Wiki FKKT - User contributions [en]

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T19:25:03Z

Primož Šenica Pavletič: /* Sprostitev fagov */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sintetičnih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma so ocenili s primerjavo dveh pogojev: pri enem je bil fagni genom že v liposomu, pri drugem pa je moral vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescence je pokazala, da prenos genoma T7 traja približno 100–105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov so merili kot PFU/nL. PFU pomeni število fagov, ki lahko okužijo bakterije in tvorijo plak; titer pa pomeni koncentracijo teh infektivnih fagov v vzorcu. Prve infektivne fage so zaznali po približno eni uri, po petih urah pa je titer dosegel približno 10⁵ PFU/nL. Ker je bil izmerjeni titer višji od pričakovanega brez replikacije DNA, so sklepali, da je v sintetičnih celicah prišlo do delnega pomnoževanja fagnega genoma. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5.

===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Masna CFE reakcija pomeni, da reakcija poteka prosto v raztopini, na primer v epruveti, in ni zaprta v liposome. Razlika je verjetno posledica prostorske omejitve liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti bolj lokalno zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski sistem in masna reakcija po učinkovitosti bolj podobna.

RdLPS je bil za sistem hkrati nujen in omejujoč. Na začetku je omogočil vezavo faga T7 na membrano in s tem vstop genoma v sintetično celico. Težava pa se je pojavila po sestavljanju novih fagov, saj so se ti lahko ponovno vezali na RdLPS v membrani. Pri fagih z močno afiniteto do RdLPS so zato zaznali približno 94 % manj prostih infektivnih delcev. To kaže, da se fagi verjetno niso izgubili zaradi neuspešnega sestavljanja, ampak so ostali vezani na receptor in zato niso bili zaznani kot prosti infektivni fagi v raztopini. RdLPS je torej omogočil začetek okužbe, hkrati pa je zmanjšal razpoložljivost potomnih fagov po njihovem nastanku.

===Sprostitev fagov===
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Fage so iz sintetičnih celic sprostili z osmotskim šokom. Liposome so prenesli iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje, zato je voda začela vstopati v liposome, membrana se je porušila in fagi so se sprostili v raztopino.

Da bi preverili, ali novi fagi res nastajajo znotraj liposomov, so primerjali aktivne sintetične celice z “mrtvimi” celicami. Mrtve celice so pripravili z dodatkom RNaze A. RNaza A razgrajuje RNA, zato prepreči normalno izražanje genov v CFE sistemu. Če ni RNA, ne more potekati translacija fagnih proteinov, zato se novi fagi ne morejo učinkovito sestavljati.

Aktivne sintetične celice so po okužbi proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot celice z RNazo A. To potrjuje, da fagi niso bili samo začetni fagi, vezani na membrano, ampak so nastali z aktivnim izražanjem genov, replikacijo in sestavljanjem znotraj liposomov.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče ustvariti sistem sintetičnih celic in združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T19:21:46Z

Primož Šenica Pavletič: /* Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sintetičnih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma so ocenili s primerjavo dveh pogojev: pri enem je bil fagni genom že v liposomu, pri drugem pa je moral vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescence je pokazala, da prenos genoma T7 traja približno 100–105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov so merili kot PFU/nL. PFU pomeni število fagov, ki lahko okužijo bakterije in tvorijo plak; titer pa pomeni koncentracijo teh infektivnih fagov v vzorcu. Prve infektivne fage so zaznali po približno eni uri, po petih urah pa je titer dosegel približno 10⁵ PFU/nL. Ker je bil izmerjeni titer višji od pričakovanega brez replikacije DNA, so sklepali, da je v sintetičnih celicah prišlo do delnega pomnoževanja fagnega genoma. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5.

===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Masna CFE reakcija pomeni, da reakcija poteka prosto v raztopini, na primer v epruveti, in ni zaprta v liposome. Razlika je verjetno posledica prostorske omejitve liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti bolj lokalno zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski sistem in masna reakcija po učinkovitosti bolj podobna.

RdLPS je bil za sistem hkrati nujen in omejujoč. Na začetku je omogočil vezavo faga T7 na membrano in s tem vstop genoma v sintetično celico. Težava pa se je pojavila po sestavljanju novih fagov, saj so se ti lahko ponovno vezali na RdLPS v membrani. Pri fagih z močno afiniteto do RdLPS so zato zaznali približno 94 % manj prostih infektivnih delcev. To kaže, da se fagi verjetno niso izgubili zaradi neuspešnega sestavljanja, ampak so ostali vezani na receptor in zato niso bili zaznani kot prosti infektivni fagi v raztopini. RdLPS je torej omogočil začetek okužbe, hkrati pa je zmanjšal razpoložljivost potomnih fagov po njihovem nastanku.

===Sprostitev fagov===
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče ustvariti sistem sintetičnih celic in združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T14:57:32Z

Primož Šenica Pavletič: /* Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sintetičnih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma so ocenili s primerjavo dveh pogojev: pri enem je bil fagni genom že v liposomu, pri drugem pa je moral vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescence je pokazala, da prenos genoma T7 traja približno 100–105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov so merili kot PFU/nL. PFU pomeni število fagov, ki lahko okužijo bakterije in tvorijo plak; titer pa pomeni koncentracijo teh infektivnih fagov v vzorcu. Prve infektivne fage so zaznali po približno eni uri, po petih urah pa je titer dosegel približno 10⁵ PFU/nL. Ker je bil izmerjeni titer višji od pričakovanega brez replikacije DNA, so sklepali, da je v sintetičnih celicah prišlo do delnega pomnoževanja fagnega genoma. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5.

===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

===Sprostitev fagov===
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče ustvariti sistem sintetičnih celic in združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T14:52:45Z

Primož Šenica Pavletič: /* Pomen raziskave in zaključek */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sintetičnih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

===Sprostitev fagov===
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče ustvariti sistem sintetičnih celic in združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T11:31:25Z

Primož Šenica Pavletič: /* Priprava sinteznih celic */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sintetičnih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

===Sprostitev fagov===
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T11:31:00Z

Primož Šenica Pavletič: /* Sprostitev fagov */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

===Sprostitev fagov===
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T11:30:48Z

Primož Šenica Pavletič: /* Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T11:30:15Z

Primož Šenica Pavletič: /* Neposredno spremljanje fagne DNA */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T11:28:54Z

Primož Šenica Pavletič: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T11:23:44Z

Primož Šenica Pavletič: /* Vpliv MOI in velikosti liposomov */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-17T11:22:44Z

Primož Šenica Pavletič:

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Vpliv MOI in velikosti liposomov===
Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI (multiplicity of infection; število infektivnih fagov na eno sintetično celico). Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic, pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T22:08:47Z

Primož Šenica Pavletič: /* Pomen raziskave in aključek */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. V tej raziskavi je bil kot receptorska komponenta uporabljen RdLPS, krajša oblika grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Zaradi manjše velikosti in večje hidrofobnosti je primernejši za stabilno vključitev v lipidno membrano liposoma kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanjem lističu membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Pomembna ugotovitev je tudi, da prisotnost RdLPS v membrani ni zavrla delovanja celično-prostega sistema izražanja genov, CFE, v notranjosti liposomov. Aktivnost CFE sistema je bila potrjena z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Vstop genoma je bil preverjen z inženiranima fagoma T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta vsebovala zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v sposobnosti vezave na RdLPS. T7-mC-S* je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Logika poskusa je temeljila na tem, da se ob uspešnem vstopu fagnega genoma v liposomu začne izražati mCherry, kar povzroči rdečo fluorescenco.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Vpliv MOI in velikosti liposomov===
Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI, torej razmerja med številom infektivnih fagov in številom sintetičnih celic. Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic. Pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in zaključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T22:08:18Z

Primož Šenica Pavletič: /* Namen raziskave */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. V tej raziskavi je bil kot receptorska komponenta uporabljen RdLPS, krajša oblika grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Zaradi manjše velikosti in večje hidrofobnosti je primernejši za stabilno vključitev v lipidno membrano liposoma kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanjem lističu membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Pomembna ugotovitev je tudi, da prisotnost RdLPS v membrani ni zavrla delovanja celično-prostega sistema izražanja genov, CFE, v notranjosti liposomov. Aktivnost CFE sistema je bila potrjena z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Vstop genoma je bil preverjen z inženiranima fagoma T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta vsebovala zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v sposobnosti vezave na RdLPS. T7-mC-S* je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Logika poskusa je temeljila na tem, da se ob uspešnem vstopu fagnega genoma v liposomu začne izražati mCherry, kar povzroči rdečo fluorescenco.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Vpliv MOI in velikosti liposomov===
Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI, torej razmerja med številom infektivnih fagov in številom sintetičnih celic. Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic. Pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in aključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T22:05:44Z

