih raziskav prispevajo k novim lipidomnim strategijam, ki bi bile zelo učinkovite pri prepoznavanju novih tarč na osnovi sfingolipidov in identifikaciji potencialnih tumorjev. Nadaljne raziskave in razumevanje metabolizma sfingolipidov naj bi doprinesle k razvoju novih kemoterapevtikov.<br /> <br /> ===Helena Jakše: Inhibicija skvalen sintaze kot alternativa statinom===<br /> Statini so zdravila, ki v sodobnem svetu služijo kot zdravila proti hiperholesterolemiji, bolezni pri kateri imamo povišan holesterol v krvni plazmi. Na tak način nas statini varujejo pred kardiovaskularnimi boleznimi. Ker pa s svojim delovanjem pri nekaterih posameznikih povzročajo močne negativne stranske učinke znanstveniki iščejo alternativo. Alternativo bi lahko predstavljali inhibitorji skvalen sintaze, encima v zadnjem delu biosintetske poti holesterola. Encim skvalen sintaza pretvori dve molekuli FPP-ja (farnezil fosfopiruvat) v skvalen, ta pa se nato v nadaljnih korakih pretvori do holesterola. Inhibitorji skvalen sintaze so se izkazali še bolj unčinkovito kot statini in ne povzročajo stranskih učinkov kot so na primer miopatija, utrujenost,… Tarča statinov je inhibicija HMG-CoA reduktaze. S takšno inhibicijo preprečimo nastanek ne le holesterola, temveč tudi mnogih za telo pomembnih snovi. Inhibitorji skvalen sintaze pa delujejo drugače in s tem ohranijo nastanek pomembnih snovi v telesu. Za zdaj so se kot učinkoviti inhibitorji izkazali TAK-475, ER-27856, BMS-18949. Preučili so tudi še nekatere druge inhibitorje, vendar so se v nekaterih primerih izkazali kot toksični in so bili zato izključenih iz nadaljnjih farmacevtskih raziskav.<br /> <br /> ===Alja Zgonc: Regulacija metabolizma lipidov z miRNA===<br /> Lipidni metabolizem je tesno reguliran na več načinov. Na regulacijo preko transkripcije genov vplivajo klasične transkripcijske molekule, kot so SREBP. To je skupina proteinov, ki lahko aktivirajo vse gene, ki sodelujejo v sintezi holesterola, maščobnih kislin in fosfolipidov. Raziskave pa so pokazale, da pri regulaciji sodelujejo tudi skupina nekodirajočih RNA molekul, dolgih od 21 do 24 nukleotidov. To so mikroRNA molekule, ki vplivajo na lipidno homeostazo z post-transkripcijsko regulacijo genov. Najbolj pomembna je miR-33, ki regulira koncentracijo holesterola in HDL biogenezo z zmanjšano ekspresijo ABC transporterjev, ABCA1 in ABCG1. miR-33 ima še dodatno funkcijo v β-oksidaciji maščobnih kislin, saj inhibira transkripcijo ključnih encimov, ki so pri tem udeleženi in tako zmanjša razgradnjo maščobnih kislin. Ker je aktivnost miRNA stimulirana z zunanjimi dejavniki, imajo te molekule velik potencial kot biomarkerji za določanje napredovanje različnih bolezni in so morebitne tarče različnih zdravil za kardiovaskularne in metabolične motnje.<br /> <br /> ===Nika Strašek: Porfirija===<br /> Porfirija je relativno slabo poznana bolezen, ki spada v skupino redkih bolezenskih stanj in je povezana s podedovanimi in pridobljenimi motnjami v biosintezi porfirinov in hema. To skupina osmih metaboličnih motenj, do katerih pride med različnimi koraki biosinteze hema. V njej je namreč udeleženih 8 encimov in kolikor pride do kakršnekoli spremembe ali pomanjkanja enega od encimov, biosinteza hema ne more potekati normalno.To se navzven kaže kot ena od oblik porfirije. <br /> Delimo jih na primarne in sekundarne ter na akutne in kronične. Pod akutne porfirije spadajo akutna intermitetna porfirija, hereditarna koproporfirija, porfirija variegata in pa porfirija pomanjkanja ALA dehidrataze pod kronične pa spadajo porfirija kutanea tarda, eritropoetična porfirija, hepatoeritropoetična porfirija in pa kongenitalna eritropoetična porfirija oz. Gunterjeva bolezen.<br /> Porfirijo imenujejo tudi »vampirska bolezen«, kajti nekateri simptomi so zelo podobni lastnostim vampirjev in najverjetneje tudi miti o vampirjih in volkodlakih izhajajo ravno iz te bolezni.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2013&diff=8636 BIO2 Seminar 2013 2013-12-13T10:50:59Z <p>Petra Tavčar: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Biokemijski seminar =<br /> Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 13:00 do 16:00.<br /> <br /> Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime Priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Tema*'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Triplat Katjuša||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892410001212 Signalizacija s člani TGF – β pri žilni morfogenezi in boleznih]||Ipšek Rok||Štukelj Sabina||Krmpotić Luka||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013<br /> |-<br /> | Krišelj Ana||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892411001772 Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih] ||Tavčar Petra||Zgonc Alja||Petrič Boštjan||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013<br /> |-<br /> | Zupančič Maja||12||[http://www.cell.com/trends/biochemical-sciences//retrieve/pii/S0968000413000911?showall%3Dtrue&amp;_returnURL=http%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0968000413000911%3Fshowall%3Dtrue Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje ekspresijo genov in celično signalizacijo]||Guštin Ema||Jakše Helena||Bolta Simon||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013<br /> |-<br /> | Božič Tim||12||[http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247%2813%2900021-1 Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje]||Oblak Zvonar Eva||Strašek Nika||Juteršek Mojca||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013<br /> |-<br /> | Vidmar Vita||14||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2013#Vita_Vidmar:_Vloga_pentozafosfatne_poti_v_metabolizmu_rakavih_celic Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic]||Rupert Jakob||Nagode Toni||Vidak Eva||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013<br /> |-<br /> | Radić Vesna||14||[http://www.nature.com/news/liver-hormone-offers-hope-for-diabetes-treatment-1.12878 Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa]||Triplat Katjuša||Ipšek Rok||Štukelj Sabina||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013<br /> |-<br /> | Guštin Ema||14||[http://www.nature.com/nrc/journal/v11/n5/full/nrc3038.html Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka]||Krišelj Ana||Tavčar Petra||Zgonc Alja||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013<br /> |-<br /> | Kapš Urša||15||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3721468/ Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni]||Zupančič Maja||Guštin Ema||Jakše Helena||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013<br /> |-<br /> | Kavčič Luka||15||[http://www.cell.com/trends/endocrinology-metabolism//retrieve/pii/S1043276012001166?_returnURL=http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1043276012001166?showall=true Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice]||Božič Tim||Oblak Zvonar Eva||Strašek Nika||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013<br /> |-<br /> | Mihalič Filip||15||[http://www.nature.com/nrm/journal/v13/n4/full/nrm3313.html Pomen microRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih]||Vidmar Vita||Rupert Jakob||Nagode Toni||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013<br /> |-<br /> | Košenina Sara||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0304383510001436? Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla]||Radić Vesna||Triplat Katjuša||Ipšek Rok||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013<br /> |-<br /> | Bensa Tjaša||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925443909001926 α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni]||Horvat Marjeta||Krišelj Ana||Tavčar Petra||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013<br /> |-<br /> | Ferenc Rok||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717610000868 Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis]||Kapš Urša||Zupančič Maja||Guštin Ema||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013<br /> |-<br /> | Buh Tajda||16||[http://jnci.oxfordjournals.org/content/102/13/932.long Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku]||Kavčič Luka||Božič Tim||Oblak Zvonar Eva||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013<br /> |-<br /> | Jazbec Vid||17||[http://www.nature.com/nrc/journal/v13/n4/full/nrc3483.html Vpliv maščobnih kislin na rakave celice]||Mihalič Filip||Vidmar Vita||Rupert Jakob||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013<br /> |-<br /> | Tahirović Aneja||17||[http://www.nature.com/news/fish-oil-supplement-research-remains-murky-1.11484 Omega - 3 maščobne kisline in njihov vpliv na človeško telo]||Košenina Sara||Radić Vesna||Triplat Katjuša||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013<br /> |-<br /> | Klofutar Domen||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163782710000524 Lipoliza - reguliran multiencimski kompleks, ki vpliva na katabolizem zalog maščobe]||Bensa Tjaša||Horvat Marjeta||Krišelj Ana||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013<br /> |-<br /> | Prolič - Kalinšek