Wiki FKKT - User contributions [en]

DARWINS

2024-04-14T10:41:04Z

Rahela Repina:

Projekt [https://2023.igem.wiki/sjtu-software/ DARWINS] so razvili člani skupine SJTU-Software iz Šanghaja za namen sodelovanja na tekmovanju iGEM 2023. DARWINS je programska oprema za določanje idealne termične stabilnosti (Tm) proteinov v procesu njihove usmerjene evolucije. Motivacija za projektno nalogo prihaja iz želje napovedovanja Tm proteinov Ago in njihovih mutant ter usmerjene evolucije proteina KmAgo do temperaturno bolj stabilnih proteinov za njihovo uporabo pri zaznavanju nukleinskih kislin in prepoznavanje virusov [1].

Dela so se lotili v treh stopnjah:
#Izuriti model za napovedovanje termične stabilnosti in njegova prilagoditev za proteine Ago in mutantne seve.
#Razvoj spletnega mesta za napovedovanje termične stabilnosti, ki uporabnikom omogoča, da ob predložitvi aminokislinskih zaporedij prejmejo vrednosti Tm skupaj z njihovo relativno razvrstitvijo.
#Uporaba modela DARWINS za podporo usmerjeni evoluciji KmAgo in pridobitev stabilnejšega in aktivnejšega KmAgo pri različnih temperaturah [1].

==Proteini Ago in KmAgo==

Proteini Ago so ključni proteini pri z RNA posredovani posttranskripcijski regulaciji. Pri evrakriontih se povezujejo z malimi molekulami RNA in tvorijo kompleks mRISC (angl. ''RNA-induced silencing complex''). Proteini Ago imajo tako mnogo vlog v različnih bioloških procesih, kot npr. prepoznavanje in razgradnja virusne RNA, utišanje genov... Z uporabo proteinov Ago in tehnologijo interferenčne RNA lahko dosežemo usmerjeno utišanje genov, kar vodi v boljše poznavanje genskih funkcij in razvoj novih terapevtskih pristopov [1, 2].

Strukturo proteinov Ago v osnovi sestavljajo tri domene:
*PAZ: prepoznava H-vezi in strukturo stebelne zanke (angl. ''stem-loop structure'') z interakcijo z 2-3 nukleotidi na 3'-koncu molekule RNA, kar omogoča razlikovanje različnih tipov miRNA od siRNA;
*MID: običajno na N-koncu proteina ob domeni PAZ, ohranjeni aminokislinski ostanki te domene omogočajo tvorbo H-vezi in hidrofonih interakcij s specifičnimi zaporedji na 5'-koncu RNA;
*PIWI: tvori jo približno 350 aminokislinskih ostankov, njena 3D-struktura pa kaže značilnosti zvitja RNaze H, vsebuje endonukleazno aktivnost [1, 3].

KmAgo je programabilna univerzalna ribonukleaza Ago, ki izvira iz mezofilne bakterije ''Kurthia massiliensis''. Čeprav učinkovito cepi večino vrst nukleinskih kislin, termična stabilnost KmAgo ni zadovoljiva. Usmerjena evolucija termične stabilnosti KmAgo lahko znatno razširi področja njene potencialne uporabe, zlasti v industrijskih procesih, ki potekajo pri visokih temperaturah. Na področjih, kot sta proizvodnja biogoriv ali industrijska encimska kataliza, izboljšana termična stabilnost KmAgo ponuja možnost delovanja v visokotemperaturnih okoljih [1, 4].

==Usmerjena evolucija==

Usmerjena evolucija je pomembno orodje v raziskavah molekularne biologije, njena vloga pa je simuliranje evolucijskega procesa na molekularni ravni v laboratoriju, kjer lahko z naključnimi mutacijami in rekombinacijami umetno ustvarimo veliko število mutantov. Z uporabo selekcijskega pritiska je mogoče izbrati proteine z željenimi lastnostmi in simulirati evolucijo na molekularni ravni. Splošni proces usmerjene evolucije vključuje mutiranje, (vnos naključnih mutacij v gen, ki ga je treba modificirati, npr. z error-prone PCR) izražanje (prenos spremenjenega gena v gostiteljske celice za izražanje) in presejanje ali selekcijo. Slednje običajno doseženo s hitrim določanjem optičnih lastnosti, kot so motnost, barva, fluorescenca ali kemiluminiscenca. Ker so tradicionalne metode selekcije pogosto zamudne in občutljive na okoljske dejavnike, je potrebno računalniško podprto selekcioniranje. Pri sodobnih uporabah usmerjenih evolucijskih metod je postopek presejanja omejen z zapletenimi eksperimentalnimi protokoli in velikimi časovnimi vložki. Projekt DARWINS uporablja model za napovedovanje termične stabilnosti kot orodje za presejanje, kar omogoča hitrejšo in priročnejšo selekcijo [1].

==Potek izvedbe==

Projekt predstavlja jezikovni model za pridobivanje značilnosti proteinskih zaporedij v podporo nadaljnjemu napovedovanju, za kar je potrebna velika količina podatkov o proteinskih zaporedjih. Uporabljeni so bili podatki o proteinih Ago, ki jih je zagotovilo podjetje Novozymes v javnem naboru podatkov na portalu Kaggle. Za pridobivanje proteinskih zaporedij za nadaljnje naloge so bili izbrani podatki v razponu dolžine 300-800 aminokislin. Po pregledu podatkov je bilo skupno 13 917 veljavnih zaporedij, ki smo jih naključno razdelili v učno in testno množico v razmerju 8:2. V sodelovanju z raziskovalno skupino profesorja Honga Lianga so bile pridobljene vrednosti Tm za 28 zaporedij mutantnih proteinov KmAgo, ki so bila eksperimentalno preverjena in so bila uporabljena za validacijo in nadaljnje delo pri usmerjeni evoluciji proteina KmAgo [1].

Prvi uporabljeni jezikovni model je bil ESM-2, proteinski jezikovni model, ki uporablja maskirano jezikovno modeliranje (MLM) za ugotavljanje aminokislinskih odvisnosti v proteinskih zaporedjih. Značilnosti proteinskih zaporedij in aminokislinske odvisnosti, pridobljene z ESM-2, se lahko uporabijo za različne nadaljnje naloge [1].

Za optimizacijo dela postopka pridobivanja proteinskih zaporedij je bil naknadno za pridobivanje značilnosti uporabljen jezikovni model TemPL. TemPL temelji na arhitekturi jezikovnega modela BERT in uporablja ogrodje modela ESM-2. Med natančnim prilagajanjem je prejel precejšnje število oznak, povezanih s temperaturo. Zato je bilo pričakovati, da bodo značilnosti proteinskih zaporedij, pridobljene z modelom TemPL, boljše od tistih z modelom ESM-2. Dejanski rezultati so se razlikovali od pričakovanj [1].

Nadaljnje delo je potekalo z razvojem orodja za napovedovanje termične stabilnosti, ki uporabnikom omogoča vnos podatkov o zaporedjih in z uporabo pridobljenih značilnosti o zaporedju za napovedovanje temperature poda optimalno Tm. Razvoj takšnega orodja vključuje kombinacijo spletnega oblikovanja v ospredju in integracijo modelov v ozadju [1].

===DARWINS 2.0===

Zaradi nekaterih pomankljivosti modela DARWINS 1.0, je bil ustvarjen posodobljen model DARWINS 2.0, kar je vključevalo spremembo zbirke parametrov za pridobivanje elementov in privedlo do večje matrike elementov za pridobivanje proteinskih zaporedij (izpis se je povečal iz 1280 dimenzij v različici 1.0 na 2560 dimenzij). Hkrati so bili v učno množico vključeni prehodno pridobljeni podatki iz 28 mutiranih zaporedij KmAgo. Cilj spremenjenega modela je bil podrobneje in natančneje izluščiti značilnosti proteinskih zaporedij, kar bi omogočilo boljšo učinkovitost pri napovedovanju mutacij, vključno z zaporedji, kot je KmAgo [1].

Glede na to, da je prvotna podatkovna zbirka za usposabljanje večinoma vsebovala podatke o divjem tipu proteina Ago in ni imela podpore za učenje podatkov o mutacijah, bi lahko prišlo do omejitev pri napovedovanju v zaporedje usmerjene evolucije proteinov. Za odpravljanje omenjene pomanjkljivosti, so model učili z uporabo drugačnega nabora podatkov o mutacijah. Izbran je bil nabor podatkov o mutacijah, ki je bil uporabljen pri učenju sistema PremPS. Ta nabor podatkov o mutacijah je bl najprej filtriran z izborom 3092 zaporedij z dolžino med 100 in 300 kb, nato pa so nabor zaporedij razdelili v razmerju 7:3 za učenje in testiranje [1].

===DARWINS 3.0===

Zaradi znatnega vpliva divjega tipa proteina na termično stabilnost mutanta je bil model DARWINS 2.0 spremenjen in preoblikovan iz regresijskega modela v binarni klasifikacijski model DARWINS 3.0. Z drugimi besedami, vnos mutiranega zaporedja v ta model vrne rezultat, ki lahko določi, ali je toplotna stabilnost mutiranega zaporedja večja ali manjša v primerjavi z divjim tipom, kar zagotavlja kakovosten vpogled v načrtovanje usmerjene evolucije [1].