Primož Šenica Pavletič: /* Vstop genoma in izražanje mCherry */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje molekule, encime, ribosome, aminokisline, nukleotide in energijske komponente, ki omogočajo transkripcijo in translacijo. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. V tej raziskavi je bil kot receptorska komponenta uporabljen RdLPS, krajša oblika grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Zaradi manjše velikosti in večje hidrofobnosti je primernejši za stabilno vključitev v lipidno membrano liposoma kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanjem lističu membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Pomembna ugotovitev je tudi, da prisotnost RdLPS v membrani ni zavrla delovanja celično-prostega sistema izražanja genov, CFE, v notranjosti liposomov. Aktivnost CFE sistema je bila potrjena z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Vstop genoma je bil preverjen z inženiranima fagoma T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta vsebovala zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v sposobnosti vezave na RdLPS. T7-mC-S* je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Logika poskusa je temeljila na tem, da se ob uspešnem vstopu fagnega genoma v liposomu začne izražati mCherry, kar povzroči rdečo fluorescenco.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Vpliv MOI in velikosti liposomov===
Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI, torej razmerja med številom infektivnih fagov in številom sintetičnih celic. Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic. Pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in aključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T22:04:42Z

Primož Šenica Pavletič: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje molekule, encime, ribosome, aminokisline, nukleotide in energijske komponente, ki omogočajo transkripcijo in translacijo. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. V tej raziskavi je bil kot receptorska komponenta uporabljen RdLPS, krajša oblika grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Zaradi manjše velikosti in večje hidrofobnosti je primernejši za stabilno vključitev v lipidno membrano liposoma kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanjem lističu membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Pomembna ugotovitev je tudi, da prisotnost RdLPS v membrani ni zavrla delovanja celično-prostega sistema izražanja genov, CFE, v notranjosti liposomov. Aktivnost CFE sistema je bila potrjena z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Vstop genoma je bil preverjen z inženiranima fagoma T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta vsebovala zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v sposobnosti vezave na RdLPS. T7-mC-S* je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Logika poskusa je temeljila na tem, da se ob uspešnem vstopu fagnega genoma v liposomu začne izražati mCherry, kar povzroči rdečo fluorescenco.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Vpliv MOI in velikosti liposomov===
Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI, torej razmerja med številom infektivnih fagov in številom sintetičnih celic. Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic. Pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Pomen raziskave in aključek==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T22:03:42Z

Primož Šenica Pavletič: /* Sprostitev fagov */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje molekule, encime, ribosome, aminokisline, nukleotide in energijske komponente, ki omogočajo transkripcijo in translacijo. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. V tej raziskavi je bil kot receptorska komponenta uporabljen RdLPS, krajša oblika grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Zaradi manjše velikosti in večje hidrofobnosti je primernejši za stabilno vključitev v lipidno membrano liposoma kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanjem lističu membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Pomembna ugotovitev je tudi, da prisotnost RdLPS v membrani ni zavrla delovanja celično-prostega sistema izražanja genov, CFE, v notranjosti liposomov. Aktivnost CFE sistema je bila potrjena z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Vstop genoma je bil preverjen z inženiranima fagoma T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta vsebovala zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v sposobnosti vezave na RdLPS. T7-mC-S* je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Logika poskusa je temeljila na tem, da se ob uspešnem vstopu fagnega genoma v liposomu začne izražati mCherry, kar povzroči rdečo fluorescenco.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Vpliv MOI in velikosti liposomov===
Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI, torej razmerja med številom infektivnih fagov in številom sintetičnih celic. Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic. Pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

==Zaključek==

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T22:01:11Z

Primož Šenica Pavletič: /* Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje molekule, encime, ribosome, aminokisline, nukleotide in energijske komponente, ki omogočajo transkripcijo in translacijo. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. V tej raziskavi je bil kot receptorska komponenta uporabljen RdLPS, krajša oblika grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Zaradi manjše velikosti in večje hidrofobnosti je primernejši za stabilno vključitev v lipidno membrano liposoma kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanjem lističu membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Pomembna ugotovitev je tudi, da prisotnost RdLPS v membrani ni zavrla delovanja celično-prostega sistema izražanja genov, CFE, v notranjosti liposomov. Aktivnost CFE sistema je bila potrjena z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Vstop genoma je bil preverjen z inženiranima fagoma T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta vsebovala zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v sposobnosti vezave na RdLPS. T7-mC-S* je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Logika poskusa je temeljila na tem, da se ob uspešnem vstopu fagnega genoma v liposomu začne izražati mCherry, kar povzroči rdečo fluorescenco.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Vpliv MOI in velikosti liposomov===
Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI, torej razmerja med številom infektivnih fagov in številom sintetičnih celic. Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic. Pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

==Sprostitev fagov==
==Zaključek==

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T22:00:38Z

Primož Šenica Pavletič: /* Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.

===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje molekule, encime, ribosome, aminokisline, nukleotide in energijske komponente, ki omogočajo transkripcijo in translacijo. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

==Priprava sinteznih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. V tej raziskavi je bil kot receptorska komponenta uporabljen RdLPS, krajša oblika grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Zaradi manjše velikosti in večje hidrofobnosti je primernejši za stabilno vključitev v lipidno membrano liposoma kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanjem lističu membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Pomembna ugotovitev je tudi, da prisotnost RdLPS v membrani ni zavrla delovanja celično-prostega sistema izražanja genov, CFE, v notranjosti liposomov. Aktivnost CFE sistema je bila potrjena z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Vstop genoma je bil preverjen z inženiranima fagoma T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta vsebovala zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v sposobnosti vezave na RdLPS. T7-mC-S* je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Logika poskusa je temeljila na tem, da se ob uspešnem vstopu fagnega genoma v liposomu začne izražati mCherry, kar povzroči rdečo fluorescenco.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

===Vpliv MOI in velikosti liposomov===
Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI, torej razmerja med številom infektivnih fagov in številom sintetičnih celic. Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic. Pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
==Sprostitev fagov==
==Zaključek==

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T21:56:36Z

Primož Šenica Pavletič: /* Vpliv MOI in velikosti liposomov */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T21:55:54Z

Primož Šenica Pavletič: /* Vstop genoma in izražanje mCherry */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T21:53:19Z

Primož Šenica Pavletič: /* Preverjanje delovanja membrane z RdLPS */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T21:51:09Z

Primož Šenica Pavletič: /* Zasnova membrane in uporaba RdLPS */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T21:49:03Z

Primož Šenica Pavletič:

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T21:40:16Z

Primož Šenica Pavletič: /* Vstop, izražanje in replikacija genoma T7 */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T21:35:26Z

Primož Šenica Pavletič: /* Preverjanje delovanja membrane z RdLPS */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T21:31:41Z

Primož Šenica Pavletič: /* Zasnova membrane in uporaba RdLPS */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T17:23:01Z

Primož Šenica Pavletič: /* Preverjanje delovanja membrane z RdLPS */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T17:22:35Z

Primož Šenica Pavletič: /* Vstop, izražanje in replikacija genoma T7 */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T17:22:25Z

Primož Šenica Pavletič: /* Vstop in izražanje fagnega genoma */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T17:19:06Z

Primož Šenica Pavletič: /* Rezultati */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T17:18:30Z

Primož Šenica Pavletič: /* Priprava in funkcionalizacija sinteznih celic */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T17:11:23Z

Primož Šenica Pavletič: /* Zasnova membrane in uporaba RdLPS */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T17:08:00Z

Primož Šenica Pavletič: /* Namen raziskave */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T13:38:17Z

Primož Šenica Pavletič: /* Zasnova membrane in uporaba RdLPS */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T13:35:11Z

Primož Šenica Pavletič: /* Zasnova membrane in uporaba RdLPS */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T13:34:31Z

Primož Šenica Pavletič: /* 3 */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T13:33:19Z

Primož Šenica Pavletič: /* 2 */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T13:32:55Z

Primož Šenica Pavletič: /* 1 */

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T11:38:15Z

Primož Šenica Pavletič: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===1===

===2===

===3===

===4===

==Rezultati==

==Zaključek==

==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T11:34:29Z

Primož Šenica Pavletič:

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===1===

===2===

===3===

===4===

==Rezultati==

==Zaključek==

==Literatura==

Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

2026-05-16T11:33:55Z

Primož Šenica Pavletič: Created page with "Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 GLYCO-BUILD: A synthetic cell phage cycle] ==Uvod== ===1=== ===2=== ===3=== ===4=== ==Rezultati== ==Zaključek== ==Literatura=="

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 GLYCO-BUILD: A synthetic cell phage cycle]