Maruša||17||[http://www.nature.com/cr/journal/v20/n2/abs/cr201013a.html Vloga PPAR pri razgradnji maščobnih kislin]||Ferenc Rok||Kapš Urša||Zupančič Maja||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013<br /> |-<br /> | Fabjan Jure||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0197018612003506 Oksidativni in nitrozativni stres v nevrotoksičnosti amoniaka]||Buh Tajda||Kavčič Luka||Božič Tim||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013<br /> |-<br /> | Rozman Jan||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1360138511001063 Proteini - Alternativni vir energije rastlin ob pomanjkanju ogljikovih hidratov]||Jazbec Vid||Mihalič Filip||Vidmar Vita||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013<br /> |-<br /> | Prezelj Peter||18||[http://ajcn.nutrition.org/content/83/2/500S.abstract?sid=e4e3425c-566d-4249-a604-0cfc846f1972 Aminokisline in regulacija proteinske sinteze v skeletnem mišičnem tkivu]||Tahirović Aneja||Košenina Sara||Radić Vesna||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013<br /> |-<br /> | Omahna Aljaž||18||[http://www.nature.com/jid/journal/v127/n4/full/5700683a.html Sinteza melanina v celicah]||Klofutar Domen||Bensa Tjaša||Horvat Marjeta||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013<br /> |-<br /> | Taškar Jan||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1357272511002135 Zgodnje napake pri oksidativni fosforilaciji v odpovedujočem človeškem srcu]||Prolič - Kalinšek Maruša||Ferenc Rok||Kapš Urša||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013<br /> |-<br /> | Kašnik Urška||19||Moj izbrani naslov||Fabjan Jure||Buh Tajda||Kavčič Luka||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013<br /> |-<br /> | Kostanjevec Mojca||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800041000071X Mitohondrijske reaktivne kisikove spojine]||Rozman Jan||Jazbec Vid||Mihalič Filip||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013<br /> |-<br /> | Krmpotić Luka||19||[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3332087/ Vpliv Ca2+ na metabolično homeostazo]||Prezelj Peter||Tahirović Aneja||Košenina Sara||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013<br /> |-<br /> | Petrič Boštjan||19||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3436951/ Regulacija in inhibicija citokrom c oksidaze]||Omahna Aljaž||Klofutar Domen||Bensa Tjaša||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013<br /> |-<br /> | Bolta Simon||20||[http://www.plantcell.org/content/23/11/3879.abstract Fotosinteza C4]||Taškar Jan||Prolič - Kalinšek Maruša||Ferenc Rok||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013<br /> |-<br /> | Juteršek Mojca||20||[http://www.nature.com/nrmicro/journal/v10/n2/full/nrmicro2677.html Regulacija sinteze peptidoglikanske celične stene]||Kašnik Urška||Fabjan Jure||Buh Tajda||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013<br /> |-<br /> | Vidak Eva||20||[http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1469-8137.2011.03781.x/abstract Fotosintetska plastičnost CAM fotosinteze: evolucijska novost za trajnostno proizvodnjo]||Kostanjevec Mojca||Rozman Jan||Jazbec Vid||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013<br /> |-<br /> | Štukelj Sabina||21||Moj izbrani naslov||Krmpotić Luka||Prezelj Peter||Tahirović Aneja||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014<br /> |-<br /> | Zgonc Alja||21||Moj izbrani naslov||Petrič Boštjan||Omahna Aljaž||Klofutar Domen||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014<br /> |-<br /> | Jakše Helena||21||[http://circ.ahajournals.org/content/123/18/1974.short regulacija skvalen sintaze]||Bolta Simon||Taškar Jan||Prolič - Kalinšek Maruša||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014<br /> |-<br /> | Strašek Nika||22||[http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/120/23/4496.short Porfirija]||Juteršek Mojca||Kašnik Urška||Fabjan Jure||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014<br /> |-<br /> | Nagode Toni||22||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19489731 Fiksacija dušika]||Vidak Eva||Kostanjevec Mojca||Rozman Jan||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014<br /> |-<br /> | Ipšek Rok||22||Moj izbrani naslov||Štukelj Sabina||Krmpotić Luka||Prezelj Peter||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014<br /> |-<br /> | Tavčar Petra||23||[http://edrv.endojournals.org/content/30/4/293.long Sestavine plastike vplivajo na delovanje endokrinega sistema]||Zgonc Alja||Petrič Boštjan||Omahna Aljaž||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014<br /> |-<br /> | Horvat Marjeta||23||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741000718X Uravnavanje metabolizma železa pri sesalcih] ||Jakše Helena||Bolta Simon||Taškar Jan||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014<br /> |-<br /> | Oblak Zvonar Eva||23||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2670357 Leptin: Signalizacija v možganih]||Strašek Nika||Juteršek Mojca||Kovačič Matic||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014<br /> |-<br /> | Rupert Jakob||23||Moj izbrani naslov||Nagode Toni||Vidak Eva||Kostanjevec Mojca||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! <br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2013|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt;Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).<br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div> Petra Tavčar https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO1_Povzetki_seminarjev&diff=7881 BIO1 Povzetki seminarjev 2013-03-04T19:01:07Z <p>Petra Tavčar: </p> <hr /> <div>== Petra Tavčar: Zdravljenje Huntingtonove bolezni s proteini s cinkovimi prsti ==<br /> Huntingtonova bolezen je monogenska dedna bolezen, ki se razvije zaradi prekomernega ponavljanja zaporedja nukleotidov CAG na genu, ki nosi zapis za protein huntingtin. Pri obolelih se zaporedje ponovi od 36 do 121-krat (normalno: 10 do 29-krat). Protein huntingtin je odgovoren za zdrav embrionalni razvoj ter razvijanje in ohranjanje nevronov pri odraslih ljudeh. Pri bolnikih nastaja protein z daljšo verigo poliglutamina, ki se z ostalimi mutiranimi huntingtin proteini združuje v proteinske agregate. Le-ti tvorijo inkluzijska telesca, ki se nalagajo na aksonih, dendritih in v jedrih nekaterih možganskih živčnih celic ter motijo normalno delovanje celic. To privede do sprememb v obnašanju, demence in horee (sunkovitih nehotenih gibov).<br /> <br /> Trenutno še ne poznamo načina, s katerim bi zdravili ali preprečevali to bolezen. V razvoju pa je zdravljenje s proteini s cinkovimi prsti. To so regulatorni proteini, ki vsebujejo motiv cinkovega prsta. Prepoznavajo in se vežejo na določene odseke DNA in s tem regulirajo izražanje gena, na katerega se vežejo. Ker je oblikovanje proteinov s cinkovimi prsti enostavno, lahko izdelamo različne proteine, ki se vežejo na različne odseke DNA. Prav tako lahko nanje pripnemo poljubne regulacijske molekule ali vezavne elemente, kar omogoča specifično vezavo na želeni mutiran gen in preprečuje represijo nemutiranih genov.<br /> <br /> Oblikovali so protein z enajstimi cinkovimi prsti, ki prepozna in se veže na poli 5´- GC(A/T) -3´. Sposoben je prepoznati poli-CAG ter poli-GCA, poli-GCT DNA del. Z raziskavo so dokazali, da represorji s cinkovimi prsti lahko povzročijo redukcijo na nivoju RNA in na nivoju proteinov v možganih miši, kar vodi do izboljšanja v fenotipu obolelih miši. Kombiniranje represorjev s cinkovimi prsti in promotorjev CAG in WPRE lahko omogoči selektivno represijo mutiranega gena, zmanjšano količino škodljivih proteinskih agregatov in blažitev simptomov Huntingtonove bolezni.<br /> <br /> <br /> == Rok Ferenc: Nov način zdravljenja Androgenic alopecia ==<br /> Androgenic alopecia oz. bolj splošno &quot;plešavost&quot; je bolezen, sicer značilna za moške, vendar prizadene tudi ženske in najstnike. Čeprav je izjemno razširjenja in bi uspešno zdravilo nedvomno ponovilo globalni uspeh in razvpitost modre tabletke, saj ima plešavost velike psihološke učinke na prizadetega, so do sedaj znana zdravila bodisi neučinkovita, bodisi zaradi stranskih učinkov nezaželena. Nedavno odkritje kapljic za oči, ki pospešijo rast trepalnic, je znanstvenike pripeljalo do novih raziskav, ki predvsem temeljijo na novo odkriti snovi - bimatoprost, ki bi hipotetično prek receptorjev lokalno lahko vplival na lasne folikle in pospešeno rast las. Slednje jim je uspelo potrditi. Najprej so izločili zunanji vpliv na rast dlak z gojenjem foliklov v kulturi, s poskusi na miših so teorijo prenesli na žive organizme, z opazovanjem delovanja antagonista za bimatoprost pa so dokončno potrdili obstoj receptorjev. Receptorje so z gelsko elektroforezo dokazali tudi v človeku ter jih s posebnimi tehnikami locirali v dermalni pupili, ki naprej stimulacijsko vpliva na celice, ki proizvajajo pigment in keratin. Svet je tako korak bliže k zdravljenju plešavosti in hkrati dvig ogromnega bremena z ramen marsikaterega moškega... pa tudi ženske.