https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Rebeka+Jerina 2026-04-15T08:27:45Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23494 2024-05-06T21:29:51Z

<p>Rebeka Jerina: /* Rezultati */</p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.) [1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'') [1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''ang. fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''ang. fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''ang. fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1, 4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1, 5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''ang. killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake, ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''ang. plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom - PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1].<br /> <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23493 2024-05-06T21:28:51Z

<p>Rebeka Jerina: /* Rezultati */</p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.) [1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'') [1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''ang. fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''ang. fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''ang. fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1, 4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1, 5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''ang. killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake, ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''ang. plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1].<br /> <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23492 2024-05-06T21:27:53Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.) [1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'') [1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''ang. fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''ang. fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''ang. fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1, 4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1, 5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''ang. killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake, ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1]. <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23491 2024-05-06T21:25:01Z

<p>Rebeka Jerina: /* Izboljšave */</p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.) [1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'') [1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''ang. fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''ang. fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''ang. fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1, 4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1, 5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''ang. killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake, ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1]. <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23490 2024-05-06T21:24:21Z

<p>Rebeka Jerina: /* Izboljšave */</p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.) [1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'') [1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''ang. fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''ang. fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''ang. fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1, 4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1, 5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''ang. killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1]. <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23489 2024-05-06T21:23:52Z

<p>Rebeka Jerina: /* Izboljšave */</p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.) [1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'') [1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''ang. fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''ang. fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''ang. fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1, 4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1, 5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1]. <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23488 2024-05-06T21:22:04Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.) [1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'') [1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''ang. fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''ang. fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''ang. fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1,4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1,5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1]. <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23487 2024-05-06T21:21:03Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.) [1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'') [1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1,4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1,5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1]. <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23486 2024-05-06T21:19:00Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.)[1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'')[1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1,4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1,5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1]. <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=LAMPS&diff=23485 2024-05-06T21:18:23Z

<p>Rebeka Jerina: Created page with &quot;[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html/ LAMPS] (&#039;&#039;Luminous Algae Material Presenting System&#039;&#039;) je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China lata 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. Avtorica povzetka: Rebeka Jerina ==Problem== Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nen...&quot;</p> <hr /> <div>[https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html/ LAMPS] (''Luminous Algae Material Presenting System'') je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China lata 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize. <br /> <br /> Avtorica povzetka: Rebeka Jerina<br /> <br /> ==Problem==<br /> Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (''United Nations''), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov.<br /> Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].<br /> ==Rešitev==<br /> Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (''Luminous Algae Material Presenting System''). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.)[1]. <br /> ==Zasnova sistema LAMPS==<br /> ===Ogrodje in osnova===<br /> Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije ''Synechococcus elongatus'' PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; ''Neutral Insertion Sites'')[1].<br /> <br /> Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (''fatty acid reductase''), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (''fatty aldehyde transferase'') in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (''fatty aldehyde oxidase''). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].<br /> <br /> Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3]. <br /> <br /> ===Izboljšave===<br /> Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.<br /> <br /> Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - ''Biofluorescence Resonance Energy Transfer''). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. <br /> Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].<br /> <br /> Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1]. <br /> <br /> Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1,4]. <br /> <br /> Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1,5]. <br /> <br /> Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (''killing switch''). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1]. <br /> <br /> Seznam uporabljenih komponent in oznake ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts <br /> <br /> ==Rezultati==<br /> Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:<br /> === Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG===<br /> Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev ''E. coli'' BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (''ang. Gibson assembly''), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (''plate reader''). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1]. <br /> === Dokaz učinkovitosti metode BRET ===<br /> Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (''Long Short-Term Memory Networks''), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].<br /> === Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom PkaiBC ===<br /> Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1]. <br /> ==Viri==<br /> # ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html<br /> # Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881<br /> # Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07<br /> # Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.<br /> # Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2023/24&diff=23484 2024-05-06T20:44:47Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek) <br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2023/24&diff=23483 2024-05-06T20:44:27Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek) <br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2023/24&diff=23482 2024-05-06T20:43:53Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek) <br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19310 2021-05-18T12:36:52Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt. <br /> <br /> ==Odkrivanje EndoU aktivnosti==<br /> Ko je bil CoV potrjen kot etiološki SARS, so raziskovalci začeli intenzivno preučevati genomska zaporedja različnih virusov. S poravnavo genomskih zaporedij 3' terminalne regije nsp15 so ugotovili, da ima CoV EndoU domena zelo podobno zaporedje kot poli(U)- specifična endoribonukleaza iz organizma ''Xenopus laevis''. Iz tega so sklepali, da bi tudi CoV nsp15 lahko imela endoribonukleazno aktivnost.<br /> <br /> Do takrat je bila EndoU domena značilna le za viruse iz rodu ''Nidovirales'', v kasnejših raziskavah pa so odkrili, da je slednja prisotna tudi pri članih družine ''Arteriviridae''. Najnovejše raziskave pa so pokazale, da prisotnost domene EndoU ni univerzalna pri vseh nidovirusih. Najdemo jo le pri nidovirusih, ki okužijo vretenčarje, vključno s koronavirusi (CoV) in arterivirusi, medtem ko nidovirusi žuželk in ronivirusi, ki okužijo nevretenčarje, nimajo zapisa za EndoU domeno.<br /> <br /> ==Nsp15 je U-specifična endoribonukleaza==<br /> Raziskave EndoU aktivnosti SARS-CoV nsp15 ''in vitro'' so potrdile napovedano ribonukleazno aktivnost proteina, saj so pokazale, da slednji lahko cepi le enoverižno (ss) in dvoverižno (ds) RNA, ter nobene izmed DNA molekul. Potrdile so tudi, da je encim endonukleaza in ne eksonukleaza, saj kovalentne modifikacije 5' ali 3' koncev RNA substratov niso vplivale na delovanje encima; nsp 15 je kljub modificiranim koncem še vedno cepil RNA. <br /> <br /> Prav tako so biokemijski eksperimenti pokazali, da nsp15 prednostno cepi RNA substrate na 3' koncu uridinov, iz česar izhaja tudi njeno ime EndoU (''Uridylate-specific endoribonuclease''), ki kaže na njeno specifičnost cepitve. Nsp15 s cepitvijo uravnava dolžino poliuridinov, ki jih najdemo na 5' koncu negativne verige RNA, in tako omogoči virusu, da se izogne aktivaciji imunskega odziva gostitelja.<br /> <br /> Strukturne analize pa so pokazale, da je nsp15 v raztopini lahko prisotna bodisi kot monomer ali heksamer, kjer slednji predstavlja aktivno obliko EndoU. Za aktivnost EndoU je torej ključna heksamerizacija nsp15. Poleg tega, nsp15 za aktivno konformacijsko obliko potrebuje kofaktorje, ki jih predstavljajo dvovalentni kovinski ioni (Mn+2).<br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3. Snijder EJ, Decroly E, Ziebuhr J. The Nonstructural Proteins Directing Coronavirus RNA Synthesis and Processing. Advances in Virus Research. Elsevier; 2016. pp. 59–126. doi:10.1016/bs.aivir.2016.08.008<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19143 2021-05-16T10:56:06Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt. <br /> <br /> ==Odkrivanje EndoU aktivnosti==<br /> Ko je bil CoV potrjen kot etiološki SARS, so raziskovalci začeli intenzivno preučevati genomska zaporedja različnih virusov. S poravnavo genomskih zaporedij 3' terminalne regije ORF1b so ugotovili, da ima CoV nsp15 (EndoU domena) zelo podobno zaporedje kot poli(U)- specifična endoribonukleaza iz organizma ''Xenopus laevis''. Iz tega so sklepali, da bi tudi CoV nsp15 lahko imela endoribonukleazno aktivnost.<br /> <br /> Do takrat je bila EndoU domena značilna le za viruse iz rodu ''Nidovirales'', v kasnejših raziskavah pa so odkrili, da je slednja prisotna tudi pri članih družine ''Arteriviridae''. Najnovejše raziskave pa so pokazale, da prisotnost domene EndoU ni univerzalna pri vseh nidovirusih. Najdemo jo le pri nidovirusih, ki okužijo vretenčarje, vključno s koronavirusi (CoV) in arterivirusi, medtem ko nidovirusi žuželk in ronivirusi, ki okužijo nevretenčarje, nimajo zapisa za EndoU domeno.<br /> <br /> ==Nsp15 je U-specifična endoribonukleaza==<br /> Raziskave EndoU aktivnosti SARS-CoV nsp15 ''in vitro'' so potrdile napovedano ribonukleazno aktivnost proteina, saj so pokazale, da slednji lahko cepi le enoverižno (ss) in dvoverižno (ds) RNA, ter nobene izmed DNA molekul. Potrdile so tudi, da je encim endonukleaza in ne eksonukleaza, saj kovalentne modifikacije 5' ali 3' koncev RNA substratov niso vplivale na delovanje encima; nsp 15 je kljub modificiranim koncem še vedno cepil RNA. <br /> <br /> Prav tako so biokemijski eksperimenti pokazali, da nsp15 prednostno cepi RNA substrate na 3' koncu uridinov, iz česar izhaja tudi njeno ime EndoU (''Uridylate-specific endoribonuclease''), ki kaže na njeno specifičnost cepitve. Nsp15 s cepitvijo uravnava dolžino poliuridinov, ki jih najdemo na 5' koncu negativne verige RNA, in tako omogoči virusu, da se izogne aktivaciji imunskega odziva gostitelja.