==Uvod==

===1===

===2===

===3===

===4===

==Rezultati==

==Zaključek==

==Literatura==

Seminarji SB 2025/26

2026-05-16T11:29:48Z

Primož Šenica Pavletič:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Logično_vezje_IN,_ki_vključuje_sistem_CRISPR/Cas9_in_HCR_za_natančno_detekcijo_ctDNA Logično vezje IN, ki vključuje sistem CRISPR/Cas9 in HCR za natančno detekcijo ctDNA] (Tiara Pšeničnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ekspresijska_kaseta_za_sintezo_heterolognih_proteinov_v_Y._lipolytica Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica] (Tonja Oman Sušnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uravnavanje_evolucijskega_potenciala_s_številom_kopij_plazmida_in_regulatorno_arhitekturo Uravnavanje evolucijskega potenciala s številom kopij plazmida in regulatorno arhitekturo] (Neža Pezo Zupančič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_sestave_gojišča_na_delovanje_vezja_na_osnovi_izločevalnega_sistema_tipa_III Vpliv sestave gojišča na delovanje vezja na osnovi izločevalnega sistema tipa III] (Jana Bregar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterijski_senzor_zelene_svetlobe,_specifičen_za_stacionarno_fazo_rasti,_za_povečanje_proizvodnje_metabolitov Bakterijski senzor zelene svetlobe, specifičen za stacionarno fazo rasti, za povečanje proizvodnje metabolitov] (Vid Kozel)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_genetskih_programov_v_sesalskih_celicah_z_uporabo_računalniskega_orodja_GCAD Načrtovanje genetskih programov v sesalskih celicah z uporabo računalniškega orodja GCAD] (Filip Petrovič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_optogenetske_stimulacije_na_izražanje_nevronskih_genov_v_človeških_mezenhimskih_matičnih_celicah,_pridobljenih_iz_kostnega_mozga_in_maščobnega_tkiva Vpliv optogenetske stimulacije na izražanje nevronskih genov v človeških mezenhimskih matičnih celicah, pridobljenih iz kostnega mozga in maščobnega tkiva] (Andreja Dimovska)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cikel_načrtovanja,_izdelave,_testiranja_in_učenja_(DBTL)_pri_razvoju_celičnega_biosenzorja_za_piruvat_na_osnovi_transkripcijskega_faktorja Cikel načrtovanja, izdelave, testiranja in učenja (DBTL) pri razvoju celičnega biosenzorja za piruvat na osnovi transkripcijskega faktorja] (Lenart Bogataj)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/GLYCO-BUILD:_Encimska_platformaza_sintezo_peptidov_z_evkarionstkimi_N-glikani GLYCO-BUILD: Encimska platforma za sintezo peptidov z evkarionstkimi N-glikani] (Anže Perc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Fagni_infekcijski_cikel_v_sintetičnih_celicah Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah] (Primož Šenica Pavletič)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SKIPPIT SKIPPIT] (Brina Klinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/InkSight InkSight] (Lucija Kovaček)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=KunPeng KunPeng] (Lara Ferjančič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NRPieceS NRPieceS] (Katarina Gomiršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pepcitrus Pepcitrus] (Meri Škorjanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BCoated BCoated] (Meta Smrečnik)
(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

Seminarji SB 2025/26

2026-05-16T11:28:37Z

Primož Šenica Pavletič:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Logično_vezje_IN,_ki_vključuje_sistem_CRISPR/Cas9_in_HCR_za_natančno_detekcijo_ctDNA Logično vezje IN, ki vključuje sistem CRISPR/Cas9 in HCR za natančno detekcijo ctDNA] (Tiara Pšeničnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ekspresijska_kaseta_za_sintezo_heterolognih_proteinov_v_Y._lipolytica Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica] (Tonja Oman Sušnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uravnavanje_evolucijskega_potenciala_s_številom_kopij_plazmida_in_regulatorno_arhitekturo Uravnavanje evolucijskega potenciala s številom kopij plazmida in regulatorno arhitekturo] (Neža Pezo Zupančič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_sestave_gojišča_na_delovanje_vezja_na_osnovi_izločevalnega_sistema_tipa_III Vpliv sestave gojišča na delovanje vezja na osnovi izločevalnega sistema tipa III] (Jana Bregar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterijski_senzor_zelene_svetlobe,_specifičen_za_stacionarno_fazo_rasti,_za_povečanje_proizvodnje_metabolitov Bakterijski senzor zelene svetlobe, specifičen za stacionarno fazo rasti, za povečanje proizvodnje metabolitov] (Vid Kozel)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_genetskih_programov_v_sesalskih_celicah_z_uporabo_računalniskega_orodja_GCAD Načrtovanje genetskih programov v sesalskih celicah z uporabo računalniškega orodja GCAD] (Filip Petrovič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_optogenetske_stimulacije_na_izražanje_nevronskih_genov_v_človeških_mezenhimskih_matičnih_celicah,_pridobljenih_iz_kostnega_mozga_in_maščobnega_tkiva Vpliv optogenetske stimulacije na izražanje nevronskih genov v človeških mezenhimskih matičnih celicah, pridobljenih iz kostnega mozga in maščobnega tkiva] (Andreja Dimovska)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cikel_načrtovanja,_izdelave,_testiranja_in_učenja_(DBTL)_pri_razvoju_celičnega_biosenzorja_za_piruvat_na_osnovi_transkripcijskega_faktorja Cikel načrtovanja, izdelave, testiranja in učenja (DBTL) pri razvoju celičnega biosenzorja za piruvat na osnovi transkripcijskega faktorja] (Lenart Bogataj)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/GLYCO-BUILD:_Encimska_platformaza_sintezo_peptidov_z_evkarionstkimi_N-glikani GLYCO-BUILD: Encimska platforma za sintezo peptidov z evkarionstkimi N-glikani] (Anže Perc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah] (Primož Šenica Pavletič)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SKIPPIT SKIPPIT] (Brina Klinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/InkSight InkSight] (Lucija Kovaček)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=KunPeng KunPeng] (Lara Ferjančič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NRPieceS NRPieceS] (Katarina Gomiršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pepcitrus Pepcitrus] (Meri Škorjanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BCoated BCoated] (Meta Smrečnik)
(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

Uravnavanje evolucijskega potenciala s številom kopij plazmida in regulatorno arhitekturo

2026-05-05T21:25:57Z

Primož Šenica Pavletič:

Izhodiščni članek: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41476172/

==UVOD==

Genetski moduli v sintezni biologiji so pogosto zasnovani po analogiji z inženirskimi sistemi. Čeprav je ta pristop lahko uspešen zaradi podobnosti med fizikalnimi in biokemičnimi sistemi, zanemarja ključni dejavnik, ki vpliva na delovanje živih organizmov: evolucijo. Medtem ko so električna vezja statična in nespremenljiva, so genetski sistemi podvrženi stalnim mutacijam in evolucijskemu pritisku, kar sčasoma vodi do postopne okvare funkcije.

Zato je pri načrtovanju sintetičnih bioloških sistemov nujno upoštevati ravnotežje med dvema ključnima lastnostma: evolucijskem potencialnom, zmožnost generiranja novih funkcij in evolucijsko stabilnostjo, ohranjanje obstoječe funkcije kljub mutacijam. Avtorja sta z združevanjem računskega modeliranja in poskusov in vivo mutageneze v bakteriji E. coli opisala, kako medsebojno delovanje genskega odmerka preko števila kopij plazmida – PCN in regulatorne arhitekture vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo.

Plazmidi kot nosilci sintetičnih vezij igrajo pomembno vlogo, saj so prisotni v več kopijah v vsakem gostitelju in omogočajo hitro evolucija preko genske amplifikacije. Visok PCN poveča genetsko raznolikost znotraj celice (heterozigotnost) in omogoča učinkovitejše prilagajanje, hkrati pa olajša širjenje genov med bakterijami preko horizontalnega prenosa. To ima velik pomen za lastnosti, kot so odpornost na antibiotike in razgradnje toksičnih snovi.

== METODE: EvolvR SISTEM IN RAČUNSKI MODEL==

Uporabljali so in vivo sistem za ustvarjanje mutacij z uporabo sistema EvolvR. To je izboljšana Cas9 nikaza, spojena z modificirano error-prone DNA polimerazo. Sistem usmerja usmerjevalna RNA, imenovana sgRNA, tako da povzroča ciljne mutacije na izbranem mestu. Izražanje EvolvR je inducibilno z arabinozo, kar omogoča časovno regulacijo mutacijskega procesa.
Eksperimentalni sistem vključuje dva glavna plazmida: prvi vsebuje EvolvR in sgRNA, drugi pa tarčne gene na plazmidih z različnimi variantami pSC101, ki omogočajo različna števila kopij v celici. Tarčni geni vključujejo okvarjen fluorescenčni protein sfGFPd, okvarjen gen za odpornost na antibiotik ampRd ter regulatorni gen lacI.

Da bi ločila vpliv števila kopij plazmidov od vpliva ekspresije genov, sta avtorja uporabila dodatne regulacijske konstrukte. Eden ključnih je IFFL (incoherent feed-forward loop), ki omogoča konstantno raven ekspresije proteina ne glede na PCN, saj povečanje števila kopij hkrati poveča tudi represijo. Poleg tega sta uporabila negativno avtoregulacijo, kjer protein LacI regulira lastno izražanje, ter TetR represijski sistem za zmanjšanje neželenih mutacij zunaj ciljnih regij. Ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo in analizo vpliva mutacij na fenotip.

Da bi raziskali, kako genski odmerek vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo, sta avtorja razvila prirejeno različico standardnega Wright-Fisherjevega modela za multiploidne populacije, saj PCN običajno presega dva. Model ima diskretne generacije s konstantno velikostjo populacije N = 10⁵, verjetnost mutacije μ = 2,5 × 10⁻⁶ na nukleotid na generacijo.