<br /> <br /> == Tomaž Rozmarič: Inženiring hiper katalitičnega encima ==<br /> Dan danes je uporaba encimov v industriji zelo visoka. Bakterije gensko modificirajo in uporabljajo za sintezo najrazličnejših snovi.Zadnje<br /> čase so bakterije postale zanimive za proizvodnjo energije, saj so sposobne sintetizirati vodik, z njimi porizvajajo bio-goriva in celo<br /> elektriko. Te reakcije so še prepočasne, da bi bile uporabne v masovnih proizvodnjah in bi lahko bile konkurenca že obstoječim virom energije<br /> kot so fosilna goriva(nafta) in jedrska energija. Zato so se znanstveniki začeli spraševati, kako bi lahko povečali hitrost reakcij in prav s<br /> tem so se ukvarjali v članku, katerega sem prebral. Idejo jim je dal mehanizem reakcije v očesu. Ko svetloba pade na rodopsin povzroči vrsto<br /> kemijskih reakcij, med drugim tudi konformacijske. To konformacijo zazna določen protein, ki jo pretvori v električni signal in pošlje do<br /> možganov. Na podlagi tega so se odločili, da bi na nek encim pripeli neko molekulo, katera bi regulirala konformacijo encima, ko bi<br /> to oni hoteli. To so potem naredili s pripetjem azobenzenskega mostu na encim(azobenzen pod določeno valovno dolžino spremeni konformacijo iz<br /> cis v trans in obratno) in ugotovili, da se je hitrost reakcije znatno povečala, kar bi lahko bil velik prelom za biogoriva in druge encimsko<br /> odvisnie reakcije.<br /> <br /> == Ana Cirnski: TAL efektorji - proteini, ki urejajo gene ==<br /> TAL (transcription activator – like) efektorji so regulatorni proteini, ki vplivajo na delovanje RNA polimeraze pri prepisovanju DNA. Z vezavnimi domenami se vežejo na specifična zaporedja baz na dvojni vijačnici in tako uravnavajo hitrost sinteze proteinov. Najbolj znani regulatorni proteini so motiv cinkovega prsta, motiv levcinske zadrge in motiv vijačnica – obrat – vijačnica.<br /> <br /> TAL efektorje so odkrili v bakteriji vrste Xanthomonas, ki jih je uporabljala za reprogramiranje gostiteljskih celic, tako da so te sintetizirale proteine, ki so ustrezali bakteriji.<br /> <br /> Domena TAL efektorja, ki se veže na DNA vsebuje 1-35 TAL ponovitev. Vsaka ponovitev je specifična za en bazni par na DNA in vsebuje 33-35 aminokislin (zadnja je okrnjena na 20 aminokislin), ki so vedno na istem mestu. Izjema sta mesti 12 in 13, znani tudi kot RVD mesti (repeat variable diresidues), ki določata specifičnost med efektorjem in DNA verigo.<br /> <br /> TAL efektorji se med seboj ločijo po aminokislinskem zaporedju in številu njihovih ponovitev. Od teh lastnosti je odvisna specifičnost efektorja.<br /> Za prepoznavo specifičnih mest na DNA sta odgovorni RVD mesti, ki določata, kam se bo efektor vezal. Obstaja tudi posebna koda po kateri se en par aminokislin veže na določen nukleotid. TAL ponovitve nimajo medsebojnega vpliva zato jih je lažje sestavljati in tako spremeniti efektor.<br /> Uporabljajo se lahko kot umetni restrikcijski encimi (TALEN) za dvoverižne prekinitve DNA (DSB – [double–strand breaks]), kar povzroči v celici popravljalne mehanizme in vodi do sprememb v genskem zapisu. Lahko pa tudi kot transkripcijski faktor (dTALE) za vklapljanje in izklapljanje genov.<br /> <br /> Čeprav je o TAL efektorjih še veliko neznanega, kažejo možnosti za široko uporabo na področju biotehnologije in genetike za izboljševanje lastnosti živil in zdravljenje nekaterih bolezni (HIV).<br /> <br /> == Griša Prinčič: DNK nanotehnologija ==<br /> Nanotehnologija je ustvarjanje in inženiring funkcionalnih sistemov na atomskem in molekularnem nivoju. DNK nanotehnologija je veja nanotehnologije, ki izkorišča strukturne in kemijske lastnosti DNK molekule ter iz nje sestavlja strukture, ki ne nosijo informacijskega zapisa in so v velikosti do nekaj 100 nanometrov. Najpomembnejši del pri sintezi DNK makromolekul je optimizirano zaporedje nukleinskih kislin. Sekundarno strukturo lahko tvori več različnih zaporedij baz, vendar bo velika večina teh zaporedij imela tudi negativne medsebojne interakcije, kar bi lahko privedlo do spremembe v obliki sekundarne strukture. DNK molekula ima sposobnost samosestavljanja (self-assembly). Pod določenimi pogoji lahko enotno daljšo verigo DNK pripravimo do zvijanja (folding) oz. tvorbe določene (želene) strukture.<br /> <br /> V seminarski nalogi se bom osredotočil predvsem na razvoj tako imenovanih nanorobotov, ki služijo kot specializiran dostavni sistem signalnih molekul do celic v človeškem telesu. Ob aktivaciji receptorja se kapsula odpre in na mesto dostavi signalne ali druge molekule.<br /> <br /> Pripravljeni so bili nanoroboti v obliki heksagonalnega »soda«, ki so sposobni prepoznati okvarjene ali rakaste celice s pomočjo aptamernega receptorja, ki služi tudi kot »ključavnični mehanizem«. Učinkovitost prepoznavanja celic in »ključavničnega mehanizma« je bila preizkušena na šestih vrstah rakastih celic. Celic Burkitt-ovega limfoma nanoroboti niso prepoznali (se niso aktivirali), pri ostalih petih vzorcih je bila aktivacija potrjena.<br /> <br /> == Bojana Lazović: Vloga prionov pri preživetju divjih kvasovk ==<br /> Kvasovke imajo pomembno vlogo pri odkrivanju in spoznavanju lastnosti prionov. Raziskave na njih lahko močno pomagajo tudi pri razumevanju prionskih bolezni, ki se pojavljajo pri ljudeh.<br /> Znano je, da je velika posebnost prionov ta, da se lahko razmnožujejo brez DNK zapisa. Znanstveniki so pri raziskavah na laboratorijskih kulturah kvasovk prišli do pomembnih ugotovitev, glede vloge prionov pri dedovanju v kvasovkah. Razne konformacije proteinov v teh celicah imajo pomembno vlogo pri epigenetskem dedovanju, to je dedovanju, ki ni odvisno od zapisa na DNK verigi. S svojim delovanjem ustvarjajo dedne fenotipske lastnosti, njihova raznolikost pa spodbuja preživetje v spreminjajočih se okoljih in vpliva na razvoj novih lastnosti. Toda te lastnosti so potrdili le v laboratorijskih kulturah. Zato se je porajalo vprašanje, če enako velja tudi v naravi oz. za »divje« vrste kvasovk ali so ugotovljene značilnosti le umetno vzpodbujene v laboratoriju. Iz tega razloga so biokemično testirali okoli 700 različnih sevov vrste kvasovk Saccharomyce, da bi ugotovili če imajo prisotne prione. Rezultati so potrdili prejšnje raziskave. Tako so potrdili tezo, da prioni v splošnem urejajo nekatere dedne lastnosti v naravi, na način ki korenito poveča sposobnost prilagajanja.<br /> <br /> == Vesna Radić: Odziv imunskega sistema z IFN-λ ==<br /> Imunost je sposobnost obrambe telesa pred tujimi oz. škodljivimi snovmi, ki jih imenujemo tudi antigeni. Ko se ti pojavijo v telesu, jih imunski sistem prepozna in se odzove tako, da jih skuša uničiti na različne načine.<br /> IFN lambda že dolgo veljajo kot pomembno orožje v imunskem sistemu v obrambi proti virusom, bakterija, parazitom in tudi tumorom. So namreč interferoni, saj so zmožni posegati v razmnoževanje in delovanje patogenov. Interferoni so celične beljakovine sposobne komuniciranja med celicami in tako na razne načine sprožitve delovanja imunskega sistema. IFN-λ so del razreda II citokinov. Lambda je podoben α, saj oba delujeta proti virusom. Razlika med njima je ta, da IFN-α lahko proizvedejo vse celice, ki imajo jedro, IFN-λ pa le nekaj določenih celic. Makrofagi proizvajajo IFN-λ za odziv na virusne in/ali bakterijske okužbe. Citokin IFN lambda se ustvari predvsem iz limfocita CD8+ T – spominske celice. T celice se aktivirajo ob prisotnosti že znanega antigena če ne pa živijo v neaktivnem stanju, ko se pa znova srečajo z že znanim antigenom, sprostijo IFN-λ. <br /> Regulacija sproščanja IFN-λ še ni povsem znana; na podlagi novih študij izvemo, da se lahko sprostijo tudi brez aktivacije pri kontaktu z antigeni. Prav tako so odkrili tudi, da imajo ti interferoni pomembno vlogo pri zdravljenju hepatitisa B in C, astme in raka.<br /> == Julija Mazej: Pretvorba HDL v LDL preko CETP molekule ==<br /> Lipoproteini so raznovrstni delci, sestavljeni iz proteinskega in holesterolnega dela. Na podlagi deleža proteinov in holesterola v posameznem delcu ločimo 5 vrst lipoproteinov: hilomikrone, LDL,HDL,VLDL in IDS. V seminarju se bom omejila na dva, ki imata še posebej veliko vlogo pri transportu holesterola po krvni plazmi. HDL je lipoprotein visoke gostote in ima prevladujoč proteinski del. Znan je tudi kot dober holesterol, saj prenaša presežni holesterol iz celic do jeter, kjer poteče razgradnja. LDL pa je lipoprotein, ki prenaša holesterol v obratni smeri. V kolikor ima celica dovolj holesterola, se prične ta kopičiti na stenah žil, kar vodi do kardiovaskularnih bolezni. Pred kratkim so znanstveniki odkrili mehanizem pretvorbe dobrega holesterola v slab holesterol, preko majhne molekule CETP. Molekula deluje kot most med obema lipoproteinoma in prečrpa holesterol iz HDL v LDL. To odkritje daje nove perspektive na področju zdravljenja kardiovaskularnih bolezni, ki so glavni vzrok bolezni in prezgodnje smrti v Evropski Uniji in razvitem svetu. Učinkovito zdravilo, bi torej moralo inhibirati delovanje CETP molekule. Po rezultatih raziskave medicinske univerze na Dunaju, pa takšno zdravilo nebi pomagalo pacientom z ledvično odpovedjo. Pri nekaterih pacientih na dializi so namreč izsledili nefunkcionalen HDL. Spregovorila bom tudi o nastanku &quot;&lt;ra slabega&quot; LDL, pri starejših in obolelih za diabetesom tipa 2.