<br /> <br /> Strukturne analize pa so pokazale, da je nsp15 v raztopini lahko prisotna bodisi kot monomer ali heksamer, kjer slednji predstavlja aktivno obliko EndoU. Za aktivnost EndoU je torej ključna heksamerizacija nsp15. Poleg tega, nsp15 za aktivno konformacijsko obliko potrebuje kofaktorje, ki jih predstavljajo dvovalentni kovinski ioni (Mn+2).<br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3. Snijder EJ, Decroly E, Ziebuhr J. The Nonstructural Proteins Directing Coronavirus RNA Synthesis and Processing. Advances in Virus Research. Elsevier; 2016. pp. 59–126. doi:10.1016/bs.aivir.2016.08.008<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19142 2021-05-16T10:50:20Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt. <br /> <br /> ==Odkrivanje EndoU aktivnosti==<br /> Ko je bil CoV potrjen kot etiološki SARS, so raziskovalci začeli intenzivno preučevati genomska zaporedja različnih virusov. S poravnavo genomskih zaporedij 3' terminalne regije ORF1b so ugotovili, da ima CoV nsp15 (EndoU domena) zelo podobno zaporedje kot poli(U)- specifična endoribonukleaza iz organizma ''Xenopus laevis''. Iz tega so sklepali, da bi tudi CoV nsp15 lahko imela endoribonukleazno aktivnost.<br /> <br /> Do takrat je bila EndoU domena značilna le za viruse iz rodu ''Nidovirales'', v kasnejših raziskavah pa so odkrili, da je slednja prisotna tudi pri članih družine ''Arteriviridae''. Najnovejše raziskave pa so pokazale, da prisotnost domene EndoU ni univerzalna pri vseh nidovirusih. Najdemo jo le pri nidovirusih, ki okužijo vretenčarje, vključno s koronavirusi (CoV) in arterivirusi, medtem ko nidovirusi žuželk in ronivirusi, ki okužijo nevretenčarje, nimajo zapisa za EndoU domeno.<br /> <br /> ==Nsp15 je U-specifična endoribonukleaza==<br /> Raziskave EndoU aktivnosti SARS-CoV nsp15 ''in vitro'' so potrdile napovedano ribonukleazno aktivnost proteina, saj so pokazale, da slednji lahko cepi le enoverižno (ss) in dvoverižno (ds) RNA, ter nobene izmed DNA molekul. Potrdile so tudi, da je encim endonukleaza in ne eksonukleaza, saj kovalentne modifikacije 5' ali 3' koncev RNA substratov niso vplivale na delovanje encima; nsp 15 je kljub modificiranim koncem še vedno cepil RNA. <br /> <br /> Prav tako so biokemijski eksperimenti pokazali, da nsp15 prednostno cepi RNA substrate na 3' koncu uridinov, iz česar izhaja tudi njeno ime EndoU (''Uridylate-specific endoribonuclease''), ki kaže na njeno specifičnost cepitve. Nsp15 s cepitvijo uravnava dolžino poliuridinov, ki jih najdemo na 5' koncu negativne verige RNA, in tako omogoči virusu, da se izogne aktivaciji imunskega odziva gostitelja.<br /> <br /> Strukturne analize pa so pokazale, da je nsp15 v raztopini lahko prisotna bodisi kot monomer ali heksamer, kjer slednji predstavlja aktivno obliko EndoU. Za aktivnost EndoU je torej ključna heksamerizacija nsp15. Poleg tega, nsp15 za aktivno konformacijsko obliko potrebuje kofaktorje, ki jih predstavljajo dvovalentni kovinski ioni (Mn+2).<br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19141 2021-05-16T10:50:05Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>*'''Rebeka Jerina''': Uvod, Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina, Odkrivanje EndoU aktivnosti, Nsp15 je U-specifična endoribonukleaza<br /> *'''Ela Bizjak''': Struktura nsp15, Vloga pri replikaciji, Delovanje aktivnega mesta, Inhibitorji<br /> *'''Veronika Bračič''': Uvod, Nsp15 kot antagonist IFN, Endoribonukleazna aktivnost (EndoU), Aktivacija različnih signalnih poti, Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19140 2021-05-16T10:49:43Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>*'''Rebeka Jerina''': Uvod, Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina, Odkrivanje EndoU aktivnosti, Nsp 15 je U-specifična endoribonukleaza<br /> *'''Ela Bizjak''': Struktura nsp15, Vloga pri replikaciji, Delovanje aktivnega mesta, Inhibitorji<br /> *'''Veronika Bračič''': Uvod, Nsp15 kot antagonist IFN, Endoribonukleazna aktivnost (EndoU), Aktivacija različnih signalnih poti, Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19139 2021-05-16T10:49:21Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>*'''Rebeka Jerina''': Uvod, Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina, Odkrivanje EndoU aktivnosti, Nsp 15 je U-specifična endoribonukleaza<br /> *'''Ela Bizjak''': Struktura nsp15, Vloga pri replikaciji, Delovanje aktivnega mesta, <br /> *'''Veronika Bračič''': Uvod, Nsp15 kot antagonist IFN, Endoribonukleazna aktivnost (EndoU), Aktivacija različnih signalnih poti, Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19138 2021-05-16T10:49:04Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>*'''Rebeka Jerina''': Uvod, Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina, Odkrivanje EndoU aktivnosti, Nsp 15 je U-specifična endoribonukleaza<br /> *'''Ela Bizjak''': Struktura nsp15, Vloga pri replikaciji, <br /> *'''Veronika Bračič''': Uvod, Nsp15 kot antagonist IFN, Endoribonukleazna aktivnost (EndoU), Aktivacija različnih signalnih poti, Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19137 2021-05-16T10:48:31Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>*'''Rebeka Jerina''': Uvod, Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina, Odkrivanje EndoU aktivnosti, Nsp 15 je U-specifična endoribonukleaza<br /> *'''Ela Bizjak''': Struktura nsp15, <br /> *'''Veronika Bračič''': Uvod, Nsp15 kot antagonist IFN, Endoribonukleazna aktivnost (EndoU), Aktivacija različnih signalnih poti, Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19136 2021-05-16T10:47:41Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt. <br /> <br /> ==Odkrivanje EndoU aktivnosti==<br /> Ko je bil CoV potrjen kot etiološki SARS, so raziskovalci začeli intenzivno preučevati genomska zaporedja različnih virusov. S poravnavo genomskih zaporedij 3' terminalne regije ORF1b so ugotovili, da ima CoV nsp15 (EndoU domena) zelo podobno zaporedje kot poli(U)- specifična endoribonukleaza iz organizma ''Xenopus laevis''. Iz tega so sklepali, da bi tudi CoV nsp15 lahko imela endoribonukleazno aktivnost.<br /> <br /> Do takrat je bila EndoU domena značilna le za viruse iz rodu ''Nidovirales'', v kasnejših raziskavah pa so odkrili, da je slednja prisotna tudi pri članih družine ''Arteriviridae''. Najnovejše raziskave pa so pokazale, da prisotnost domene EndoU ni univerzalna pri vseh nidovirusih. Najdemo jo le pri nidovirusih, ki okužijo vretenčarje, vključno s koronavirusi (CoV) in arterivirusi, medtem ko nidovirusi žuželk in ronivirusi, ki okužijo nevretenčarje, nimajo zapisa za EndoU domeno.<br /> <br /> ==Nsp 15 je U-specifična endoribonukleaza==<br /> Raziskave EndoU aktivnosti SARS-CoV nsp15 ''in vitro'' so potrdile napovedano ribonukleazno aktivnost proteina, saj so pokazale, da slednji lahko cepi le enoverižno (ss) in dvoverižno (ds) RNA, ter nobene izmed DNA molekul. Potrdile so tudi, da je encim endonukleaza in ne eksonukleaza, saj kovalentne modifikacije 5' ali 3' koncev RNA substratov niso vplivale na delovanje encima; nsp 15 je kljub modificiranim koncem še vedno cepil RNA. <br /> <br /> Prav tako so biokemijski eksperimenti pokazali, da nsp15 prednostno cepi RNA substrate na 3' koncu uridinov, iz česar izhaja tudi njeno ime EndoU (''Uridylate-specific endoribonuclease''), ki kaže na njeno specifičnost cepitve. Nsp15 s cepitvijo uravnava dolžino poliuridinov, ki jih najdemo na 5' koncu negativne verige RNA, in tako omogoči virusu, da se izogne aktivaciji imunskega odziva gostitelja.<br /> <br /> Strukturne analize pa so pokazale, da je nsp15 v raztopini lahko prisotna bodisi kot monomer ali heksamer, kjer slednji predstavlja aktivno obliko EndoU. Za aktivnost EndoU je torej ključna heksamerizacija nsp15. Poleg tega, nsp15 za aktivno konformacijsko obliko potrebuje kofaktorje, ki jih predstavljajo dvovalentni kovinski ioni (Mn+2).<br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19135 2021-05-16T10:35:26Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt. <br /> <br /> ==Odkrivanje EndoU aktivnosti==<br /> Ko je bil CoV potrjen kot etiološki SARS, so raziskovalci začeli intenzivno preučevati genomska zaporedja različnih virusov. S poravnavo genomskih zaporedij 3' terminalne regije ORF1b so ugotovili, da ima CoV nsp15 (EndoU domena) zelo podobno zaporedje kot poli(U)- specifična endoribonukleaza iz organizma ''Xenopus laevis''. Iz tega so sklepali, da bi tudi CoV nsp15 lahko imela endoribonukleazno aktivnost.<br /> <br /> Do takrat je bila EndoU domena značilna le za viruse iz rodu ''Nidovirales'', v kasnejših raziskavah pa so odkrili, da je slednja prisotna tudi pri članih družine ''Arteriviridae''. Najnovejše raziskave pa so pokazale, da prisotnost domene EndoU ni univerzalna pri vseh nidovirusih. Najdemo jo le pri nidovirusih, ki okužijo vretenčarje, vključno s koronavirusi (CoV) in arterivirusi, medtem ko nidovirusi žuželk in ronivirusi, ki okužijo nevretenčarje, nimajo zapisa za EndoU domeno.<br /> <br /> ==Nsp 15 je U-specifična endoribonukleaza==<br /> Raziskave EndoU aktivnosti SARS-CoV nsp15 ''in vitro'' so potrdile napovedano ribonukleazno aktivnost proteina, saj so pokazale, da slednji lahko cepi le enoverižno (ss) in dvoverižno (ds) RNA, ter nobene izmed DNA molekul. Potrdile so tudi, da je encim endonukleaza in ne eksonukleaza, saj kovalentne modifikacije 5' ali 3' koncev RNA substratov niso vplivale na delovanje encima; nsp 15 je kljub modificiranim koncem še vedno cepil RNA. <br /> <br /> Prav tako so biokemijski eksperimenti pokazali, da nsp15 prednostno cepi RNA substrate na 3' koncu uridinov, iz česar izhaja tudi njeno ime EndoU (''Uridylate-specific endoribonuclease''), ki kaže na njeno specifičnost cepitve. Nsp15 s cepitvijo uravnava dolžino poliuridinov, ki jih najdemo na 5' koncu negativne verige RNA, in tako omogoči virusu, da se izogne aktivaciji imunskega odziva gostitelja.<br /> <br /> Strukturne analize pa so pokazale, da je nsp15 v raztopini lahko prisotna bodisi kot monomer ali heksamer, kjer slednji predstavlja aktivno obliko EndoU. Za aktivnost EndoU je torej ključna heksamerizacija nsp15. Poleg tega, nsp15 za aktivno konformacijsko obliko potrebuje kofaktorje, ki jih predstavljajo dvovalentni kovinski ioni.<br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19134 2021-05-16T10:21:30Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt. <br /> <br /> ==Odkrivanje EndoU aktivnosti==<br /> Ko je bil CoV potrjen kot etiološki SARS, so raziskovalci začeli intenzivno preučevati genomska zaporedja različnih virusov. S poravnavo genomskih zaporedij 3' terminalne regije ORF1b so ugotovili, da ima CoV nsp15 (EndoU domena) zelo podobno zaporedje kot poli(U)- specifična endoribonukleaza iz organizma ''Xenopus laevis''. Iz tega so sklepali, da bi tudi CoV nsp15 lahko imela endoribonukleazno aktivnost.<br /> <br /> Do takrat je bila EndoU domena značilna le za viruse iz rodu ''Nidovirales'', v kasnejših raziskavah pa so odkrili, da je slednja prisotna tudi pri članih družine ''Arteriviridae''. Najnovejše raziskave pa so pokazale, da prisotnost domene EndoU ni univerzalna pri vseh nidovirusih. Najdemo jo le pri nidovirusih, ki okužijo vretenčarje, vključno s koronavirusi (CoV) in arterivirusi, medtem ko nidovirusi žuželk in ronivirusi, ki okužijo nevretenčarje, nimajo zapisa za EndoU domeno.<br /> <br /> ==Nsp 15 je U-specifična endoribonukleaza==<br /> Raziskave EndoU aktivnosti SARS-CoV nsp15 ''in vitro'' so potrdile napovedano ribonukleazno aktivnost proteina, saj so pokazale, da slednji lahko cepi le enoverižno (ss) in dvoverižno (ds) RNA, ter nobene izmed DNA molekul. Potrdile so tudi, da je encim endonukleaza in ne eksonukleaza, saj kovalentne modifikacije 5' ali 3' koncev RNA substratov niso vplivale na delovanje encima; nsp 15 je kljub modificiranim koncem še vedno cepil RNA. <br /> <br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19133 2021-05-16T10:10:59Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>*'''Rebeka Jerina''': Uvod, Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina, Odkrivanje EndoU aktivnosti, <br /> *'''Ela Bizjak''': Struktura nsp15, <br /> *'''Veronika Bračič''': Uvod, Nsp15 kot antagonist IFN, Endoribonukleazna aktivnost (EndoU), Aktivacija različnih signalnih poti, Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19132 2021-05-16T10:10:29Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt. <br /> <br /> ==Odkrivanje EndoU aktivnosti==<br /> Ko je bil CoV potrjen kot etiološki SARS, so raziskovalci začeli intenzivno preučevati genomska zaporedja različnih virusov. S poravnavo genomskih zaporedij 3' terminalne regije ORF1b so ugotovili, da ima CoV nsp15 (EndoU domena) zelo podobno zaporedje kot poli(U)- specifična endoribonukleaza iz organizma ''Xenopus laevis''. Iz tega so sklepali, da bi tudi CoV nsp15 lahko imela endoribonukleazno aktivnost.<br /> <br /> Do takrat je bila EndoU domena značilna le za viruse iz rodu ''Nidovirales'', v kasnejših raziskavah pa so odkrili, da je slednja prisotna tudi pri članih družine ''Arteriviridae''. Najnovejše raziskave pa so pokazale, da prisotnost domene EndoU ni univerzalna pri vseh nidovirusih. Najdemo jo le pri nidovirusih, ki okužijo vretenčarje, vključno s koronavirusi (CoV) in arterivirusi, medtem ko nidovirusi žuželk in ronivirusi, ki okužijo nevretenčarje, nimajo zapisa za EndoU domeno.<br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19131 2021-05-16T10:05:57Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt. <br /> <br /> ==Odkrivanje EndoU aktivnosti==<br /> Ko je bil CoV potrjen kot etiološki SARS, so raziskovalci začeli intenzivno preučevati genomska zaporedja različnih virusov. S poravnavo genomskih zaporedij 3' terminalne regije ORF1b so ugotovili, da ima CoV nsp15 (EndoU domena) zelo podobno zaporedje kot poli(U)-specifična endoribonukleaza iz organizma ''Xenopus laevis''. Iz tega so sklepali, da bi tudi CoV nsp15 lahko imela na endoribonukleazno aktivnost.