Wiki FKKT - User contributions [en]

Določanje zvijanja RNA in nastanek RNP-kompleksov z mikroskopijo

2026-05-13T14:13:13Z

Ps27615: Created page with "=Uvod= Sekundarna in terciarna struktura RNA se formirata že med transkripcijo in nastajata skupaj s sproščanjem nascentne RNA iz RNA polimeraznega kompleksa. Struktura RNA ima esencialno vlogo pri regulaciji transkripcije, procesiranju mRNA, izrezovanju intronov, regulaciji izražanja genov. Za njihovo preučevanje se poslužujemo monomolekularnih mikroskopskih tehnik, ki nam omogočajo spremljanje formacije RNA strukture v realnem času, določanje sekundarnih motiv..."

=Uvod=
Sekundarna in terciarna struktura RNA se formirata že med transkripcijo in nastajata skupaj s sproščanjem nascentne RNA iz RNA polimeraznega kompleksa. Struktura RNA ima esencialno vlogo pri regulaciji transkripcije, procesiranju mRNA, izrezovanju intronov, regulaciji izražanja genov. Za njihovo preučevanje se poslužujemo monomolekularnih mikroskopskih tehnik, ki nam omogočajo spremljanje formacije RNA strukture v realnem času, določanje sekundarnih motivov, interakcije s proteini, časovni okvir transkripcije...
=Metode=
==smFRET==
smFRET (single-molecule Förster resonance energy transfer) je aplikacija FRET(Förster resonance energy transfer) na molekularnem nivoju za spremljanje zvijanja nascentne RNA med transkripcijo RNA iz DNA matrice. Poslužuje se pojava FRET pri katerem pride do prenosa energije med dvema različnima kromatoforama. Energija se preko interakcij dipol-dipol prenese iz donorske kromatofore, z višjo eksitacijsko frekvenco, ki je v vzbujenem stanju, na akceptorsko kromatoforo z nižjo eksitacijsko frekvenco, ki preide v vzbujeno stanje in nato izseva foton svetlobe. Učinkovitost prenosa energije upada s šesto potenco razdalje, zaradi česar je FRET močno občutljiv na spremembe v razdalji kromatoforama. Občutljivost FRET je 3 - 8 nm in se uporablja za detekcijo spremembe razdalje med dvema bližnjima molekulama in posameznima mestoma v eni molekuli.
Inkorporacija fluorokroma na željenem mestu v RNA je dosežena z iniciacijo transkripcije v odsotnosti določenega nukleotida, tako da pride do ustavitve RNA polimeraze pred željenim mestom. Ustavljen transkripcijski kompleks je nato imobiliziran na na površini z biotinilirano DNA matrico ali RNA polimerazo. Fluorokromi so inkorporirani v RNA z modificiranimi nukleotid trifosfati(NTP). Modificirani nukleotid trifosfati se dodajajo ločenih zaporednih korakih, da se prepreči inkorporacija modificiranih NTP na neželjenih mestih, kar pa je v praksi neučinkovito in omejuje analizo na mesta bližini 5’ konca nascentne RNA.
SmFRET se lahko uporablja za zaznavo motivov kot so lasnica, pseudovozel, G-četvorček, i-motiv, R-zanka in preučevanje delovanja ribo-stikal.

==SiM-KARST==
Pri SiM-KARST (single-molecule kinetic analysis of RNA transient structure) spremljamo interakcijo med fluorescenčno označenim oligonukleotidom in nascentno RNA. Dostopnost RNA za vezavo nukleotida služi kot posrednik za merjenje zvijanja RNA,kjer velja, da določena kinetika vezave oligonukleotida korelira specifični konformaciji RNA. Podobno kot smFRET se tudi SiM-KARST poslužuje FRET svetlobnega signala, namesto para modificiranih NTP, pa sta fluorescenčno označena oligonukleotid in nastajajoča RNA, prednost tega pristopa pa je da se z uporabo fluorescenčno označenega oligonukleotida izognemo neučinkoviti inkorporaciji modificiranih NTP.