<br /> <br /> == Ana Grom: Visokotehnološko odkrivanje rakavih celic dojk ==<br /> Rak na dojkah je v današnjem svetu kar velik problem pri ženskah. Metode, ki se uporabljajo za zaznavo le tega, pa niso dovršene. Vsaka od njih (mamografija, ultrazvok, magnetna resonanca in druge) ima kakšno slabo lastnost. Metode, ki bi bila zdravju popolnoma neškodljiva, nezmotljiva, kratkotrajna in cenovno lahko dostopna še ni odkrita. Zato so znanstveniki prišli na idejo, da bi poizkusili z nanodelci detektirati rakave celice. Najprej so si izbrali Her2 protein (Human epidermal growth factor receptor 2), ki bo tarča teh nanodelcev. Za protein so predhodno vedeli, da se v 30% rakavih celic dojk čezmerno izraža. Da bi se magnetni nanodelci usmerili proti rakavim celicam in nanje tudi vezali, so ustvarili nanodelce povezane s protitelesi za Her2 protein. Nato, ko bi se nanodelci vezali na celice, pa bi s posebnimi občutljivimi napravami zaznavali te nanodelce in s tem tudi rakave celice v telesu. Poskusi, ki so jih izvedli, da bi potrdili svoja predvidevanja so bili zelo spodbudni. Uspelo jim je dokazati, da se nanodelci resnično v večji meri vežejo na celice, ki imajo več Her2 receptorjev (rakave celice). Nekaj izmed metod, s katerimi so prišli do teh rezultatov, bom tudi sama predstavila.<br /> <br /> == Robert Berger: Svetlobno stikalo za bolečino ==<br /> S podaljševanjem življenjske dobe in vse bolj tveganimi življenjskimi slogi v današnjem času ne moremo mimo bolečin, pa naj bodo akutne ali kronične, zato si medicina prizadeva, da bi jih, če jih že ne more odpraviti, vsaj lajšala. Vendar pri analgetikih in anastetikih pogosto naletimo na sistemske stranske učinke in odvisnosti, zato je odkrivanje novih vrst anastetikov in analgetikov eden pomembnejših ciljev farmacevtske industrije. Quaternary ammonium – azobenzene – quaternary ammonium oziroma QAQ je ena izmed možnih rešitev pri nadzoru bolečine. Sicer obstajajo optogenetske metode za uravnavanje aktivnosti nociceptorjev (bolečinskih receptorjev), vendar so pogosto preveč invazivne, saj zahtevajo spremembo DNK in lahko vodijo v trajne genetske spremembe, kar pa ni vedno zaželeno. QAQ s svojo strukturo omogoča blokado ionskih kanalov v nociceptorjih in tako prepreči bolečinski signal. Njegova posebnost pa je v njegovi strukturi, saj ga lahko z določenimi valovnimi dolžinami svetlobe (380 in 500 nm) spreminjamo med cis in trans izomerom, pri čemer cis izomer dovoljuje nemoten pretok Na+ in Ca2+ ionov, trans izomer pa zapre ionski kanal. Tako lahko prostorsko in tudi časovno nadzorujemo njegovo aktivnost. Pri podobnih anastetikih, kot so npr lidokain, ki deluje na podoben način kot QAQ izomerizacija in s tem tudi časovni nadzor nista možna.<br /> <br /> == Erik Janežič:Raziskave golih krtovskih podgan (GKP) ==<br /> Tekom zgodovine je velika večina tehnoloških iznajdb našla navdih v živalskem svetu. Danes pa morda prav živali kot so gole krtovske podgane, skrivajo odgovera na nekatera največja vprašanja človeštva kot sta zdravljenje raka in staranje. Gole krtovske podgane niso pritegnile posebne pozornosti med zannstveniki, dokler ni bil v 2. trtjini 20. stoletja pri njih odkrit eusocialen način življenja. Do danes so bile odkrite izjemna lasttnosti golih krtovskih podgan kot naprimer; odpornost na raka, na hipooksično okolje, neobčutljivost na iritacijo s kislinami ter izredno dolga življenska doba v primerjavi z drugimi glodalci. V seminarski nalogi vam bom predstavil nekaj splošnih značilnosti golih krtovskih podgan in njihove odpornosti na rakava obolenja, podrobneje pa bom predstavil raziskavo, ki se je ukvarjala z opazovanjem intracelularnega kalcija pri izpostavitvi možganskih celic GKP hipooksičnem okolju. Povečane koncentracije intracelularnega kalcija v možganskih celicah je namreč glavni razlog, da celice odmrejo oziroma imajo trajne poškodbe strukture in funkcije.<br /> <br /> == Špela Tomaž: Specifično gibanje motornega proteina dineina ==<br /> Za normalno delovanje celic in potek celičnih procesov, so med drugim izredno pomembne funkcije transporta, organizacije ter gibanja celičnih delov in organelov. Nalogo opravljajo tako imenovani motorni proteini, ki aktivno prenašajo tovor z enega dela celice na drugega, s svojim gibanjem omogočijo delovanje bičkov ter migetalk in so odgovorni tudi za gibanje mišic. Posebej zanimiva je mehanika njihovega premikanja, saj zaradi sprememb v konformaciji njihovih sestavnih proteinov dobesedno korakajo po svoji bazi (mikrotubuli ali aktinski filamenti). Medtem ko je kinetika gibalnih proteinov miozinov in kinezinov že raziskana, pa je premikanje tretje vrste, dineinov, še vedno slabo poznano. Dineini se v mnogih strukturnih lastnostih od ostalih vrst razlikujejo, kar posledično vpliva tudi na njihovo korakanje, ki ni urejeno in periodično, tako kot pri miozinih in kinezinih. Sposobni so različno dolgih korakov, ne le naprej in nazaj, temveč tudi vstran pod različnimi koti. Izmenično preklapljajo med koordiniranim in nekoordiniranim gibanjem in so nepredvidljivi ter dinamični, kar bi jim predvidoma lahko prinašalo mnoge ugodnosti in boljše sposobnosti prilagoditve. V seminarski nalogi bom opisala nekatere ugotovitve nedavnih raziskav ter predstavila nekatere odkrite značilnosti gibanja dineina.<br /> <br /> == Samo Zakotnik: Telomeri in nesmrtnost celic ==<br /> <br /> Človeštvo že odkar obstaja sanja o nesmrtnosti, o večnem življenju. Medicina je skozi človeško zgodovino uspešno podaljševala življenja z odkrivanjem vedno novih zdravil in zdi se, da je v prihodnosti možno doseči nesmrtnost, toda le, če bomo premagali staranje. Starost samih celic pa je močno povezana z dolžino telomerov. Telomer je ponavljajoče se zaporedje nukleotidov, ki ščitijo kromosome pred poškodbami. Premajhna dolžina telomerov naj bi vodila v razvoj škodljivih mutacij in razvoju onkogenov, ki vodijo v nastanek raka. Da bi lahko preprečili škodljivo krajšanje telomerov moramo podrobno preučiti mehanizme, ki zagotavljajo ohranjanje dolžin telomerov v okvirjih, ki niso potencialno škodljivi, ali celo omogočajo obnavljanje telomerov in njihovo podaljševanje, kar bi vodilo do celične nesmrtnosti. Vse to je povezano s samo zgradbo telomerov in delovanjem telomeraze, encima, ki skrbi za podaljševanje telomerov.<br /> V drugem delu seminarja pa bom predstavil mehanizme somatskega obnavljanja telomerov in posledice inhibicije telomeraze na primeru ploskih črvov vrste Schmidtea mediterranea. Vrsta je predmet preučevanja že več kot 200 let zaradi izjemnih sposobnosti regeneracije, v sedanjem času pa postaja vse pomembnejši modelni organizem za preučevanje telomer in delovanja telomeraz. Leta 2010 so podelili Nobelovo nagrado za medicino in fizlologijo prav za odkritje, kako so konci kromosomov zaščiteni s telomeri in za odkritje encima telomeraze.<br /> <br /> == Zala Gluhić: Rubisco aktivaza ==<br /> <br /> Rubisco je encim, ki v temotnih reakcijah fotosinteze katalizira pretvorbo sladkorja ribuloza-1,5-bifosfat v molekuli 3-fosfoglicerata, iz katerih se nato lahko tvori glukoza. Vezava ribuloze-1,5-bifosfata na nekarboksiliran encim Rubisco inhibira. Za nemoten potek fotosinteze je potrebno sladkor odstraniti, kar v rastlinah poteka s pomočjo ATP odvisnega procesa z encimom Rubisco aktivaza. Rubisco aktivaze delimo na zeleni in rdeči tip. Struktura pri zelenem tipu je bila pojasnjena s pomočjo Rubisco aktivaze, poimenovane Rca, pri vrsti tobakovca N. tabacum. Pri rdečem tipu so bili izolirani kristali kompleksa iz rdeče alge R. sphaeroides (Rubisco aktivazo so poimenovali Cbbx). Pri obeh proteinih so odkrili podobno zgradbo. Sestavljena sta iz dveh domen - α/β poddomene ter α-vijačnica poddomene. Za svoje delovanje potrebujeta ATP, tvorita heksamerne obročaste strukture, na sredini katerih se nahaja pora. Zaenkrat mehanizem njunega delovanja še ni pojasnjen. Sklepajo, da gre pri Rca za premestitev Rubisca do centralne pore, kjer zanke destabilizirajo Rubiscovo aktivno mesto. Pri Cbbx pa verjetno sodeluje podaljšan C-konec Rubisca, ki ga aktivaza potegne v poro in s tem sprosti zanko, ki na Rubiscu veže sladkor, zato se sladkor lahko odcepi in Rubisco spet normalno deluje naprej.<br /> <br /> == Katarina Tolar: Razvoj plastidov (kloroplastov) in Paulinella ==<br /> <br /> Endosimbioza in posledično razvoj organelov je še vedno dokaj nepojasnjena. Čeprav je čedalje več rezultatov raziskav, ki endosimbiotsko teorijo potrjujejo in razlagajo. Najprimernejši in najuporabnejši organizem za raziskovanje in preučevanje tega dela evolucije je organizem Paulinella chromatophora. Ta organizem je najprimernejši, ker znanstveniki verjamejo, da je to najbolj izvoren še živeč fotosintetski protist. P. chromatophora naj bi bil en prvih organizmov, ki je vključil cianobakterije. Plastidi, ki so vključeni v različnih vrstah protistov se med seboj razlikujejo. Ugotovili so, da je genom plastida močno reduciran, v nekaterih vrstah plastidov bolj, v drugih manj. Vendar so med njimi velike podobnosti. Prav tako so dokazali, da so se plastidi res razvili iz cianobakterij, saj obstaja ogromna podobnost med genomi cianobakterij in genomi plastidov. Ker je genom plastidov močno zreduciran, so posledično plastidi močno odvisni od jedra. Zato so plastidi in gostiteljska celica razvili Tic in Toc premestitven sistem, ki omogoča prenos proteinov, ki so pomembni za gradnjo in razvoj plastidov iz citoplazme v sam plastid. Ta premestitveni sistem se je razvijal skupaj z rastlinami. Vendar je ohranjal tudi cianobakterijske lastnosti. To je še en dokaz, ki potrjuje endosimbiotsko teorijo.