==Preverjanje in uporaba modelov==

Med razvojem sistema je ključnega pomena, da se potrdi natančnost modelov za napovedovanje termične stabilnosti. Primerjani so bili trije glavni modeli - PremPS, FoldX in dynamut2. Ti trije modeli zagotavljajo le spletne storitve napovedovanja in ne podpirajo množičnih vnosov. Zato preizkušanje njihove učinkovitosti na večji zbirki podatkov za primerjavo ni bilo izvedljivo. Poleg tega se ti trije modeli razlikujejo po tem, kako v svojih rezultatih odražajo termično stabilnost. PremPS na primer izpisuje ddG, ki odraža, v kolikšni meri je mutant bolj ali manj termodinamsko stabilen v primerjavi z divjim tipom. Nasprotno pa modela DARWINS 1.0 in DARWINS 2.0 prikazujeta neposredne vrednosti Tm. Ob upoštevanju teh razlik je bila izvedena napoved binarne klasifikacije na 28 mutiranih zaporedjih KmAgo z uporabo omenjenih treh modelov in rezultati primerjani z modelom binarne klasifikacije, DARWINS 3.0. Prav tako je bila izvedena primerjava DARWINS 3.0 in treh omenjenih modelov z uporabo podatkov 28 izvirnih zaporedij [1].

Opazimo lahko, da je model DARWINS 3.0 v nekaterih vidikih napovedovanja v splošnem primerljiv s tremi uporabljenimi modeli. Znatno se je izboljšala stopnja priklica, kar kaže, da lahko model bolje zajame mutacije, ki povzročijo povečanje termične stabilnosti proteinskih zaporedij, s čimer se zmanjša verjetnost izpada resnično pozitivnih rezultatov. Poleg tega spletna platforma omogoča nalaganje in napovedovanje več zaporedij, kar raziskovalcem zagotavlja večjo uporabnost v primerjavi s spletnimi storitvami primerjanih treh modelov [1].

Regresijska modela DARWINS 1.0 in DARWINS 2.0 sta bila uporabljena za napovedovanje vrednosti Tm proteinskih zaporedij KmAgo po enem krogu mutacij. Cilj je bil identificirati mesta mutacij in sorodna mutirana zaporedja, ki lahko povečajo vrednosti Tm, kar omogoča vpogled v nadaljnjo evolucijo, usmerjeno v termično stabilnost. Hkrati je bila izvedena tudi vizualizacija mutacijskih mest za obstoječih 28 mutiranih zaporedij KmAgo z že znanimi eksperimentalnimi podatki. Vizualizacija je bila izvedena s pomočjo toplotnih kart, kjer lahko opazujemo razlike v napovedanih vrednostih Tm za vsako mutirano vrsto. Prav tako je mogoče identificirati položaje proteinskih zaporedij, kjer je večja verjetnost, da bodo mutacije povzročile povečanje termične stabilnosti [1].

Skupina SJTU-Software se je pri svojem delu soočila z nekaterimi izzivi, med katerimi so tudi:
#Natančnost napovedi vrednosti Tm proteinov s pomočjo modela je močno odvisna od kakovosti učnega niza. Za raziskovalno tarčo KmAgo so model usposobili le za natančno napovedovanje Tm KmAgo in članov iste družine proteinov.
#Prikazovanje proteinskih zaporedij kot struktur zahteva precejšnjo porabo pomnilnika za večjo zanesljivost.
#Delovanje predhodno usposobljenih modelov z visokim številom parametrov zahteva daljši čas.
#Vrednost Tm je le eden od kazalnikov, ki odražajo stabilnost proteinov, zato je primerjava s podobno programsko opremo otežena [1].
==Literatura==
<nowiki>[1]</nowiki> DARWINS. https://2023.igem.wiki/sjtu-software/index.html (pridobljeno 14. 4. 2024).

<nowiki>[2]</nowiki> Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. ''Genes & development''. 2002, 16(21), str. 2733–2742.

<nowiki>[3]</nowiki> Wu, J., Yang, J., Cho, W. C., Zheng, Y. Argonaute proteins: Structural features, functions and emerging roles. ''Journal of advanced research''. 2020, 24, str. 317–324.

<nowiki>[4]</nowiki> Liu, Y., Li, W., Jiang, X., Wang, Y., Zhang, Z., Liu, Q., He, R., Chen, Q., Yang, J., Wang, L., Wang, F., Ma, L. A programmable omnipotent Argonaute nuclease from mesophilic bacteria Kurthia massiliensis. ''Nucleic acids research''. 2021, 49(3), str. 1597–1608.

DARWINS

2024-04-14T10:38:10Z

Rahela Repina: Created page with "Projekt [https://2023.igem.wiki/sjtu-software/ DARWINS] so razvili člani skupine SJTU-Software iz Šanghaja za namen sodelovanja na tekmovanju iGEM 2023. DARWINS je programska oprema za določanje idealne termične stabilnosti (Tm) proteinov v procesu njihove usmerjene evolucije. Motivacija za projektno nalogo prihaja iz želje napovedovanja Tm proteinov Ago in njihovih mutant ter usmerjene evolucije proteina KmAgo do temperaturno bolj stabilnih proteinov za njihovo upo..."

Projekt [https://2023.igem.wiki/sjtu-software/ DARWINS] so razvili člani skupine SJTU-Software iz Šanghaja za namen sodelovanja na tekmovanju iGEM 2023. DARWINS je programska oprema za določanje idealne termične stabilnosti (Tm) proteinov v procesu njihove usmerjene evolucije. Motivacija za projektno nalogo prihaja iz želje napovedovanja Tm proteinov Ago in njihovih mutant ter usmerjene evolucije proteina KmAgo do temperaturno bolj stabilnih proteinov za njihovo uporabo pri zaznavanju nukleinskih kislin in prepoznavanje virusov [1].

Dela so se lotili v treh stopnjah:
#Izuriti model za napovedovanje termične stabilnosti in njegova prilagoditev za proteine Ago in mutantne seve.
#Razvoj spletnega mesta za napovedovanje termične stabilnosti, ki uporabnikom omogoča, da ob predložitvi aminokislinskih zaporedij prejmejo vrednosti Tm skupaj z njihovo relativno razvrstitvijo.
#Uporaba modela DARWINS za podporo usmerjeni evoluciji KmAgo in pridobitev stabilnejšega in aktivnejšega KmAgo pri različnih temperaturah [1].

==Proteini Ago in KmAgo==

Proteini Ago so ključni proteini pri z RNA posredovani posttranskripcijski regulaciji. Pri evrakriontih se povezujejo z malimi molekulami RNA in tvorijo kompleks mRISC (angl. ''RNA-induced silencing complex''). Proteini Ago imajo tako mnogo vlog v različnih bioloških procesih, kot npr. prepoznavanje in razgradnja virusne RNA, utišanje genov... Z uporabo proteinov Ago in tehnologijo interferenčne RNA lahko dosežemo usmerjeno utišanje genov, kar vodi v boljše poznavanje genskih funkcij in razvoj novih terapevtskih pristopov [1, 2].

Strukturo proteinov Ago v osnovi sestavljajo tri domene:
*PAZ: prepoznava H-vezi in strukturo stebelne zanke (angl. ''stem-loop structure'') z interakcijo z 2-3 nukleotidi na 3'-koncu molekule RNA, kar omogoča razlikovanje različnih tipov miRNA od siRNA;
*MID: običajno na N-koncu proteina ob domeni PAZ, ohranjeni aminokislinski ostanki te domene omogočajo tvorbo H-vezi in hidrofonih interakcij s specifičnimi zaporedji na 5'-koncu RNA;
*PIWI: tvori jo približno 350 aminokislinskih ostankov, njena 3D-struktura pa kaže značilnosti zvitja RNaze H, vsebuje endonukleazno aktivnost [1, 3].

KmAgo je programabilna univerzalna ribonukleaza Ago, ki izvira iz mezofilne bakterije ''Kurthia massiliensis''. Čeprav učinkovito cepi večino vrst nukleinskih kislin, termična stabilnost KmAgo ni zadovoljiva. Usmerjena evolucija termične stabilnosti KmAgo lahko znatno razširi področja njene potencialne uporabe, zlasti v industrijskih procesih, ki potekajo pri visokih temperaturah. Na področjih, kot sta proizvodnja biogoriv ali industrijska encimska kataliza, izboljšana termična stabilnost KmAgo ponuja možnost delovanja v visokotemperaturnih okoljih [1, 4].

==Usmerjena evolucija==

Usmerjena evolucija je pomembno orodje v raziskavah molekularne biologije, njena vloga pa je simuliranje evolucijskega procesa na molekularni ravni v laboratoriju, kjer lahko z naključnimi mutacijami in rekombinacijami umetno ustvarimo veliko število mutantov. Z uporabo selekcijskega pritiska je mogoče izbrati proteine z željenimi lastnostmi in simulirati evolucijo na molekularni ravni. Splošni proces usmerjene evolucije vključuje mutiranje, (vnos naključnih mutacij v gen, ki ga je treba modificirati, npr. z error-prone PCR) izražanje (prenos spremenjenega gena v gostiteljske celice za izražanje) in presejanje ali selekcijo. Slednje običajno doseženo s hitrim določanjem optičnih lastnosti, kot so motnost, barva, fluorescenca ali kemiluminiscenca. Ker so tradicionalne metode selekcije pogosto zamudne in občutljive na okoljske dejavnike, je potrebno računalniško podprto selekcioniranje. Pri sodobnih uporabah usmerjenih evolucijskih metod je postopek presejanja omejen z zapletenimi eksperimentalnimi protokoli in velikimi časovnimi vložki. Projekt DARWINS uporablja model za napovedovanje termične stabilnosti kot orodje za presejanje, kar omogoča hitrejšo in priročnejšo selekcijo [1].