==Vektorska analiza zvijanja==
Vektorska analiza zvijanja (vector folding assay)temelji na spremljanju zvijanja proste RNA z FRET, ki služi kot model zvijanja nascentne RNA. Od drugih monomolekularnih metod pa se razlikuje v tem, da ne spremlja zvijanja nascentne RNA, ampak že sintetizirane proste verige RNA, ki se prosti iz RNA:DNA hibrida, ki ga razcepi RepX helikaza.
Vektorska analiza zvijanja poteka po naslednjem postopku: RNA veriga v RNA:DNA hibridu je imobilizirana s koplementarnim oligonukleotidom, ki je z biotinom pritrjen na površino. S fluorokromom sta označena RNA veriga in oligonukleotid, ki jo imobilizira. RepX helikaza nato razcepi RNA:DNA hibrid in sproščena RNA veriga se zvije. Konforacijo RNA verige se spremlja z intenziteto svetlobnega signala FRET, ki je odvisna od razdalje med fluorokromoma.
Slabost te metode je, da se nastale konformacije pri zvijanju nastajajoče nascentne RNA lahko razlikuje od konformacije celotne proste RNA, ki nastane ob razvitju s RepX helikazo, zaradi česar lahko prihaja do razlik z nativno strukturo RNA.

==Dvojna optična past==
Pri tej metodi sta dve stekleni ali polistirenski kroglici z laserskim žarkom imobilizirani v raztopini s konstanto silo nekaj pN na medsebojni razdalji nekaj nm. Na kroglicah sta imobilizirani RNA polimeraza in komplementarni oligonukleotid, ki veže nascentno RNA. Ker sta kroglici imobilizirani s konstantno silo, so spremembe razdalje med kroglicama neposredno odvisne od sil, ki nastajajo kot posledica podaljševanja in zvijanja nascentne RNA. Z merjenjem razdalje med kroglicama v odvisnosti od časa lahko v realnem času spremljamo transkripcijo in zvijanja nascentne verige RNA.Pozitivni naklon grafa nakazuje na rast nascentne RNA, negativni naklon nakazuje hkratno rast in zvijanje nascentne RNA(do krajšanja pride ker v primeru rasti pride do podaljšanja za 1 nukleotid, v primeru zlaganja pa ob povezavi dveh nukleotidov pride do skrajšanja za 2 nukleotida), vodoraven graf pa pomeni ustavitev transkripcije.

==smPIFE==
smPIFE (single-molecule protein induced fluorescene enhancement) temelji na ojačitvi fluorescence ob vezavi proteina v neposredno bližino(0 – 3 nm) cijaninskega barvila, do katere pride zaradi spremembe okolja, prisotnosti viskozne molecule pride do stabilizacije fotoaktivne trans konformacije barvila ob vezavi proteina, kar povzroči 2 – 3x intenziteto izsevane svetlobe. SmPIFE se lahko uporablja za določanje celotnega časa transkripcije RNA z označitvijo konca DNA s fluoroforom. Lahko se kombinira tudi s smFRET, pri čemer je protein označen s fluorokromom

=Viri=
*Andrés Bustamante, Tucker J. Carrocci, David A. Nicholson, Margaret L. Rodgers, Nascent RNA Folding and RNP Assembly Revealed by Single-molecule Microscopy, Journal of Molecular Biology, Volume 438, Issue 1, 2026, 169365, ISSN 0022-2836, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2025.169365.
*Fukuda, Shingo, et al. “The Biogenesis of SRP RNA Is Modulated by an RNA Folding Intermediate Attained during Transcription.” Molecular Cell, vol. 77, no. 2, Jan. 2020, pp. 241-250.e8. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.10.006.
*Lee, Chun-Ying, and Sua Myong. “Probing Steps in DNA Transcription Using Single-Molecule Methods.” Journal of Biological Chemistry, vol. 297, no. 3, Sept. 2021, p. 101086. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.101086.
*Lisica, Ana, and Stephan W. Grill. “Optical Tweezers Studies of Transcription by Eukaryotic RNA Polymerases.” Biomolecular Concepts, vol. 8, no. 1, Mar. 2017, pp. 1–11. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1515/bmc-2016-0028.
*Hua, Boyang, et al. “Real-Time Monitoring of Single ZTP Riboswitches Reveals a Complex and Kinetically Controlled Decision Landscape.” Nature Communications, vol. 11, no. 1, Sept. 2020, p. 4531. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1038/s41467-020-18283-1.
*Wikipedia contributors. (2026, April 6). Förster resonance energy transfer. In Wikipedia, The Free Encyclopedia. Retrieved 18:34, May 1, 2026, from https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=F%C3%B6rster_resonance_energy_transfer&oldid=1347474509