<br /> <br /> == Barbara Dušak: Funkcionalne posledice spremenjenih podenot v RNA polimerazah ==<br /> <br /> RNA polimeraze so encimi, ki usmerjajo transkripcijo DNA in sodelujejo pri genski regulaciji. V vseh evkariontskih organizmih so prisotne tri različne RNA polimeraze (I, II, III), rastline pa imajo še dve dodatni polimerazi RNA (IV in V). Polimeraze RNA II, IV in V so sestavljene iz 12 različnih podenot, ki imajo različne vloge. Izbrana raziskava se je osredotočila na delovanje devete podenote, ki ima dve različici, 9a in 9b, v Pol II, IV in V pri rastlini Arabidopsis thaliana. Izkazalo se je, da imata nefunkcionalni podenoti različne posledice na delovanje polimeraz. Raziskave so izvajali s križanjem rastlin divjega tipa z mutantkami 9a-1 in 9b-1, nato pa opazovali spremembe v organizmu. Heterozigoti 9a-1 niso kazali nobenih sprememb, 9b-1 pa so se fenotipsko razlikovali od divjega tipa. Homozigoti za mutirani različici obeh genov se sploh niso razvili. <br /> Predstavila bom spremembe, ki so se pojavile na molekularnem nivoju, v povezavi s tem, kar je že znano o delovanju polimeraz RNA.<br /> <br /> == Rok Razpotnik: Botulinum toksin v kompleksu z NTNHA (nehemaglutinirajočimi proteini) ==<br /> <br /> Botulinum toksin je najmočnejši do sedaj odkriti nevrotoksin. Botulinum nevrotoksin je možen agent za bioterorizem, po drugi strani pa se uporablja v terapijah in kozmetični industriji, znan pod imenom botox. V obeh primerih deluje kot inhibitor acetilholina, pri čemer napade živčne celice. Preden pa uspe priti do živčnih celic, ki nadzirajo delovanje mišic, mora toksin, pri zaužitju, iti skozi dolgo pot – preko celotne prebavne poti, kjer so prisotni številni prebavni encimi in izredno močno kislinsko okolje, do črevesja, kjer je nato vsrkan v krvni obtok, kjer se prevaža vse do živčnih celic. V seminarski nalogi vam bom predstavil organizem, ki proizvaja omenjeni nevrotoksin; bolezensko stanje, ki ga povzroča kontaminacija z botulinum toksinom; strukturo ter mehanizem delovanja, ter na koncu izsledke raziskave, kjer so ugotovili mehanizem delovanja kompleksa, v katerem je nevrotoksin vezan pri poti skozi prebavni trakt. V raziskavi so ugotovili, da se botulinum toksin veže v zaprt in stabilen kompleks z netoksičnim nehemaglutinirajočim proteinom (NTNHA), ta pa ga varuje pred ekstremnimi pogoji v želodcu (nizek pH, delovanje prebavnih proteaz). Kompleks se razpusti ko ta preide v črevesje, kjer vlada nevtralna pH vrednost. Tako prosti botulinum toksin v črevesju vstopi v krvožilje, ki potuje naprej do kolinergičnih nevronov, ker povzroči inhibicijo acetilholina. To se kaže v paralizmu mišic. Ugotovili so torej, da je mehanizem vezave botulinum toksina ter NTNHA ter preživetja nevrotoksina pogojen z mehanizmom spremembe pH vrednosti.<br /> <br /> == Erik Mršnik: Vloga Oct4 pri izražanju genov matičnih celic ==<br /> <br /> Med sesalčevim razvojem je potrebno, da iz ene totipotentne celice nastane več kot dvesto različnih tipov celic. Inducirane pluripotentne zarodne celice (ali krajše iPSCs) je možno pridobivati tudi iz somatskih celic z ekspresijo transkripcijskih faktorjev, ki so navadno izraženi v ESCs. Pluripotentno stanje se da vzdrževati z določenimi citokini. Na primer z LIF-om ali BMP4. <br /> Transkripcijski faktor Oct 4 (iz družine PouV) je osnoven za nastajanje in vzdrževanje iPSCs in ESCs. Če ga odstranimo, povzročimo diferenciacijo teh celic. Oct4 se izraža tudi v fazi gastrulacije matičnih celic, kjer blokira prezgodnjo diferenciacijo. Kljub mnogim raziskavam pa še vedno ni povsem znano, kako Oct4 deluje kot transkripcijski faktor pri reguliranju diferenciacije. Nekateri eksperimenti so pokazali, da lahko deluje kot aktivator ali represor genske transkripcije.<br /> Odkrili so, da se Oct4 pri svojem delovanju združuje z nekaterimi drugimi transkripcijskimi faktorji. Predvsem z Sox2 (iz družine HMG) in Nanog. Ti naj bi istočasno kontrolirali izražanje genov in regulirali razvoj ESCs. <br /> V tej študiji so se posvetili derivatom Oct4, ki so jih izdelali izključno kot aktivatorje ali represorje transkripcije. Vsak protein ima PouV DNA-prepoznavno sekvenco združeno z močno aktivacjsko (VP16) ali represijsko (Engrailed ali HP1) regijo transkripcije. Tekom študije so ugotovili, da pravzaprav samo aktivatorska oblika povzroči nastanek iPSCs. Aktivatorska fuzija vzdržuje rast in pluripotentnost mišjih ESCs, ki jim manjka »divjega tipa« Oct4. Oct4-aktivatorska fuzija lahko prepreči pluripotentost ne glede na pisotnost LIF-a. Predvidevajo, da delovanje Oct4 kot aktivatorja zadošča za povzročitev nastanka iPSC in vzdrževanje ESCs.<br /> <br /> == Matej Vrhovnik: Nove spojine, ki preprečujejo širjenje in izboljšajo zdravljenje raka ==<br /> <br /> Glioblastom je oblika agresivnega malignega raka, ki se razvije iz vezivnega tkiva v možganih. Po operaciji imajo pacienti naveč 2 leti življenja, brez zdravljena nekje do 3 mesece. Problem se pojavi po operaciji, kjer se odstrani do 99% rakastega tkiva in obsevanju, ker noben kemoterapevtik ne deluje dovolj učinkovito. Glioblastom tvori veliko metastaz, ki so zelo razširjene po zdravem tkivu in zato ne moremo z kemoterapevtiki napasti vse rakave celice, ker bi uničili tudi preveč zdravega tkiva, oziroma zdravilo ima preveč blag učinek. <br /> Znanstveniki so zato ustvarili spojino imipramine blue. Deluje tako, da inhibira tvorjenje reaktivnih kisikovih spojin, inhibira NADPH-oksidazo in reorganizira aktin v citoskeletu. Ravno reaktivne kisiko spojine so krive za invazivno širjenje rakastih celic po zdravem tkivu, kar pa imipramine blue prepreči, posledično je rak v strjeni skupini, kjer kemoterapevtik lažje opravi svoje delo. Dokazali so, da v kombinaciji z doxorubicinom zelo podaljša življenjsko dobo podgan, ki imajo tumor RT2, ki je zelo podoben človeškemu glioblastomu. Prav tako preprečuje poškodbo krvno-možganske pregrade, kar je ponavadi eden izmed stranskih učinkov kemoterapevtikov.<br /> <br /> == Matic Kovačič: Kronični stres vodi do poškodb DNA ==<br /> <br /> Stres je pri ljudeh prisoten že odkar imata nadledvični žlezi sposobnost izločanja stresnih hormonov, kot sta na primer adrenalin in noradrenalin. Včasih sta se hormona izločala kratek čas med bojem in telo pripravila na lažje preživetje. Danes pa smo v moderni družbi zaradi hitrega načina življenja in obveznosti, ki jih moramo izpolniti, podvrženi stresu skoraj ves čas. Dolgoročni stres, ki se imenuje tudi kronični stres, ima na naše zdravje in počutje negativne posledice. Znanstveniki so s poskusi na miših, na katerih so simulirali kroničen stres, ugotovili, da kronični stres vodi do povečanih napak v DNA z zmanjšanjem koncentracije proteina p53. Stresni hormoni, kot je recimo adrenalin, se vežejo na β2-adrenoreceptorje, kar povzroči večji izvoz proteinov p53 iz jedra v citosol, kjer jih proteasom razgradi. Protein p53 imenujejo tudi varuh genoma, saj v primeru poškodbe DNA zaustavi celični cikel in aktivira popravljanje poškodovanih delov DNA, če pa so poškodbe DNA prevelike, p53 povzroči celično smrt. Neka druga skupina znanstvenikov pa je ugotovila, da kroničen stres tudi zelo močno pospeši rast tumorjev. Povedal bom nekaj splošnih stvari o stresu in proteinu p53, nato pa predstavil raziskave in ugotovitve znanstvenikov.<br /> <br /> == Andreja Kukovec: Epigenetska blokada kognitivnih funkcij pri Alzheimerjevi demenci ==<br /> <br /> Alzheimerjeva demenca je ena od najpogostejših oblik demence. Večinoma se pojavi po 65. letu starosti. Eden začetnih simptomov je poslabšanje spomina, kar posamezniki pogosto napačno interpretirajo kot posledico staranja ali stresa. Gre za nevrogenenrativno bolezen. Točen vzrok nastanka Alzheimerjeve demence še ni znan. Dandanes je v veljavi opredelitev, da je Alzheimerjeva demenca posledica akumuliranja napačno zvitih proteinov - t. i. beta amiloidni plaki. Prisotni so tudi nevrofibrilarni vozli, ki se pa, za razliko od amiloidnih plakov, nahajajo znotraj nevronov. &lt;br/&gt; Histoni so bazični proteini, okoli katerih se ovije DNA. Na nestabilnih aminokislinskih koncih histonov se odvijajo različne modifikacije, ki regulirajo izražanje genov. Med slednje spadata tudi acetilacija in deacetilacija, ki imata pomembno vlogo pri izražanju genov, ki so povezani s spominom in učenjem. V raziskavi so ugotovili, da je histon HDAC2 pri bolnikih z Alzheimerjevo demenco prisoten v preveliki meri, kar blokira izražanje genov, pomembnih za spomin. Ko so z inhibitorji zmanjšali nivo HDAC2 se je nevronom povrnila sinaptična plastičnost in izražanje s spominom povezanih genov. To znižanje HDAC2 pa se je pokazalo tudi kot izboljšanje kognitivnih funkcij (pri miših), kar pomeni, da bi te ugotovitve lahko imele pomembno vlogo pri zdravljenju Alzheimerjeve demence.