<br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19130 2021-05-16T09:55:10Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>*'''Rebeka Jerina''': Uvod, Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina, <br /> *'''Ela Bizjak''': Struktura nsp15, <br /> *'''Veronika Bračič''': Uvod, Nsp15 kot antagonist IFN, Endoribonukleazna aktivnost (EndoU), Aktivacija različnih signalnih poti, Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19129 2021-05-16T09:54:54Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>*'''Rebeka Jerina''': Uvod, Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina, <br /> *'''Ela Bizjak''':<br /> *'''Veronika Bračič''': Uvod, Nsp15 kot antagonist IFN, Endoribonukleazna aktivnost (EndoU), Aktivacija različnih signalnih poti, Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19128 2021-05-16T09:50:38Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt. <br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19127 2021-05-16T09:43:10Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina==<br /> <br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19126 2021-05-16T09:41:22Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>*'''Rebeka Jerina''': Uvod, <br /> *'''Ela Bizjak''':<br /> *'''Veronika Bračič''': Uvod, Nsp15 kot antagonist IFN, Endoribonukleazna aktivnost (EndoU), Aktivacija različnih signalnih poti, Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19125 2021-05-16T09:41:02Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Vloga_koronavirusne_endonukleaze_pri_izogibanju_protivirusnemu_odgovoru&diff=19124 2021-05-16T09:39:08Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.<br /> <br /> Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp 15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp 15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.<br /> <br /> ==Struktura nsp15==<br /> EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana.<br /> Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen.<br /> Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.<br /> <br /> ==Vloga pri replikaciji==<br /> Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.<br /> <br /> ==Delovanje aktivnega mesta==<br /> V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.<br /> <br /> ==Inhibitorji==<br /> Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.<br /> <br /> ==Nsp15 kot antagonist IFN==<br /> Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.<br /> <br /> ==Endoribonukleazna aktivnost (EndoU)==<br /> Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.<br /> <br /> ==Aktivacija različnih signalnih poti==<br /> Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti.<br /> Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov.<br /> Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa.<br /> Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.<br /> <br /> ==Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva==<br /> Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.<br /> <br /> ==Literatura==<br /> <br /> 1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024<br /> <br /> 2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Molekularna_biologija_koronavirusov&diff=18134 2021-03-26T10:12:25Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.<br /> <br /> Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili. <br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.<br /> <br /> Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.<br /> <br /> Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici. <br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30). <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> # Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/)<br /> # Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)<br /> # Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)<br /> # Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)<br /> # Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)<br /> # Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)<br /> # Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)<br /> # Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)<br /> # Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)<br /> # Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)<br /> # Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)<br /> # RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)<br /> # Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/<br /> # Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)<br /> # Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)<br /> ----<br /> <br /> Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju. <br /> Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.<br /> <br /> 0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović)&lt;br&gt;<br /> <br /> # Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )<br /> # Molekularni vidiki koronavirusov (Neža Leskovar, Iva Matić)<br /> # Način pakiranja RNA pri koronavirusih (Timotej Sotosek, Erik Ptar, Eva Vene)<br /> # Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)<br /> # Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)<br /> # Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)<br /> # Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)<br /> # Natančnost replikacije koronavirusne RNA<br /> # Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)<br /> # Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik, Aljaž Simonič, Luka Hafner)<br /> # Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (Aleksandra Rauter, Nika Banovšek)<br /> # RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)<br /> # Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom<br /> # Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak, Rebeka Jerina)<br /> # Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc, Vid Dobrovoljc, Rahela Repina)<br /> <br /> <br /> Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: &lt;nowiki&gt;[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]&lt;/nowiki&gt;&lt;br&gt;. Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.<br /> <br /> Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).<br /> <br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Molekularna_biologija_koronavirusov&diff=18089 2021-03-26T09:40:14Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, kar je glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema. Za seminarje sem določil 15 ožjih področij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.<br /> <br /> Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili. <br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.<br /> <br /> Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.<br /> <br /> Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici. <br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30). <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> # Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/) (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )<br /> # Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/) (Neža Leskovar)<br /> # Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/) (Timotej Sotosek, Erik Putar, Eva Vene)<br /> # Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)(Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka StankoviĆ)<br /> # Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/) (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)<br /> # Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/) (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)<br /> # Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/) (Tinkara Božič, Nika Bedrač, Maja Kobal)<br /> # Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)<br /> # Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/) (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)<br /> # Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)<br /> # Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)<br /> # RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)<br /> # Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/)<br /> # Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/) (Rebeka Jerina)<br /> # Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/) (Vid Dobrovoljc)</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Povzetki_seminarjev_2020&diff=17653 2020-10-30T22:29:14Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 =<br /> <br /> <br /> ==Jan Bregar - Protein retinoblastoma==<br /> <br /> Protein retinoblastoma (pRb) je eden ključnih proteinov, ki regulirajo celični cikel in njegova inaktivacija lahko povzroči različna bolezenska stanja. Ta protein regulira ključni prehod iz G1 v S fazo celičnega cikla s pomočjo interakcij z družino E2F, ki je vrsta transkripcijskih faktorjev celičnega cikla. Retinoblastoma protein (pRb) nadzoruje tudi izstop celice iz celičnega cikla. Njeno aktivnost regulira več mehanizmov, ki zaznavajo znotraj- in zunajcelične signale, ki blokirajo ali dovoljujejo fosforilacijo. pRb fosforilirajo od ciklina odvisne kinaze (Cdk-ji) in s tem protein Rb bodisi inaktivirajo ali pa rahlo spremenijo njegove lastnosti, protein pa vseeno ohrani svojo funkcijo. Odkrili so tudi, da pRb regulira apoptozo s pomočjo enakih interakcij s transkripcijskimi faktorji E2F. To, da je pRb vpleten pri apoptozi, popolno dopolnjuje pRb kot pomemben določevalec usode celice. Med trajanjem celičenga cikla je pRb inaktiviran, kar povzroči, da je celica bolj občutljiva na apoptotske stimuluse. Regulacijo apoptoze lahko onesposobijo nekateri virusi, ki s svojimi onkoproteini povzročijo napake v delovanju proteina Rb, kar lahko predstavlja tveganje za organizem. pRb – E2F kompleksi imajo pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije genov, ki so vključeni v diferenciaciji in razvoju.<br /> <br /> <br /> ==Ajda Beltram - Struktura in dinamika signalnih komplekov GPCR==<br /> <br /> Receptorji sklopljeni z G-proteinom (GPCR) so transmembranski proteini, ki kot odgovor na ligande regulirajo veliko signalnih poti preko heterotrimernih G-proteinov ali pa preko fosforilacije receptorja s kinazo GRK in arestinov. Vendar ti proteini ne obstajajo le v aktivirani ali neaktivirani obliki, pač pa imajo veliko konformacijskih stanj, ki vsaka sproži svojo signalno pot. Mene je zanimala podrobna razlaga konformacijskih sprememb, ki se zgodijo med prenosom signala. Za aktivacijo G-proteinov je potrebna zamenjava GDP z GTP, kjer igra ključno vlogo razcep domen podenote α G-proteina in destabilizacija vezavnega mesta za nukleotid na Ras-domeni podenote α, kar so posledice konformacijskih sprememb, ki jih povzroči vezava na receptor. Različni ligandi, ki se vežejo na receptorje, pa lahko vplivajo tudi na afiniteto G-proteina do GDP. Kompleksi receptor-G-protein, ki nastanejo z vezavo popolnih agonistov, imajo manjšo afiniteto do GDP, kot tisti, ki so nastali z vezavo delnih agonistov. Pri arestinih pa so prav tako prišli do novega spoznanja. Aktivacija arestinov je večinoma prikazana kot proces iz dveh delov in sicer vezave na fosforiliran C-rep receptorja in nato vezave na jedro receptorja, vendar pa so odkrili, da lahko obe vezavi posebej aktivirata arestin. To nakazuje na to, da verjetno obstaja veliko različnih kompleksov arestina in receptorja, ki regulirajo vsak svojo signalno pot.<br /> <br /> <br /> ==Anja Moškrič - Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmitorjev==<br /> <br /> Signalizacija živčnih celic med drugim poteka s prenosom nevrotransmitorjev preko sinaps. Pri kemični sinapsi gre za pretvarjanje električnih impulzov v eksocitotsko sprostitev nevrotransmitorja (npr. glutamat, GABA, epinefrin, norepinefrin). Pri pretvarjanju signala imajo ključno vlogo napetostno uravnavani kalcijevi ionski kanalčki (Cav), v presinaptičnem predelu. Ti, kot odgovor na depolarizacijo nevrona, usmerjajo kalcijeve ione v notranjost celice in posledično sprožijo fuzijo mešička (z nevrotransmitorjem) s presinaptično membrano. Zgrajeni so iz več podenot, od teh je glavna α1, ki tvori poro za pretok ionov. Podenoti α2δ in β pa regulirata lastnosti. Kanalčke glede na obliko glavne podenote klasificiramo v 3 večje skupine: Cav1, Cav2 in Cav3. V večini sinaps so prisotni kanalčki iz družine Cav2. Da eksocitoza lahko poteče hitro in učinkovito, morajo biti Cav locirani znotraj aktivne regije presinaptične membrane, v bližini mesta eksocitoze. Slednjo kalcijevi kanalčki regulirajo preko različnih proteinov. Pomembnejši predstavnik je družina proteinov RIM (z rab3 vezavne molekule). Ti se na kanalček vežejo z RIM vezavnimi proteini (RBP). Z njimi asociira tudi protein munc13, ki je v membrani vezikla in nevrona vezani s proteini SNARE. Ti so mediatorji pri fuziji membran. Delovanje kanalčka inaktivirajo procesi, kot sta od napetosti odvisni mehanizem in od kalcija odvisen mehanizem, ki je povezan s kalmodulinom.<br /> <br /> <br /> ==Gregor Strniša - Načini aktivacije GPCR==<br /> <br /> GPCR, oziroma z G proteinom sklopljeni receptorji, so transmembranski proteini, ki s svojim delovanjem vplivajo na dogajanje v celici. Zaradi vezave liganda na njihovo zunajcelično stran se jim spremeni konformacija in omogoči prenos signala preko različnih signalnih molekul. Signal se preko različnih G proteinov in β-arrestinov prenaša do drugih proteinov v celici. Kmalu po odkritju GPCR se je izkazalo, da vsi ne delujejo po istem principu. Nove raziskovalne metode so omogočile napredek na področju vizualizacije molekul in njihovega sledenja v celici. Tako so znanstveniki prišli do odkritja petih novih metod aktivacije GPCR, ki lažje razložijo delovanje receptorjev. Med seboj so si različne, a se lahko pogosto prekrivajo in dopolnjujejo. GPCR omogočijo več možnosti odgovora na določen ligand in njegovo koncentracijo. Načini aktivacije, predstavljeni v moji seminarski nalogi, so pristranska aktivacija, znotrajcelična aktivacija, dimerizacijska aktivacija, transaktivacija in dvofazna aktivacija. Posamezen receptor navadno deluje na več načinov. Ob posameznem načinu so podani primeri receptorjev in njihovega delovanja. Z razumevanjem načinov njihove aktivacije se odprejo nove možnosti razvoja zdravil, ki bi delovale preko GPCR, ali vplivale na njihove signalne poti.