Wiki FKKT - User contributions [en]

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-15T00:11:05Z

Rozamunda2:

==Uvod==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje senzor za malonil-CoA. Pri nizki koncentraciji senzor za malonil-CoA zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za senzor za malonil-CoA z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije senzorja za malonil-CoA'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) senzorja za malonil-CoA karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja (matC) in malonil-CoA sintaze (matB) iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa (acetil-CoA karboksilaza) toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).

Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.

Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.

Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

==Viri==

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.

2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.

3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T22:33:58Z

Rozamunda2:

==Uvod==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje senzor za malonil-CoA. Pri nizki koncentraciji senzor za malonil-CoA zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za senzor za malonil-CoA z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije senzorja za malonil-CoA'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) senzorja za malonil-CoA karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja (matC) in malonil-CoA sintaze (matB) iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa (acetil-CoA karboksilaza) toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).

Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.

Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.

Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

==Viri==

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.

2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.

3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T21:33:36Z

Rozamunda2:

==Uvod==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje senzor za malonil-CoA. Pri nizki koncentraciji senzor za malonil-CoA zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za senzor za malonil-CoA z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije senzorja za malonil-CoA'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) senzorja za malonil-CoA karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja (matC) in malonil-CoA sintaze (matB) iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).

Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.

Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.

Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

==Viri==

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.

2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.

3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T21:31:25Z

Rozamunda2:

==Uvod==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje senzor za malonil-CoA. Pri nizki koncentraciji senzor za malonil-CoA zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za senzor za malonil-CoA z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije senzorja za malonil-CoA'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) senzorja za malonil-CoA karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).

Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.

Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.

Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

==Viri==

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.

2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.

3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T21:05:48Z

Rozamunda2:

==Uvod==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).

Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.

Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.

Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

==Viri==

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.

2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.

3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T21:05:15Z

Rozamunda2:

==Uvod==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).

Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.

Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.

Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

==Viri==

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T21:04:26Z

Rozamunda2:

==Uvod==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T21:04:08Z

Rozamunda2:

=='''Uvod'''==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

3. ==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

4. ==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T21:03:53Z

Rozamunda2:

=='''Uvod'''==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

2. ==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

3. ==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

4. ==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T21:02:50Z

Rozamunda2:

1.== Uvod ==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

2. ==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

3. ==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

4. ==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T21:01:56Z

Rozamunda2:

1. ==Uvod==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

2. ==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

3. ==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.

• '''Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

4. ==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T20:59:31Z

Rozamunda2:

1. '''Uvod'''

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule.

2. '''Senzor za malonil-CoA'''

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

3. Rezultati
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.
'''
• Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• '''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• '''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.

4. '''Zaključek'''

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T20:59:13Z

Rozamunda2:

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T20:57:27Z

Rozamunda2:

1. '''Uvod'''

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér et al. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. col''i. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v E.coli sintetizira največ iskane molekule.

2. Senzor za malonil-CoA
V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu et al., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij Bacillus subtilis [3]. E. coli takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B. subtillis v E.coli klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v B. subtilis pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

3. Rezultati
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v E.coli. Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.
'''
• Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''
V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice E. coli bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''
V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov
Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• Testiranje vpliva substrata v gojišču
Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.
4. Zaključek
V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T20:56:54Z

Rozamunda2:

1. '''Uvod'''

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér et al. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v E. coli. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v E.coli sintetizira največ iskane molekule.

2. Senzor za malonil-CoA
V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu et al., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij Bacillus subtilis [3]. E. coli takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B. subtillis v E.coli klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v B. subtilis pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

3. Rezultati
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v E.coli. Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.
'''
• Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''
V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice E. coli bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''
V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov
Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• Testiranje vpliva substrata v gojišču
Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.
4. Zaključek
V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T20:56:43Z

Rozamunda2:

1. '''Uvod'''[[Link title]]
V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér et al. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v E. coli. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v E.coli sintetizira največ iskane molekule.

2. Senzor za malonil-CoA
V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu et al., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij Bacillus subtilis [3]. E. coli takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B. subtillis v E.coli klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v B. subtilis pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

3. Rezultati
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v E.coli. Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.
'''
• Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''
V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice E. coli bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''
V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov
Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• Testiranje vpliva substrata v gojišču
Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.
4. Zaključek
V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

2015-12-14T20:56:29Z

Rozamunda2: New page: 1. Uvod V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo gor...

