Wiki FKKT - User contributions [en]

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T20:12:18Z

Pia.m: /* Optimizacija SINGER vezja */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genetskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja zapisov za terapevtske proteine, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genetska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinaciji z bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev [3]. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), za katerega je bila predhodno dokazana selektivna kolonizacija tumorskih tkiv in varna uporaba pri ljudeh [4]. Genetsko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein in njegovo izločanje v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za proizvodnjo izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje zapisa za terapevtski protein pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genetskega stikala. Zasnovano genetsko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost proizvodnje terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje zapisa za terapevtski protein. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje, pri čemer valovanje ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje zapisa za azurin v tumorskem mikrookolju ter remisijo tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja zapisa za terapevtski protein in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolne remisije tumorja.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, in tako potrdili tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno remisijo tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic s protitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513. 
[4] W. Chen, Y. Wang, M. Qin, X. Zhang, Z. Zhang, X. Sun, Z. Gu: Bacteria-Driven Hypoxia Targeting for Combined Biotherapy and Photothermal Therapy. ''ACS Nano'' '''2018''', 12, 5995–6005.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T20:04:20Z

Pia.m:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genetskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja zapisov za terapevtske proteine, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genetska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinaciji z bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev [3]. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), za katerega je bila predhodno dokazana selektivna kolonizacija tumorskih tkiv in varna uporaba pri ljudeh [4]. Genetsko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein in njegovo izločanje v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za proizvodnjo izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje zapisa za terapevtski protein pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano genetsko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost proizvodnje terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje zapisa za terapevtski protein. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje, pri čemer valovanje ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje zapisa za azurin v tumorskem mikrookolju ter remisijo tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja zapisa za terapevtski protein in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolne remisije tumorja.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, in tako potrdili tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno remisijo tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic s protitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513. 
[4] W. Chen, Y. Wang, M. Qin, X. Zhang, Z. Zhang, X. Sun, Z. Gu: Bacteria-Driven Hypoxia Targeting for Combined Biotherapy and Photothermal Therapy. ''ACS Nano'' '''2018''', 12, 5995–6005.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T19:50:38Z

Pia.m: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja zapisov za terapevtske proteine, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinaciji z bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev [3]. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), za katerega je bila predhodno dokazana selektivna kolonizacija tumorskih tkiv in varna uporaba pri ljudeh [4]. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein in njegovo izločanje v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za proizvodnjo izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje zapisa za terapevtski protein pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost proizvodnje terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje zapisa za terapevtski protein. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje, pri čemer valovanje ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje zapisa za azurin v tumorskem mikrookolju ter remisijo tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja zapisa za terapevtski protein in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolne remisije tumorja.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, in tako potrdili tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno remisijo tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic s protitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513. 
[4] W. Chen, Y. Wang, M. Qin, X. Zhang, Z. Zhang, X. Sun, Z. Gu: Bacteria-Driven Hypoxia Targeting for Combined Biotherapy and Photothermal Therapy. ''ACS Nano'' '''2018''', 12, 5995–6005.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T19:49:30Z

Pia.m:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja zapisov za terapevtske proteine, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinaciji z bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev [3]. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), za katerega je bila predhodno dokazana selektivna kolonizacija tumorskih tkiv in varna uporaba pri ljudeh [4]. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein in njegovo izločanje v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za proizvodnjo izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje zapisa za terapevtski protein pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost proizvodnje terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje zapisa za terapevtski protein. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje, pri čemer valovanje ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje zapisa za azurin v tumorskem mikrookolju ter remisijo tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja zapisa za terapevtski protein in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolne remisije tumorja.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, in tako potrdili tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno remisijo tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic s protitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513. 
[4] W. Chen, Y. Wang, M. Qin, X. Zhang, Z. Zhang, X. Sun, Z. Gu: Bacteria-Driven Hypoxia Targeting for Combined Biotherapy and Photothermal Therapy. ACS Nano 2018, 12, 5995–6005.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T19:39:37Z

Pia.m:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja zapisov za terapevtske proteine, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinaciji z bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein in njegovo izločanje v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za proizvodnjo izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje zapisa za terapevtski protein pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost proizvodnje terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje zapisa za terapevtski protein. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje, pri čemer valovanje ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje zapisa za azurin v tumorskem mikrookolju ter remisijo tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja zapisa za terapevtski protein in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolne remisije tumorja.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, in tako potrdili tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno remisijo tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic s protitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T19:31:03Z