<br /> <br /> ==Nikola Janakievski - Selective Androgen Receptor Modulators==<br /> <br /> Selective Androgen Receptors Modulators or better known as SARMs, were discovered 30 years ago, as a potential replacement to steroid therapy. SARMs are a type of Selective Receptor Modulators (SRM), compounds which can act both as agonists and antagonists in androgen receptors (ARs) (as a non-steroid replacement), according to the tissue they are in. The main idea behind SARMs, is improving the hormone therapies we have currently, which use synthetic steroids. An ideal SARM could have all the benefits of steroid hormones, without the side effects. The potential benefits and safety of SARMs is yet to be determined, there are numerous ongoing studies for various applications. It is important to have a summary of all these potential application and past examples of studies. In this seminar, we aim to do just that, by comparing all past studies and future potential applications related to SARMs. We conclude that, SARMs are a viable alternative, possibly an improvement to synthetic steroids, although much more research and clinical trials are required for SARMs to become truly applicable.<br /> <br /> ==Vid Dobrovoljc - Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti==<br /> <br /> Preučevanje součinkovanja med signalnimi potmi v celici je zelo zanimivo področje, vendar dokaj težko za raziskovanje. S seminarjem sem poizkusil predstaviti sovplivanje inzulinske(RTK) in β-adrenergične (GCPR) poti v srcu. . Inzulin na β-adrenergične (βAR) poti vpliva s fosforilacijo receptorja z različnimi kinazami, na primer protein kinazo A (PKA) G-protein kinazo (GRK2) in celo sam inzulinskim receptorjem (INSR), kar vodi do desenzitacije in včasih tudi internalizacije receptorja z vezavo β-arestina. Drug način vplivanja je z delovanjem na nižje člene v signalni poti, na primer na koncentracijo cAMP s fosfodiesterazami (PDE). Inzulin lahko tudi s pomočjo fosforilacije uporabi β-adrenergično pot za krepitev svojega signala. Zelo pomembna točka obeh signalnih poti je GRK2, ki po naravi deluje inhibirajoče na obe signalni poti, po zadnjih rezultatih pa jo poleg tega inzulin uporablja za še dodatno inhibicijo GPCR poti. Vplivanje βAR poti na inzulinsko pot je manj jasno, vendar kaže, da lahko βAR na sprejem glukoze v odvisnosti od situacije vpliva tako pozitivno kot negativno, dokaj pomembno vlogo pri tem pa ima PKB. Domnevam, da bo v prihodnosti vedno več raziskav na temo povezav med signalnimi potmi, saj bodo razvite nove opazovalne tehnike, poleg tega pa je razumevanje povezav koristno tako pri razvoju novih tehnik zdravljenja, kot pri samem študiju razvoja celične signalizacije<br /> <br /> ==Rebeka Jerina - Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev== <br /> <br /> Veliko ljudi po svetu pije kavo, čaj ali kokakolo. Vsem naštetim pijačam je skupen kofein, najpogosteje zaužit psihostimulant na svetu. Kofein povzroča veliko učinkov, med katerimi je najbolj znan vpliv na budnost. Zanima me ali vemo kako in zakaj jo povzroči. Kofein je antagonist adenozinskih receptorjev (ARs). Ima podobno strukturo kot adenozin, zato lahko zaseda njegova vezavna mesta. Adenozinski receptorji so izraženi v mnogih tkivih, veliko pa jih najdemo v centralnem živčnem sistemu (CNS). Raziskala sem, da kofein večinoma vpliva na adenozinska receptorja podtipa A1 in A2A. Te dva podtipa adenozinskih receptorjev (ARs) vplivata na regulacijo mnogih fizioloških funkcij kot so spanje, kognicija, motivacija in čustva. Kofein tako z antagonizmom adenozinskih receptorjev (ARs) prepreči signalno kaskado, ki bi spodbudila zaspanost in posledično ohranja budnost. Adenozinski receptorji (ARs) spadajo pod receptorje povezane z G-proteini. Zgradba A1AR in A2AAR se nekoliko razlikuje, zato je tudi mehanizem delovanja teh dveh podtipov nekoliko drugačen. Signalizacija adenozinskih receptorjev (ARs) lahko poteka po več različnih signalnih poteh. Kofein bi zaradi pozitivnih okrepitvenih učinkov, pojava različnih duševnih motenj in pojava negativnih simptomov po prenehanju uživanja lahko prištevali med droge. Raziskave so pokazale, da se z antagonizmom adenozinskih receptorjev da uspešno zdraviti tudi številne bolezni. Glede na učinke in uporabo kofeina bi lahko rekli, da velja za hranilo, zdravilo ali drogo.<br /> <br /> ==Zala Perko - Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice== <br /> <br /> Fotoreceptorji v membrani celic očesne mrežnice so značilni predstavniki z G-proteinom sklopljenih receptorjev. Njihova naloga je absorpcija svetlobe določene valovne dolžine in prenos signala preko G-proteina na citoplazemsko stran, kjer poteče veriga encimsko kataliziranih reakcij. Aktiviran fotoreceptor mora v procesu regeneracije ponovno zavzeti neaktivno konformacijo in vezati naravni ligand 11-cis-retinal. Barvni fotoreceptorji jodopsini zahtevajo učinkovit regeneracijski mehanizem, ker morajo stalno procesirati veliko količino svetlobnih signalov. Aktivna konformacija jodopsina razpade veliko hitreje v primerjavi z rodopsinom in tudi sam potek regeneracije je pri jodopsinih hitrejši. Vzrok za to bi lahko bila različna usoda desenzibiliziranih receptorjev. Nedavno so odkrili možnost, da pri regeneraciji jodopsinov pride do preusmeritve signalne poti. Namesto, da se receptor deaktivira preko internalizacije z arestinom, ostane v membrani in veže ligand glede na prehodno konformacijsko stanje v katerem se nahaja. Na različen potek regeneracije jodopsinov bi lahko vplivala tudi vezava druge molekule retinala v alosterično mesto, ki je posledica konformacijskih sprememb. Povezava med interakcijo retinala in njegovih analogov z določenim konformacijskim intermediatom ima pomembno vlogo tudi s terapevtskega vidika, saj GPCR-ji v splošnem predstavljajo terapevtske tarče za zdravljenje mnogih obolenj. Uporaba analogov 11-cis-retinala, kot sta 9CR in 6mr, ki se vežeta v aktivno ali eno od alosteričnih mest, bi lahko predstavljala učinkovit pristop pri zdravljenju prirojenih mutacij v fotoreceptorjih.<br /> <br /> ==Eva Vene - Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1==<br /> <br /> Družina TRP kanalčkov pri živalih združuje devet manjših skupin kationskih prenašalcev, ki odločilno vplivajo na pravilno delovanje organizma. Eden od tovrstnih kanalčkov je tudi TRPV1 z angleškim imenom »transient receptor potential vanilloid 1«. Tega najdemo v mnogih organih in organskih sistemih, natančneje pa se v tem seminarju osredotočamo na njegovo vlogo v perifernem živčevju. TRPV1 vsebuje okoli polovica vseh somatskih in visceralnih senzoričnih nevronov, zato je pomemben mediator pri nocicepciji oziroma zaznavanju možno nevarnih stimulov ter njihovim prevodom v akcijskih potencial. Njegovo delovanje, poleg nekaterih drugih dražljajev, lahko vzbudi organska molekula, imenovana kapsaicin. Slednjega najdemo v sadežih rastlin rodu Capsicum in ga pojmujemo kot eno odločilnih molekul za pekoč okus teh plodov. Ob vezavi kapsaicina na TRPV1 v celico vdrejo kationi, ki spodbudijo različne celične procese, ključne za oblikovanje in prenos živčnega signala do možganov ter pojav vnetja. Posebej zanimive so dvolične posledice vezave kapsaicina, ki sicer vodijo do bolečine, draženja in vnetja, a omogočijo tudi refrakcijsko dobo kanalčka, ki predstavlja čas, ko slednjega ne moremo aktivirati ter desenzitacijo in degradacijo živčnih vlaken, kar povezujemo z analgetičnim učinkom te molekule. Ob redni daljši izpostavitvi kapsaicinu, ki ga lahko administriramo transdermalno ali injiciramo, se tako uspešno uporablja pri lajšanju kroničnih bolečin.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2020&diff=17626 2020-10-16T10:44:51Z

<p>Rebeka Jerina: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Biokemijski seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''poglavje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Jan Bregar||12||||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Vid Dobrovoljc||12||||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Nikola Janakievski||12||||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Eva Vene||12||Povezava vnetne bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Zala Perko||12||||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Erik Putar||14-15||||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Timotej Sotošek||14-15||||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Nika Tomsič||16||||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Aleksandra Rauter||16||||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Laura Unuk||17||||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Stefanija Ivanova||17||||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Jakob Tomšič||17||||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Neža Leskovar||18||||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Nika Perko||18||||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Ela Bizjak||19||||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Bor Krajnik||19||||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Maja Kobal||19||||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Mateja Milošević||20||||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Tinkara Božič||20||||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Martin Stanonik||20||||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Luka Stanković||21||||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Ana Pervanja||21||||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Nika Banovšek||21||||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Aljaž Simonič||22||||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Luka Hafner||22||||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Srna Anastasovska||23||||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Maruša Sernc||23||||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada<br /> Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali. <br /> Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti &lt;font color=red&gt; pregledni &lt;/font&gt; članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo &lt;font color=red&gt;2700 do 3000 besed &lt;/font&gt;, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. &lt;font color=red&gt;Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> * &lt;font color=green&gt;312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši&lt;/font&gt;<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2020_Povzetki_seminarjev&diff=16958 2020-05-03T15:25:10Z

<p>Rebeka Jerina: </p> <hr /> <div>=== Gregor Strniša: Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost===<br /> <br /> Invazivne vrste predstavljajo velik problem naši družbi, saj s svojim širjenjem spreminjajo ravnotežje v ekosistemih. Razumevanje njihovega genoma je ključnega pomena za prepoznavanje sposobnosti, ki jim omogočajo prilagajanje na življenje v drugačnih krajih. Okrogli gobi je ena najbolj uspešnih invazivnih vrst, ki se je razširila iz svojega nativnega območja ob Črnem morju vse do Velikih jezer v Ameriki. Znanstveniki so ob primerjavi genoma okroglega gobija z drugimi podobnimi vrstami odkrili nenavadne prilagoditve, zaradi katerih lažje preživi v novih okoljih. Razširjena področja genov za imunski sistem mu omogočajo boljšo obrambo pred drugačnimi mikroorganizmi, ki jih lahko sreča v novem okolju. Povečana so vsa območja genov za nastanek inflamosoma - celične strukture, ki inducira nadzorovano celično smrt preko piroptoze ob detekciji tujih mikroorganizmov. Ima razširjeno območje genov družine CYP (citokromi P450), ki sodelujejo pri razgradnji telesu tujih snovi. Odkrili so še nekaj mutacij genov na receptorjih za vid in voh, za katere pa se še ne ve, ali imajo vpliv na preživetje okroglega gobija v novih okoljih. Nadaljnje raziskave drugih invazivnih vrst bodo pokazale, kako lahko omejimo njihovo širjenje in ohranimo naše ekosisteme.<br /> <br /> === Jan Trebušak:Vbod klopa vrste Amblyomma americanum sproži proizvodnjo IgE in preobčutljivost preko celic T CD4+ in od MyD88 odvisnih poti.===<br /> Alergije, ki jih pri ljudeh sproži vbod klopa so bile zaradi zakasnelih simptomov diagnosticirane šele pred kratkim, predstavljajo pa naraščujočo grožnjo javnemu zdravju. Sindrom alfa-gal je alergija, ki se lahko pojavi, ko gostitelj ob vbodu pride v stik z molekulami galaktoze-alfa-1,3-galaktoze iz klopove sline, to je krvni antigen, ki v klopa pride s pitjem krvi svojega gostitelja. V takih primerih postane oseba alergična na vse vrste mesa, ki vsebujejo omenjeni ogljikov hidrat t.j vse rdeče meso, razen meso višjih primatov in ljudi. Alergija na rdeče meso je ena izmed redkih alergij na hrano, ki lahko sproži hude kožne, gastrointestinalne in respiratorne reakcije, oziroma anafilakso, buren odziv telesa najverjetneje sprožijo specifična protitelesa IgE. Ker so mehanizmi po katerih pride do alergij na hrano slabo poznani, je bil cilj študije razviti mišji model alergijske senzitizacija ob dermalni izpostavitvi klopom, ki bi ga potencialno lahko uporabili za identifikacijo mehanizmov, ki nazdorujejo sprožitev IgE protiteles povezanih z boleznimi, ki jih prenašajo klop.<br /> <br /> === Sara Golob: Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni ===<br /> <br /> Pri Alzheimerjevi bolezni pride do padca kognitivnih funkcij, kot so spomin, govor, pozornost, učenje, itd. Razvije se zaradi različnih dejavnikov, ki so lahko dedni ali okoljski. Eden od okoljskih dejavnikov je okužba z virusom Herpes simpleks tip 1. Ta povzroči večje izražanje ε4 alela apolipoproteina E, ki povzroča nalaganje Tau proteina in amiloida beta, ki sestavljata senilne plake pri Alzheimerjevi bolezni. To povezavo so odkrili s protitelesi proti virusu Herpes simpleks tipa 1 ter preko lizosomske okvare, zaradi katere pride do nalaganja amiloida beta v možganih. Dokazana je bila tudi povezava med Alzheimerjevo boleznijo in drugimi boleznimi (epilepsija, demenca, shizofrenija, fibromialgija, demenca), pri katerih je opazna kognitivna disfunkcija. Pri bolnikih z epilepsijo so odkrili amiloidne plake, ki so značilni za Alzheimerjevo bolezen, zaradi česar je večja verjetnost, da oboleli za epilepsijo zbolijo še za Alzheimerjevo boleznijo in obratno. Herpes simpleks virus redko povzroča tudi akutni encefalitis, katerega posledica so epileptični napadi, izguba spomina in spremembe v vedenju. Zato znanstveniki menijo, da je povezava med epilepsijo in Alzheimerjevo boleznijo tudi v apolipoproteinu E.