==Potek izvedbe==

Projekt predstavlja jezikovni model za pridobivanje značilnosti proteinskih zaporedij v podporo nadaljnjemu napovedovanju, za kar je potrebna velika količina podatkov o proteinskih zaporedjih. Uporabljeni so bili podatki o proteinih Ago, ki jih je zagotovilo podjetje Novozymes v javnem naboru podatkov na portalu Kaggle. Za pridobivanje proteinskih zaporedij za nadaljnje naloge so bili izbrani podatki v razponu dolžine 300-800 aminokislin. Po pregledu podatkov je bilo skupno 13 917 veljavnih zaporedij, ki smo jih naključno razdelili v učno in testno množico v razmerju 8:2. V sodelovanju z raziskovalno skupino profesorja Honga Lianga so bile pridobljene vrednosti Tm za 28 zaporedij mutantnih proteinov KmAgo, ki so bila eksperimentalno preverjena in so bila uporabljena za validacijo in nadaljnje delo pri usmerjeni evoluciji proteina KmAgo [1].

Prvi uporabljeni jezikovni model je bil ESM-2, proteinski jezikovni model, ki uporablja maskirano jezikovno modeliranje (MLM) za ugotavljanje aminokislinskih odvisnosti v proteinskih zaporedjih. Značilnosti proteinskih zaporedij in aminokislinske odvisnosti, pridobljene z ESM-2, se lahko uporabijo za različne nadaljnje naloge [1].

Za optimizacijo dela postopka pridobivanja proteinskih zaporedij je bil naknadno za pridobivanje značilnosti uporabljen jezikovni model TemPL. TemPL temelji na arhitekturi jezikovnega modela BERT in uporablja ogrodje modela ESM-2. Med natančnim prilagajanjem je prejel precejšnje število oznak, povezanih s temperaturo. Zato je bilo pričakovati, da bodo značilnosti proteinskih zaporedij, pridobljene z modelom TemPL, boljše od tistih z modelom ESM-2. Dejanski rezultati so se razlikovali od pričakovanj [1].

Nadaljnje delo je potekalo z razvojem orodja za napovedovanje termične stabilnosti, ki uporabnikom omogoča vnos podatkov o zaporedjih in z uporabo pridobljenih značilnosti o zaporedju za napovedovanje temperature poda optimalno Tm. Razvoj takšnega orodja vključuje kombinacijo spletnega oblikovanja v ospredju in integracijo modelov v ozadju [1].

===DARWINS 2.0===

Zaradi nekaterih pomankljivosti modela DARWINS 1.0, je bil ustvarjen posodobljen model DARWINS 2.0, kar je vključevalo spremembo zbirke parametrov za pridobivanje elementov in privedlo do večje matrike elementov za pridobivanje proteinskih zaporedij (izpis se je povečal iz 1280 dimenzij v različici 1.0 na 2560 dimenzij). Hkrati so bili v učno množico vključeni prehodno pridobljeni podatki iz 28 mutiranih zaporedij KmAgo. Cilj spremenjenega modela je bil podrobneje in natančneje izluščiti značilnosti proteinskih zaporedij, kar bi omogočilo boljšo učinkovitost pri napovedovanju mutacij, vključno z zaporedji, kot je KmAgo [1].

Glede na to, da je prvotna podatkovna zbirka za usposabljanje večinoma vsebovala podatke o divjem tipu proteina Ago in ni imela podpore za učenje podatkov o mutacijah, bi lahko prišlo do omejitev pri napovedovanju v zaporedje usmerjene evolucije proteinov. Za odpravljanje omenjene pomanjkljivosti, so model učili z uporabo drugačnega nabora podatkov o mutacijah. Izbran je bil nabor podatkov o mutacijah, ki je bil uporabljen pri učenju sistema PremPS. Ta nabor podatkov o mutacijah je bl najprej filtriran z izborom 3092 zaporedij z dolžino med 100 in 300 kb, nato pa so nabor zaporedij razdelili v razmerju 7:3 za učenje in testiranje [1].

===DARWINS 3.0===

Zaradi znatnega vpliva divjega tipa proteina na termično stabilnost mutanta je bil model DARWINS 2.0 spremenjen in preoblikovan iz regresijskega modela v binarni klasifikacijski model DARWINS 3.0. Z drugimi besedami, vnos mutiranega zaporedja v ta model vrne rezultat, ki lahko določi, ali je toplotna stabilnost mutiranega zaporedja večja ali manjša v primerjavi z divjim tipom, kar zagotavlja kakovosten vpogled v načrtovanje usmerjene evolucije [1].

==Preverjanje in uporaba modelov==

Med razvojem sistema je ključnega pomena, da se potrdi natančnost modelov za napovedovanje termične stabilnosti. Primerjani so bili trije glavni modeli - PremPS, FoldX in dynamut2. Ti trije modeli zagotavljajo le spletne storitve napovedovanja in ne podpirajo množičnih vnosov. Zato preizkušanje njihove učinkovitosti na večji zbirki podatkov za primerjavo ni bilo izvedljivo. Poleg tega se ti trije modeli razlikujejo po tem, kako v svojih rezultatih odražajo termično stabilnost. PremPS na primer izpisuje ddG, ki odraža, v kolikšni meri je mutant bolj ali manj termodinamsko stabilen v primerjavi z divjim tipom. Nasprotno pa modela DARWINS 1.0 in DARWINS 2.0 prikazujeta neposredne vrednosti Tm. Ob upoštevanju teh razlik je bila izvedena napoved binarne klasifikacije na 28 mutiranih zaporedjih KmAgo z uporabo omenjenih treh modelov in rezultati primerjani z modelom binarne klasifikacije, DARWINS 3.0. Prav tako je bila izvedena primerjava DARWINS 3.0 in treh omenjenih modelov z uporabo podatkov 28 izvirnih zaporedij [1].

Opazimo lahko, da je model DARWINS 3.0 v nekaterih vidikih napovedovanja v splošnem primerljiv s tremi uporabljenimi modeli. Znatno se je izboljšala stopnja priklica, kar kaže, da lahko model bolje zajame mutacije, ki povzročijo povečanje termične stabilnosti proteinskih zaporedij, s čimer se zmanjša verjetnost izpada resnično pozitivnih rezultatov. Poleg tega spletna platforma omogoča nalaganje in napovedovanje več zaporedij, kar raziskovalcem zagotavlja večjo uporabnost v primerjavi s spletnimi storitvami primerjanih treh modelov [1].

Regresijska modela DARWINS 1.0 in DARWINS 2.0 sta bila uporabljena za napovedovanje vrednosti Tm proteinskih zaporedij KmAgo po enem krogu mutacij. Cilj je bil identificirati mesta mutacij in sorodna mutirana zaporedja, ki lahko povečajo vrednosti Tm, kar omogoča vpogled v nadaljnjo evolucijo, usmerjeno v termično stabilnost. Hkrati je bila izvedena tudi vizualizacija mutacijskih mest za obstoječih 28 mutiranih zaporedij KmAgo z že znanimi eksperimentalnimi podatki. Vizualizacija je bila izvedena s pomočjo toplotnih kart, kjer lahko opazujemo razlike v napovedanih vrednostih Tm za vsako mutirano vrsto. Prav tako je mogoče identificirati položaje proteinskih zaporedij, kjer je večja verjetnost, da bodo mutacije povzročile povečanje termične stabilnosti [1].

Skupina SJTU-Software se je pri svojem delu soočila z nekaterimi izzivi, med katerimi so tudi:
#Natančnost napovedi vrednosti Tm proteinov s pomočjo modela je močno odvisna od kakovosti učnega niza. Za raziskovalno tarčo KmAgo so model usposobili le za natančno napovedovanje Tm KmAgo in članov iste družine proteinov.
#Prikazovanje proteinskih zaporedij kot struktur zahteva precejšnjo porabo pomnilnika za večjo zanesljivost.
#Delovanje predhodno usposobljenih modelov z visokim številom parametrov zahteva daljši čas.
#Vrednost Tm je le eden od kazalnikov, ki odražajo stabilnost proteinov, zato je primerjava s podobno programsko opremo otežena [1].

<nowiki>[1]</nowiki> DARWINS. https://2023.igem.wiki/sjtu-software/index.html (pridobljeno 14. 4. 2024).

<nowiki>[2]</nowiki> Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. ''Genes & development''. 2002, 16(21), str. 2733–2742.

<nowiki>[3]</nowiki> Wu, J., Yang, J., Cho, W. C., Zheng, Y. Argonaute proteins: Structural features, functions and emerging roles. ''Journal of advanced research''. 2020, 24, str. 317–324.

<nowiki>[4]</nowiki> Liu, Y., Li, W., Jiang, X., Wang, Y., Zhang, Z., Liu, Q., He, R., Chen, Q., Yang, J., Wang, L., Wang, F., Ma, L. A programmable omnipotent Argonaute nuclease from mesophilic bacteria Kurthia massiliensis. ''Nucleic acids research''. 2021, 49(3), str. 1597–1608.

Seminarji SB 2023/24

2024-04-14T10:16:25Z

Rahela Repina:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila

2021-05-17T12:46:39Z

Rahela Repina: /* Antifusogene učinkovine proti SARS-CoV */

== Uvod ==
Protein S je najpomembnejša tarča zdravil in cepiv proti koronavirusom. Na njem najdemo dve pomembnejši tarči za zdravila, in sicer regijo, ki se veže na receptor in regijo, ki je odgovorna za zlitje z membrano. Regija proteina S, ki je odgovorna za vezavo na receptor, je zelo slabo ohranjena med različnimi koronavirusi in zato ni najbolj primerna tarča za zdravila, ki imajo širok spekter delovanja na več koronavirusov. Medtem pa je regija, ki je odgovorna za zlitje z membrano, med najbolj ohranjenimi regijami koronavirusov, in tako primerna tarča za zdravila, ki imajo širši spekter delovanja na več koronavirusov. V nadaljevanju se bomo osredotočili na razvoj antifusogenih zdravil in njihovih proteinskih tarč.