1. Uvod
V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje malonil-CoA senzor. Pri nizki koncentraciji malonil-CoA senzor zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér et al. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v E. coli. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v E.coli sintetizira največ iskane molekule.

2. Senzor za malonil-CoA
V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu et al., 2015). Ustvarili so senzor za malonil-CoA senzor z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij Bacillus subtilis [3]. E. coli takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B. subtillis v E.coli klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP. Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v B. subtilis pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA.

3. Rezultati
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v E.coli. Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina.
'''
• Preverjanje funkcije malonil-CoA senzorja'''
V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice E. coli bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence.

• '''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''
V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) malonil-CoA senzorja karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja matC in matB iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum.

• Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov
Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa in proteinov kot je malonil-CoA karboksilaza toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG, merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA, MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco.

• Testiranje vpliva substrata v gojišču
Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG.
4. Zaključek
V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine skupina Dr. Fuzhong Zhanga. Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).
Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.
Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.
Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA.

1. Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.
2. Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.
3. Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.

Seminarji SB 2015/16

2015-12-14T20:54:54Z

Rozamunda2:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” (Nastja Pirman)
* Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation (Monika Praznik)
* Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy (Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* Towards engineering biological systems in a broader context (Aleksander Benčič)
* Synthetic biology: Novel approaches for microbiology (Daša Janeš)
* Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism (Jure Zabret)
* Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)
* Better together: engineering and application of microbial symbioses (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates (Mojca Banič)
* Synthetic biology of fungal natural products (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors (Benjamin Bajželj)
* How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application (Ana Grom & Ana Unkovič)
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)
* Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications (Maša Mirkovič)
* Synthetic biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)

Talk:Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:36:46Z

Rozamunda2:

Ajda Rojc - Uvod, Homologna rekombinacija, Rezultati

Zala Gluhić - Rezultati homologne rekombinacije

Špela Tomaž - Diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorje

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:36:27Z

Rozamunda2:

==1 Uvod==
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

==2 Homologna rekombinacija==
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

==3 Rezultati homologne rekombinacije==
V izvornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

==4 Diferenciacija iPS v HP celice==
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

==5 Rezultati==
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.

==6 Zaključek==
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Talk:Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:35:12Z

Rozamunda2:

Ajda Rojc - Uvod, Homologna rekombinacija, Rezultati

Zala Gluhić - Potek poskusa

Špela Tomaž - Diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorje

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:29:17Z

Rozamunda2:

==1 Uvod==
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

==2 Homologna rekombinacija==
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

==3 Potek poskusa==
V izVornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

==4 Diferenciacija iPS v HP celice==
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

==5 Rezultati==
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.

==6 Zaključek==
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:28:11Z

Rozamunda2:

==1 Uvod==
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

==2 Homologna rekombinacija==
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

==3 Potek poskusa==
V izVornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

==4 Diferenciacija iPS v HP celice==
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

==5 Rezultati==
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:27:21Z

Rozamunda2:

===1 Uvod===
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

===2 Homologna rekombinacija===
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

===3 Potek poskusa===
V izVornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

===4 Diferenciacija iPS v HP celice===
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

===5 Zaključek===
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega, saj so z GFP označene celice ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Reprogramiranje celic

2013-05-27T21:25:32Z

Rozamunda2: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijske_zna%C4%8Dilnosti_izvornih_celic Biokemijske značilnosti izvornih celic](Urška Rode)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Epigenetsko_reprogramiranje_celic Epigenetsko reprogramiranje] (Karmen Belšak, Maša Mohar)
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Erik Janežič, Tomaž Rozmarič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inducirane_pluripotentne_celice_iz_mišjih_fibroblastov Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov ](Ana Kunšek, Nastja Pirman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izboljšane_mišje_inducirane_pluripotentne_celice Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice] /za 3 študente/ (Julija Mazej, Bojana Lazović, Maja Kostanjevec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_iPSC_za_zdravljenje_anemije_srpastih_celic_pri_miših Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših] (Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prve_človeške_inducirane_pluripotentne_celice Prve človeške inducirane pluripotentne celice](Dejan Marjanovič, Suzana Semič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezvirusni_na%C4%8Din_priprave_iPSC Brezvirusni način priprave iPSC](Griša Prinčič, Erik Mršnik, Jakob Gašper Lavrenčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema Reprogramiranje z dvema faktorjema](Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_s_transpozicijo Reprogramiranje s transpozicijo] (Barbara Dušak, Sara Lorbek)
# Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tumorigenost_iPSC Tumorigenost iPSC](Urška Navodnik, Ana Remžgar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_miRNA Reprogramiranje z miRNA] (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pregled_in_prihodnost_postopkov_za_pripravo_iPSC Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC] / (Aleksander Benčič, Jernej Pušnik)
# Kombiniranje tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic in genskih modifikacij pri zdravljenju mišične distrofije (Urška Rauter)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.