<br /> <br /> === Ena Kartal: Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije ===<br /> Čeprav je bila vzpostavljena povezava med kroničnim vnetjem in nevrodegenerativnimi boleznimi, je bilo veliko odprtih vprašanj v zvezi s tem, kako celično staranje, proces, pri katerem celice, ki se nehajo deliti pod stresom, izločijo mešanico vnetnih beljakovin, vplivajo na te patologije. Raziskovalci poročajo, da staranje v astrocitih, ki je najbolj razširjena vrsta celic v možganih, vodi do škodljive '' ekscitotoksičnosti '' na kortikalnih nevronih, ki so vključeni v spomin.In pri tem pride do Alzheimerjeve bolezni,ki je najpogostejši vzrok demence pri starejših, je nepopravljiva, napredujoča možganska motnja, ki ubija možganske celice in postopoma uničuje spomin.<br /> <br /> === Lenka Stanković: Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 ===<br /> <br /> Karakteristika raka je njegova sposobnost spodbujanja angiogeneze, oziroma tvorba novih krvnih žil. Angiogeneza prispeva k rasti in napredovanju tumorja z induciranjem in vzdrževanjem kislega / hipoksičnega in imunosupresivnega okolja. Krvne žile v rakih so pogosto nefunkcionalne in omejujejo promet s T-celicami. Odkritje angiogenih zaviralcev naj bi pripomoglo k zmanjšanju umrljivosti zaradi karcinomov. Tukaj prikazujemo, da imunoterapija proti CD40 poveča tumorsko infiltracijo CD8+T, vendar regresijo tumorja dosežemo močneje, če anti-CD40 kombinirano z dvojno blokado Ang2 in VEGFA. Kombinacija anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonističkih protiteles proti anti-CD40 omogoča zavrnitev tumorjev pri sintetičnih modelih tumorjev. Proučevali so odzive tumorjev na anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonistična protitelesa proti CD40 v različnih modelih mišjega raka. V raziskavi so pokazali, da kombinacija agonističnih protiteles CD40 z dvojno blokado VEGFA/Ang2 povečuje protitumorski odziv v modelnih raka miši s pomočjo sinergistične regulacije genov in indukcije imunskega permisivnega mikrookruženja tumorja, za katero je značilno provnetno (M1 podobno) aktivacijo makrofagov, vaskularno normalizacija ter izboljšanja infiltracije in prostorska lokalizacija efektorskih T-celic. T-celice pošljejo signale drugim vrstam imunskih celic, vključno s citotoksičnimi T celicami CD8+. Citotoksične T-celice, znane tudi kot CD8 + T-celice, izražajo svoje TCR, ki jih spremlja glikoprotein CD8. CD8 + T-celice so povezane z učinkovitim ubijanjem rakavih celic: med antigensko specifično aktivacijo afiniteta med CD8 glikoproteinom, izraženim s celico CD8 + T, in molekulo MHC razreda I, izraženo z rakavo celico, ohranja obe vrsti celic skupaj. Tesna vezava T celic in rakavih celic skozi kompleks CD8 / TCR in kompleks antigen / MHC-I povzroči, da celice CD8 + T izločajo perforin in grancime, kar vodi v lizo rakavih celic.<br /> <br /> === Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije ===<br /> Po oceni World Health Organisation- World malaria report 2019 je v letu 2018 bilo 228 milijonov primerov malarije. Sladkor je glavni vir energije parazita, zato je razumevanje presnove sladkorjev pomembna tema, ki bi lahko predstavljala pomoč pri sestavljanju zdravil in izrivanju tega parazita. Glavna razlika v presnovi sladkorjev med parazitom in drugimi organizmi je prenašalec, ki sladkorje prenaša v celico. Za to je odgovoren šeskotni prenašalec PfHT1, ki je sposoben transportirati bodisi glukozo kot fruktozo. Strukturno pa je zelo podoben prenašalcem človeške celice GLUT. Prenašalec obsega 12 transmembranskih vijačnic, ki tvorijo osrednjo pot za vstop glukoze. Ključni del proteina pa predstavljajo izrastki ki delujejo kot receptorji za sladkorje. Sladkorne prenašalce še nadaljnjo stabilizirajo solne medcelične povezave. Druga velika razlika med PfHT1 in drugimi prenašalci je brez dvoma način odpiranja in zapiranja prenašalca, saj ni sestavljenen samo iz treh običajnih stanj (odprto navznoter, zaprto, odprto navznoter), temveč ga zaznamujejo še dve vmesni stanji (zaprto navznoter in zaprto navzven, angl. inward–occluded in outward-occluded). Nadaljnjo raziskovanje bi torej lahko omogočilo razvoja novih antimalaričnih zdravil, ki blokirajo uvoz sladkorja in zastrašujejo parazita do smrti oz. razvoja novih zaviralcev, ki so bolj specifični za blokiranje funkcije PfHT1, ne da bi pri tem vplivali na transport sladkorja v človeških celicah.<br /> <br /> === Maša Mencigar: Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem ===<br /> Apoptotske celice v telesu lahko nadzorujejo imunski sistem in preprečijo nezaželene imunske odzive na telesu lastna tkiva oziroma celice. Avtoimune bolezni so kronične, neozdravljive in predstavlajo velik zdravstven problem, saj bolniki trpijo, hkrati pa povzročajo velike stroške. Znanstveniki iz nemškega centra za raziskave rakavih bolezni (DKFZ - Deutsches Krebsforschungszentrum; angl: German Cancer Research Center) so našli receptor na imunskih celicah miši, ki aktivira ta zaščitni mehanizem in prepreči nevarne avtoimunske reakcije. Ta receptor se imenuje dektin-1, ki ima dvojno vlogo, saj veže beta-glukane in aksin proteine. Pomankanje dektina-1 vodi do simptomov avtoimunih bolezni šele proti koncu življenske dobe. Ključna pa je povezava med encimom NAHPH oksidazo-2 in dektinom-1, zato imajo ljudje, ki nimajo tega encima avtoimune bolezni.<br /> <br /> === Ema Kovačič: Izpostavljenost ploda materini mikrobioti ===<br /> Študija o prehodu materine mikrobiote skozi placento pri otrocih, ki so se rodili s carskim rezom prezgodaj in normalno. Mamam so vzeli brise iz različnih delov telesa, otrokom pa takoj po rojstvu vzorce iz ustne votline in mekonija. Imunski sistem pri otrocih se razvije že v prenatalnem obdobju. Našli so DNK nekaterih bakterij v posteljici, plodovnici in mekoniju, kar kaže, da se zarodek spopade z bakterijami že v prenatalnem obdobju. Odkritje bakterijskih zapisov v materničnem okolju nakazuje na koesistenco mehanizmov za kontorolo izpostavljenosti pri plodu in materini mikrobioti.<br /> <br /> === Zala Puklavec: Globoko učenje void do odkritja novih antibiotikov===<br /> Zaradi naglega pojava bakterij, ki so odporne na antibiotike, raste potreba po odkritju novih antibiotikov. Zato so naučili globoko nevronsko mrežo napovedati molekule, ki imajo antibakterijske lastnosti. S tem računalniškim modelom so odkrili, da ima halicin (c-Jun N-terminal kinase inhibitor SU3327) zelo močne antibakterijske lastnosti. Nadaljni eksperimenti so pokazali, da deluje na drugačen način kot večina antibiotikov. Za razliko od ostalih je halicin proti E.coli bakteriociden, ne le bakteriostatski. Testirali so ga tudi na bakterijah, za katere po mnenju Svetovne zdravstvene organizacije najnujneje potrebujemo neko obliko zdravljenja, in proti veliki večini je deloval zelo uspešno. Z daljšo izpostavljenostjo E.coli halicinu so poskušali izolirati mutantske celice, ki so razvile odpornost nanj, vendar jim ni uspelo, kar kaže na to, da te odpornosti ni možno ali pa se vsaj veliko težje razvije. Z še nekaj eksperimenti pa so prišli do zaključka, da halicin disipatira transmembranski pH potencial in najverjetneje veže Fe3+ pred pH disipacijo in povezavo z membrano.<br /> <br /> === Martin Stanonik: De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc===<br /> Odkrivamo vedno več proteinov, ki so nastali iz de novo genov. To pomeni, da so se kodirali iz nekodirajočih delov DNA, kar velja za redek proces. V laboratorijskih poskusih je preveliko izražanje teh nastajajočih genov omogočalo boljše delovanje celice v primerjavi z prevelikim izražanjem že vzpostavljenih genov in motenje tega procesa ni vplivalo na delovanje celice. za osebek so uporabili kvas, saj glive kvasovke vsebujejo najboljše lastnosti za izražanje genov.To prikazuje velik potencial, še posebej za timinsko bogate sekvence za izdelavo transmembranskih proteinov. Iz kombinacij različnih analiz je bil predlagan nov model genskega nastanka. Ta odkritja, bi lahko omogočala nov način izdelave polipeptidov, ki nastanejo iz teh, de novo, delov DNA.<br /> <br /> === Klara Kočman: Koronavirus: SARS-CoV in SARS-CoV-2 ===<br /> Koronavirusi so veliki, pozitivni RNA virusi. Okuženost z virusom lahko opazimo z značilni simptomi kot so vročina, kašelj in pomanjkanje zraka. Najnovejši tip koronavirusa, SARS-CoV-2, tudi 2019-nCoV, se je prvič pojavil 31. decembra 2019 v mestu Wuhan na Kitajskem. Transport virusa s človeka na človeka je pogost pri telesnih stikih z bolnikom. SARS-CoV-2 primerjajo z virusama MERS-CoV in SARS-CoV. Na podlagi celotne analize genoma in proteinov je virus bližje SARS­-CoV kot MERS-CoV, saj obstaja več kot 90% genetska podobnost s SARS-CoV, medtem kot je s MERS-CoV-jem neznatna. Genom virusa SARS-CoV-2 je sestavljen iz približno 30 kilobaz, ki jih kodira več strukturnih in nestrukturnih proteinov. S SARS-CoV si je podoben po dolžini genoma ter podobnem mehanizmu vstopa v celico ter uporabi celičnih receptorjev (ACE2). Glikoprotein ACE2 se nahaja na površini membrane in je pomemben za vezavo receptorjev gostiteljskih celic in gostitelja. Transmembranski proteini virusa se vežejo na človeško celico preko receptorjev ACE2 (encim za pretvorbo angiotenzina 2). Med 120 sekvencami virusa SARS-CoV-2 ni bila zanana niti ena mutacija, zato lahko s ciljenjem slednjih nudimo zaščito. Znanstveniki z opazovanjem odziva na protitelesa pri miših raziskujejo cepivo.<br /> <br /> ===Timotej Sotošek: Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje Vzhodni respiratorni sindrom koronavirusa===<br /> Zdravilo remdesivir (bolj natančno Remdesivir trifosfat) je preiskovalna spojina, ki je bilo sprva ustvarjeno za zdravit Ebolo. Ima širok spektrum protivirusnih aktivnosti proti RNA virusih kot na primer koronavirusi , Filovirusi,… Njegova tarča je multi-podenotni RNA sintezni kompleks znan pod imenom RNA-odvisna RNA polimeraza na katerem s pomočjo drugih proteinov poteka sinteza virusne RNA verige. Remdesivir je nukleotidni analog ATP-ja s katerim tekmuje za vezavo v nastajajočo se virusno RNA verigo po tem, ko je virus že okuži celico. V primeru, da se Remdesivir uspe vezat v virusno RNA verigo bo ta prenehala rast in tako postala ne uporabna. To pomeni, da je Remdesivir le inhibitor, ki upočasnjuje oz. preprečuje nadaljno širjenje virusa. Raziskave so preiskovale mehanizem inhibicije na virusu Srednje Vzhodni respiratorni sindrom(MERS-CoV) in ga primerjali kako je učinkovit v primerjavi inhibicije virusa Ebola, ter na splošno kako zelo je njegov mehanizem učinkovit. Ker sta si MERS-CoV in SARS-CoV-2 sorodna virusa bi lahko zdravilo Remdesivir pomagal ozdravit obolele z SARS-CoV-2 koronavirusom.<br /> <br /> ===Nika Perko: Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk===<br /> Komarji vrste Aedes aegypti so eni glavnih povzročiteljev bolezni kot so denga, rumena mrzlica, zika in čikungunja. Najdemo jih v tropskem in subtropskem pasu ter celo v Evropi. Znanstveniki Univerze Nove Mehike so poiskali način, kako preprečiti širitev omenjenih bolezni. Ustvarili so naraven insekticid, ki prepreči razvoj komarjev, ko so ti še v stopnji ličinke. Larvicid je sestavljen iz enostavnih komponent: eteričnega olja pomarančevca Citrus sinensis in gliv kvasovk vrste Saccharomyces cervevisiae. Sintetiziran je bil s postopkom enkapsulacije eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk. Med korake tega procesa so vpeljali še enega novega. Z njim so odstranili odvečno eterično olje, ki je ostalo na zunanji strani celic. To je bilo izredno pomembno, saj je odvečno olje delovalo kot repelent. Z različnimi analizami in primerjavami so ugotovili, da struktura celične stene, membrane in oljnih kapljic ostane po enkapsulaciji nespremenjena. Pomembna ugotovitev je bila tudi, da se kvasovke po enkapsulaciji niso mogle več razmnoževat. Testi efektivnosti so bili vzpodbudni, saj je bil larvicid učinkovit pri vseh ličinkah. Najbolj pa je bil učinkovit pri začetni razvojni stopnji ličink. Novi larvicid ima kar nekaj dobrih lastnosti: je naraven, ne more se nenadzorovano širit in tako škodit vodnemu okolju, izdelava je relativno poceni, je neškodljiv za ljudi, dolgo učinkuje…<br /> <br /> === Anja Moškrič: Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR-Cas tipa I ===<br /> Sistem CRISPR-Cas je imunski mehanizem, ki je značilen za veliko prokariontov in arhej. Gre za gruče enakomerno prekinjenih palindromskih ponovitev, ki nosijo zapis za obrambo proti vdoru tujega dednega materiala (virusov in plazmidov). Kratica Cas pa predstavlja s CRISPR povezane gene, ki kodirajo zapis za nekatere encime, ki cepijo DNA. CRISPR lokus je sestavljen iz ponavljajočih CRISPR genov, med katerimi so vmesniki. Na teh pa je shranjena kopija dela zapisa virusa oz. plazmida. S študijo so želeli izvedeti vpliv infekcije bakterije Pseudomonas aeruginosa, s temperiranim oziroma lizogenim bakteriofagom (DMS3), ki se v obliki profaga vključi v dedni material gostiteljske celice. Izbrana bakterijska vrsta vrši sistem CRISPR-Cas tipa I-F. Za primerjavo so za eksperimente uporabljali tudi nekatere mutirane vrste bakterij,ki so imele napako v CRISPR lokusu. Eksperimenti so pokazali, da ob infekciji z nemutiranimi bakteriofagi bakterije niso sposobne uspešno odstranit le-teh. Iz zbranih rezultatov so ugotovili, da je v tem primeru imunski mehanizem slabo prilagojen celicam, saj povzroča imunopatološki efekt (avtoimunost). Do tega pride zaradi nepopolnega ujemanja zapisa na CRISPR vmesnikih s profagi. Če bakteriofagi ne kodirajo zapisa za acr gene (anti-CRISPR geni, ki zatirajo omenjen mehanizem), lahko to privede do izgube sistema CRISPR-Cas skozi evolucijo. <br /> <br /> ===Maja Deutsch: Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline===<br /> Med vsemi mnogoceličarji in njihovimi mikrobiomi se pojavijo številne medsebojne kemične interakcije. Številne molekule, za katere je znano, da jih proizvaja mikrobiom, izrazito vplivajo na ravnovesje med zdravjem in boleznijo. Z uporabo masne spektrometrije in vizualizacije podatkov so bili ocenjeni učinki mikrobioma na celotno kemijo sesalca s primerjavo podatkov metabolomike pri aseptičnih miši in specifičnih-mikroorganizmov-prostih miši. Ugotovljeno je bilo, da mikrobiota vpliva na kemijo vseh organov. To je vključevalo aminokislinske konjugacije žolčnih kislin, ki so bile uporabljene za proizvodnjo fenilalanoholne kisline, tirozoholne kisline in levcoholne kisline, ki prej še niso bile identificirane, kljub obsežnim raziskavam kemije žolčnih kislin. Ti konjugati žolčne kisline so bili najdeni tudi pri ljudeh, vendar so bile bolj pogoste pri bolnikih z vnetnimi črevesnimi boleznmi, cistično fibrozo in pri dojenčkih. Te spojine so agonizirale farnezodini receptor X (FXR) in miši, ki so imele na novo odkrite kisline, so pokazale zmanjšano izražanje genov za sintezo žolčne kisline. Potrebne pa so nadaljnje raziskave, da se ugotovi, ali imajo te spojine fiziološko vlogo v sesalcih in ali prispevajo k črevesnim boleznim, ki so povezane z mikrobiomsko disbiozo.