== Proteolitska aktivacija koronavirusov ==

Koronavirusi lahko v celico vstopijo na dva načina, kadar so prisotne membranske proteaze virus lahko vstopi, tako da se zlije s celično membrano, v kolikor membranske proteaze niso prisotne virus vstopi s pomočjo endocitoze in se šele v notranjosti celice zlije z endocitotsko membrano.
Za zlitje koronavirusa s celično membrano je potrebna prisotnost različnih proteaz, ki cepijo protein S in tako omogočijo vstop virusa v celico. In-vivo študije so pokazale, da se ob prisotnosti eksogenih proteaz, kot so tripsin, termolizin in elastaze, infektivnost SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 poveča. Ugotovitev, da elastaza poveča infektivnost, bi lahko imela klinični pomen, saj elastazo med okužbo s SARS-CoV proizvajajo vnetne celice v pljučih, kar bi lahko spodbudilo okužbo pljučnih celic z virusom.
V fizioloških pogojih imajo pomembnejšo vlogo transmembranske proteaze, saj mora cepitev na koronavirusu poteči šele potem, ko se virus veže na receptor, kar pri eksogenih proteazah težje kontroliramo kot pri transmembranskih. Pri vstopu koronavirusa v celico sodelujejo predvsem transmembranske serinske proteaze tipa II. Inhibitorji transmembranskih proteaz bi lahko bili potencialno zdravilo, ki bi zmanjšalo infekcijo celic z virusom, saj se ta ne bi mogel zliti z membrano.

Če ustrezne proteaze niso prisotne lahko virus v celico vstopi s pomočjo endocitoze, ki je lahko odvisna ali neodvisna od klatrina. Pri MERS-CoV pa pride do vstopa z endocitozo, tudi kadar ta ni bil cepljen na mestih S1/S2 med samo biosintezo ne glede na prisotnost proteaz. Za takšen način vstopa koronavirusa v celico je potreben nizek pH, ki aktivira katepsina B in L, ki proteolitsko aktivirata virus, da se ta lahko zlije z membrano endosoma in njegov virion vstopi v citosol. Študije so pokazale, da inhibitorji katepsinov pri okužbah s SARS-CoV in MERS-CoV zmanjšajo njihovo zmožnost vstopa v celico.

Torej SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 lahko v celico vstopijo na dva načina. V kolikor so na celični membrani prisotne TMPRS22 proteaze pride do fuzije virusa s celično membrano, v primeru MERS-CoV je zato potrebna tudi predhodna cepitev na mestih S1/S2. Če ti pogoji niso izpolnjeni, bo virus v celico vstopil z endocitozo, in se ob znižanju pH ter posledični aktivaciji katepsinov zlil z membrano citosola in tako vstopil v citosol.
Neposredna fuzija koronavirusa s celično membrano pa je tudi ugodnejši način vstopa za virusa, saj se njegov dedni material zlije direktno v citosol. Tak način vstopa v celico pa je tudi klinično pomembnejši.

== Membranska fuzija ==

Fuzija membran je termodinamsko gledano ugoden proces, vendar je prvi korak približevanja membran energijsko zelo zahteven Vloga virusnih fuzijskih proteinov je kataliza in prispevanje energije za reakcijo približevanja.
Koronavirusni fuzijski proteini sodijo v prvi razred fuzijskih proteinov, kamor jih uvrščamo zaradi strukture, potrebe po aktivaciji s proteolitično cepitvijo ter delovanja s heptadnimi ponovitvami (HR1/2). Med delovanjem proteinov prvega razreda preidejo proteini čez več oblik: predfuzijska nativna oblika, predfuzijska metastabilna oblika, predlasnična oblika in postfuzijska stabilna oblika. Po sintezi se protein S nahaja v predfuzijski nativni obliki, v matestabilno obliko pa preide ob cepitvi na mestu S1/S2. S prehodom iz metastabilnega v predlasnično obliko protein premaga kinetično bariero. Energijo za ta dogodek dobi protein preko interakcije s sprožilcem iz okolja, pri koronavirusih so ta sprožilec proteaze. Interakcija s sprožilcem povzroči ireverzibilne konformacijske spremembe proteina, ki mu omogočijo vstavitev fuzijskega peptida (FP) v tarčno membrano. Vstavitvi FP sledi sestavljanje HR1 v trimer nato pa se nanj vežejo še trije peptidi HR2, kar tvori t.i. fuzijsko jedro. Konformacijske spremembe tega kompleksa povlečejo obe membrani bližje skupaj, tako da se lahko fuzija začne, fuzijski protein pa preide v postfuzijsko stabilno obliko.
Sama fuzija je sestavljena iz dveh korakov: prvo nastane hemifuzijska tvorba in nato pora. Hemifuzijska tvorba je stanje, kjer sta se zlili le zunanji membrani, notranji membrani pa sta še ločeni, tako da citosol in notranjost virusa še nista povezana. Hemifuzijsko stanje lahko razpade nazaj na virus in celico, ali pa se zlijeta še notranji membrani in dobimo poro, ki se lahko še razširi.

=== Vloga holesterola pri fuziji ===

Za fuzijo so najbolj dovzetni lipidni splavi, saj se na njih klasično nahaja veliko proteinov in receptorjev, ki lajšajo fuzijo membran. Raziskave na različnih virusih kažejo, da je holesterol zelo pomemben za uspešnost fuzije virusa s tarčo. Poleg vloge pri vzpostavitvi tarč (lipidnih splavov),holesterol fuzijo membran olajšuje tudi mehanistično, saj znižuje potrebno energijo za nastanek fuzijskih intermediatov. Razumevanje vpliva holesterola na delovanje koronavirusov je dokaj omejeno, največ raziskav pa je bilo narejenih na SARS-CoV. Vsi razlogi niso bili natančno določeni, ugotovili pa so, da je holesterol definitivno pomemben za uspešnost fuzije tudi pri koronavirusih. Virus je bil namreč pri celicah, tretiranih z metil-β-ciklodekstrinom, spojino, ki zmanjša koncentracijo holesterola, 60-90 % manj uspešen. V prihodnosti nameravajo enak poskus izvesti še z SARS-CoV-2 in MERS-CoV, vendar pa bo treba pri MERS-CoV predhodno ugotoviti, ali se njegov tarčni receptor sploh nahaja v lipidnih splavih.

=== Vloga kalcija pri fuziji ===

Poleg pH in prisotnosti različnih proteaz se je za veliko virusov kot zelo pomembna izkazala tudi koncentracija Ca2+ ionov, ki je ne morejo nadomestiti primerljive koncentracije drugih 2+ ionov. S poskusi na SARS-CoV in MERS-Cov so najprej ugotovili, da je Ca2+ pomemben za uspešnost fuzije, z biofizikalnimi metodami pa še kakšna je interakcija Ca2+ pri fuziji. Ca2+ ioni stabilizirajo FP in pomagajo pri za fuzijo ugodnem urejanju membrane. Obstajajo pa večje razlike med interakcijami pri MERS-CoV in SARS-CoV. Ca2+ je namreč bolj pomemben za SARS-CoV, saj je odsotnost kalcija v primerjavi z MERS-CoV bolj prizadela SARS-CoV infektivnost, kar bi bila lahko posledica tega, da SARS-CoV-FP veže dva Ca2+ iona, enega na FP1 in drugega na FP2, MERS-CoV-FP pa ima le eno vezavno mesto na FP1.

== Antifusogene učinkovine proti SARS-CoV ==

V procesu fuzije virusne membrane z gostiteljsko membrano imata pomembno vlogo peptida HR1 in HR2, ki sodelujeta pri formaciji pore med virusno in gostiteljsko membrano. Zaradi tega sta ta peptida pomembni tarči antifusogenih antiviretikov.
Prva odkrita in potrjena za uporabo kot zdravilna učinkovina (ZU) z antifusogenim učinkom je bila enfuvirtid (uporabljana kot zdravilo proti HIV). Ta zdravilna učinkovina je HR2 peptid (prvotno z imenom DP-178), ki se kompetitivno veže na HR1 peptid in tako prepreči njegovo povezavo s HR2 in zavre fuzijo membran. Nadaljnje raziskave so pokazale, da so HR2 zelo specifični za HR2 vezavno zaporedje na HR1 peptidu in tako tudi specifični za posamezni virus – enfuvirtid je uporaben le proti virusu HIV-1, ne pa tudi proti HIV-2.

Poravnava zaporedij HR1 in HR2 regij med SARS-CoV in SARS-CoV-2 pokaže 92,6 % in 100 % homolognost iz česar lahko sklepamo, da bo uporaba SARS-CoV HR2 peptidov učinkovita tudi v primeru SARS-CoV-2. Podobno velja za MERS-CoV, ki pa nima visoke stopnje homolognosti in tako peptidi proti SARS-CoV v tem primeru niso uporabni. Več dejavnikov vpliva na učinkovitost in uporabnost teh peptidov:

· Razlike v aminokislinskih (AK) ostankih na vezavnem mestu HR1 za peptid: MERS-CoV s peptidom tvori več vodikovih vezi kot SARS-CoV in ima tako večjo afiniteto vezave.

· Prevladujoč način infekcije gostiteljskih celic: za MERS-CoV je prevladujoč način skozi plazemsko membrano, za SARS-CoV je bolj značilna endosomalna pot. Peptidi so bolj na voljo v ekstracelularnem prostoru in tako lažje dostopajo do svojih tarč v primeru, ko virus prehaja v celico skozi plazemsko membrano in ne endosomalno. Podoben vpliv ima obdelava SARS-CoV s tripsinom, ki povzroči, da virus spremeni svoj način vstopa v celice.