Postopek v vsaki generaciji poteka v štirih korakih. V prvem koraku vsak plazmid divjega tipa mutira z verjetnostjo μ, kar modelirajo kot Poissonov proces. Nato se posodobijo števila plazmidov divjega tipa in mutiranih plazmidov. V drugem koraku se število novih plazmidov po replikaciji ustvari v skladu s Poissonovo porazdelitvijo s povprečjem, enakim povprečnemu PCN. Ta bazen se nato razdeli po binomski porazdelitvi, tako da so novi plazmidi naključno dodeljeni kot divji tip ali mutirani glede na razmerja v celici. V tretjem koraku obe hčerinski celici prejmeta približno polovico plazmidov. Hipergeometrična porazdelitev določi, kako so mutirani in nemutirani plazmidi porazdeljeni. V četrtem koraku se naključno izbere polovica populacije za naslednjo generacijo, preostanek pa se zavrže, tako da velikost populacije ostane konstantna.

==REZULTATI==

Rezultati simulacij pokažejo tri ključne trende. Prvič, delež celic, ki vsebujejo vsaj en mutiran plazmid, narašča z večjim PCN. Drugič, absolutno število mutiranih plazmidov znotraj posamezne celice prav tako narašča s PCN. Tretjič pa, relativni delež mutiranih plazmidov na celico pada s PCN, saj večje število nemutiranih kopij zmanjša relativni vpliv mutacij. To pomeni, da višji PCN povečuje genetsko raznolikost na ravni populacije, hkrati pa omogoča kompenzacijo mutacij na ravni posamezne celice.

===MUTACIJE, KI POVZROČIJO PRIDOBITEV FUNKCIJE===

Avtorja sta eksperimentalno preverila napovedi modela s preprostim genskim vezjem, sestavljenim iz dveh plazmidov. Prvi plazmid z izvorom replikacije p15A vsebuje sistem EvolvR in sgRNA, oba izražena z arabinoza-inducibilnim PBAD promotorjem. Drugi plazmid vsebuje pSC101 varianto izvora replikacije s številom kopij (PCN) med 3 in 25 na kromosom ter vsebuje konstitutivno izražen sfGFP z okvaro. Okvara je posledica zamenjave metionina s stop kodonom, kar povzroči nefluorescentnost. Ob dodatku arabinoze se aktivira EvolvR, ki lahko popravi stop kodon in tako ponovno vzpostavi fluporescenco, kar predstavlja mutacijo, ki povzroči pridobitev funkcije.

Rezultati pretočne citometrije so pokazali, da manj kot 1% celic izraža visoko raven izražanja sfGFP. Fenotipska mutacijska stopnja brez dodatne regulacije narašča s povečanjem PCN, saj večje število kopij pomeni več tarčnih mest za mutacije in s tem večje število novonastalih mutacij. Vendar pa večji PCN hkrati poveča tudi skupno koncentracijo izraženega proteina, kar moti interpretacijo rezlutatov, saj ni jasno, ali spremembe izvirajo iz mutacij ali iz povečane ekspresije.

Zato so avtorji vključili IFFL (incoherent feed-forward loop) regulacijski modul, ki omogoča konstantno izražanje tarčnega proteina ne glede na PCN. V tem primeru koncentracija sfGFP narašča s številom mutiranih plazmidov, vendar je prispevek posameznega mutiranega plazmida k skupni koloičini proteina manjši pri višjem PCN zaradi represije. Posledično se pojavita dva nasprotujoča si učinka: večje število mutiranih kopij povečuje verjetnost zaznavnega signala, hkrati pa posamezna mutacija prispeva manj funkcionalnega proteina.

Kateri učinek prevlada, je odvisno od detekcijskega praga fenotipa. Pri nizkem pragu, kot je odpornost na antibiotik, zadostuje že majhna količina funkcionalnega proteina. Zato drugi učinek ni pomemben in fenotipska mutacija monotono narašča s PCN. To so avtorji dodatno potrdili z eksperimentom z okvarjenim genom ampRd, kjer so celice po indukciji gojili na gojišču z ampicilinom – preživele so le tiste, pri katerih mutacija je obnovila funkcijo gena. Število preživelih kolonij je naraščalo s PCN, kar jasno kaže na prevladujoč vpliv povečane mutacijske oskrbe.
Pri višjem detekcijskem pragu, kot je fluorescenčni signal, pa mora biti količina proteina dovolj veilka, da jo zaznamo. V tem primeru lahko pride do nemonotone odvisnosti, kjer mutacijska stopnja najprej narašča, nato začne padati, kar so opazili tako v simulacijah kot eksperimentih.

===MUTACIJE, KI POVZROČIJO IZGUBO FUNKCIJE===

Pri mutacijah tipa, ki povzročijo izgubo funkcije, kjer mutacija uniči funkcijo gena (na primer mutacija lacI, ki povzroči izgubo represije), je trend obraten. Fenotipska mutacijska stopnja se zmanjšuje z naraščajočim PCN. Razlog je v tem, da nemutirane kopije gena še vedno proizvajajo funkcionalni protein, ki kompenzira učinek mutacije.

===MUTACIJE V KODIRAJOČI IN REGULATORNI REGIJI===

Mutacije v kodirajoči regiji pogosto povzročijo nefunkcionalne proteine, vendar so njihov učinek pogosto kompenziran z drugimi, nemutiranimi kopijami gena. Zato njihov fenotipski vpliv upada z večjim PCN. Nasprotno pa mutacije v regulatornih regijah, kot so promotorji ali vezavna mesta za regulatorje, niso kompenzirane na enak način. Ena sama mutirana kopija promotorja lahko vodi do izražanja gena ne glede na stanje drugih kopij. Zato se njihov fenotipski učinek povečuje z večjim PCN. To pomeni, da so regulatorne mutacije pogosto dominantne ali kodominantne, medtem ko so mutacije v kodirajočih regijah pogosto recesivne.

Regulatorni konstrukti igrajo ključno vlogo pri oblikovanju teh učinkov. IFFL modul omogoča stabilno ekspresijo ne glede na število kopij in s tem razkriva subtilne učinke mutacij. TetR represijski sistem zmanjšuje neželene mutacije izven ciljnih regij in izboljšuje natančnost eksperimentov. Skupaj ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo evolucijskih lastnosti sistema.

==ZAKLJUČEK==

Na podlagi rezultatov pridemo do zaključka, da fenotipski učinek mutacij ni odvisen zgolj od narave mutacije, temveč tudi od konteksta, v katerem se mutacija pojavi. Ključna dejavnika sta število kopij gena in regulatorna arhitektura. Višji PCN poveča evolucijski potencial, saj omogoča več mutacij in večjo genetsko raznolikost, vendar hkrati zmanjša vpliv posamezne mutacije zaradi kompenzacije. Mutacije, ki povzročijo pridobitev funkcije se obnašajo dominantno in postajajo pogostejše z večjim PCN. Mutacije, ki povzročijo izgubo funkcije so recesivne in njihov fenotipski vpliv upada, medtem ko regulatorne mutacije pogosto kažejo dominantno ali kodominantno vedenje.
Ti rezultati imajo pomembne implikacije za sintezno biologijo. Z ustrezno izbiro števila kopij plazmidov in regulatornih mehanizmov je mogoče načrtovati sisteme, ki so bodisi evolucijsko stabilni bodisi sposobni hitrega prilagajanja. Poleg tega izbira tarčnega mesta mutacije bistveno vpliva na evolucijski izid: mutacije v regulatornih regijah imajo večjo verjetnost fenotipskega učinka kot mutacije v kodirajočih regijah.

==VIRI==
#Li, X., & Gyorgy, A. (2025). Tuning evolvability via plasmid copy number and regulatory architecture. Nature Communications, 17(1), 1230. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67995-9

Uravnavanje evolucijskega potenciala s številom kopij plazmida in regulatorno arhitekturo

2026-05-05T07:45:39Z

Primož Šenica Pavletič:

Izhodiščni članek: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41476172/

==UVOD==

Genetski moduli v sintezni biologiji so pogosto zasnovani po analogiji z inženirskimi sistemi. Čeprav je ta pristop lahko uspešen zaradi podobnosti med fizikalnimi in biokemičnimi sistemi, zanemarja ključni dejavnik, ki vpliva na delovanje živih organizmov: evolucijo. Medtem ko so električna vezja statična in nespremenljiva, so genetski sistemi podvrženi stalnim mutacijam in evolucijskemu pritisku, kar sčasoma vodi do postopne okvare funkcije.

Zato je pri načrtovanju sintetičnih bioloških sistemov nujno upoštevati ravnotežćje med dvema ključnima lastnostma: evolvabilnostjo, zmožnost generiranja novih funkcij in evolucijsko stabilnostjo, ohranjanje obstoječe funkcije kljub mutacijam. Avtorja sta z združevanjem računskega modeliranja in poskusov in vivo mutageneze v bakteriji E. coli opisala, kako medsebojno delovanje genskega odmerka preko števila kopij plazmida – PCN in regulacijske arhitekture vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo.