<br /> <br /> === Hana Glavnik: Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo ===<br /> Pri raziskovanju malarije so znanstveniki odkrili pojav, ki so ga poimenovali rozeta. Rozeta je skupek neokuženih rdečih krvnih celic, ki s pomočjo proteinov, ki jih sintetizira parazit obkolijo okuženo rdečo krvno celico. Parazit se tako zaščiti pred gostiteljevim imunskim sistemom, saj ga monocite tako obkoljenega težje zaznajo. Raziskovali so tvorjenje rozet pri različnih pogojih. Izoliranim parazitom so dodali različne vrste monocitov in opazovali njihovo reakcijo. S tem so odkrili tudi protein IGFBP7, ki inducira tvorjenje rozet, vendar le ob prisotnosti dodatnih serumskih faktorjev. Odkritje proteina IGFBP7 je vodilo v odkritje novega načina tvorjenja rozet, tako imenovanega tipa II, saj za razliko od prvotnega tipa I, ta ne poteče spontano. Nato so pod drobnogled vzeli tvorjenje rozet s proteinom IGFBP7. Z namenom, da bi lahko razložili ta pojav, so eritrocite zdravili z encimom Heparinaza in jih nato izpostavili pogojem, ugodnim za nastanek rozet ter opazovali dobljene rezultate. IGFBP7 opozori parazite na prihod monocitov, nato parazit ta protein uporabi kot most, ki se poveže še z dvema človeškima proteinoma na zdravem eritrocitu in tako pomaga pri tvorjenju.<br /> <br /> === Eva Ratajc: Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika ===<br /> Virus Zahodnega Nila (WNV) je glavni povzročitelj virusnega encefalitisa v Združenih državah Amerike. Tudi okužbe z virusom zika (ZIKV) povzročajo resne nevrološke bolezni in prirojene napake. Znano je, da ima pri sproženju imunskega odziva pomembno vlogo Z-DNA vezavni protein 1 (ZBP1). Z-DNA vezavni protein (ZBP1) je citoplazmatski DNA-senzor, ki služi kot receptor za prepoznavanje molekularnih vzorcev. Ob okužbi telesa z virusom zika in virusom Zahodnega Nila se poveča izražanje ZBP1 v mišjih možganih. Zaradi tega so raziskovalci želeli raziskati vlogo ZBP1 pri omejitvi patogeneze pri osebkih, okuženih z navedenima virusoma. Pri miših z izbitim genom za ZBP1 −/− so zaznali višjo stopnjo okužb in višjo smrtnost po okužbi tako s smrtonosno kot z nesmrtonosno obliko virusa Zahodnega Nila kot pri miših divjega tipa (WT). Raziskovalci so ugotovili, da ima ZBP1 ključno vlogo pri omejitvi patogeneze pri miših. ZBP1 prepreči širjenje okužbe WNV in ZIKV v primarnih mišjih celicah in je pomemben za preživetje osebkov z boleznimi, ki ju povzročata omenjena virusa. Pomanjkanje ZBP1 je povzročilo večje količine virusa v serumu in možganih pri ZBP1−/− miših v primerjavi z divjim tipom. Pri ZBP1−/− miših so zaznali tudi višje virusne titre, ki so jih povezali z znižanimi leveli protivirusnih citokinov in kemokinov.<br /> <br /> === Lana Kores: Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona ===<br /> Ionski kanalček TRPA1 (znan tudi kot wasabi receptor) je receptor za dražilce, ki povzročajo akutno bolečino in nevrogeno vnetje. Toksin za wasabi receptor WaTx je toksin avstralskega škorpijona, ki s pasivno difuzijo preide čez membrano celice in se nato veže na TRPA1. WaTx deluje na podoben način kot elektofilni dražilci receptorja, le da v nasprotju z njimi kanalčka ne odpre direktno, ampak le stabilizira njegovo odprto stanje in tako zmanjša prepustnost za Ca2+ ione. Koncentracija Ca2+ ionov je zato zadostna, da povzroči akutno bolečino, ne pa dovolj velika, da bi prišlo do nevrogenega vnetja, kot npr. pri elektrofilnem dražilcu AITC.<br /> <br /> === Eva Vene: Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo ===<br /> Neuspešnost cepiva ter dejstvo, da je, zaradi širjenja življenjskega prostora A. aegypti, ogroženih 50% svetovnega prebivalstva, je vodilo v nadaljnje raziskave, ki bi omogočile zaustavitev širjenja virusa z restrikcijo slednjega že v samih prenašalcih. Možnost za uspeh obetajo protitelesa s širokim spektrom nevtralizacije (ang. broadly neutralizing antibodies), saj so slednja uspešna proti antigensko različnim virusom. Zaenkrat tovrstna protitelesa kot možnost zatiranja širjenja bolezni še niso bila uporabljena proti katerikoli vrsti virusa, njihova upešnost pa se je pokazala pri drugi veji mikroorganizmov.<br /> Za raziskave so uporabili človeško protitelo 1C19, katerega uspešnost proti serotipom DENV je bila znana že iz prejšnjih let. V genom transgenih komarjev je bil dodan modificiran gen za scFv 1C19 (človeško protitelo, ki deluje proti DENV) in fluorescenčni označevalec, ki se sintetizira za protitelesom, tipa tdTomato. V komarje je bil določen serotip virusa vnešen z okuženo krvjo. Določili so dva možna izida okužbe: ponekod je DENV prosto prehajal čez srednje črevo – komarji so postali prenašalci virusa; v drugem primeru pa so izražena protitelesa nevtralizirala serotip virusa in s tem preprečila prenos okužbe naprej. <br /> <br /> === Nina Žgajnar: In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov ===<br /> Konvencionalne metode genskega inženirstva za reševanje zapletenih problemov se običajno osredotočajo na prilagajanje enega ali več genov. Sintezna biologija pa k tem težavam pristopa z novega vidika: ukvarja se z večjimi spremembami obstoječih celičnih struktur in z izgradnjo bolj zapletenih sistemov. Sinteza kemičnega sistema, ki je sposoben razmnoževanja in razvoja, je glavni cilj sintezne biologije. To bi lahko dosegli z in vitro rekonstrukcijo minimalno samozadostne centralne dogme. Znanstveniki so ustvarili sistem in vitro translacije, ki omogoča samostojno podvajanje in izražanje večjih genomov. Demonstrirali so samostojno podvojevanje genoma iz več kot 116 kilobaz, ki zajema celoten niz translacijskih faktorjev E. coli, vse tri ribosomske RNA, sistem za obnavljanje energije ter RNA in DNA polimeraze. Vzporedno z replikacijo DNA sistem omogoča sintezo vsaj 30 kodiranih translacijskih faktorjev, od katerih je polovica izražena v enakih ali večjih količinah od njihovih vhodnih nivojev. Vprašanje, kaj vse lahko dosežemo s samosestavljanjem kemijskih spojin, velja za eno izmed pomembnejših vprašanj v znanosti. Sintezna biologija tukaj postavlja nov cilj: sestaviti organizem izključno iz majhnih molekul. Potencialno bi tako lahko ustvarili organizme, ki bi čistili nevarne odpadke na nedostopnih mestih, rastline, ki bi zaznavale določene kemikalije in se nanje ustrezno odzvale, proizvedli čisto gorivo na učinkovit in trajnosten način ali prepoznavali in uničevali tumorje.<br /> <br /> === Luka Šegota: Sulfolipid-1, kot sprožilec kašlja pri tuberkuloznih bakterijah ===<br /> Tuberkuloza je pljučna bolezen, ki jo povzroča bakterija Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Med sesalci se ta bakterija prenaša s kašljem. Kašelj je vzbujen zaradi nociceptorske inervacije pljuč (porazdelitve končičev nevronov po pljučih). Mycobacterium tuberculosis sintetizira molekule, ki interagirajo z nevroni v pljučih in pri tem se poveča intercelularna koncentracija kalcija. Na osnovi merjenja koncentracije kalcija v dorzalnem koreninskem gangliju mišjega zarodka po stiku s bakterijo so ugotovili, da Mtb ativira nevrone. Da bi odkrili vzbujevalno molekulo, so ganglije mišjih zarodkov izpostavili izvlečkom (Mtb) celične membrane, frakcijam citosola, proteinom iz celične stene in proteinom Triton X-114. Ugotovili so, da le deli celice, ki vsebujejo lipide, vzbujajo nevrone. Molekula, ki je za to »odgovorna« se imenuje sulfolipid-1. Gre za najbolj sulfatiran glikolipid, ki se nahaja v zunanji membrani celične stene Mtb, najden je le v patogenih bakterijah te vrste. Eksperimenti so pokazali, da živali kašljajo le zaradi sevov Mtb bakterij, ki so sposobne sintetizirati sulfolipid-1. Morebitna terapija, ki zavira kašelj, bi lahko znatno zmanjšala prenos tuberkuloze in drugih bolezni.<br /> <br /> === Jan Kogovšek: Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije ===<br /> Parazit Plasmodium falciparum je najpogostejši povzročitelj malarije pri ljudeh. S to boleznijo zboli več milijonov ljudi, umre pa jih približno 400 000 vsako leto. Antimalariki, ki so v uporabi, počasi izgubljajo svojo moč, kajti parazit je postal rezistenten na do sedaj najbolj učinkovito terapijo, imenovano artemisinin combination therapy (ATC). Znanstveniki so v ta namen odkrili tri nove zdravilne učinkovine, ki delujejo kot inhibitorji plazmepsina IX in plazmepsina X, ki ju izloča Plasmodium. Odkrili so, da inhibitorji zavrejo izločanje dodatnih proteinov iz celic, ki parazitu omogočajo vstop v eritrocite. S testi so ugotovili, da WM4 in WM5, ki sta prva na novo odkrita inhibitorja, delujeta na isti princip, vendar ne vplivata na dozorevanje in širjenje oocist parazita. WM382, naknadno odkrit inhibitor, pa poleg istih mehanizmov, kot jih imata WM4 in WM5, deluje tudi na dozorevanje oocist v fazi rasti parazita v jetrih. Za vse tri učinkovine so tudi dokazali specifično delovanje na oba plazmepsina. S tem ko WM382 zavira rast in zorenje oocist parazita, se tudi zmanjša prenašanje parazita na komarje in možnost prenosa rezistence na že obstoječe antimalarike.<br /> <br /> === Kostadin Mitkov: Heat shock factor 2 helps the cells to maintain cell adhesion and protect themselves against stress ===<br /> Maintenance of protein homeostasis is essential for the cell viability and growth. The cells in the human body are constantly exposed to environmental stress factors, which tend to disturb that protein homeostasis maintenance. For the first time, research shows that the contacts between cells, known as cell adhesion, are essential for cells to survive stress and maintain protein homeostasis. Cell adhesion is relied on heat shock factors (HSFs). HSFs mediate their protective functions through diverse genetic programs, which are composed of genes encoding molecular chaperones and other genes crucial for cell survival. Scientists have found that HSF2 is critical for cell survival during prolonged proteotoxicity, and their RNA sequencing (RNA-seq) analyses revealed that cells that lack HSF2 have weakened viability which is not caused by inadequate induction of molecular chaperones but is due to marked downregulation of cadherin superfamily genes. They demonstrated that maintenance of cadherin-mediated cell-cell adhesion is dependent on HSF2 and it is also required for protection against stress induced by proteasome inhibition. This study identifies HSF2 as a key regulator of cadherin superfamily genes and defines cell-cell adhesion as a determinant of proteotoxic stress resistance.<br /> <br /> === Jan Bregar: Prehodno neintegrativno izražanje reprogramirnih faktorjev v jedru spodbuja večplastno izboljšanje starajočih se človeških celic ===<br /> Za staranje je značilno postopno poslabševanje delovanja na nivoju molekul in posledicno tudi celic, tkiv in nenazadnje celotnega organizma. Na kromatinskem nivoju s starostjo povezujemo pogostejše pojavljanje epigenetskih napak, izčrpavanje matičnih celic, senescenco in deregulirano celično/tkivno homeostazo. Jedrno reprogramiranje, ki vodi k pluripotenci (zmožnost celice, da se diferencira v kateri koli zarodni sloj), lahko vrne celico, tako starostno kot tudi identitetsko, v stanje ekvivalentno embrionalni celici. Ta raziskava je dokazala, da lahko dosežemo celični preporod pri človeških celicah, ki smo jih izolirali iz naravno staranih posameznikov. Pokazali so, da lahko neintegrativno prehodno celično reprogramiranje na podlagi mRNA naglo spremeni širok spekter znakov staranja v začetni fazi, ko se epigenetski izbris celične identitete še ni zgodil. Pokazali so, da se proces preporoda pojavi pri naravno staranih človeških in mišjih celicah, s tem ko se povrne izgubljena funkcionalnost v obolelih celicah, brez da bi posegli v celično identiteto.<br /> <br /> === Ajda Beltram: Identifikacija potencialnih komponent cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV ===<br /> Cilj te raziskave je pomoč pri izdelavi cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV, saj sta si virusa genetske zelo podobna. Dokazali so veliko podobnost med posameznimi strukturnimi proteini SARS-CoV-2 in SARS-CoV, ter nekoliko manjšo med SARS-CoV-2 in MERS-CoV. Primerjali so tudi eksperimentalno določene epitope celic T in B strukturnih proteinov (S in N) SARS-CoV s strukturnimi proteini SARS-CoV-2. Epitope celic T so dobili na podlagi pozitivnega odziva celic T na epitope ali pozitivne vezave MHC na epitope, epitope celic B pa s pozitivno vezavo celic B na epitope. Ugotovili so, da se 23 % epitopov celic T in 16 % epitopov celic B SARS-CoV popolnoma ujema s SARS-CoV-2 in so tudi brez mutacij. Velik potencial predstavljajo predvsem epitopi celic T, saj je bilo dokazano pri SARS-CoV, da omogočajo dolgotrajno zaščito. Pri celicah B pa imajo za sprožitev imunskega odziva s protitelesi za SARS-CoV-2 več potenciala linearni epitopi celic B podenote S2 proteina S, saj se jih veliko popolnoma ujema s SARS-CoV-2. Zaradi vsega tega so najverjetneje cepiva, ki spodbudijo odziv celic T, in cepiva, ki poskušajo izzvati protitelesa, ki se vežejo na linearne epitope podenote S2, efektivna in bi morala biti v prihodnje še bolj raziskana.