· Mutacije določenih AK ostankov: dodatek negativno in pozitivno nabitih ostankov (kot sta glutamat in lizin) vodi do nastanka solnih mostičkov in izboljšanje stabilnosti, topnosti in antivirusne aktivnosti peptida. Prav tako se zniža IC50.

· Konjugacija na monoklonsko protitelo, ki povečuje specifičnost vezave peptida z vezavnim mestom na virusu;

· Konjugacija s palmitatom: CoV receptorji se delijo v lipidno-bogate domene, kjer pride do vstopa CoV, palmitat povzroča delitev v lipidne splave in tako usmerja peptide proti lipidno-bogatim domenam.

Odkrite so bile tudi tarče za antifusogene peptide izven HR področij. Te tarče se nahajajo v okolici delitvenih mest S1/S2 in S2' in preprečujejo konformacijske spremembe potrebne za fuzijo.
Pomemben del raziskovanja novih ZU je tudi na področju že odobrenih učinkovin, ki pa še nimajo določene uporabnosti za zdravljenje okužbe s SARS-CoV-2 (t.i. 'repurposing'). Ena izmed teh ZU je imatinib, prvotno uporabljena pri zdravljenju kronične mieloične levkemije, nato pa tudi proti Ebola virusu, coxsackie virusu in vakcinija virusu. Predvidevajo, da imatinib preprečuje ključne prerazporeditve citoskeleta v virusu, ki sodelujejo pri fuziji.

== Viri in literatura ==

· Članek

· H. P. Rang, J. M. Ritter, R. J. Flower, G. Henderson: Rang and Dale's Pharmacology. Eighth edition. Elsevier Churchill Livingstone 2016, pp. 642-651, 676-691.

· Harrison SC. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 2008;15:690–698.

Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila

2021-05-17T12:43:52Z

Rahela Repina: /* Antifusogene učinkovine proti SARS-CoV */

== Uvod ==
Protein S je najpomembnejša tarča zdravil in cepiv proti koronavirusom. Na njem najdemo dve pomembnejši tarči za zdravila, in sicer regijo, ki se veže na receptor in regijo, ki je odgovorna za zlitje z membrano. Regija proteina S, ki je odgovorna za vezavo na receptor, je zelo slabo ohranjena med različnimi koronavirusi in zato ni najbolj primerna tarča za zdravila, ki imajo širok spekter delovanja na več koronavirusov. Medtem pa je regija, ki je odgovorna za zlitje z membrano, med najbolj ohranjenimi regijami koronavirusov, in tako primerna tarča za zdravila, ki imajo širši spekter delovanja na več koronavirusov. V nadaljevanju se bomo osredotočili na razvoj antifusogenih zdravil in njihovih proteinskih tarč.

== Proteolitska aktivacija koronavirusov ==

Koronavirusi lahko v celico vstopijo na dva načina, kadar so prisotne membranske proteaze virus lahko vstopi, tako da se zlije s celično membrano, v kolikor membranske proteaze niso prisotne virus vstopi s pomočjo endocitoze in se šele v notranjosti celice zlije z endocitotsko membrano.
Za zlitje koronavirusa s celično membrano je potrebna prisotnost različnih proteaz, ki cepijo protein S in tako omogočijo vstop virusa v celico. In-vivo študije so pokazale, da se ob prisotnosti eksogenih proteaz, kot so tripsin, termolizin in elastaze, infektivnost SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 poveča. Ugotovitev, da elastaza poveča infektivnost, bi lahko imela klinični pomen, saj elastazo med okužbo s SARS-CoV proizvajajo vnetne celice v pljučih, kar bi lahko spodbudilo okužbo pljučnih celic z virusom.
V fizioloških pogojih imajo pomembnejšo vlogo transmembranske proteaze, saj mora cepitev na koronavirusu poteči šele potem, ko se virus veže na receptor, kar pri eksogenih proteazah težje kontroliramo kot pri transmembranskih. Pri vstopu koronavirusa v celico sodelujejo predvsem transmembranske serinske proteaze tipa II. Inhibitorji transmembranskih proteaz bi lahko bili potencialno zdravilo, ki bi zmanjšalo infekcijo celic z virusom, saj se ta ne bi mogel zliti z membrano.

Če ustrezne proteaze niso prisotne lahko virus v celico vstopi s pomočjo endocitoze, ki je lahko odvisna ali neodvisna od klatrina. Pri MERS-CoV pa pride do vstopa z endocitozo, tudi kadar ta ni bil cepljen na mestih S1/S2 med samo biosintezo ne glede na prisotnost proteaz. Za takšen način vstopa koronavirusa v celico je potreben nizek pH, ki aktivira katepsina B in L, ki proteolitsko aktivirata virus, da se ta lahko zlije z membrano endosoma in njegov virion vstopi v citosol. Študije so pokazale, da inhibitorji katepsinov pri okužbah s SARS-CoV in MERS-CoV zmanjšajo njihovo zmožnost vstopa v celico.

Torej SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 lahko v celico vstopijo na dva načina. V kolikor so na celični membrani prisotne TMPRS22 proteaze pride do fuzije virusa s celično membrano, v primeru MERS-CoV je zato potrebna tudi predhodna cepitev na mestih S1/S2. Če ti pogoji niso izpolnjeni, bo virus v celico vstopil z endocitozo, in se ob znižanju pH ter posledični aktivaciji katepsinov zlil z membrano citosola in tako vstopil v citosol.
Neposredna fuzija koronavirusa s celično membrano pa je tudi ugodnejši način vstopa za virusa, saj se njegov dedni material zlije direktno v citosol. Tak način vstopa v celico pa je tudi klinično pomembnejši.

== Membranska fuzija ==

Fuzija membran je termodinamsko gledano ugoden proces, vendar je prvi korak približevanja membran energijsko zelo zahteven Vloga virusnih fuzijskih proteinov je kataliza in prispevanje energije za reakcijo približevanja.
Koronavirusni fuzijski proteini sodijo v prvi razred fuzijskih proteinov, kamor jih uvrščamo zaradi strukture, potrebe po aktivaciji s proteolitično cepitvijo ter delovanja s heptadnimi ponovitvami (HR1/2). Med delovanjem proteinov prvega razreda preidejo proteini čez več oblik: predfuzijska nativna oblika, predfuzijska metastabilna oblika, predlasnična oblika in postfuzijska stabilna oblika. Po sintezi se protein S nahaja v predfuzijski nativni obliki, v matestabilno obliko pa preide ob cepitvi na mestu S1/S2. S prehodom iz metastabilnega v predlasnično obliko protein premaga kinetično bariero. Energijo za ta dogodek dobi protein preko interakcije s sprožilcem iz okolja, pri koronavirusih so ta sprožilec proteaze. Interakcija s sprožilcem povzroči ireverzibilne konformacijske spremembe proteina, ki mu omogočijo vstavitev fuzijskega peptida (FP) v tarčno membrano. Vstavitvi FP sledi sestavljanje HR1 v trimer nato pa se nanj vežejo še trije peptidi HR2, kar tvori t.i. fuzijsko jedro. Konformacijske spremembe tega kompleksa povlečejo obe membrani bližje skupaj, tako da se lahko fuzija začne, fuzijski protein pa preide v postfuzijsko stabilno obliko.
Sama fuzija je sestavljena iz dveh korakov: prvo nastane hemifuzijska tvorba in nato pora. Hemifuzijska tvorba je stanje, kjer sta se zlili le zunanji membrani, notranji membrani pa sta še ločeni, tako da citosol in notranjost virusa še nista povezana. Hemifuzijsko stanje lahko razpade nazaj na virus in celico, ali pa se zlijeta še notranji membrani in dobimo poro, ki se lahko še razširi.

=== Vloga holesterola pri fuziji ===

Za fuzijo so najbolj dovzetni lipidni splavi, saj se na njih klasično nahaja veliko proteinov in receptorjev, ki lajšajo fuzijo membran. Raziskave na različnih virusih kažejo, da je holesterol zelo pomemben za uspešnost fuzije virusa s tarčo. Poleg vloge pri vzpostavitvi tarč (lipidnih splavov),holesterol fuzijo membran olajšuje tudi mehanistično, saj znižuje potrebno energijo za nastanek fuzijskih intermediatov. Razumevanje vpliva holesterola na delovanje koronavirusov je dokaj omejeno, največ raziskav pa je bilo narejenih na SARS-CoV. Vsi razlogi niso bili natančno določeni, ugotovili pa so, da je holesterol definitivno pomemben za uspešnost fuzije tudi pri koronavirusih. Virus je bil namreč pri celicah, tretiranih z metil-β-ciklodekstrinom, spojino, ki zmanjša koncentracijo holesterola, 60-90 % manj uspešen. V prihodnosti nameravajo enak poskus izvesti še z SARS-CoV-2 in MERS-CoV, vendar pa bo treba pri MERS-CoV predhodno ugotoviti, ali se njegov tarčni receptor sploh nahaja v lipidnih splavih.

=== Vloga kalcija pri fuziji ===

Poleg pH in prisotnosti različnih proteaz se je za veliko virusov kot zelo pomembna izkazala tudi koncentracija Ca2+ ionov, ki je ne morejo nadomestiti primerljive koncentracije drugih 2+ ionov. S poskusi na SARS-CoV in MERS-Cov so najprej ugotovili, da je Ca2+ pomemben za uspešnost fuzije, z biofizikalnimi metodami pa še kakšna je interakcija Ca2+ pri fuziji. Ca2+ ioni stabilizirajo FP in pomagajo pri za fuzijo ugodnem urejanju membrane. Obstajajo pa večje razlike med interakcijami pri MERS-CoV in SARS-CoV. Ca2+ je namreč bolj pomemben za SARS-CoV, saj je odsotnost kalcija v primerjavi z MERS-CoV bolj prizadela SARS-CoV infektivnost, kar bi bila lahko posledica tega, da SARS-CoV-FP veže dva Ca2+ iona, enega na FP1 in drugega na FP2, MERS-CoV-FP pa ima le eno vezavno mesto na FP1.