Reprogramiranje celic

2013-05-27T21:23:38Z

Rozamunda2: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijske_zna%C4%8Dilnosti_izvornih_celic Biokemijske značilnosti izvornih celic](Urška Rode)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Epigenetsko_reprogramiranje_celic Epigenetsko reprogramiranje] (Karmen Belšak, Maša Mohar)
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Erik Janežič, Tomaž Rozmarič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inducirane_pluripotentne_celice_iz_mišjih_fibroblastov Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov ](Ana Kunšek, Nastja Pirman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izboljšane_mišje_inducirane_pluripotentne_celice Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice] /za 3 študente/ (Julija Mazej, Bojana Lazović, Maja Kostanjevec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_iPSC_za_zdravljenje_anemije_srpastih_celic_pri_miših] (Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prve_človeške_inducirane_pluripotentne_celice Prve človeške inducirane pluripotentne celice](Dejan Marjanovič, Suzana Semič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezvirusni_na%C4%8Din_priprave_iPSC Brezvirusni način priprave iPSC](Griša Prinčič, Erik Mršnik, Jakob Gašper Lavrenčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema Reprogramiranje z dvema faktorjema](Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_s_transpozicijo Reprogramiranje s transpozicijo] (Barbara Dušak, Sara Lorbek)
# Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tumorigenost_iPSC Tumorigenost iPSC](Urška Navodnik, Ana Remžgar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_miRNA Reprogramiranje z miRNA] (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pregled_in_prihodnost_postopkov_za_pripravo_iPSC Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC] / (Aleksander Benčič, Jernej Pušnik)
# Kombiniranje tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic in genskih modifikacij pri zdravljenju mišične distrofije (Urška Rauter)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.

Reprogramiranje celic

2013-05-27T21:22:28Z

Rozamunda2: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijske_zna%C4%8Dilnosti_izvornih_celic Biokemijske značilnosti izvornih celic](Urška Rode)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Epigenetsko_reprogramiranje_celic Epigenetsko reprogramiranje] (Karmen Belšak, Maša Mohar)
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Erik Janežič, Tomaž Rozmarič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inducirane_pluripotentne_celice_iz_mišjih_fibroblastov Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov ](Ana Kunšek, Nastja Pirman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izboljšane_mišje_inducirane_pluripotentne_celice Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice] /za 3 študente/ (Julija Mazej, Bojana Lazović, Maja Kostanjevec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_iPSC_za_zdravljenje_anemije_srpastih_celic_pri_miših](Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prve_človeške_inducirane_pluripotentne_celice Prve človeške inducirane pluripotentne celice](Dejan Marjanovič, Suzana Semič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezvirusni_na%C4%8Din_priprave_iPSC Brezvirusni način priprave iPSC](Griša Prinčič, Erik Mršnik, Jakob Gašper Lavrenčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema Reprogramiranje z dvema faktorjema](Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_s_transpozicijo Reprogramiranje s transpozicijo] (Barbara Dušak, Sara Lorbek)
# Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tumorigenost_iPSC Tumorigenost iPSC](Urška Navodnik, Ana Remžgar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_miRNA Reprogramiranje z miRNA] (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pregled_in_prihodnost_postopkov_za_pripravo_iPSC Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC] / (Aleksander Benčič, Jernej Pušnik)
# Kombiniranje tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic in genskih modifikacij pri zdravljenju mišične distrofije (Urška Rauter)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.