Plazmidi kot nosilci sintetičnih vezij igrajo pomembno vlogo, saj prisotni v več kopijah v vsakem gostitelju in omogočajo hitro evolucija preko genske amplifikacije. Visok PCN poveča genetsko raznolikost znotraj celice (heterozigotnost) in omogoča učinkovitejše prilagajanje, hkrati pa olajša širjenje genov med bakterijami preko horizontalnega prenosa. To ima velik pomen za lastnosti, kot so odpornost na antibiotike in razgradnje toksičnih snovi.

== METODE: EvolvR SISTEM IN RAČUNSKI MODEL==

Za eksperimentalno preučevanje mutacij sta avtorja uporabila sistem EvolvR, ki temelji na fuziji Cas9 nikaze in modificirani error-prone DNA polimerazi. Usmerja jo ena sama usmerjevalna RNA – sgRNA. Ta sistem omogoča ciljno induciranje mutacij na določenih mestih DNA, ki jih določa sgRNA. EvolvR je izražen pod nadzorom arabinoza-inducibilnega promotorja, kar omogoča časovno regulacijo mutacijskega procesa. Eksperimentalni sistem vključuje dva glavna plazmida: prvi vsebuje EvolvR in sgRNA, drugi pa tarčne gene na plazmidih z različnimi variantami pSC101, ki omogočajo različna števila kopij v celici. Tarčni geni vključujejo okvarjen fluorescenčni protein sfGFPd, okvarjen gen za odpornost na antibiotik ampRd ter regulatorni gen lacI.

Da bi ločila vpliv števila kopij plazmidov od vpliva ekspresije genov, sta avtorja uporabila dodatne regulacijske konstrukte. Eden ključnih je incoherent feed-forward loop (IFFL), ki omogoča konstantno raven ekspresije ne glede na PCN, saj povečanje števila kopij hkrati poveča tudi represijo. Poleg tega sta uporabila negativno avtoregulacijo, kjer protein LacI regulira lastno izražanje, ter TetR represijski sistem za zmanjšanje neželenih mutacij zunaj ciljnih regij. Ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo in analizo vpliva mutacij na fenotip.

Prednost in vivo pred in vitro mutacijami je več. Prvič, mutacije so neposredno povezane s sposobnostjo gostitelja. Drugič, zagotovljeni so vzporedni tokovi mutacij zaradi nenehno replicirajoče populacije. Tretjič, omogočene so potencialno širše in daljše mutacijske poti.

Da bi raziskali, kako genski odmerek vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo, sta avtorja razvila prirejeno različico standardnega Wright-Fisherjevega modela za multiploidne populacije, saj PCN običajno presega dva. Model ima diskretne in nepreekrivajoče se generacije s konstantno velikostjo populacije N = 10⁵, verjetnost mutacije μ = 2,5 × 10⁻⁶ na nukleotid na generacijo.

Postopek v vsaki generaciji poteka v štirih korakih. V prvem koraku vsak plazmid divjega tipa mutira z verjetnostjo μ, kar modelirajo kot Poissonov proces. Nato se posodobijo števila plazmidov divjega tipa in mutiranih plazmidov. V drugem koraku se število novih plazmidov po replikaciji ustvari v skladu s Poissonovo porazdelitvijo s povprečjem, enakim povprečnemu PCN. Ta bazen se nato razdeli po binomski porazdelitvi, tako da so novi plazmidi naključno dodeljeni kot divji tip ali mutirani glede na razmerja v celici. V tretjem koraku obe hčerinski celici prejmeta približno polovico plazmidov. Hipergeometrična porazdelitev določi, kako so mutirani in nemutirani plazmidi porazdeljeni. V četrtem koraku se naključno izbere polovica populacije za naslednjo generacijo, preostanek pa se zavrže, tako da velikost populacije ostane konstantna.

==REZULTATI==

Rezultati simulacij pokažejo tri ključne trende. Prvič, delež celic, ki vsebujejo vsaj en mutiran plazmid, narašča z večjim PCN. Drugič, absolutno število mutiranih plazmidov znotraj posamezne celice prav tako narašča. Tretjič pa relativni delež mutiranih plazmidov na celico pada, saj večje število nemutiranih kopij zmanjša relativni vpliv mutacij. To pomeni, da višji PCN povečuje genetsko raznolikost na ravni populacije, hkrati pa omogoča kompenzacijo mutacij na ravni posamezne celice.

===MUTACIJE, KI POVZROČIJO PRIDOBITEV FUNKCIJE===

Avtorja sta eksperimentalno preverila napovedi modela s preprostim genskim vezjem, sestavljenim iz dveh plazmidov. Prvi plazmid z izvorom replikacije p15A vsebuje sistem EvolvR in sgRNA, oba izražena z arabinoza-inducibilnim PBAD promotorjem. Drugi plazmid vsebuje pSC101 varianto izvora replikacije s številom kopij (PCN) med 3 in 25 na kromosom ter vsebuje konstitutivno izražen sfGFP z okvaro. Okvara je posledica zamenjave metionina s stop kodonom, kar povzroči nefluorescentnost. Ob dodatku arabinoze se aktivira EvolvR, ki lahko popravi stop kodon in tako ponovno vzpostavi fluporescenco, kar predstavlja mutacijo, ki povzroči pridobitev funkcije.

Rezultati pretočne citometrije so pokazali, da manj kot 1% celic izraža visoko fluorescenco. Fenotipska mutacijska stopnja brez dodatne regulacije narašča s povečanjem PCN, saj večje število kopij pomeni več tarčnih mest za mutacije in s tem večjo mutacijsko oskrbo. Vendar pa večji PCN hkrati poveča tudi skupno koncentracijo izraženega proteina, kar moti interpretacijo rezlutatov, saj ni jasno, ali spremembe izvirajo iz mutacij ali iz povečane ekspresije.

Zato so avtorji vključili IFFL (incoherent feed-forward loop) regulacijski modul, ki omogoča konstantno izražanje tarčnega proteina ne glede na PCN. V tem primeru koncentracija sfGFP narašča s številom mutiranih plazmidov, vendar je prispevek posameznega mutiranega plazmida k skupni koloičini proteina manjši pri višjem PCN zaradi represije. Posledično se pojavita dva nasprotujoča si učinka: večje število mutiranih kopij povečuje verjetnost zaznavnega signala, hkrati pa posamezna mutacija prispeva manj funkcionalnega proteina.

Kateri učinek prevlada, je odvisno od detekcijskega praga fenotipa. Pri nizkem pragu, kot je odpornost na antibiotik, zadostuje že majhna količina funkcionalnega proteina. Zato drugi učinek ni pomemben in fenotipska mutacija monotono narašča s PCN. To so avtorji dodatno potrdili z eksperimentom z okvarjenim genom ampRd, kjer so celice po indukciji gojili na gojišču z ampicilinom – preživele so le tiste, pri katerih je mutacija obnovila funkcijo gena. Število preživelih kolonij je naraščalo s PCN, kar jasno kaže na prevladujoč vpliv povečane mutacijske oskrbe.
Pri višjem pragu, kot je fluorescenčni signal, pa mora biti količina protein dovolj veilka, da jo zaznamo. V tem primeru lahko pride do nemonotone odvisnosti, kjer mutacijska stopnja najprej narašča, nato začne padati, kar so opazili tako v simulacijah kot eksperimentih.

===MUTACIJE, KI POVZROČIJO IZGUBO FUNKCIJE===

Pri mutacijah tipa, ki povzročijo izgubo funkcije, kjer mutacija uniči funkcijo gena (na primer mutacija lacI, ki povzroči izgubo represije), je trend obraten. Fenotipska mutacijska stopnja se zmanjšuje z naraščajočim PCN. Razlog je v tem, da nemutirane kopije gena še vedno proizvajajo funkcionalni protein, ki kompenzira učinek mutacije. Večje število kopij tako pomeni večjo “rezervo” funkcionalnega produkta, zaradi česar mutacija težje vpliva na fenotip. Ta pojav ustreza recesivnemu vedenju mutacij.

===MUTACIJE V KODIRAJOČI IN REGULATORNI REGIJI===

Mutacije v kodirajoči regiji pogosto povzročijo nefunkcionalne proteine, vendar so njihov učinek pogosto kompenziran z drugimi, nemutiranimi kopijami gena. Zato njihov fenotipski vpliv upada z večjim PCN. Nasprotno pa mutacije v regulatornih regijah, kot so promotorji ali vezavna mesta za regulatorje, niso kompenzirane na enak način. Ena sama mutirana kopija promotorja lahko vodi do izražanja gena ne glede na stanje drugih kopij. Zato se njihov fenotipski učinek povečuje z večjim PCN. To pomeni, da so regulatorne mutacije pogosto dominantne ali kodominantne, medtem ko so mutacije v kodirajočih regijah pogosto recesivne.