<br /> <br /> == Sara Bitenc: Okužba s Toxoplasmo gondii in povečana količina dopamina ==<br /> <br /> Kljub veliki farmacevtski ponudbi cepiv in antibiotikov na tržišču se žal ne moremo izogniti nekaterim infekcijskim boleznim, katerih vzrok so mikroorganizmi. Eden izmed takšnih organizmov, ki povzroča povsem svetu razširjeno in zahrbtno bolezen t. i. toksoplazmozo, je Toxoplasma gondii, znotrajcelični zajedavec. Ta zahteva tako gostitelja kot tudi vmesnega gostitelja, da je življenjski cikel parazita sklenjen. Ciste parazita povzročajo kronično infekcijo, pri čemer se razširijo v gostiteljeve mišice in možgane (največjih delež teh se je nahajal v amygdali in nucleus accumbens – predela v možganih), v posameznih znotrajceličnih tkivnih cistah pa T. gondii tvori več sto bradiozit. Da bi znanstveniki podali zaključek v zvezi s spremembami količine dopamine, so s paraziti okužene možgane pri miših raziskovali s protitelesi dopamina in ugotovili,da parazit prevzame nadzor nad gostiteljsko celico in začne spreminjati nevrotransmitsko signalno transdukcijo, kar v organizmu izzove različne vedenjske spremembe. Glavna ugotovitev moje seminarske naloge je, da je količina sproščenega dopamina povezana s številom parazitov v gojeni kulturi. Poskusi, ki jih bom predstavila, so bili izvedeni »in vivo« in »in vitro«. Veriga interakcij med patogenom (tistim, ki povzroča bolezen – T. gondii) in njegovim gostiteljem (v našem primeru je ta žrtev naša npr. živčna celica) je torej zelo zapletena; nedolgo nazaj je znanstvenike begala povezava med parazitom in njegovim obnašanjem… Danes pa vemo, da je za spremembe v metabolizmu dopamina ključna T. gondii, ta dognanja pa bodo prispevala k razlagi razvoja bolezni pri bolnikih s toksoplazmozo in nekaterih psihovedenjskih bolezni.<br /> <br /> == Jan Taškar: Mikrobske gorivne celice in uporaba umetnega konzorcija bakterij ==<br /> <br /> Današnji svet se približuje energetski krizi, saj smo še vedno v preveliki meri odvisni od fosilnih goriv, ki jih bo kmalu zmanjkalo,a še vedno nimamo dovolj razvitih alternativnih virov energije, ki bi jih lahko nadomestili. Zato se stalno odkriva nove alternativne načine pridobivanja energije, kot so tudi mikrobske gorivne celice. Mikrobska gorivna celica ali MFC (microbial fuel cell), kot druge gorivne celice, proizvaja električni tok, le da za njegov nastanek izkorišča naravne procese mikroorganizmov, kjer se nek organski substrat razgradi in nastanejo elektroni. Sama ideja pridobivanja elektrike s pomočjo mikroorganizmov nam je znana že od leta 1911, vendar se je zanimanje za njih povečalo šele po sedemdesetih letih prejšnjega stoletja, ko so počasi začeli bolje razumevati mikroorganizme prisotne pri pridelavi elektrike, ter odkrivati nove načine za izboljšanje delovanja in s tem tudi potencial MFC-jev kot čisti vir energije. Dandanes je vloženo veliko truda v izboljšanje in tudi boljše razumevanje te zelo potencialne tehnologije, z namenom da bi nekegega dne lahko dosegli dovoljšen izkoristek da bi s pomočjo posebnih mikroorganizmov hkrati čistili odpadne vode, ter istočasno pridobivali dovolj elektriko za naše potrebe.<br /> <br /> == Monika Biasizzo: Vloga TOR signalne poti pri regeneraciji tkiv ==<br /> <br /> Regeneracija je proces obnavljanja, popravljanja in rasti, ki omogoče organizmom ustrezen odgovor na poškodbe ali motnje, ki negativno delujejo na organizem. Poškodovano ali izgubljeno tkivo morajo nadomestiti nove celice, zato sta potrebni celična rast in delitev. Celično rast in delitev sprožijo in omogočijo različne signalne poti in mehanizmi. Ena izmed pomembnih signalnih poti je TOR signalna pot. Protein TOR oziroma tarča rapamicina je glavni protein TOR signalne poti, ki vpliva na sintezo proteinov preko stimulacije mRNA translacije, transkripcije in biosinteze ribosomov. TOR signalna pot lahko sproži in zavre sintezo proteinov glede na zunanje signale, kot so dostopnost hranil, rastni hormoni in nivo celične energije. Zaradi te signalne poti celica ob premajhni količini hranil in energije ne raste in se ne deli, saj je sinteza proteinov zavrta. Ta mehanizem omogoča celicam, da rastejo in se delijo le, ko imajo na voljo dovolj snovi. Vlogo TOR signalne poti pri regeneraciji tkiv so raziskovali pri ploskih črvih rodu ''Planaria'', ker imajo izredno sposobnost regeneracije. Skupino ploskih črvov, ki so jim utišali izražanje gena za protein TOR s tehnologijo RNAi, so primerjali s kontrolno skupino med regeneracijo po amputaciji. Ugotovili so, da ima TOR signalna pot pomembno vlogo pri mitotski delitvi in tvorjenju blastem – novo tkivo, kjer se manjkajoče strukture regenerirajo. TOR signalna pot je v zadnjem času predmet raziskav za terapije proti raku in inhibicija TOR v planarijih nam lahko pokaže posledice dolgoročne inhibicije TOR signalne poti.<br /> <br /> == Matic Urlep: Odpornost bakterij na sulfonamidne antibiotike ==<br /> <br /> V današnjem času je vedno več bakterij, ki so postala odporna na veliko antibiotikov in to postaja vedno večji problem. V svojem seminarju bom opisal raziskavo znanstvenikov ustanove » St. Jude Children's Research Hospital «. Ti so se osredotočili na sulfonamidne antibiotike. Ti antibiotiki inhibirajo delovanje dihidropteroat sintaze, encima ki je ključen pri biosintezi folne kisline. Folat ali folna kislina pa pomaga pri sintezi DNA, popravi DNA in pri hitri celični delitvi. Sposobnost bakterij do prilagoditve je naredila te antibiotike skoraj neuporabne. Znanstveniki pod okriljem Mi-Kyung Yuna so se osredotočili na delovanje DHPS ( dihidropteroat sintaza ) in kaj se dogaja z aktivnim mestom med samo biosintezo dihidropteroata in kako sulfoamidi uničijo bakterije. Njihova odkritja odpirajo možnosti za proizvodnjo novih antibiotikov na katera bi se bakterije težje prilagodile in bi imeli manj stranskih učinkov.<br /> <br /> == Maja Kostanjevec: Antioksidanti - spojine, ki lahko poškodujejo DNA ==<br /> <br /> Antioksidanti so spojine, ki ščitijo celice pred škodljivimi radikali, ki nastajajo v procesu oksidacije. Njihovi učinki se danes raziskujejo v povezavi z različnimi boleznimi, saj je za njih značilno, da imajo na telo pozitivne učinke. Vendar pa je raziskava genotoksičnih spojin pokazala, da lahko nekateri v velikih koncentracijah poškodujejo DNA. &lt;br/&gt; Za določitev genotoksičnih spojin so raziskovalci ustvarili novo metodo analize, ki temelji na povišanju ravni proteina ATAD5. Ta se v celici pojavi ob poškodbi DNA, saj zavira genomsko nestabilnost in nastajanje tumorjev ter sodeluje pri popravljanju DNA. &lt;br/&gt; Za tri antioksidante (resveratrol, genisteinin in baicalein) so v raziskavi dokazali, da lahko uničijo celice, za katere je značilna hitra delitev, poleg tega pa so tudi selektivni, kar pomeni, da ne poškodujejo celic okoli njih. V celici ne povzročajo večjih preureditev in premestitev kromosomov. Te lastnosti omogočajo potencialno uporabo antioksidantov v prihodnosti pri zdravljenju raka, saj je moč njihove genotokičnosti primerljiva s trenutno uporabljajočimi kemoterapevtiki. Poleg tega pa so antioksidanti selektivni in ne povzročajo mutageneze, zaradi česar bi bili primernejši od zdajšnjih kemoterapevtikov. Vsekakor pa bo potrebno še več raziskav, ki bodo podrobneje pokazale, katere vrste rakastih celic ti antioksidanti uničujejo.<br /> <br /> == Katja Leben: Vpliv zgradbe agregiranih proteinov na celico ==<br /> <br /> S podaljševanjem življenske dobe postajajo vse bolj aktualne tudi nekatere bolezni, ki se pojavijo s starostjo, kot sta Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen. Obe sta povezani s proteinskimi agregati, ki se nalagajo v organizmu.<br /> Preden proizvedeni protein doseže nativno stanje je kratek čas izpostavljen topilu in takrat lahko hidrofobni in polarni deli, ki tvorijo vodikove vezi, reagirajo intra ali pa intermolekularno, predvsem so k temu nagnjeni proteini, ki nimajo enotno določene sekundarne in terciarne strukture. V določenih pogojih, primer je tudi visoka koncentracija proteinov, ki je značilna za rekombinantne proteine, prevladajo intermolekularne interakcije in nastanejo agregati, kar privede do problemov pri ekspresiji rekombinantnega proteina. <br /> Agregacija proteinov v celici je dokazano toksična, a do nedavnega je bil vpliv zgradbe proteinov, ki sestavljajo agregate, na celično kondicijo nepoznan. Izsledki raziskav kažejo, da je vpliv agregacije proteina na celico tesno povezan z aminokislinskim zaporedjem polipeptida, ki tvori agregat. Pogojuje stopnjo agregacije ter posredno strukturne in funkcionalne lastnosti agregata, od katerih je odvisen učinek šaperonov na agregate.<br /> Ugotovitve raziskave so zagotovile osnovne podatke o vplivih mutacij v zaporedju na strukturne lastnosti agregatov, ki bodo omogočile predvidevanje vplivov proteinskih agregatov na kompleksnejše žive organizme in nadaljnje raziskave, ki bi vodile k razumevanju in posledično zdravljenju bolezni kot je Alzheimerjeva.