Pia.m:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja zapisov za terapevtske proteine, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein in njegovo izločanje v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za proizvodnjo izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje zapisa za terapevtski protein pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost proizvodnje terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje zapisa za terapevtski protein. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje, pri čemer valovanje ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje zapisa za azurin v tumorskem mikrookolju ter remisijo tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja zapisa za terapevtski protein in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolne remisije tumorja.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, in tako potrdili tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno remisijo tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic s protitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:52:12Z

Pia.m: /* PD-L1 nb kot terapevtski protein */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter remisijo tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolne remisije tumorja.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, in tako potrdili tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno remisijo tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic s protitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:49:51Z

Pia.m: /* Azurin kot terapevtski protein */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter remisijo tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolne remisije tumorja.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, in tako potrdili tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:42:24Z

Pia.m: /* Azurin kot terapevtski protein */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:40:17Z

Pia.m: /* Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PTlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:39:26Z

Pia.m: /* Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:36:29Z

Pia.m: /* Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:35:51Z

Pia.m: /* Optimizacija SINGER vezja */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:30:55Z

Pia.m: /* Optimizacija SINGER vezja */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:27:54Z

Pia.m: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:14:45Z

Pia.m: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-04T09:11:15Z

Pia.m: /* PD-L1 nb kot terapevtski protein */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T21:55:41Z

Pia.m: /* PD-L1 nb kot terapevtski protein */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T20:11:09Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji S. typhimurium VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T20:09:34Z

Pia.m: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' '''2024''', 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' '''2023''', 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' '''2024''', 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T20:08:15Z

Pia.m: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. ''Front. Immunol.'' 2024, 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. ''Pharmaceutics'' 2023, 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. ''Cell Reports Medicine'' 2024, 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T20:06:26Z

Pia.m: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. Front. Immunol. 2024, 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. Pharmaceutics 2023, 15, 2214. 
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. Cell Reports Medicine 2024, 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T20:06:13Z

Pia.m: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. Front. Immunol. 2024, 15. 
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. Pharmaceutics 2023, 15, 2214.
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. Cell Reports Medicine 2024, 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T20:05:52Z

Pia.m:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C) [3].

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom [3].

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

==Literatura==
[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. Front. Immunol. 2024, 15.
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. Pharmaceutics 2023, 15, 2214.
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. Cell Reports Medicine 2024, 5, 101513.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T14:02:03Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji S. typhimurium VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Ob/pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja/nad izražanje terapevtskih proteinov. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev.

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Gensko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije.

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C).

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam.

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb.

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno.

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom.

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T14:01:42Z

Pia.m: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Ob/pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja/nad izražanje terapevtskih proteinov. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev.

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Genetsko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije.

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C).

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam.

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb.

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno.

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom.

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T12:10:03Z

Pia.m: /* Terapija s PD-L1 nb */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Ob/pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genetskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja/nad izražanje terapevtskih proteinov. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genetska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev.

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Genetsko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije.

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C).

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam.

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb.

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno.

====PD-L1 nb kot terapevtski protein====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom.

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T12:09:44Z

Pia.m: /* Terapija z azurinom */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Ob/pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genetskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja/nad izražanje terapevtskih proteinov. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genetska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev.

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Genetsko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije.

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C).

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam.

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb.

====Azurin kot terapevtski protein====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno.

====Terapija s PD-L1 nb====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom.

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T12:09:10Z

Pia.m: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Ob/pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genetskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja/nad izražanje terapevtskih proteinov. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genetska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev.

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Genetsko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije.

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C).

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam.

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb.

====Terapija z azurinom====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno.
====Terapija s PD-L1 nb====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom.

==Zaključek==
Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, sistemska uporabnost, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T11:40:57Z

Pia.m: /* Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Ob/pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genetskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja/nad izražanje terapevtskih proteinov. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genetska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev.

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Genetsko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije.

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C).

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam.

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb.

====Terapija z azurinom====
Dokazali so, da ''S. typhimurium'', transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno.
====Terapija s PD-L1 nb====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celicah T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža ''S. typhimurium'', transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom.

==Zaključek==

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T11:08:11Z

Pia.m: /* Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Ob/pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genetskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja/nad izražanje terapevtskih proteinov. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genetska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev.

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Genetsko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije.

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C).

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam.

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM.