== Antifusogene učinkovine proti SARS-CoV ==

V procesu fuzije virusne membrane z gostiteljsko membrano imata pomembno vlogo peptida HR1 in HR2, ki sodelujeta pri formaciji pore med virusno in gostiteljsko membrano. Zaradi tega sta ta peptida pomembni tarči antifusogenih antiviretikov.
Prva odkrita in potrjena za uporabo kot zdravilna učinkovina (ZU) z antifusogenim učinkom je bila enfuvirtid (uporabljana kot zdravilo proti HIV). Ta zdravilna učinkovina je HR2 peptid (prvotno z imenom DP-178), ki se kompetitivno veže na HR1 peptid in tako prepreči njegovo povezavo s HR2 in zavre fuzijo membran. Nadaljnje raziskave so pokazale, da so HR2 zelo specifični za HR2 vezavno zaporedje na HR1 peptidu in tako tudi specifični za posamezni virus – enfuvirtid je uporaben le proti virusu HIV-1, ne pa tudi proti HIV-2.

Poravnava zaporedij HR1 in HR2 regij med SARS-CoV in SARS-CoV-2 pokaže 92,6 % in 100 % homolognost iz česar lahko sklepamo, da bo uporaba SARS-CoV HR2 peptidov učinkovita tudi v primeru SARS-CoV-2. Podobno velja za MERS-CoV, ki pa nima visoke stopnje homolognosti in tako peptidi proti SARS-CoV v tem primeru niso uporabni. Več dejavnikov vpliva na učinkovitost in uporabnost teh peptidov:
· Razlike v aminokislinskih (AK) ostankih na vezavnem mestu HR1 za peptid: MERS-CoV s peptidom tvori več vodikovih vezi kot SARS-CoV in ima tako večjo afiniteto vezave.
· Prevladujoč način infekcije gostiteljskih celic: za MERS-CoV je prevladujoč način skozi plazemsko membrano, za SARS-CoV je bolj značilna endosomalna pot. Peptidi so bolj na voljo v ekstracelularnem prostoru in tako lažje dostopajo do svojih tarč v primeru, ko virus prehaja v celico skozi plazemsko membrano in ne endosomalno. Podoben vpliv ima obdelava SARS-CoV s tripsinom, ki povzroči, da virus spremeni svoj način vstopa v celice.
· Mutacije določenih AK ostankov: dodatek negativno in pozitivno nabitih ostankov (kot sta glutamat in lizin) vodi do nastanka solnih mostičkov in izboljšanje stabilnosti, topnosti in antivirusne aktivnosti peptida. Prav tako se zniža IC50.
· Konjugacija na monoklonsko protitelo, ki povečuje specifičnost vezave peptida z vezavnim mestom na virusu;
· Konjugacija s palmitatom: CoV receptorji se delijo v lipidno-bogate domene, kjer pride do vstopa CoV, palmitat povzroča delitev v lipidne splave in tako usmerja peptide proti lipidno-bogatim domenam.

Odkrite so bile tudi tarče za antifusogene peptide izven HR področij. Te tarče se nahajajo v okolici delitvenih mest S1/S2 in S2' in preprečujejo konformacijske spremembe potrebne za fuzijo.
Pomemben del raziskovanja novih ZU je tudi na področju že odobrenih učinkovin, ki pa še nimajo določene uporabnosti za zdravljenje okužbe s SARS-CoV-2 (t.i. 'repurposing'). Ena izmed teh ZU je imatinib, prvotno uporabljena pri zdravljenju kronične mieloične levkemije, nato pa tudi proti Ebola virusu, coxsackie virusu in vakcinija virusu. Predvidevajo, da imatinib preprečuje ključne prerazporeditve citoskeleta v virusu, ki sodelujejo pri fuziji.

== Viri in literatura ==

· Članek

· H. P. Rang, J. M. Ritter, R. J. Flower, G. Henderson: Rang and Dale's Pharmacology. Eighth edition. Elsevier Churchill Livingstone 2016, pp. 642-651, 676-691.

· Harrison SC. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 2008;15:690–698.

Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila

2021-05-17T12:40:26Z

Rahela Repina: /* Viri: */

== Uvod ==
Protein S je najpomembnejša tarča zdravil in cepiv proti koronavirusom. Na njem najdemo dve pomembnejši tarči za zdravila, in sicer regijo, ki se veže na receptor in regijo, ki je odgovorna za zlitje z membrano. Regija proteina S, ki je odgovorna za vezavo na receptor, je zelo slabo ohranjena med različnimi koronavirusi in zato ni najbolj primerna tarča za zdravila, ki imajo širok spekter delovanja na več koronavirusov. Medtem pa je regija, ki je odgovorna za zlitje z membrano, med najbolj ohranjenimi regijami koronavirusov, in tako primerna tarča za zdravila, ki imajo širši spekter delovanja na več koronavirusov. V nadaljevanju se bomo osredotočili na razvoj antifusogenih zdravil in njihovih proteinskih tarč.

== Proteolitska aktivacija koronavirusov ==

Koronavirusi lahko v celico vstopijo na dva načina, kadar so prisotne membranske proteaze virus lahko vstopi, tako da se zlije s celično membrano, v kolikor membranske proteaze niso prisotne virus vstopi s pomočjo endocitoze in se šele v notranjosti celice zlije z endocitotsko membrano.
Za zlitje koronavirusa s celično membrano je potrebna prisotnost različnih proteaz, ki cepijo protein S in tako omogočijo vstop virusa v celico. In-vivo študije so pokazale, da se ob prisotnosti eksogenih proteaz, kot so tripsin, termolizin in elastaze, infektivnost SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 poveča. Ugotovitev, da elastaza poveča infektivnost, bi lahko imela klinični pomen, saj elastazo med okužbo s SARS-CoV proizvajajo vnetne celice v pljučih, kar bi lahko spodbudilo okužbo pljučnih celic z virusom.
V fizioloških pogojih imajo pomembnejšo vlogo transmembranske proteaze, saj mora cepitev na koronavirusu poteči šele potem, ko se virus veže na receptor, kar pri eksogenih proteazah težje kontroliramo kot pri transmembranskih. Pri vstopu koronavirusa v celico sodelujejo predvsem transmembranske serinske proteaze tipa II. Inhibitorji transmembranskih proteaz bi lahko bili potencialno zdravilo, ki bi zmanjšalo infekcijo celic z virusom, saj se ta ne bi mogel zliti z membrano.

Če ustrezne proteaze niso prisotne lahko virus v celico vstopi s pomočjo endocitoze, ki je lahko odvisna ali neodvisna od klatrina. Pri MERS-CoV pa pride do vstopa z endocitozo, tudi kadar ta ni bil cepljen na mestih S1/S2 med samo biosintezo ne glede na prisotnost proteaz. Za takšen način vstopa koronavirusa v celico je potreben nizek pH, ki aktivira katepsina B in L, ki proteolitsko aktivirata virus, da se ta lahko zlije z membrano endosoma in njegov virion vstopi v citosol. Študije so pokazale, da inhibitorji katepsinov pri okužbah s SARS-CoV in MERS-CoV zmanjšajo njihovo zmožnost vstopa v celico.

Torej SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 lahko v celico vstopijo na dva načina. V kolikor so na celični membrani prisotne TMPRS22 proteaze pride do fuzije virusa s celično membrano, v primeru MERS-CoV je zato potrebna tudi predhodna cepitev na mestih S1/S2. Če ti pogoji niso izpolnjeni, bo virus v celico vstopil z endocitozo, in se ob znižanju pH ter posledični aktivaciji katepsinov zlil z membrano citosola in tako vstopil v citosol.
Neposredna fuzija koronavirusa s celično membrano pa je tudi ugodnejši način vstopa za virusa, saj se njegov dedni material zlije direktno v citosol. Tak način vstopa v celico pa je tudi klinično pomembnejši.

== Membranska fuzija ==

Fuzija membran je termodinamsko gledano ugoden proces, vendar je prvi korak približevanja membran energijsko zelo zahteven Vloga virusnih fuzijskih proteinov je kataliza in prispevanje energije za reakcijo približevanja.
Koronavirusni fuzijski proteini sodijo v prvi razred fuzijskih proteinov, kamor jih uvrščamo zaradi strukture, potrebe po aktivaciji s proteolitično cepitvijo ter delovanja s heptadnimi ponovitvami (HR1/2). Med delovanjem proteinov prvega razreda preidejo proteini čez več oblik: predfuzijska nativna oblika, predfuzijska metastabilna oblika, predlasnična oblika in postfuzijska stabilna oblika. Po sintezi se protein S nahaja v predfuzijski nativni obliki, v matestabilno obliko pa preide ob cepitvi na mestu S1/S2. S prehodom iz metastabilnega v predlasnično obliko protein premaga kinetično bariero. Energijo za ta dogodek dobi protein preko interakcije s sprožilcem iz okolja, pri koronavirusih so ta sprožilec proteaze. Interakcija s sprožilcem povzroči ireverzibilne konformacijske spremembe proteina, ki mu omogočijo vstavitev fuzijskega peptida (FP) v tarčno membrano. Vstavitvi FP sledi sestavljanje HR1 v trimer nato pa se nanj vežejo še trije peptidi HR2, kar tvori t.i. fuzijsko jedro. Konformacijske spremembe tega kompleksa povlečejo obe membrani bližje skupaj, tako da se lahko fuzija začne, fuzijski protein pa preide v postfuzijsko stabilno obliko.
Sama fuzija je sestavljena iz dveh korakov: prvo nastane hemifuzijska tvorba in nato pora. Hemifuzijska tvorba je stanje, kjer sta se zlili le zunanji membrani, notranji membrani pa sta še ločeni, tako da citosol in notranjost virusa še nista povezana. Hemifuzijsko stanje lahko razpade nazaj na virus in celico, ali pa se zlijeta še notranji membrani in dobimo poro, ki se lahko še razširi.