<br /> <br /> === Nadja Dolničar: Interferonsko spodbujeno izločanje živega patogena Cryptococcus neoformans iz makrofagov kot posledica virusne okužbe ===<br /> V življenju so ljudje pogosto izpostavljeni več okužbam hkrati. Ker so le-te pogosto proučevane posamično, ostaja njihovo vzajemno delovanje dokaj nepoznano. Zato so se znanstveniki odločili raziskati, kako na odziv prirojenega imunskega sistema na glivo Cryptococcus neoformans vpliva sočasna virusna okužba. Kljub temu da makrofagi ohranijo normalno sposobnost fagocitoze in onesposobljanja mikroba, vseeno izražajo izjemno povečano nagnjenost k vomocitozi. To je mehanizem pri katerem makrofag izloči glivo, ji pri tem ne škodi, sam pa tudi ne razpade (non-lytic extrusion). Aktivacija vomocitoze je sprožena s strani interferonov tipa 1, protivirusnih molekul, ki predstavljajo eno od družin citokinov, majhno molekulskih proteinov, ki skrbijo za komunikacijo med celicami in njihovo aktivacijo ob odzivu prirojenega imunskega sistema na patogeni mikrob oz. virus. Interferoni z vezavo na interferonske receptorje na makrofagu signalno sprožijo izločitev glive iz makrofaga. Tako lahko sklepamo, da ta do sedaj neopazovan pojav predstavlja nekakšno hierarhijo, ki ji celice imunskega sistema sledijo oz. »reprioritizacijo«, pri kateri lahko celice imunskega sistem spreminjajo frekvenco izločanja prvotnega patogena glede na stopnjo ogroženosti s strani sekundarne okužbe. Tako makrofage na nek način sprostijo in jim omogočijo boj proti sekundarni virusni okužbi. Ta pojav pa je lahko za organizem tako ugoden kot tudi usoden, odvisno od okoliščin.<br /> <br /> === Tinkara Božič: Atomske zgradbe zaprtih in odprtih protonskih kanalčkov BM2 razkrivajo transportni mehanizem gripe tipa B === <br /> Poznamo tri različne viruse, ki povzročajo gripo (influenco) – to so virusi A, B in C; vsak od njih pa vsebuje drugačno verzijo proteina M2 (AM2, BM2, CM2). M2 je ionsko reguliran kanalček, ki prenaša protone skozi zunanjo virusno membrano (ali lipidno ovojnico). Kisel pH aktivira protonski kanalček BM2 gipe tipa B, da se sproži odvijanje virusa. Za razliko od proteina AM2, ki povzroča gipo tipa A in usmerja protone samo v notranjost kanalčka, sprošča BM2 protone navznoter in navzven. Z uporabo jedrske magnetne resonančne (NMR) spektroskopije v trdnem stanju so znanstveniki pokazali strukture transmembranske domene odprtega in zaprtega kanalčka BM2 v fosfolipidnem okolju. Pri aktivaciji transmembranske vijačnice povečajo kot nagnjenosti za 6 ° in svoj povprečen premer za 2,1 Å. Ob tem pridobi BM2 gibanje za aktivacijo, podobno škarjam, ki je zelo drugačno od gibanja AM2 – ta se izmenično odpira in zapira in tako protonom omogoči vstop. Prav zaradi simetričnega gibanja, podobnega škarjam, se lahko protoni skozi kanalček BM2 premikajo v obe smeri, skozi AM2 pa samo v eno smer. Protonskoselektiven histidin in obramben triptofan v odprtem kanalčku BM2 se reorientirata podobno kot v AM2, ob čemer so znanstveniki ugotovili, da je dinamika stranskih verig ključna za prenos protonov po kanalčku.<br /> <br /> === Tina Javeršek: Vpliv trans maščobnih kislin na potek apoptoze preko mitohondrijske pozitivne povratne zanke JNK-Sab-ROS === <br /> Trans maščobne kisline sodijo v skupino nenasičenih maščobnih kislin, ki imajo v svoji strukturi eno ali več dvojnih vezi. Linolelaidinska in elaidinska kislina, ki sta najbolj pogosti trans maščobni kislini v prehrani, nastajata med industrijsko delno hidrogenacijo rastlinskih in ribjih olj. Pri raziskovanju vpliva elaidinske kisline na potek apoptoze so uporabili sredstvo doksorubicin, ki povzroča okvare DNK. Zdravljenje celic z doksorubicinim, ki so bila pred tem izpostavljena elaidinski kislini, je zmanjšalo njihovo sposobnost preživetja, medtem ko cis-izomera elaidinske kisline (oleinska kislina) ni imela takšnega učinka. Elaidinska kislina torej služi kot spodbujevalni faktor pri apoptozi tako, da olajša vzajemno povečanje mitohondrijske generacije ROS in aktivacijo JNK, ki jo posreduje Sab (mitohondrijska pozitivna povratna zanka JNK-Sab-ROS). ROS (reactive oxygen species) so mitohondrijske reaktivne kisikove zvrsti, nastanejo pa kot stranski produkti mitohondrijske presnove. Kopičenje ter zvrsti je potencialno škodljivo, saj visoke ravni le teh povzročajo okvare DNK. Doksorubicin sproži generacijo ROS in poznejšo aktivacijo ASK1-p38/ JNK, kar vodi v celično smrt. Zmanjšanje mitohondrijske ROS je zaviral potek apoptoze ter nastanek generacije ROS samo v prisotnosti elaidinske kisline, vendar ne, ko te ni bilo. To je bil dokaz, da imajo trans maščobne kisline potencial, da sprožijo aktivacijo pozitivne povratne zanke JNK-Sab-ROS, ki pa se ne aktivira v pogojih brez trans maščob. Te maščobne kisline, predvsem industrijske, povečajo tveganje za razvoj in napredovanje različnih obolenj, kot so vnetja, metabolični sindrom, nevrodegenerativne motnje in tudi kardiovaskularne bolezni.<br /> <br /> === Vid Dobrovoljc: Povratni vsadek za dolgotrajno inkapsulacijo in preživetje terapevtskih celic v njem === <br /> Celična terapija je način zdravljenja, pri katerem bolniku presadijo terapevtske celice, ki bodisi nadomeščajo ali pa zdravijo bolne celice. Glavni problem celičnih terapij je imunski odziv. V tej raziskavi se posvečajo obrambi terapevtskih celic z uporabo polimernih makroinkapsulacijskih naprav. Napravo za makroinkapsulacijo, ki so jo uporabili, v grobem sestavlja celični rezervoar, pritrjen na porozno polimerno membrano PCTE. Naloga naprave je zaščita terapevtskih celic pred imunskim odzivom. Ta se kaže na dva načina. Prvi je direkten s citokini, drugi pa je posreden z nastankom fibrotične kapsule. Za zavrtje prvega potrebujemo membrano s porami ustrezne velikosti, ki morajo preprečevati prehod določenim komponentam imunskega sistema, po drugi strani pa morajo omogočati prehod hranilom. V raziskavi so določili, da so najustreznejše pore velikosti med 0,8 µm in 0,4 µm. Za zmanjšanje drugega načina pa je pomembno, da je naprava čim bolj biokompatibilna. To so dosegli z razvojem nove prevleke THPT. Uporabnost novih naprav so preizkusili še na več načinov. Naprave so se na preizkusih dobro obnesle, saj so terapevtske celice v napravah funkcionirale čez celoten 130-dnevni test. Diabetične miši, ki so jim z uporabo naprav presadili langerhansove otočke, pa so skozi daljša obdobja kazale glikemično sliko zdravih miši.<br /> <br /> === Polona Leban: Zakaj so motnje avtističnega spektra (ASD) pogostejše pri dečkih kot pri deklicah? ===<br /> Vzrok za to še ni čisto jasen. Vsaka celica našega telesa vsebuje dva spolna kromosoma, pri ženski populaciji XX, pri moški pa XY kromosoma. Primerjali so dva gena NLGN4, enega na X in enega na Y kromosomu, ki sta ključna za vzpostavitev in delovanje sinaps. Do nedavnega so domnevali, da sta gena NLGN4X in NLGN4Y, ki kodirata proteine, delovala v enaki meri v nevronih. Izkazalo se je, da je dinamika proteina NLGN4Y v možganskih celicah manjša, zato ni sposoben vzdrževati sinapse, kar oslabi prehajanje signalov med nevroni. Mutacije na NLGN4X lahko vodijo do hudih učinkov na delovanje možganov, medtem ko vloga NLGN4Y še ni čisto jasna, a naj bi bile težave s slednjim posledica ene same aminokisline. Med drugim so odkrili, da je regija, ki obdaja to aminokislino v NLGN4X občutljiva na mutacije. Ko se na enem od genov NLGN4X pojavi mutacija, lahko drugi gen pri ženskah temu kompenzira. NLGN4Y pri moških pa ne more prevzeti funkcije mutiranega gena, ker se že sam funkcionalno razlikuje. Nezmožnost kompenzacije nam pomaga razložiti, zakaj je ASD pri moških, ki imajo samo en X kromosom, pogostejša. Podrobnejše znanje teh proteinov bi zdravnikom, ki zdravijo bolnike z mutacijami na NLGN4X, pomagalo bolje razumeti njihove simptome.<br /> <br /> === Stefanija Ivanova: Perceived healthiness of food items and the traffic light front of pack nutrition labelling: choice-based conjoint analysis and cross-sectional survey ===<br /> Perceptions of healthy eating are thought to be an important determinant, where food items are often categorised as healthy or unhealthy.Traffic light labelling was introduced to aid the selection of healthier choices with a simple red, amber green colour coding system. In this study, the goal was to find out whether it was fat, saturated fat, sugar or salt people most wanted to avoid and see whether the traffic light labelling was influencing this decision. Foods with a high sugar content and products flagged with a red label were by far perceived to be the worst for health . These behaviours highlight possible unintended consequences of the effect of the single-nutrient approach on perceptions of health. Focusing on reducing the intake of one nutrient might drive people to neglect the overall quality of the food, which gives the food industry the chance to modify other ingredients, regardless of their healthiness, at the same time as keeping the level of the focused nutrient in the recommended quantities. Despite a lack of knowledge about the daily intake recommendations, decisions made by participants concerning the healthfulness of food products were significantly influenced by sugar content. TLL appears to guide consumer beliefs in the absence of deep knowledge. Taking all of the factors that would affect the process of reading nutrition labelling into consideration would increase the effectiveness of the use of TLL. This includes individual motivation and interest in health, educational level, socioeconomic status and other critical factors.<br /> <br /> === Sara Jerič:Plenitev morskih virusov s strani negostiteljskih organizmov ===<br /> Morski virusi so najštevilčnejša oblika življenja v morjih in oceanih. S svojimi okužbami močno vplivajo na ravnotežje v morskih ekosistemih in na dinamiko populacij gostiteljskih organizmov. Da bi torej lahko razumeli, kako se to ravnotežje ohranja, je pomembno poznati tudi kako se v naravi zmanjša številčnost virusov. Eden izmed bioloških načinov so negostiteljski organizmi. Virusom namreč predstavljajo oviro oz. nevarnost. V raziskavi so se odločili pogledati, kako negostiteljski organizmi z vmešavanjem v prenos parazita v sistem parazit – gostitelj vplivajo na zmanjšanje številčnosti virusov. Za model virusnega sistema so uporabili fitoplanktonski virus PgV-07T. S prvim eksperimentom so testirali 10 morskih negostiteljskih organizmov. Najslabše so številčnost virusa zmanjšali vitičnjaki, ceponožci in školjke, najboljše pa krpaste spužve. Slednje so zato raziskovali še naprej v drugem eksperimentu, kjer so gledali spužvino odstranjevanje virusov v daljšem časovnem obdobju. Spužve so se izkazale kot izredno učinkovit odstranjevalec virusov. Rezultati so pokazali, da so negostiteljski organizmi učinkoviti v zmanjševanju številčnosti virusov z vmešavanjem v prenos. Pri tem so najverjetje pomembni tudi drugi okoljski faktorji, katerih učinke še ne poznamo. Na ohranjanje morske biodiverzitete imajo torej poleg virusov, velik vpliv tudi negostiteljski organizmi.<br /> <br /> === Ana Pervanja: Biološki material za sintezo umetnih žilnih struktur ===<br /> Kompleks ELK1-GO je sestavljen iz proteina ELK1, ki je eden od potencialnih proteinov za sintezo bioloških materialov, ker je zaradi kratkih, ponavljajočih se zaporedij aminokislin neurejen in ker se mu ob spreminjanju temperature reverzibilno spreminja tudi struktura. Sestavljajo ga štiri ponovitve motiva VPGIG in ena VPGKG (pozitivno nabita). Druga komponenta biološkega materiala je grafenov oksid (GO), ki ima hidrofobno površino in negativno nabite karboksilne skupine na robovih. Skupaj sestavljata stabilno in temperaturno odporno membrano, ki se je sposobna preurediti v cevaste strukture s premerom do 10 µm. Močne interakcije med molekulama so posledica elektrostatičnih sil in vodikovih vezi med stransko skupino lizina in glavno verigo peptida. Podpira celično rast, ki je primerljiva z rastjo celic na TCP-ju. Membrane ELK1-GO so zaradi stabilnosti, sposobnosti upiranja vodnim tokovom, odpornosti in bioaktivnosti odličen biološki material, ki bi se lahko v prihodnosti uporabljal za sintezo kompleksnega biološkega tkiva, ki bi simuliral delovanje organov (organ-on-a-chip device). Tako bi lahko testirali npr. zdravila in dobili bolj realne podatke kot s testiranjem živali ali testiranjem na celicah.<br /> <br /> === Luka Stanković: Gen cirkadianega ritma oslabi imunsko obrambo pred pljučnico z inhibicijo gibljivosti in fagocitoške funkcije makrofagov ===<br /> Kot posledica rotacije zemlje okoli osi in kroženja okoli sonca so organizmi skozi evolucijo razvili cirkadialne cikle, ki jih uravnavajo kompleksni mehanizmi znotraj vsake celice. To omogoča organizmom opravljanje različnih procesov glede na del dneva, ne da bi prejeli kakršnokoli informacijo iz zunanjega okolja. Te endogene procese v večini nadzoruje proteinski kompleks kodiran z genom '''Bmal1''' . Skozi raziskave je bilo ugotovljeno, da deluje gen v makrofagih kot zavora, saj jih ohranja bolj rigidne. V organizmih, kjer je bil gen v makrogfagih odstranjen so zabeležili drastično povečanje hitrosti in fagocitoze makrofagov na račun spremenjene aktinske strukture. Miši brez gena Bmal1 so se z bakterijsko okužbo s ''S. Pneumoniae'' bistveno bolje spopadale kakor skupina z genom. Vsi te ugotovitve odpirajo možnosti za številne nove raziskave v smeri zdravljenja bakterijskih okužb na podlagi zmanjšanja funkcije gena Bmal1 v celicah imunskega sistema.<br /> <br /> === Marija Dujaković : Beljakovine v krvi ščitijo pred poškodbami nevronov po možganski krvavitvi ===<br /> Če možgana arterija poči in pride do krvavitve v možganih ali okoli njih, potem govorimo o intracerebralni ali subanarhoidni krvavitvi.Subarahnoidna krvavitev anevrizme (ASAH) se pojavlja predvsem pri mlajših osebah in sicer z zelo močnim glavobolom. Vazospazem je povezan tudi s prisotnostjo krvi v v subarahnoidnem prostoru. Vazospazem je zoženje krvnih žil, najpogosteje zaradi krčev. Pojavi se lahko med 3. in 14. dnem od ASAH-a.Nevrološko poslabšanje se pojavi predvsem tri dni po krvavitvi in se zato imenuje »zapozneli ishemični nevrološki deficit« DIND ( angl. Delayed Ishemic Neurological Deficit).Raziskovalci z univerze v Zürichu so pri raziskavi prišli do zaključka, da prosti hemoglobin (Hb) v CSF povzroči pojav vazospazma.Odkrit je bil nov protein haptoglobin (Hp), ki preprečuje razpad prostega Hb in njegovo uničenje nevronov. Z vzorci, ki so jih dobili s pomočjo testiranj pri ovcah so dokazali nekatere škodljive lastnosti samega hemoglobina v možganskih tkivih.Osnovna funkcija haptoglobina je ravno ta, da veže hemoglobin, ki se sprošča iz eritrocitov z visoko afiniteto in tako inhibira njegovo oksidativno vrednost.