<br /> <br /> == Filip Mihalič: Kako lizocimi v solzah uničijo nevarne bakterije ==<br /> <br /> Lizocimi so encimi, ki jih najdemo v človeških solzah ter smrklju in katalizirajo razcep glikozidne vezi med dvema monosaharidnima enotama v molekuli peptidoglikana, v celični steni bakterije ter s tem povzroči njen propad. Sam mehanizem kako lizocim katalizira razcep te vezi, ter njegovo spreminjanje konformacije med procesom sta bila do nedavnega še precej neraziskana, saj znanstveniki niso poznali metode s katero bi lahko opazovali posamezne molekule.<br /> Raziskovalci z univerze &quot;Univerza v Kaliforniji, Irvine&quot;, so pred nedavnim uporabili nov pristop za opazovanje posameznih makromolekul, in sicer so eno samo molekulo lizocima povezali z karbonsko nanocevko prek pirenskega sidrišča ter nato spremljali tresljale ki jih je sprožila molekula lizocima. ob tem so prišli do zanimivih ugotovitev, saj so lahko zelo natančno določili gibanje molekule ter njeno obnašanje v procesu cepitve glikozidne vezi. Bolj kot samo opazovanje lizocima je pomembna sama metoda s katero so opazovali molekulo, saj odpira nove možnosti na opazovanju posameznih molekul v naravnem okolju - metod ki bi omogočale opazovanje posameznih molekul je zelo malo pa še te so po večini nezanesljive, oz. neuporabne za daljše opazovanje molekul. V predstavitvi bom povedal najprej nekaj o lizocimu, nato pa se bom posvetil znanstveni raziskavi ter njenim rezultatom.<br /> <br /> == Mirjana Malnar: Zastoji v procesu translacije ==<br /> <br /> Translacija je prevajanje nukleotidnega zaporedja mRNA v aminokislinsko. Pri procesu translacije pride do zastojev (trenutna prekinitev translacije ali upočasnjena translacija). Ti zastoji so posledica ali določenega zaporedja baz mRNA ali interakcij med novo sintetiziranim polipeptidom in ribosomskim tunelom. V raziskavah se je izkazalo da so različni predeli ribosomskega tunela različno ugodni za določene delce (odvisno od velikosti, polarnosti, hidrofobnosti delcev). Posledično bodo polipeptidi, odvisno od svojih lastnosti čez tunel potovali različno (zastoji na različnih mestih ipd.). Raziskave so bile narejene na primeru E.coli. secA je motorni protein E.coli ki sodeluje pri prenosu proteinov čez celično membrano. Njegova sinteza je regulirana s translacijo secM proteina, katerega se kodirajoča sekvenca nahaja navzgor od kodirajoče sekvence secA (na isti mRNA). Ugotovili so da določeno zaporedje aminokislin secM tvori interakcije z ribosomskim tunelom zaradi česa pride do zastoja v translaciji. Če je ta zastoj daljši, se sintetizira več secA proteina. V drugih raziskavah so prišli do ugotovitve da do zastojev pride tudi pri translaciji kodirajoče sekvence za secA, ampak ti zastoji niso bili povezani z interakcijami z ribosomskim tunelom. Izkazalo se da sekvence podobne Shine-Dalgarno sekvencami (SD) v kodirajočem zaporedju mRNA povzročijo te zastoje zaradi interakcij z rRNA. (SD sekvenca je pomembna ker se veže z anti-Shine-Dalgarno sekvenco na rRNA in pri tem tvori mRNA-ribosom kompleks; nahaja se 8-10 baz pred start kodonom). Bolj so te sekvence podobne SD, večjo imajo afiniteto do vezave z anti-SD na rRNA in posledično povzročajo daljše zastoje.<br /> <br /> == Ellen Malovrh: Dolgoživi jedrni proteini in njihov vpliv na celično staranje ==<br /> <br /> Proteini sodijo med najkompleksnejše in najštevilčnejše organske molekule v celicah in omogočajo njihovo pravilno delovanje. Že med samim nastankom ali v času delovanja pa se lahko izkaže, da so proteini nefunkcionalni, zato je za celico izjemno pomemben proces razgradnje takih proteinov in sinteza novih. Proteini, ki se počasi obnavljajo oziroma imajo dolge življenjske dobe, so zato bolj izpostavljeni kopičenju škode. <br /> Taki so tudi proteini nukleoporini, ki tvorijo kompleks jedrne pore, ki omogoča transport molekul med citoplazmo in jedrom. V raziskavi, ki sem jo predstavila v seminarski nalogi, so znanstveniki v možganih podgan odkrili nukleoporine, ki so bili stari celo več kot eno leto. Poškodbe na teh proteinih povečajo prepustnost jedrnih por, zato lahko citoplazemski proteini vdirajo v jedro. Spremeni se lahko tudi genski zapis v celici, kar je bilo opaženo predvsem pri starajočih se celicah.<br /> Pričujoča raziskava bi tako lahko rešila eno od ključnih znanstvenih vprašanj o življenju: kako in zakaj se celice starajo ter posledično omogočila razvoj novih načinov zdravljenja starostno pogojenih bolezni. Spremembe v genskem zapisu so namreč odgovorne za staranje celic in lahko vodijo do številnih starostnih bolezni, kot sta Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen.<br /> <br /> == Ana Kunšek: Proteini za zaznavanje bolečine ==<br /> <br /> Mehanska zaznava je zelo pomembna pri vsakodnevnih opravilih. Organe, ki nam prevajajo zunanje dražljaje pa imenujemo čutila. Eno izmed pomembnejših (če ne ravno najbolj pomembno) je prav zagotovo čutilo za tip, saj z njim zaznavamo še tako majhne dražljaje, vročino, električni tok, itd. Vse to pa poteka prek električnega toka po živčnih celicah v našem živčnem sistemu. Ampak, ste se že kdaj vprašali kdo je pravzaprav odgovoren za delovanje tega oz. vseh čutil? &lt;br/&gt;<br /> Nekaj o čutilih so pravzaprav že ugotovili. Ugotovili so, kako se prenašajo dražljaji po nevronih, kako se začnejo premikati mišice in v katere dele naših možganov potujejo električni dražljaji iz različnih čutil. Nikoli pa še niso ugotovili kdo v celicah je odgovoren za zaznavo dražljajev in kaj s to zaznavo naredi. <br /> V svojem seminarju se bom osredotočila prav na protein, ki je zanj odgovoren. Prav tako bom razložila kako (če) se spremeni delovanje, če organizmu z rezanjem eksonov iz DNA odstranimo gen za ta protein in ga potem v svojem življenju nima. &lt;br/&gt;<br /> S to študijo so si odprli nove poti za ugotavljanje kako deluje naš čutilni sistem, kar bodo v prihodnosti s pridom izkoristili za preučevanje zaznavanja zvoka, krvnega tlaku, in ostalih mehanizmih v človeškem telesu, ki s svojim delovanjem pritiskajo na celične membrane, kar bi lahko vodilo v lažje zdravljenje zdravstvenih težav. <br /> <br /> == Aleksander Benčič: S1P₁ receptorji in njihov pomen ==<br /> <br /> Eden od osnovnih mehanizmov v celici, ki je pogoj za delovanje vseh živih organizmov je signalizacija in sporazumevanje celice z okoljem. Zaradi tega so se v celicah razvili številni mehanizmi za komunikacijo, ki jim omogočajo opravljanje njihovih bioloških funkcij. Eden najpomembnejših tovrstnih mehanizmov so receptorji, prisotni na membrani celice. V svoji seminarski nalogi se bom osredotočil na vlogo in delovanje enega od teh receptorjev imenovanega sfingozin-1-fosfat receptor 1. V prvi raziskavi so znanstveniki preučili mehanizem delovanja novega zdravila za multiplo sklerozo fingolimod, ki je modulator S1P₁ receptorjev. Do sedaj je veljala domneva, da naj bi fingolimod preprečeval izhajanje limfocitov iz limfnih vozlov in tako blažil simptome multiple skleroze, vendar so v tej raziskavi ugotovila, da je glavni mehanizem delovanja povezan s signalnimi potmi v centralnem živčnem v katerih sodelujejo S1P₁ receptorji. Druga raziskava je bila prav tako povezana z signalnimi potmi v centralnem živčnem sistemu, ki jih uravnava sfingozin-1-fosfat. Preučili so vpliv, ki ga imajo na migracijo zarodnih živčnih celic ob poškodbi centralnega živčnega sistema v smeri poškodbe. Vse te raziskave so pokazale, da imajo S1P₁ receptorji izreden pomen na delovanje telesa vendar številni od mehanizmov delovanja še niso raziskani. Iz teh raziskav je viden velik potencial, ki ga imajo na področju zdravljenja številnih obolenj povezanih predvsem z osrednjim živčnim sistemom in poškodbami le tega.<br /> <br /> == Jakob Gašper Lavrenčič: Uporaba fotosintetskega sistema I za bio-sončne celice ==<br /> <br /> Zaradi naraščajoče potrebe po energiji poskuša veliko znanstvenikov odkriti učinkovit način pridobivanja energije, ne da bi dodatno obrmenili okolje. Znanih je mnogo načinov pridobivanja okolju prijazne energije, od veternic do elektrarn, ki izkoriščajo valovanje morja. Zato bom v svoji seminarski nalogi predstavil zelo obetajoč način pridobivanja energije, ki izpolnjuje naštete pogoje. Bio-sončne celice predstavljajo poceni način pridobivanja električne energije, ki izkorišča učinkovitost rastlinski beljakovin za proizvodno električne napetosti. Predvsem se izkorišča fotosintetski sistem I (PS-I), katerega lastnost je ravno prenos elektronov preko membrane, kar je bistveno za potek fotosinteze. Njihova največja prednost je ravno v tem, da lahko njihovo glavno surovino PS-I, poceni pridobivamo iz zelenih rastlinskih tkiv, tudi v industrijskem merilu. Raziskovalna skupina je sestavila dve sončni celici, s katerima so preizkušali lastnosti in učinkovitost PS-I, saj so mnoge predhodnje raziskave naletele na obilico težav, z izkoriščanjem tega sistema. Ker so te raziskave zahtevale uporabo dragih in okolju nevarnih snovi, je dolgo veljalo, da je izkoriščanje rastlinskih fotosintetskih beljakovin v sončnih celicah neučinkovito in drago. Ampak nova spoznanja in razumevanje fotosintetskih beljakovin, od stabilnosti do osnovne učinkovitosti ter primernosti različnih oblik sončnih celic, kažejo na to, da so takšne sončne celice okolju neškodljive, učinkovite in poceni.