=== Vloga holesterola pri fuziji ===

Za fuzijo so najbolj dovzetni lipidni splavi, saj se na njih klasično nahaja veliko proteinov in receptorjev, ki lajšajo fuzijo membran. Raziskave na različnih virusih kažejo, da je holesterol zelo pomemben za uspešnost fuzije virusa s tarčo. Poleg vloge pri vzpostavitvi tarč (lipidnih splavov),holesterol fuzijo membran olajšuje tudi mehanistično, saj znižuje potrebno energijo za nastanek fuzijskih intermediatov. Razumevanje vpliva holesterola na delovanje koronavirusov je dokaj omejeno, največ raziskav pa je bilo narejenih na SARS-CoV. Vsi razlogi niso bili natančno določeni, ugotovili pa so, da je holesterol definitivno pomemben za uspešnost fuzije tudi pri koronavirusih. Virus je bil namreč pri celicah, tretiranih z metil-β-ciklodekstrinom, spojino, ki zmanjša koncentracijo holesterola, 60-90 % manj uspešen. V prihodnosti nameravajo enak poskus izvesti še z SARS-CoV-2 in MERS-CoV, vendar pa bo treba pri MERS-CoV predhodno ugotoviti, ali se njegov tarčni receptor sploh nahaja v lipidnih splavih.

=== Vloga kalcija pri fuziji ===

Poleg pH in prisotnosti različnih proteaz se je za veliko virusov kot zelo pomembna izkazala tudi koncentracija Ca2+ ionov, ki je ne morejo nadomestiti primerljive koncentracije drugih 2+ ionov. S poskusi na SARS-CoV in MERS-Cov so najprej ugotovili, da je Ca2+ pomemben za uspešnost fuzije, z biofizikalnimi metodami pa še kakšna je interakcija Ca2+ pri fuziji. Ca2+ ioni stabilizirajo FP in pomagajo pri za fuzijo ugodnem urejanju membrane. Obstajajo pa večje razlike med interakcijami pri MERS-CoV in SARS-CoV. Ca2+ je namreč bolj pomemben za SARS-CoV, saj je odsotnost kalcija v primerjavi z MERS-CoV bolj prizadela SARS-CoV infektivnost, kar bi bila lahko posledica tega, da SARS-CoV-FP veže dva Ca2+ iona, enega na FP1 in drugega na FP2, MERS-CoV-FP pa ima le eno vezavno mesto na FP1.

== Antifusogene učinkovine proti SARS-CoV ==

V procesu fuzije virusne membrane z gostiteljsko membrano imata pomembno vlogo peptida HR1 in HR2, ki sodelujeta pri formaciji pore med virusno in gostiteljsko membrano. Zaradi tega sta ta peptida pomembni tarči antifusogenih antiviretikov.
Prva odkrita in potrjena za uporabo kot zdravilna učinkovina (ZU) z antifusogenim učinkom je bila enfuvirtid (uporabljana kot zdravilo proti HIV). Ta zdravilna učinkovina je HR2 peptid (prvotno z imenom DP-178), ki se kompetitivno veže na HR1 peptid in tako prepreči njegovo povezavo s HR2 in zavre fuzijo membran. Nadaljnje raziskave so pokazale, da so HR2 zelo specifični za HR2 vezavno zaporedje na HR1 peptidu in tako tudi specifični za posamezni virus – enfuvirtid je uporaben le proti virusu HIV-1, ne pa tudi proti HIV-2.
Poravnava zaporedij HR1 in HR2 regij med SARS-CoV in SARS-CoV-2 pokaže 92,6 % in 100 % homolognost iz česar lahko sklepamo, da bo uporaba SARS-CoV HR2 peptidov učinkovita tudi v primeru SARS-CoV-2. Podobno velja za MERS-CoV, ki pa nima visoke stopnje homolognosti in tako peptidi proti SARS-CoV v tem primeru niso uporabni. Več dejavnikov vpliva na učinkovitost in uporabnost teh peptidov:
Razlike v aminokislinskih (AK) ostankih na vezavnem mestu HR1 za peptid: MERS-CoV s peptidom tvori več vodikovih vezi kot SARS-CoV in ima tako večjo afiniteto vezave.
Prevladujoč način infekcije gostiteljskih celic: za MERS-CoV je prevladujoč način skozi plazemsko membrano, za SARS-CoV je bolj značilna endosomalna pot. Peptidi so bolj na voljo v ekstracelularnem prostoru in tako lažje dostopajo do svojih tarč v primeru, ko virus prehaja v celico skozi plazemsko membrano in ne endosomalno. Podoben vpliv ima obdelava SARS-CoV s tripsinom, ki povzroči, da virus spremeni svoj način vstopa v celice.
Mutacije določenih AK ostankov: dodatek negativno in pozitivno nabitih ostankov (kot sta glutamat in lizin) vodi do nastanka solnih mostičkov in izboljšanje stabilnosti, topnosti in antivirusne aktivnosti peptida. Prav tako se zniža IC50.
Konjugacija na monoklonsko protitelo, ki povečuje specifičnost vezave peptida z vezavnim mestom na virusu;

Konjugacija s palmitatom: CoV receptorji se delijo v lipidno-bogate domene, kjer pride do vstopa CoV, palmitat povzroča delitev v lipidne splave in tako usmerja peptide proti lipidno-bogatim domenam.
Odkrite so bile tudi tarče za antifusogene peptide izven HR področij. Te tarče se nahajajo v okolici delitvenih mest S1/S2 in S2' in preprečujejo konformacijske spremembe potrebne za fuzijo.
Pomemben del raziskovanja novih ZU je tudi na področju že odobrenih učinkovin, ki pa še nimajo določene uporabnosti za zdravljenje okužbe s SARS-CoV-2 (t.i. 'repurposing'). Ena izmed teh ZU je imatinib, prvotno uporabljena pri zdravljenju kronične mieloične levkemije, nato pa tudi proti Ebola virusu, coxsackie virusu in vakcinija virusu. Predvidevajo, da imatinib preprečuje ključne prerazporeditve citoskeleta v virusu, ki sodelujejo pri fuziji.

== Viri in literatura ==

· Članek

· H. P. Rang, J. M. Ritter, R. J. Flower, G. Henderson: Rang and Dale's Pharmacology. Eighth edition. Elsevier Churchill Livingstone 2016, pp. 642-651, 676-691.

· Harrison SC. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 2008;15:690–698.

Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila

2021-05-17T12:36:30Z

Rahela Repina: /* Vloga holesterola pri fuziji */

== Uvod ==
Protein S je najpomembnejša tarča zdravil in cepiv proti koronavirusom. Na njem najdemo dve pomembnejši tarči za zdravila, in sicer regijo, ki se veže na receptor in regijo, ki je odgovorna za zlitje z membrano. Regija proteina S, ki je odgovorna za vezavo na receptor, je zelo slabo ohranjena med različnimi koronavirusi in zato ni najbolj primerna tarča za zdravila, ki imajo širok spekter delovanja na več koronavirusov. Medtem pa je regija, ki je odgovorna za zlitje z membrano, med najbolj ohranjenimi regijami koronavirusov, in tako primerna tarča za zdravila, ki imajo širši spekter delovanja na več koronavirusov. V nadaljevanju se bomo osredotočili na razvoj antifusogenih zdravil in njihovih proteinskih tarč.

== Proteolitska aktivacija koronavirusov ==

Koronavirusi lahko v celico vstopijo na dva načina, kadar so prisotne membranske proteaze virus lahko vstopi, tako da se zlije s celično membrano, v kolikor membranske proteaze niso prisotne virus vstopi s pomočjo endocitoze in se šele v notranjosti celice zlije z endocitotsko membrano.
Za zlitje koronavirusa s celično membrano je potrebna prisotnost različnih proteaz, ki cepijo protein S in tako omogočijo vstop virusa v celico. In-vivo študije so pokazale, da se ob prisotnosti eksogenih proteaz, kot so tripsin, termolizin in elastaze, infektivnost SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 poveča. Ugotovitev, da elastaza poveča infektivnost, bi lahko imela klinični pomen, saj elastazo med okužbo s SARS-CoV proizvajajo vnetne celice v pljučih, kar bi lahko spodbudilo okužbo pljučnih celic z virusom.
V fizioloških pogojih imajo pomembnejšo vlogo transmembranske proteaze, saj mora cepitev na koronavirusu poteči šele potem, ko se virus veže na receptor, kar pri eksogenih proteazah težje kontroliramo kot pri transmembranskih. Pri vstopu koronavirusa v celico sodelujejo predvsem transmembranske serinske proteaze tipa II. Inhibitorji transmembranskih proteaz bi lahko bili potencialno zdravilo, ki bi zmanjšalo infekcijo celic z virusom, saj se ta ne bi mogel zliti z membrano.