Regulatorni konstrukti igrajo ključno vlogo pri oblikovanju teh učinkov. IFFL modul omogoča stabilno ekspresijo ne glede na število kopij in s tem razkriva subtilne učinke mutacij. Negativna avtoregulacija stabilizira gensko izražanje in zmanjšuje variabilnost. TetR represijski sistem zmanjšuje neželene mutacije izven ciljnih regij in izboljšuje natančnost eksperimentov. Skupaj ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo evolucijskih lastnosti sistema.

==ZAKLJUČEK==

Na podlagi rezultatov pridemo do zaključka, da fenotipski učinek mutacij ni odvisen zgolj od narave mutacije, temveč tudi od konteksta, v katerem se mutacija pojavi. Ključna dejavnika sta število kopij gena in regulacijska arhitektura. Višji PCN poveča evolvabilnost, saj omogoča več mutacij in večjo genetsko raznolikost, vendar hkrati zmanjša vpliv posamezne mutacije zaradi kompenzacije. Mutacije, ki povzročijo pridobitev funkcije se obnašajo dominantno in postajajo pogostejše z večjim PCN, mutacije, ki povzročijo izgubo funkcije so recesivne in njihov fenotipski vpliv upada, medtem ko regulatorne mutacije pogosto kažejo dominantno ali kodominantno vedenje.
Ti rezultati imajo pomembne implikacije za sintezno biologijo. Z ustrezno izbiro števila kopij plazmidov in regulacijskih mehanizmov je mogoče načrtovati sisteme, ki so bodisi evolucijsko stabilni bodisi sposobni hitrega prilagajanja. Poleg tega izbira tarčnega mesta mutacije bistveno vpliva na evolucijski izid: mutacije v regulatornih regijah imajo večjo verjetnost fenotipskega učinka kot mutacije v kodirajočih regijah. Članek tako ponuja pomemben korak proti razvoju bolj predvidljivega in racionalnega načrtovanja sintetičnih bioloških sistemov, ki upoštevajo evolucijo kot ključen dejavnik.

==VIRI==
#Li, X., & Gyorgy, A. (2025). Tuning evolvability via plasmid copy number and regulatory architecture. Nature Communications, 17(1), 1230. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67995-9

Uravnavanje evolucijskega potenciala s številom kopij plazmida in regulatorno arhitekturo

2026-05-04T20:07:30Z

Primož Šenica Pavletič:

Izhodiščni članek: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41476172/

==UVOD==

Genetski moduli v sintezni biologiji so pogosto zasnovani po analogiji z inženirskimi sistemi. Čeprav je ta pristop lahko uspešen zaradi podobnosti med fizikalnimi in biokemičnimi sistemi, zanemarja ključni dejavnik, ki vpliva na delovanje živih organizmov: evolucijo. Medtem ko so električna vezja statična in nespremenljiva, so genetski sistemi podvrženi stalnim mutacijam in evolucijskemu pritisku, kar sčasoma vodi do postopne okvare funkcije.

Zato je pri načrtovanju sintetičnih bioloških sistemov nujno upoštevati ravnotežćje med dvema ključnima lastnostma: evolvabilnostjo, zmožnost generiranja novih funkcij in evolucijsko stabilnostjo, ohranjanje obstoječe funkcije kljub mutacijam. Avtorja sta z združevanjem računskega modeliranja in poskusov in vivo mutageneze v bakteriji E. coli opisala, kako medsebojno delovanje genskega odmerka preko števila kopij plazmida – PCN in regulacijske arhitekture vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo.

Plazmidi kot nosilci sintetičnih vezij igrajo pomembno vlogo, saj prisotni v več kopijah v vsakem gostitelju in omogočajo hitro evolucija preko genske amplifikacije. Visok PCN poveča genetsko raznolikost znotraj celice (heterozigotnost) in omogoča učinkovitejše prilagajanje, hkrati pa olajša širjenje genov med bakterijami preko horizontalnega prenosa. To ima velik pomen za lastnosti, kot so odpornost na antibiotike in razgradnje toksičnih snovi.

== METODE: EvolvR SISTEM IN RAČUNSKI MODEL==

Za eksperimentalno preučevanje mutacij sta avtorja uporabila sistem EvolvR, ki temelji na fuziji Cas9 nikaze in modificirani error-prone DNA polimerazi. Usmerja jo ena sama usmerjevalna RNA – sgRNA. Ta sistem omogoča ciljno induciranje mutacij na določenih mestih DNA, ki jih določa sgRNA. EvolvR je izražen pod nadzorom arabinoza-inducibilnega promotorja, kar omogoča časovno regulacijo mutacijskega procesa. Eksperimentalni sistem vključuje dva glavna plazmida: prvi vsebuje EvolvR in sgRNA, drugi pa tarčne gene na plazmidih z različnimi variantami pSC101, ki omogočajo različna števila kopij v celici. Tarčni geni vključujejo okvarjen fluorescenčni protein sfGFPd, okvarjen gen za odpornost na antibiotik ampRd ter regulatorni gen lacI.

Da bi ločila vpliv števila kopij plazmidov od vpliva ekspresije genov, sta avtorja uporabila dodatne regulacijske konstrukte. Eden ključnih je incoherent feed-forward loop (IFFL), ki omogoča konstantno raven ekspresije ne glede na PCN, saj povečanje števila kopij hkrati poveča tudi represijo. Poleg tega sta uporabila negativno avtoregulacijo, kjer protein LacI regulira lastno izražanje, ter TetR represijski sistem za zmanjšanje neželenih mutacij zunaj ciljnih regij. Ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo in analizo vpliva mutacij na fenotip.

Prednost in vivo pred in vitro mutacijami je več. Prvič, mutacije so neposredno povezane s sposobnostjo gostitelja. Drugič, zagotovljeni so vzporedni tokovi mutacij zaradi nenehno replicirajoče populacije. Tretjič, omogočene so potencialno širše in daljše mutacijske poti.

Da bi raziskali, kako genski odmerek vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo, sta avtorja razvila prirejeno različico standardnega Wright-Fisherjevega modela za multiploidne populacije, saj PCN običajno presega dva. Model ima diskretne in nepreekrivajoče se generacije s konstantno velikostjo populacije N = 10⁵, verjetnost mutacije μ = 2,5 × 10⁻⁶ na nukleotid na generacijo.

Postopek v vsaki generaciji poteka v štirih korakih. V prvem koraku vsak plazmid divjega tipa mutira z verjetnostjo μ, kar modelirajo kot Poissonov proces. Nato se posodobijo števila plazmidov divjega tipa in mutiranih plazmidov. V drugem koraku se število novih plazmidov po replikaciji ustvari v skladu s Poissonovo porazdelitvijo s povprečjem, enakim povprečnemu PCN. Ta bazen se nato razdeli po binomski porazdelitvi, tako da so novi plazmidi naključno dodeljeni kot divji tip ali mutirani glede na razmerja v celici. V tretjem koraku obe hčerinski celici prejmeta približno polovico plazmidov. Hipergeometrična porazdelitev določi, kako so mutirani in nemutirani plazmidi porazdeljeni. V četrtem koraku se naključno izbere polovica populacije za naslednjo generacijo, preostanek pa se zavrže, tako da velikost populacije ostane konstantna.

==REZULTATI==

Rezultati simulacij pokažejo tri ključne trende. Prvič, delež celic, ki vsebujejo vsaj en mutiran plazmid, narašča z večjim PCN. Drugič, absolutno število mutiranih plazmidov znotraj posamezne celice prav tako narašča. Tretjič pa relativni delež mutiranih plazmidov na celico pada, saj večje število nemutiranih kopij zmanjša relativni vpliv mutacij. To pomeni, da višji PCN povečuje genetsko raznolikost na ravni populacije, hkrati pa omogoča kompenzacijo mutacij na ravni posamezne celice.

===GAIN-OF-FUNCTION MUTACIJE===

Avtorja sta eksperimentalno preverila napovedi modela s preprostim genskim vezjem, sestavljenim iz dveh plazmidov. Prvi plazmid z izvorom replikacije p15A vsebuje sistem EvolvR in sgRNA, oba izražena z arabinoza-inducibilnim PBAD promotorjem. Drugi plazmid vsebuje pSC101 varianto izvora replikacije s številom kopij (PCN) med 3 in 25 na kromosom ter vsebuje konstitutivno izražen sfGFP z okvaro. Okvara je posledica zamenjave metionina s stop kodonom, kar povzroči nefluorescentnost. Ob dodatku arabinoze se aktivira EvolvR, ki lahko popravi stop kodon in tako ponovno vzpostavi fluporescenco, kar predstavlja gain-of-function mutacijo.

Rezultati pretočne citometrije so pokazali, da manj kot 1% celic izraža visoko fluorescenco. Fenotipska mutacijska stopnja brez dodatne regulacije narašča s povečanjem PCN, saj večje število kopij pomeni več tarčnih mest za mutacije in s tem večjo mutacijsko oskrbo. Vendar pa večji PCN hkrati poveča tudi skupno koncentracijo izraženega proteina, kar moti interpretacijo rezlutatov, saj ni jasno, ali spremembe izvirajo iz mutacij ali iz povečane ekspresije.