====Terapija z azurinom====
Na osnovi prejšnjih rezultatov so razvili platformo za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1, za zdravljenje tumorjev. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb.
Dokazali so, da S. typhimurium, transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi S. typhimurium, transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji S. typhimurium, transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo S. typhimurium, transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno.
====Terapija s PD-L1 nb====
Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili nanotelo, usmerjeno proti ligandu programirane celične smrti 1 (PD-L1 nb), ki ima imunostimulacijski učinek. PD-L1 je prisoten na površini tumorskih celic in se veže na receptor PD-1, ki se nahaja predvsem na celic T. Vezava PD-L1 na PD-1 povzroči inaktivacijo celic T ter tako zavira imunski odziv. Ob prisotnosti PD-L1 nb je ta interakcija onemogočena, s čimer je omogočena reaktivacija antitumorske imunosti.
Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža S. typhimurium, transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno zavrtje rasti tumorja.
Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Poleg inhibicije primarnega tumorja so želeli preveriti tudi, ali terapija s SINGER-2 zavira oziroma preprečuje metastaziranje. V raziskavi so zato uporabili miši z rakom H22, znanim po metastazah v bezgavke, in učinkovitost sistemskega antitumorskega delovanja terapije ovrednotili z analizo populacij imunskih celic v bezgavkah.
Poleg tega so ocenili tudi splošni imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah (TDLN). Zabeležili so povišanje števila imunskih celic z antitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protitumorskim učinkom.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T11:04:58Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji S. typhimurium VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Ob/pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genetskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja/nad izražanje terapevtskih proteinov. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja terapevtskih proteinov, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genetska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (''angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit''). Uporaba SINGER vezij v kombinacijiz bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev.

== Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji ''S. typhimurium'' VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb ==

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev. Za šasijo so izbrali oslabljen sev ''Salmonella typhimurium'' VNP20009 (v nadaljevanju ''S. typhimurium''), ki je znan po selektivni kolonizaciji tumorskih tkiv in varni uporabi pri ljudeh. Genetsko vezje so vnesli v ''S. typhimurium'' v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, usmerjenega proti PD-L1 (PD-L1 nb).
V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje in izločanje terapevtskega proteina v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za izražanje izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije.

===Optimizacija SINGER vezja===
Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje terapevtskega proteina pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA39, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor PtlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo.
Z uporabo represorja TlpA39 in njegovega pripadajočega promotorja PTlpA so zagotovili možnost oddaljene (daljinsko sprožene) aktivacije genskega stikala. Zasnovano gensko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: PTlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje OTlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA39), RBS3, YopE-tag1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator.
Druga transkripcijska enota vsebuje: Pj23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA39 (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA39, RBS3, YopE-tag1-15, Pj23100, TlpA39) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav.
Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost izražanja tarčnega terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja čim nižjo bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja (pri fiziološki temperaturi 37 °C).

===Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovitost izražanja in izločanja terapevtskih proteinov===

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje terapevtskega proteina. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje terapevtskega proteina, pri čemer ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam.

===Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih===

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko vnesli bakterije ''S. typhimurium'', transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja PtlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije ''S. typhimurium'' znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM.

====Terapija z azurinom====
Na osnovi prejšnjih rezultatov so razvili platformo za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1, za zdravljenje tumorjev. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb.
Dokazali so, da S. typhimurium, transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo.
Ob intratumoralni dostavi S. typhimurium, transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje azurina v tumorskem mikrookolju ter delno do popolno izkoreninjenje tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja terapevtskega proteina in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolnega izkoreninjenja tumorjev.
Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji S. typhimurium, transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, kar potrjuje tarčno kolonizacijo tumorja.
Z nadaljnjo intravensko aplikacijo S. typhimurium, transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo.
Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, podobno kot pri melanomu B16F10, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno.

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T10:45:57Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji S. typhimurium VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T08:01:50Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji S. typhimurium VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:53:14Z

Pia.m: /* Optimizacija SINGER vezja */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:51:58Z

Pia.m: /* Optimizacija SINGER vezja */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:45:37Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji S. typhimurium VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:39:54Z

Pia.m: /* Uvod */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:39:47Z

Pia.m: /* Uvod */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:39:34Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji S. typhimurium VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:36:21Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji S. typhimurium VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:24:02Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji " S. typhimurium " VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:23:35Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji "S. typhimurium" VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:16:33Z

Pia.m: /* Razvoj sinteznobiološkega sistema */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-03T07:00:59Z

Pia.m: /* Uvod */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-02T21:17:26Z

Pia.m: /* Uvod */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-02T21:12:15Z

Pia.m: /* Uvod */

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-02T20:59:02Z

Pia.m:

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-02T20:56:04Z

Pia.m:

Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

2025-05-02T20:55:08Z

Pia.m: Created page with "Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub] == Uvod == Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so (predvsem) posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno, tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, in s tem je zagotovljene višja in bolj selektivna terapevt..."

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666379124001824?via%3Dihub]

== Uvod ==

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so (predvsem) posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno, tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, in s tem je zagotovljene višja in bolj selektivna terapevtska učinkovitost.