Če ustrezne proteaze niso prisotne lahko virus v celico vstopi s pomočjo endocitoze, ki je lahko odvisna ali neodvisna od klatrina. Pri MERS-CoV pa pride do vstopa z endocitozo, tudi kadar ta ni bil cepljen na mestih S1/S2 med samo biosintezo ne glede na prisotnost proteaz. Za takšen način vstopa koronavirusa v celico je potreben nizek pH, ki aktivira katepsina B in L, ki proteolitsko aktivirata virus, da se ta lahko zlije z membrano endosoma in njegov virion vstopi v citosol. Študije so pokazale, da inhibitorji katepsinov pri okužbah s SARS-CoV in MERS-CoV zmanjšajo njihovo zmožnost vstopa v celico.

Torej SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 lahko v celico vstopijo na dva načina. V kolikor so na celični membrani prisotne TMPRS22 proteaze pride do fuzije virusa s celično membrano, v primeru MERS-CoV je zato potrebna tudi predhodna cepitev na mestih S1/S2. Če ti pogoji niso izpolnjeni, bo virus v celico vstopil z endocitozo, in se ob znižanju pH ter posledični aktivaciji katepsinov zlil z membrano citosola in tako vstopil v citosol.
Neposredna fuzija koronavirusa s celično membrano pa je tudi ugodnejši način vstopa za virusa, saj se njegov dedni material zlije direktno v citosol. Tak način vstopa v celico pa je tudi klinično pomembnejši.

== Membranska fuzija ==

Fuzija membran je termodinamsko gledano ugoden proces, vendar je prvi korak približevanja membran energijsko zelo zahteven Vloga virusnih fuzijskih proteinov je kataliza in prispevanje energije za reakcijo približevanja.
Koronavirusni fuzijski proteini sodijo v prvi razred fuzijskih proteinov, kamor jih uvrščamo zaradi strukture, potrebe po aktivaciji s proteolitično cepitvijo ter delovanja s heptadnimi ponovitvami (HR1/2). Med delovanjem proteinov prvega razreda preidejo proteini čez več oblik: predfuzijska nativna oblika, predfuzijska metastabilna oblika, predlasnična oblika in postfuzijska stabilna oblika. Po sintezi se protein S nahaja v predfuzijski nativni obliki, v matestabilno obliko pa preide ob cepitvi na mestu S1/S2. S prehodom iz metastabilnega v predlasnično obliko protein premaga kinetično bariero. Energijo za ta dogodek dobi protein preko interakcije s sprožilcem iz okolja, pri koronavirusih so ta sprožilec proteaze. Interakcija s sprožilcem povzroči ireverzibilne konformacijske spremembe proteina, ki mu omogočijo vstavitev fuzijskega peptida (FP) v tarčno membrano. Vstavitvi FP sledi sestavljanje HR1 v trimer nato pa se nanj vežejo še trije peptidi HR2, kar tvori t.i. fuzijsko jedro. Konformacijske spremembe tega kompleksa povlečejo obe membrani bližje skupaj, tako da se lahko fuzija začne, fuzijski protein pa preide v postfuzijsko stabilno obliko.
Sama fuzija je sestavljena iz dveh korakov: prvo nastane hemifuzijska tvorba in nato pora. Hemifuzijska tvorba je stanje, kjer sta se zlili le zunanji membrani, notranji membrani pa sta še ločeni, tako da citosol in notranjost virusa še nista povezana. Hemifuzijsko stanje lahko razpade nazaj na virus in celico, ali pa se zlijeta še notranji membrani in dobimo poro, ki se lahko še razširi.

== Vloga holesterola pri fuziji ==

Za fuzijo so najbolj dovzetni lipidni splavi, saj se na njih klasično nahaja veliko proteinov in receptorjev, ki lajšajo fuzijo membran. Raziskave na različnih virusih kažejo, da je holesterol zelo pomemben za uspešnost fuzije virusa s tarčo. Poleg vloge pri vzpostavitvi tarč (lipidnih splavov),holesterol fuzijo membran olajšuje tudi mehanistično, saj znižuje potrebno energijo za nastanek fuzijskih intermediatov. Razumevanje vpliva holesterola na delovanje koronavirusov je dokaj omejeno, največ raziskav pa je bilo narejenih na SARS-CoV. Vsi razlogi niso bili natančno določeni, ugotovili pa so, da je holesterol definitivno pomemben za uspešnost fuzije tudi pri koronavirusih. Virus je bil namreč pri celicah, tretiranih z metil-β-ciklodekstrinom, spojino, ki zmanjša koncentracijo holesterola, 60-90 % manj uspešen. V prihodnosti nameravajo enak poskus izvesti še z SARS-CoV-2 in MERS-CoV, vendar pa bo treba pri MERS-CoV predhodno ugotoviti, ali se njegov tarčni receptor sploh nahaja v lipidnih splavih.

== Vloga kalcija pri fuziji ==

Poleg pH in prisotnosti različnih proteaz se je za veliko virusov kot zelo pomembna izkazala tudi koncentracija Ca2+ ionov, ki je ne morejo nadomestiti primerljive koncentracije drugih 2+ ionov. S poskusi na SARS-CoV in MERS-Cov so najprej ugotovili, da je Ca2+ pomemben za uspešnost fuzije, z biofizikalnimi metodami pa še kakšna je interakcija Ca2+ pri fuziji. Ca2+ ioni stabilizirajo FP in pomagajo pri za fuzijo ugodnem urejanju membrane. Obstajajo pa večje razlike med interakcijami pri MERS-CoV in SARS-CoV. Ca2+ je namreč bolj pomemben za SARS-CoV, saj je odsotnost kalcija v primerjavi z MERS-CoV bolj prizadela SARS-CoV infektivnost, kar bi bila lahko posledica tega, da SARS-CoV-FP veže dva Ca2+ iona, enega na FP1 in drugega na FP2, MERS-CoV-FP pa ima le eno vezavno mesto na FP1.

== Antifusogene učinkovine proti SARS-CoV ==

V procesu fuzije virusne membrane z gostiteljsko membrano imata pomembno vlogo peptida HR1 in HR2, ki sodelujeta pri formaciji pore med virusno in gostiteljsko membrano. Zaradi tega sta ta peptida pomembni tarči antifusogenih antiviretikov.
Prva odkrita in potrjena za uporabo kot zdravilna učinkovina (ZU) z antifusogenim učinkom je bila enfuvirtid (uporabljana kot zdravilo proti HIV). Ta zdravilna učinkovina je HR2 peptid (prvotno z imenom DP-178), ki se kompetitivno veže na HR1 peptid in tako prepreči njegovo povezavo s HR2 in zavre fuzijo membran. Nadaljnje raziskave so pokazale, da so HR2 zelo specifični za HR2 vezavno zaporedje na HR1 peptidu in tako tudi specifični za posamezni virus – enfuvirtid je uporaben le proti virusu HIV-1, ne pa tudi proti HIV-2.
Poravnava zaporedij HR1 in HR2 regij med SARS-CoV in SARS-CoV-2 pokaže 92,6 % in 100 % homolognost iz česar lahko sklepamo, da bo uporaba SARS-CoV HR2 peptidov učinkovita tudi v primeru SARS-CoV-2. Podobno velja za MERS-CoV, ki pa nima visoke stopnje homolognosti in tako peptidi proti SARS-CoV v tem primeru niso uporabni. Več dejavnikov vpliva na učinkovitost in uporabnost teh peptidov:
Razlike v aminokislinskih (AK) ostankih na vezavnem mestu HR1 za peptid: MERS-CoV s peptidom tvori več vodikovih vezi kot SARS-CoV in ima tako večjo afiniteto vezave.
Prevladujoč način infekcije gostiteljskih celic: za MERS-CoV je prevladujoč način skozi plazemsko membrano, za SARS-CoV je bolj značilna endosomalna pot. Peptidi so bolj na voljo v ekstracelularnem prostoru in tako lažje dostopajo do svojih tarč v primeru, ko virus prehaja v celico skozi plazemsko membrano in ne endosomalno. Podoben vpliv ima obdelava SARS-CoV s tripsinom, ki povzroči, da virus spremeni svoj način vstopa v celice.
Mutacije določenih AK ostankov: dodatek negativno in pozitivno nabitih ostankov (kot sta glutamat in lizin) vodi do nastanka solnih mostičkov in izboljšanje stabilnosti, topnosti in antivirusne aktivnosti peptida. Prav tako se zniža IC50.
Konjugacija na monoklonsko protitelo, ki povečuje specifičnost vezave peptida z vezavnim mestom na virusu;
Konjugacija s palmitatom: CoV receptorji se delijo v lipidno-bogate domene, kjer pride do vstopa CoV, palmitat povzroča delitev v lipidne splave in tako usmerja peptide proti lipidno-bogatim domenam.
Odkrite so bile tudi tarče za antifusogene peptide izven HR področij. Te tarče se nahajajo v okolici delitvenih mest S1/S2 in S2' in preprečujejo konformacijske spremembe potrebne za fuzijo.
Pomemben del raziskovanja novih ZU je tudi na področju že odobrenih učinkovin, ki pa še nimajo določene uporabnosti za zdravljenje okužbe s SARS-CoV-2 (t.i. 'repurposing'). Ena izmed teh ZU je imatinib, prvotno uporabljena pri zdravljenju kronične mieloične levkemije, nato pa tudi proti Ebola virusu, coxsackie virusu in vakcinija virusu. Predvidevajo, da imatinib preprečuje ključne prerazporeditve citoskeleta v virusu, ki sodelujejo pri fuziji.

== Viri: ==

· Članek

· H. P. Rang, J. M. Ritter, R. J. Flower, G. Henderson: Rang and Dale's Pharmacology. Eighth edition. Elsevier Churchill Livingstone 2016, pp. 642-651, 676-691.

· Harrison SC. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 2008;15:690–698.