Študija je pokazala, da dajanje prostega prečiščenega Hp neposredno v CSF veže Hb in preprečuje vazospazem.<br /> <br /> <br /> === Nevena Ješić: Nepravilne komunikacije med celicami vodijo v levkemijo ===<br /> Nove raziskave so razkrile, kako napačne komunikacije v matičnih celicah krvi lahko povzročijo levkemijo. Odkritje bi lahko utrlo pot novim, usmerjenim medicinskim zdravljenjem, ki bi ovirale ta proces. Mednarodna skupina znanstvenikov, je odkrila, kako te mutacije omogočajo celicam, da odstopajo od svoje običajne metode medsebojne komunikacije, zaradi česar razvoj krvnih celic ne poteka normalno. Znanstveniki so uporabili fluorescenčno mikroskopijo z visoko ločljivostjo, da so preučili način, kako matične celice komunicirajo med seboj v realnem času. Opazovali so, kako celice prejemajo navodila od „signalnih proteinov“, ki se vežejo na receptor na površini druge celice, preden oddajo signal, ki celici pove, kako naj se reagira. Opazovanja so pripeljala do prej neznanega mehanizma, kako posamezne mutacije sprožijo krvne matične celice, da začnejo signalizirati neodvisno od citokinov, kar vodi v nenormalno delovanje in posledično do bolezni, kot je levkemija. Ta raziskovalna skupina je uporabila kombinacijo molekularnega modeliranja, strukturne biologije, biofizike, mikroskopije z visoko ločljivostjo in celične biologije, da bi prvič dokazala, da te specifične receptorje na površini matičnih celic krvi so povezane s citokini in tvorijo pare.<br /> <br /> <br /> === Jerina Rebeka: Proizvodnja heparina v celičnih kulturah ===<br /> Farmacevtski heparin je močan antikoagulant in zato eno izmen najbolj predpisanih zdravil v klinični medicini. Uporabljajo ga za zdravljenje globoke venske tromboze in pljučne embolije. Dandanes pridobivajo farmacevtski heparin z ekstrahiranjem heparina oziroma heparan sulfata (HS), ki je njegov sorodni polisaharid, iz živalskih tkiv, najpogosteje iz črevesne sluznice prašičev. Zaradi omejenih zalog izvornih tkiv, možnosti kontaminacije heparina/HS ter drugih varnostnih razlogov znanstveniki vztrajno iščejo nove načine pridobivanja farmacevtskega heparina. Heparin kot tudi heparan sulfat (HS) uvrščamo med visoko sulfatne glikozaminoglikane. Molekuli sta dokaj podobni, vendar med njima prihaja do pomembne razlike. Medtem ko se HS nahaja na celični površini vseh živalskih celic, se heparin sintetizira in nahaja večinoma le v mastocitih. Znano je, da imata polisaharida skupno biosintetsko pot, v nedavnih raziskavah pa so odkrili tudi ključne encime, ki so odgovorni za edinstveno sintezo heparina v mastocitih. Znanstveniki tako z željo po proizvodnji heparina v živalskih celičnih linijah, ki običajno niso sposobne sinteze heparina, iščejo razne transkripcijske faktorje, ki bi lahko uravnavali izražanje ključnih biosintetskih encimov heparina. Zadnja študija je pokazala, da je eden takih faktorjev tudi ZNF263 (''zinc finger protein''), za katerega so ugotovili, da je aktivni represor dveh sulfotransferaz, ki sta posredno odgovorni za antikoagulativno sposobnost heparina. <br /> <br /> <br /> Konec klepeta<br /> Napiši sporočilo ...</div>

Rebeka Jerina https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2020-seminar&diff=16836 2020-04-22T18:50:19Z

<p>Rebeka Jerina: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.<br /> <br /> Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita. <br /> Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.<br /> Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## &quot;##&quot; sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.<br /> Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| {{table}}<br /> {| border=&quot;1&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Povezava'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3<br /> |-<br /> | Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković<br /> |-<br /> | Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar<br /> |-<br /> | Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner<br /> |-<br /> | Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj<br /> |-<br /> | Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina<br /> |-<br /> | Zala Puklavec ||Globoko učenje vodi do odkritja novih antibiotikov || https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30102-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420301021%3Fshowall%3Dtrue || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko<br /> |-<br /> | Martin Stanonik || De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar<br /> |-<br /> | Klara Kočman || Novi koronavirus SARS-CoV-2 in SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200131114755.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak<br /> |-<br /> | Maša Mencigar || Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200108123137.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič<br /> |-<br /> | Nevena Ješić || Nepravilne komunikacije med celicami vodijo v levkemijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144824.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal<br /> |-<br /> | Nika Perko ||Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk ||https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-019-3870-4 || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler<br /> |-<br /> | Timotej Sotošek || Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje vzhodni respiratorni sindrome koronavirusa|| || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić<br /> |-<br /> | Hana Glavnik || Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218124346.htm || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski<br /> |-<br /> | Maja Deutsch || Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline || https://www.nature.com/articles/s41586-020-2047-9 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska<br /> |-<br /> | Eva Ratajc || Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika || https://www.readcube.com/articles/10.3389/fmicb.2019.02089 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik<br /> |-<br /> | Lana Kores || Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona || https://www.sciencedaily.com/releases/2019/08/190822113400.htm || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar<br /> |-<br /> | Jan Kogovšek || Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141514.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković<br /> |-<br /> | Nina Žgajnar || In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218130501.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal<br /> |-<br /> | Erika Rihter || Mikrobiomska analiza krvi in tkiv kot pristop k diagnosticiranju rakavih obolenj || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200311123302.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič<br /> |-<br /> | Luka Šegota || Sulfolipid-1 je sprožilec kašlja, ki prenaša tuberkulozo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200306183349.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič<br /> |-<br /> | Eva Vene ||Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116141710.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob<br /> |-<br /> | Ajda Beltram || Identifikacija potencialnih komponent cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200226091227.htm|| 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec<br /> |-<br /> | Jan Trebušak ||Vbod klopa vrste Amblyomma americanum sproži proizvodnjo IgE in preobčutljivost preko celic T CD4+ in od MyD88 odvisnih poti||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/08/190820130938.htm|| 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik<br /> |-<br /> | Jan Bregar || Prehodno neintegrativno izražanje reprogramirnih faktorjev v jedru spodbuja večplastno izboljšanje starih človeških celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200324090007.htm || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič<br /> |-<br /> | Gregor Strniša || Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200211103721.htm || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar<br /> |-<br /> | Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić<br /> |-<br /> | Nadja Dolničar ||Interferonsko spodbujeno izločanje živega patogena Cryptococcus neoformans iz makrofagov kot posledica virusne okužbe ||https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1008240 || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko<br /> |-<br /> | Tina Javeršek ||Vpliv trans maščobnih kislin na potek apoptoze preko mitohondrijske pozitivne povratne zanke JNK-Sab-ROS || https://www.nature.com/articles/s41598-020-59636-6 || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek<br /> |-<br /> | Vid Dobrovoljc ||Povratni vsadek za dolgotrajno inkapsulacijo in preživetje terapevtskih celic v njem||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200330152124.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik<br /> |-<br /> | Tinkara Božič ||Zgradba na atomskem nivoju zaprtega in odprtega protonskega kanalčka M2 razkriva transportni mehanizem gripe tipa B ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141435.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman<br /> |-<br /> | Kostadin Mitkov ||Heat shock factor 2 helps the cells to maintain cell adhesion and protect themselves against stress ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116112548.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik<br /> |-<br /> | Sara Jerič ||Plenitev morskih virusov s strani negostiteljskih organizmov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200327113658.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović<br /> |-<br /> | Polona Leban ||Zakaj so motnje avtističnega spektra (ASD) pogostejše pri dečkih kot pri deklicah? ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/04/200402134622.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič<br /> |-<br /> | Stefanija Ivanova || Perceived healthiness of food items and the traffic light front of pack nutrition labelling: choice-based conjoint analysis and cross-sectional survey|| https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200228102257.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc<br /> |-<br /> | Luka Stanković || Odstranitev gena cirkadianega cikla ščiti miši pred pljučnico || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200106123428.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores<br /> |-<br /> | Ana Pervanja || Biomaterial za sintezo umetnih žilnih struktur || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141557.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek<br /> |-<br /> | Marija Dujaković || Beljakovine v krvi ščitijo pred poškodbami nevronov po možganski krvavitvi || https://www.sciencedaily.com/releases/2019/10/191022174405.htm || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek<br /> |-<br /> | Neža Leskovar || Zaščita origamija DNA in molekularno povezovanje z inženirsko opredeljenimi sekvencami peptoidov || https://www.pnas.org/content/117/12/6339 || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar<br /> |-<br /> | Luka Hafner || Protibakterijsko delovanje srebrovih ionov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/04/200409140021.htm || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter<br /> |-<br /> | Anja Moškrič || Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR - Cas tipa I|| https://www.nature.com/articles/s41586-020-1936-2 || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota<br /> |-<br /> | Rebeka Jerina || Proizvodnja heparina v celičnih kulturah || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/04/200410162452.htm || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene<br /> |-<br /> | Zala Perko || Regulacija s staranjem povezanih patoloških stanj z acetilacijo proteina NLRP3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144837.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram<br /> |-<br /> | Ana Žagar || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak<br /> |-<br /> | Karin Rak || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar<br /> |-<br /> | Jakob Tomšič || Vpliv BPA in njegovega analoga BPS na placento in razvijajoče se možgane ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218182202.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša<br /> |-<br /> | Maja Kobal || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor<br /> |-<br /> |Erika Rihter || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar<br /> |-<br /> | Jasmina Bešić || Kako matične celice popravijo škodo zaradi srčnih napadov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200313112144.htm || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek<br /> |-<br /> | Nikola Janakievski || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc<br /> |-<br /> | Aljaž Simonič || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič<br /> |-<br /> | Manca Pirc || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov<br /> |-<br /> | Nika Bedrač || Nižji vnos žveplo vsebujočih amino kislin niža tveganje za razvoj kardiometaboličnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič<br /> |-<br /> | Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban<br /> |-<br /> | Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova<br /> |-<br /> | Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković<br /> |-<br /> | Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].<br /> * naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> *Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].<br /> * vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.<br /> * Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.<br /> * En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!<br /> Poslati morate naslednje datoteke:<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx<br /> * TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;'''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). &lt;br&gt;'''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).&lt;br&gt;'''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Rebeka Jerina