<br /> <br /> == Sandra Zupančič: Možnosti uporabe matičnih krvnih celic pri okužbi z virusom HIV ==<br /> Virus HIV je virus, ki ga lahko z raznimi zdravili sicer obvladamo, vendar se pa ga nikoli popolnoma ne znebimo. Ker spada v družino retrovirusov, kar pomeni da ima genski zapis v RNA, ki se potem v gostiteljski celici, prepiše v DNA. Pri prepisovanju, pri katerem sodeluje reverzna transkriptaza, pride pogosto do napak, kar pa posledično privede do tega da virus mutira in postane odporen oziroma nedovzeten za napade celic našega imunskega sistema. Ker reverzna transkriptaza pomaga pri razmnoževanju virusa HIV, lahko uporabimo zdravila, ki zavrejo delovanje te reverzne transkriptaze – s tem pa zavrejo tudi razmnoževanje virusa. Znanstveniki si prizadevajo, da bi našli čim bolj učinkovit način za zdravljenje tega virusa. Prav v tej raziskavi so z vrsto poskusov dokazali, da je možno gensko modificirati naše krvne matične celice tako, da postanejo specifične za HIV-1 Gag protein, pri tem pa ne izgubijo svoje funkcije. V raziskavi so uporabili miši, v katerih so poskušali čim bolj poustvariti človeški imunski sistem – od samega nastanka celic pa do reakcij ki potekajo ob okužbi.<br /> <br /> == Jernej Pušnik: Zaznavanje proteinov z zlatimi nanodelci ==<br /> Metoda zaznavanja proteinov z zlatimi nanoantenami, kot že samo ime pove, za senzor uporablja zlat nanodelec paličaste oblike. Ko tak nanodelec zazna protein, se rahlo spremeni njegova frekvenca, kar lahko z drugimi besedami opišemo kot zelo majhna sprememba barve, ki jo s prostim očesom nebi mogli zaznati, zato se uporabljajo posebni detektorji. Ti detektorji so sposobni zaznavati spremembe s izjemno visoko časovno resolucijo, vse do milisekunde, kar omogoča natančno opazovanje proteinske dinamike. Ta pridobitev odkriva povsem nova obzorja, saj je s tem omogočeno opazovanje adsorpcije proteinov, njihovo gibanje, zvijanje v terciarno obliko, sledenje spreminjanju gostote proteinov, njihova vezava na določena mesta itd. Mislim, da je to odkritje izrednega pomena in bo olajšalo pot do razlage marsikaterih pomembnih procesov v biokemiji.<br /> <br /> == Ajda Rojc: Nematociste - najhitrejši mehanizem v naravi ==<br /> Knidocite so eksplozivne epidermalne celice, ki vsebujejo velik sekrecijski organel nematocisto. Ob dražljaju sprožijo strup, ki se nahaja v nematocistah. To lastnost so ožigalkarji razvili za obrambo in ulov plena. Organel je sestavljen iz prožne kapusle in tubula, ki je nanjo pritrjen. Med eksocitozo se bodičast del izstreli s pospeškom, ki je 5 milijonkrat večji od gravitacijskega, proces pa se odvije v manj kot 700ns. Raziskava je razkrila do sedaj še neraziskane proteine, ki so odgovorni za biomehanske lastnosti celice. S centrifugiranjem so izolirali nepoškodovane, še neizstreljene nematociste iz organizma H.magnipapillata. Pripravek nematocist je bil raztopljen v DTT, proteine pa so ločili z eletroforezo. Razporeditev proteinov je pokazala, da je v vzorcu največ proteinov z molekulsko maso med 10 in 40 kDa. Po tej proceduri so lahko izključili 50 nepomembnih proteinov in identificirali 410 posameznih proteinskih sekvenc. 25 ostalih sekvenc iz analize celotnega proteoma so označili kot onesnažene.<br /> Znano je, da je zunanja stena nematocist sestavljena iz globularnih proteinov, a je njihova funkcija še neznana. Notranja stena pa je sestavljena iz skupkov kolagenskih fibril, ki se nahajajo z razmikom od 50 do 100 nm in so med seboj prekrižani v intervalih 32 nm. Fibrile so sestavljene iz polimerov minikolagenov, katerih je v Hydri zelo veliko. Ta izrazit vzorec daje prožnost, ki je potrebna, da kapsula zdrži zelo velik ozmotski pritisk (150bar).<br /> <br /> == Luka Krmpotić: Štirje geni in spomin pri odraslih ==<br /> Problem Alzeimerjeve bolezeni še ni rešen. Ta napade hipokampus in zmanjša njegov volumen. Pri nekaterih posameznikih je hipokampus “poškodovan”, ima manj kot normalen volumen. Vzrok so majhne variacije v dednem zapisu, ki pospešijo normal proces skrčenja hipokampusa za približno štiri leta. Po 65-tem letu se nevarnost za Alzeimerjevo bolezen podvoji vsakih 5 let, torej bi posameznik s temi genskimi variacijami imel skoraj 2-kratno možnost da zboli za Alzeimerjevo. Oziroma, drugače povedano, če bi posameznik s temi genskimi variacijami zbolel za Alzeimerjevo boleznijo, bi ta napadla že “oslabljen” hipokampus, in posameznik bi trpel hujše simptome kot tisti brez teh genov.<br /> Genoma wide association study, je dokaj nova raziskovalna metoda, ki se uporablja na področju medicine in biokemije, s katero lahko najdemo genske variacije določene bolezni ali fiziološke lastnosti. V primeru raziskave, ki je tema te raziskovalne naloge, so bile najdeni SNP-ji (variacije gena v eni DNK črki) ki vplivajo na volumen hipokampusa in SNP-ji ki vplivajo na znotrajlobanjski volumen.<br /> <br /> == Alenka Mikuž: Pretvorba belega v rjavo maščobno tkivo ==<br /> Dandanes, ko velja, da večino dneva presedimo in je vnos kalorij toliko večji, je debelost eden izmed največjih problemov današnje populacije. Belemu in rjavemu maščobnemu tkivu je skupno le to, da oba shranjujeta trigliceride. Belo zato, da skladišči odvečno energijo, rjavo pa zato, da ima tako prekurzorje, ki spodbujajo izražanje UCP-1. UCP-1 je protein, ki omogoča proizvodnjo toplote v rjavem maščevju in s tem porablja energijo. Prekomerno kopičenje maščobnega tkiva škoduje zdravju človeka, zato bi bilo spodbujanje nastajanja rjavega maščevja ali pa sprememba belega v rjavo maščevje nova tarča pri proizvodnji farmacevtskih zdravil, ki bi kljubovala debelosti in njenim metabolnim in srčnožilnim težavam. V raziskavi so raziskali delovanje PRDM16, ki deluje skupaj s CtBP-1 ali PGC-1α v rjavem maščevju. Kompleks PRDM16/CtBP-1 uspešno zavira izražanje genov belega maščobnega tkiva. Kompleks PRDM16/PGC-1α spodbuja izražanje genov rjavega maščobnega tkiva. Obstaja še veliko drugih transkripcijskih faktorjev, ki vplivajo na izražanje maščobnega tkiva. Odkriti morajo najbolj primernega in ga stabilizirati. Čeprav izkoriščanje nastajanja rjavega maščobnega tkiva iz belega lahko ponudi rešitve za razvoj zdravil, ki bi kljubovala metabolnim in srčnožilnim boleznim, ki so posledica debelosti, to še vedno ne nadomesti tradicionalnih pristopov proti debelosti, tj. uravnotežena prehrana in telesna aktivnost.<br /> <br /> == Estera Merljak: Potencialna terapevtska vloga funkcionalnih inkluzijskih telesc ==<br /> Zaradi vse večje uporabe rekombinantnih proteinov v industriji in raziskavah se povečuje tudi potreba po nizkocenovni produkciji. V ta namen se kot gostiteljski organizem najpogosteje uporablja bakterijo Escherichia Coli. Vendar pa se zaradi hiperprodukcije proteina v bakteriji oblikujejo inkluzijska telesca (ang.: Inclusion bodies oz. IB) za katere so znanstveniki domnevali, da so skupki odpadnega materiala v celici. Nedolgo nazaj pa so odkrili, da IB vsebujejo ter v določenih optimalnih pogojih tudi izločajo aktivne proteine. Tako se je porodila ideja o uporabi IB kot zdravila nanovelikosti za nekatere bolezni, ki so povzročene s strani okvarjenih ali nefunkcionalnih proteinov. <br /> S pomočjo fluorescence so dokazali, da se GFP ncIB vežejo na membrano človeških HeLa celic ter celo prodrejo v celico in njeno jedro. <br /> Ko so različnim kulturam okvarjenih celic dodali Hsp70, DHFR, CAT, ali LIF ncIB so opazili znatno povečanje števila preživelih celic, kar se sklada s predpostavko o terapevtskem učinku ncIB. <br /> Ugotovili so tudi, da ob zaužitju ncIB nima toksičnega vpliva na organizem, vendar ga le-ta sprejme v omejenih količinah in nakopiči predvsem v jetrih.<br /> <br /> == Janez Meden: α –sinuclein, amiloid prisoten pri bolnikih s Parkinsonovo boleznijo ==<br /> α-sinuklein je majhen protein, ki se nahaja v presinaptičnih membranah dopaminergičnih nevronih. Odkar so odkrili njegove amiloidne lastnosti ter da je glavna komponenta citotoksičnih lewyjevih telesc pri bolnikih z neozdravljivo in napredujočo parkinsonovo boleznijo je postal predmet številnih znanstvenih raziskav, saj je bolnikov s to boleznijo iz leta v leto več.<br /> Novejše raziskave kažejo na to, da je lahko sicer ta membranski protein prisoten tudi kot topen in urejen oligomer in sicer tetramer, ki je bil odkrit pred kratkim in ni škodljiv za možganske celice. Najbrž je ta oligomer v celici v ravnotežju z netopnim α-sin ter topnim monomerom. Kaj vpliva na ravnotežje še ni raziskano, mogoče pa je to omega-3 maščobna kislina –DHA.<br /> Kar pomeni, da ima pomemben vpliv na odlaganje citotoksičnih α-sin agregatov tudi prehrana. DHA je precej propagiran prehranski dodatek (priporočajo ga predvsem doječim materam), vpliva na regulacijo α-sinukleina pri miših. Miši z več DHA v dieti so namreč bolj izpostavljene α-sin agregaciji, še posebej če je gen za α-sin mutiran (v tem primeru A53T).<br /> Obe raziskavi sta obetajoči za nadaljni razvoj zdravilnih učinkovin za to boleznijo.</div> Petra Tavčar