Reprogramiranje celic

2013-05-27T21:20:28Z

Rozamunda2: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijske_zna%C4%8Dilnosti_izvornih_celic Biokemijske značilnosti izvornih celic](Urška Rode)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Epigenetsko_reprogramiranje_celic Epigenetsko reprogramiranje] (Karmen Belšak, Maša Mohar)
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Erik Janežič, Tomaž Rozmarič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inducirane_pluripotentne_celice_iz_mišjih_fibroblastov Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov ](Ana Kunšek, Nastja Pirman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izboljšane_mišje_inducirane_pluripotentne_celice Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice] /za 3 študente/ (Julija Mazej, Bojana Lazović, Maja Kostanjevec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_iPSC_za_zdravljenje_anemije_srpastih_celic_pri_mi%C5%](Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prve_človeške_inducirane_pluripotentne_celice Prve človeške inducirane pluripotentne celice](Dejan Marjanovič, Suzana Semič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezvirusni_na%C4%8Din_priprave_iPSC Brezvirusni način priprave iPSC](Griša Prinčič, Erik Mršnik, Jakob Gašper Lavrenčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema Reprogramiranje z dvema faktorjema](Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_s_transpozicijo Reprogramiranje s transpozicijo] (Barbara Dušak, Sara Lorbek)
# Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tumorigenost_iPSC Tumorigenost iPSC](Urška Navodnik, Ana Remžgar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_miRNA Reprogramiranje z miRNA] (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pregled_in_prihodnost_postopkov_za_pripravo_iPSC Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC] / (Aleksander Benčič, Jernej Pušnik)
# Kombiniranje tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic in genskih modifikacij pri zdravljenju mišične distrofije (Urška Rauter)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:16:08Z

Rozamunda2:

===1 UVOD===
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

===2 HOMOLOGNA REKOMBINACIJA===
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

===3 POTEK POSKUSA===
V izVornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

===4 DIFERENCIACIJA iPS V HEMATOPOETIČNE PREKURZORSKE CELICE===
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Transplantirane HP celice so preprečile smrt zaradi anemije. Iz iPS ter iz ES so se v krvi miši razvile zdrave krvničke ter obnovile vse linije krvnih celic. Analiza je pokazala, da so v miših po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP.

===5 ZAKLJUČEK===
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega, saj so z GFP označene celice ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:15:45Z

Rozamunda2:

==Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših==

===1 UVOD===
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

===2 HOMOLOGNA REKOMBINACIJA===
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

===3 POTEK POSKUSA===
V izVornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

===4 DIFERENCIACIJA iPS V HEMATOPOETIČNE PREKURZORSKE CELICE===
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Transplantirane HP celice so preprečile smrt zaradi anemije. Iz iPS ter iz ES so se v krvi miši razvile zdrave krvničke ter obnovile vse linije krvnih celic. Analiza je pokazala, da so v miših po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP.

===5 ZAKLJUČEK===
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega, saj so z GFP označene celice ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:15:19Z

Rozamunda2:

==Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših==

===1_UVOD===
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

===2_HOMOLOGNA REKOMBINACIJA===
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

===3_POTEK POSKUSA===
V izvornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

===4_DIFERENCIACIJA iPS V HEMATOPOETIČNE PREKURZORSKE CELICE===
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Transplantirane HP celice so preprečile smrt zaradi anemije. Iz iPS ter iz ES so se v krvi miši razvile zdrave krvničke ter obnovile vse linije krvnih celic. Analiza je pokazala, da so v miših po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP.

===5_ZAKLJUČEK===
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega, saj so z GFP označene celice ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:13:28Z

Rozamunda2:

==Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših==

===UVOD===
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

===HOMOLOGNA REKOMBINACIJA===
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

===POTEK POSKUSA===
V izvornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

===DIFERENCIACIJA iPS V HEMATOPOETIČNE PREKURZORSKE CELICE===
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Transplantirane HP celice so preprečile smrt zaradi anemije. Iz iPS ter iz ES so se v krvi miši razvile zdrave krvničke ter obnovile vse linije krvnih celic. Analiza je pokazala, da so v miših po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP.

===REZULTATI===
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega, saj so z GFP označene celice ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T20:44:21Z

Rozamunda2: New page: dfd

dfd

Reprogramiranje celic

2013-03-20T11:28:40Z

Rozamunda2:

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# Biokemijske značilnosti izvornih celic
# Epigenetsko reprogramiranje
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006)
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela, Zala, Ajda)
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema
# Reprogramiranje s transpozicijo
# Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# Tumorigenost iPSC
# Reprogramiranje z miRNA (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.