Zato so avtorji vključili IFFL (incoherent feed-forward loop) regulacijski modul, ki omogoča konstantno izražanje tarčnega proteina ne glede na PCN. V tem primeru koncentracija sfGFP narašča s številom mutiranih plazmidov, vendar je prispevek posameznega mutiranega plazmida k skupni koloičini proteina manjši pri višjem PCN zaradi represije. Posledično se pojavita dva nasprotujoča si učinka: večje število mutiranih kopij povečuje verjetnost zaznavnega signala, hkrati pa posamezna mutacija prispeva manj funkcionalnega proteina.

Kateri učinek prevlada, je odvisno od detekcijskega praga fenotipa. Pri nizkem pragu, kot je odpornost na antibiotik, zadostuje že majhna količina funkcionalnega proteina. Zato drugi učinek ni pomemben in fenotipska mutacija monotono narašča s PCN. To so avtorji dodatno potrdili z eksperimentom z okvarjenim genom ampRd, kjer so celice po indukciji gojili na gojišču z ampicilinom – preživele so le tiste, pri katerih je mutacija obnovila funkcijo gena. Število preživelih kolonij je naraščalo s PCN, kar jasno kaže na prevladujoč vpliv povečane mutacijske oskrbe.
Pri višjem pragu, kot je fluorescenčni signal, pa mora biti količina protein dovolj veilka, da jo zaznamo. V tem primeru lahko pride do nemonotone odvisnosti, kjer mutacijska stopnja najprej narašča, nato začne padati, kar so opazili tako v simulacijah kot eksperimentih.

===LOSS-OF-FUNCTION MUTACIJE===

Pri mutacijah tipa loss-of-function, kjer mutacija uniči funkcijo gena (na primer mutacija lacI, ki povzroči izgubo represije), je trend obraten. Fenotipska mutacijska stopnja se zmanjšuje z naraščajočim PCN. Razlog je v tem, da nemutirane kopije gena še vedno proizvajajo funkcionalni protein, ki kompenzira učinek mutacije. Večje število kopij tako pomeni večjo “rezervo” funkcionalnega produkta, zaradi česar mutacija težje vpliva na fenotip. Ta pojav ustreza recesivnemu vedenju mutacij.

===MUTACIJE V KODIRAJOČI IN REGULATORNI REGIJI===

Mutacije v kodirajoči regiji pogosto povzročijo nefunkcionalne proteine, vendar so njihov učinek pogosto kompenziran z drugimi, nemutiranimi kopijami gena. Zato njihov fenotipski vpliv upada z večjim PCN. Nasprotno pa mutacije v regulatornih regijah, kot so promotorji ali vezavna mesta za regulatorje, niso kompenzirane na enak način. Ena sama mutirana kopija promotorja lahko vodi do izražanja gena ne glede na stanje drugih kopij. Zato se njihov fenotipski učinek povečuje z večjim PCN. To pomeni, da so regulatorne mutacije pogosto dominantne ali kodominantne, medtem ko so mutacije v kodirajočih regijah pogosto recesivne.

Regulatorni konstrukti igrajo ključno vlogo pri oblikovanju teh učinkov. IFFL modul omogoča stabilno ekspresijo ne glede na število kopij in s tem razkriva subtilne učinke mutacij. Negativna avtoregulacija stabilizira gensko izražanje in zmanjšuje variabilnost. TetR represijski sistem zmanjšuje neželene mutacije izven ciljnih regij in izboljšuje natančnost eksperimentov. Skupaj ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo evolucijskih lastnosti sistema.

==ZAKLJUČEK==

Na podlagi rezultatov pridemo do zaključka, da fenotipski učinek mutacij ni odvisen zgolj od narave mutacije, temveč tudi od konteksta, v katerem se mutacija pojavi. Ključna dejavnika sta število kopij gena in regulacijska arhitektura. Višji PCN poveča evolvabilnost, saj omogoča več mutacij in večjo genetsko raznolikost, vendar hkrati zmanjša vpliv posamezne mutacije zaradi kompenzacije. Gain-of-function mutacije se obnašajo dominantno in postajajo pogostejše z večjim PCN, loss-of-function mutacije so recesivne in njihov fenotipski vpliv upada, medtem ko regulatorne mutacije pogosto kažejo dominantno ali kodominantno vedenje.
Ti rezultati imajo pomembne implikacije za sintezno biologijo. Z ustrezno izbiro števila kopij plazmidov in regulacijskih mehanizmov je mogoče načrtovati sisteme, ki so bodisi evolucijsko stabilni bodisi sposobni hitrega prilagajanja. Poleg tega izbira tarčnega mesta mutacije bistveno vpliva na evolucijski izid: mutacije v regulatornih regijah imajo večjo verjetnost fenotipskega učinka kot mutacije v kodirajočih regijah. Članek tako ponuja pomemben korak proti razvoju bolj predvidljivega in racionalnega načrtovanja sintetičnih bioloških sistemov, ki upoštevajo evolucijo kot ključen dejavnik.

==VIRI==
#Li, X., & Gyorgy, A. (2025). Tuning evolvability via plasmid copy number and regulatory architecture. Nature Communications, 17(1), 1230. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67995-9

Uravnavanje evolucijskega potenciala s številom kopij plazmida in regulatorno arhitekturo

2026-05-04T19:58:16Z

Primož Šenica Pavletič: Created page with " ==UVOD== Genetski moduli v sintezni biologiji so pogosto zasnovani po analogiji z inženirskimi sistemi. Čeprav je ta pristop lahko uspešen zaradi podobnosti med fizikalnimi in biokemičnimi sistemi, zanemarja ključni dejavnik, ki vpliva na delovanje živih organizmov: evolucijo. Medtem ko so električna vezja statična in nespremenljiva, so genetski sistemi podvrženi stalnim mutacijam in evolucijskemu pritisku, kar sčasoma vodi do postopne okvare funkcije. Zato..."

==UVOD==

Genetski moduli v sintezni biologiji so pogosto zasnovani po analogiji z inženirskimi sistemi. Čeprav je ta pristop lahko uspešen zaradi podobnosti med fizikalnimi in biokemičnimi sistemi, zanemarja ključni dejavnik, ki vpliva na delovanje živih organizmov: evolucijo. Medtem ko so električna vezja statična in nespremenljiva, so genetski sistemi podvrženi stalnim mutacijam in evolucijskemu pritisku, kar sčasoma vodi do postopne okvare funkcije.

Zato je pri načrtovanju sintetičnih bioloških sistemov nujno upoštevati ravnotežćje med dvema ključnima lastnostma: evolvabilnostjo, zmožnost generiranja novih funkcij in evolucijsko stabilnostjo, ohranjanje obstoječe funkcije kljub mutacijam. Avtorja sta z združevanjem računskega modeliranja in poskusov in vivo mutageneze v bakteriji E. coli opisala, kako medsebojno delovanje genskega odmerka preko števila kopij plazmida – PCN in regulacijske arhitekture vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo.

Plazmidi kot nosilci sintetičnih vezij igrajo pomembno vlogo, saj prisotni v več kopijah v vsakem gostitelju in omogočajo hitro evolucija preko genske amplifikacije. Visok PCN poveča genetsko raznolikost znotraj celice (heterozigotnost) in omogoča učinkovitejše prilagajanje, hkrati pa olajša širjenje genov med bakterijami preko horizontalnega prenosa. To ima velik pomen za lastnosti, kot so odpornost na antibiotike in razgradnje toksičnih snovi.

== METODE: EvolvR SISTEM IN RAČUNSKI MODEL==

Za eksperimentalno preučevanje mutacij sta avtorja uporabila sistem EvolvR, ki temelji na fuziji Cas9 nikaze in modificirani error-prone DNA polimerazi. Usmerja jo ena sama usmerjevalna RNA – sgRNA. Ta sistem omogoča ciljno induciranje mutacij na določenih mestih DNA, ki jih določa sgRNA. EvolvR je izražen pod nadzorom arabinoza-inducibilnega promotorja, kar omogoča časovno regulacijo mutacijskega procesa. Eksperimentalni sistem vključuje dva glavna plazmida: prvi vsebuje EvolvR in sgRNA, drugi pa tarčne gene na plazmidih z različnimi variantami pSC101, ki omogočajo različna števila kopij v celici. Tarčni geni vključujejo okvarjen fluorescenčni protein sfGFPd, okvarjen gen za odpornost na antibiotik ampRd ter regulatorni gen lacI.

Da bi ločila vpliv števila kopij plazmidov od vpliva ekspresije genov, sta avtorja uporabila dodatne regulacijske konstrukte. Eden ključnih je incoherent feed-forward loop (IFFL), ki omogoča konstantno raven ekspresije ne glede na PCN, saj povečanje števila kopij hkrati poveča tudi represijo. Poleg tega sta uporabila negativno avtoregulacijo, kjer protein LacI regulira lastno izražanje, ter TetR represijski sistem za zmanjšanje neželenih mutacij zunaj ciljnih regij. Ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo in analizo vpliva mutacij na fenotip.