Nukleoproteinski kompleksi

2026-05-08T22:00:11Z

Ps27615:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2025/26 obravnavajo področje nukleoproteinskih kompleksov, torej povezave med proteini in nukleinskimi kislinami, ki niso zgolj interakcije po principu encim-substrat ali protein-matrica. Zaradi vezave proteina pride do spremembe delovanja nukleinske kisline ali njene topologije, možni pa so tudi drugi scenariji v celici in organizmu. Predstavili bomo nastanek tovrstnih kompleksov, njihovo dinamiko in delovanje pri bakterijah in evkariontih.

Naslovi seminarskih tem so navedeni na spodnjem seznamu.

Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene tematike, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato praviloma vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1600 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200–1600 besed), ki ste jih uporabili. Če izjemoma seminar pripravita dva študenta, je obseg povzetka 1000-1200 besed, če je študent sam, pa 700-900 besed.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 20-25 minut, temu pa bo sledila razprava (5-10 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali, in vključite le malo splošnega uvoda. Če seminar predstavljata dva študenta, imata na voljo 15-20 minut, če je študent sam, pa 10-12 minut.

Seminarske predstavitve bodo potekale med 13. aprilom in 4. majem 2026. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot sredini termini namenjeni seminarjem.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. ~10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 20-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Hkrati je možno, da so izšli še novejši pregledni članki, ki naj imajo prednost pred starejšimi. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro eden za drugim, nekatere teme pa so med seboj vsebinsko povezane.

Ko boste pripravljali povzetek, naslov izbrane teme, ki ga vpišete na spodnji seznam, povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>. Primer, kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_RNA Molekularna biologija RNA].

Seznam tem in referenti:

13. april: 
* [[R-zanke in G-kvadrupleksi pri organizaciji genoma in transkripciji]] (Bine Bedjanič, Žiga Černoša)
* [[Nastanek, sestava in delovanje stresnih granul]] (Neža Uršič, Tjaša Prevodnik, Manja Kokol)
* [[Agregati RNP pri nevrodegenerativnih boleznih]] (Tina Jelaković, Petar Ničić)
* [[Virusni nukleoproteinski kompleksi in njihova funkcija]] (Maša Bratkovič, Klemen Matjašec, Lina Založnik)

15. april: 
* [[Heterogeni jedrni RNP-ji in njihova vloga v celici]] (Ema Fink Ružič, Ana Kranjc Praprotnik, Ana Debevec)
* [[Telomerazni RNP pri kvasovki]] (Tjaša Bogataj, Nika Habič, Saška Žavcer)
* [[Biogeneza in delovanje spliceosomske komponente U1]] (Tadej Vertnik, Pavel Trojer, Jakob Sedonja)

20. april: 
* [[Funkcionalna raznolikost dolgih nekodirajočih RNA: Kako lokalizacija v celici in okolje določata vlogo nekodirajočih molekul]] (Klara Logar, Inja Rampre, Anna Sitki)
* [[Funkcije protismernih zaporedij RNA]] (Anja Činkole Črček, Mia Sumina, Teja Zaletelj)
* [[Organizacija mitohondrijskega nukleoida in vloga TFAM pri tem]] (Vesna Pikelj, Zoja Peteh, Evdokija Markova)
* tema 11

22. april: 
* [[Zgradba očetovega kromatina pri sesalcih: zamenjava histonov s protamini in reprogramiranje po oploditvi]] (Kristina Grošelj, Eva Lanišek, Urška Željko)
* [[piRNA v boju za zaščito genoma]] (Žan Filipič, Timon Jeretič, Nejc Štante)
* [[Bitka za RNA-vezavne proteine med virusom in okuženo celico]] (Maruša Korbar, Bruno Žižmund, Maja Papa)

4. maj: 
* [[Signalizacija z mRNA pri rastlinah]] (Nuša Šen Bubnjevič, Ana Špan, Živa Smodiš)
* [[H-NS kot regulator transkripcije in strukture bakterijskega kromatina]] (Lara Gobec, Urša Presker, Maša Kovač)
* [[Določanje zvijanja RNA in nastanek RNP-kompleksov z mikroskopijo]] (Peter Sojer)