Prednost in vivo pred in vitro mutacijami je več. Prvič, mutacije so neposredno povezane s sposobnostjo gostitelja. Drugič, zagotovljeni so vzporedni tokovi mutacij zaradi nenehno replicirajoče populacije. Tretjič, omogočene so potencialno širše in daljše mutacijske poti.

Da bi raziskali, kako genski odmerek vpliva na fenotipsko mutacijsko stopnjo, sta avtorja razvila prirejeno različico standardnega Wright-Fisherjevega modela za multiploidne populacije, saj PCN običajno presega dva. Model ima diskretne in nepreekrivajoče se generacije s konstantno velikostjo populacije N = 10⁵, verjetnost mutacije μ = 2,5 × 10⁻⁶ na nukleotid na generacijo.

Postopek v vsaki generaciji poteka v štirih korakih. V prvem koraku vsak plazmid divjega tipa mutira z verjetnostjo μ, kar modelirajo kot Poissonov proces. Nato se posodobijo števila plazmidov divjega tipa in mutiranih plazmidov. V drugem koraku se število novih plazmidov po replikaciji ustvari v skladu s Poissonovo porazdelitvijo s povprečjem, enakim povprečnemu PCN. Ta bazen se nato razdeli po binomski porazdelitvi, tako da so novi plazmidi naključno dodeljeni kot divji tip ali mutirani glede na razmerja v celici. V tretjem koraku obe hčerinski celici prejmeta približno polovico plazmidov. Hipergeometrična porazdelitev določi, kako so mutirani in nemutirani plazmidi porazdeljeni. V četrtem koraku se naključno izbere polovica populacije za naslednjo generacijo, preostanek pa se zavrže, tako da velikost populacije ostane konstantna.

==REZULTATI==

Rezultati simulacij pokažejo tri ključne trende. Prvič, delež celic, ki vsebujejo vsaj en mutiran plazmid, narašča z večjim PCN. Drugič, absolutno število mutiranih plazmidov znotraj posamezne celice prav tako narašča. Tretjič pa relativni delež mutiranih plazmidov na celico pada, saj večje število nemutiranih kopij zmanjša relativni vpliv mutacij. To pomeni, da višji PCN povečuje genetsko raznolikost na ravni populacije, hkrati pa omogoča kompenzacijo mutacij na ravni posamezne celice.

===GAIN-OF-FUNCTION MUTACIJE===

Avtorja sta eksperimentalno preverila napovedi modela s preprostim genskim vezjem, sestavljenim iz dveh plazmidov. Prvi plazmid z izvorom replikacije p15A vsebuje sistem EvolvR in sgRNA, oba izražena z arabinoza-inducibilnim PBAD promotorjem. Drugi plazmid vsebuje pSC101 varianto izvora replikacije s številom kopij (PCN) med 3 in 25 na kromosom ter vsebuje konstitutivno izražen sfGFP z okvaro. Okvara je posledica zamenjave metionina s stop kodonom, kar povzroči nefluorescentnost. Ob dodatku arabinoze se aktivira EvolvR, ki lahko popravi stop kodon in tako ponovno vzpostavi fluporescenco, kar predstavlja gain-of-function mutacijo.

Rezultati pretočne citometrije so pokazali, da manj kot 1% celic izraža visoko fluorescenco. Fenotipska mutacijska stopnja brez dodatne regulacije narašča s povečanjem PCN, saj večje število kopij pomeni več tarčnih mest za mutacije in s tem večjo mutacijsko oskrbo. Vendar pa večji PCN hkrati poveča tudi skupno koncentracijo izraženega proteina, kar moti interpretacijo rezlutatov, saj ni jasno, ali spremembe izvirajo iz mutacij ali iz povečane ekspresije.

Zato so avtorji vključili IFFL (incoherent feed-forward loop) regulacijski modul, ki omogoča konstantno izražanje tarčnega proteina ne glede na PCN. V tem primeru koncentracija sfGFP narašča s številom mutiranih plazmidov, vendar je prispevek posameznega mutiranega plazmida k skupni koloičini proteina manjši pri višjem PCN zaradi represije. Posledično se pojavita dva nasprotujoča si učinka: večje število mutiranih kopij povečuje verjetnost zaznavnega signala, hkrati pa posamezna mutacija prispeva manj funkcionalnega proteina.

Kateri učinek prevlada, je odvisno od detekcijskega praga fenotipa. Pri nizkem pragu, kot je odpornost na antibiotik, zadostuje že majhna količina funkcionalnega proteina. Zato drugi učinek ni pomemben in fenotipska mutacija monotono narašča s PCN. To so avtorji dodatno potrdili z eksperimentom z okvarjenim genom ampRd, kjer so celice po indukciji gojili na gojišču z ampicilinom – preživele so le tiste, pri katerih je mutacija obnovila funkcijo gena. Število preživelih kolonij je naraščalo s PCN, kar jasno kaže na prevladujoč vpliv povečane mutacijske oskrbe.
Pri višjem pragu, kot je fluorescenčni signal, pa mora biti količina protein dovolj veilka, da jo zaznamo. V tem primeru lahko pride do nemonotone odvisnosti, kjer mutacijska stopnja najprej narašča, nato začne padati, kar so opazili tako v simulacijah kot eksperimentih.

===LOSS-OF-FUNCTION MUTACIJE===

Pri mutacijah tipa loss-of-function, kjer mutacija uniči funkcijo gena (na primer mutacija lacI, ki povzroči izgubo represije), je trend obraten. Fenotipska mutacijska stopnja se zmanjšuje z naraščajočim PCN. Razlog je v tem, da nemutirane kopije gena še vedno proizvajajo funkcionalni protein, ki kompenzira učinek mutacije. Večje število kopij tako pomeni večjo “rezervo” funkcionalnega produkta, zaradi česar mutacija težje vpliva na fenotip. Ta pojav ustreza recesivnemu vedenju mutacij.

===MUTACIJE V KODIRAJOČI IN REGULATORNI REGIJI===

Mutacije v kodirajoči regiji pogosto povzročijo nefunkcionalne proteine, vendar so njihov učinek pogosto kompenziran z drugimi, nemutiranimi kopijami gena. Zato njihov fenotipski vpliv upada z večjim PCN. Nasprotno pa mutacije v regulatornih regijah, kot so promotorji ali vezavna mesta za regulatorje, niso kompenzirane na enak način. Ena sama mutirana kopija promotorja lahko vodi do izražanja gena ne glede na stanje drugih kopij. Zato se njihov fenotipski učinek povečuje z večjim PCN. To pomeni, da so regulatorne mutacije pogosto dominantne ali kodominantne, medtem ko so mutacije v kodirajočih regijah pogosto recesivne.

Regulatorni konstrukti igrajo ključno vlogo pri oblikovanju teh učinkov. IFFL modul omogoča stabilno ekspresijo ne glede na število kopij in s tem razkriva subtilne učinke mutacij. Negativna avtoregulacija stabilizira gensko izražanje in zmanjšuje variabilnost. TetR represijski sistem zmanjšuje neželene mutacije izven ciljnih regij in izboljšuje natančnost eksperimentov. Skupaj ti konstrukti omogočajo natančno manipulacijo evolucijskih lastnosti sistema.

==ZAKLJUČEK==

Na podlagi rezultatov pridemo do zaključka, da fenotipski učinek mutacij ni odvisen zgolj od narave mutacije, temveč tudi od konteksta, v katerem se mutacija pojavi. Ključna dejavnika sta število kopij gena in regulacijska arhitektura. Višji PCN poveča evolvabilnost, saj omogoča več mutacij in večjo genetsko raznolikost, vendar hkrati zmanjša vpliv posamezne mutacije zaradi kompenzacije. Gain-of-function mutacije se obnašajo dominantno in postajajo pogostejše z večjim PCN, loss-of-function mutacije so recesivne in njihov fenotipski vpliv upada, medtem ko regulatorne mutacije pogosto kažejo dominantno ali kodominantno vedenje.
Ti rezultati imajo pomembne implikacije za sintezno biologijo. Z ustrezno izbiro števila kopij plazmidov in regulacijskih mehanizmov je mogoče načrtovati sisteme, ki so bodisi evolucijsko stabilni bodisi sposobni hitrega prilagajanja. Poleg tega izbira tarčnega mesta mutacije bistveno vpliva na evolucijski izid: mutacije v regulatornih regijah imajo večjo verjetnost fenotipskega učinka kot mutacije v kodirajočih regijah. Članek tako ponuja pomemben korak proti razvoju bolj predvidljivega in racionalnega načrtovanja sintetičnih bioloških sistemov, ki upoštevajo evolucijo kot ključen dejavnik.

Seminarji SB 2025/26

2026-05-04T19:57:55Z

Primož Šenica Pavletič:

Uravnavanje evolucijskega prilagajanja s številom kopij plazmida in regulacijsko arhitekturo

2026-05-04T19:56:56Z

Primož Šenica Pavletič: Blanked the page

Seminarji SB 2025/26

2026-05-04T19:55:56Z

Primož Šenica Pavletič: