Wiki FKKT - User contributions [en]

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-28T09:33:42Z

Sašo Jakob: /* Betaksantinski reporterski sistem */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot z GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot z GPCR in galaktozni regulon ter v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot z GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverili z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Izražanje betaksantinskega reporterskega sistema dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov, je bilo regulirano z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1). Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot z GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca, so omogočili izražanje heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za receptorje drugih vrst patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo konstitutivnega promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev PK2-1C, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco, ob dodajanju faktorja Ca, s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12 – torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali in opisali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke Sc-G1.0-Ca so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju nativnega transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice seva Sc-4.0, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih patogenov je potrebovala receptor za zaznavo tarčnih molekul; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T17:48:36Z

Sašo Jakob: /* 1. generacija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot z GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot z GPCR in galaktozni regulon ter v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot z GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverili z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Izražanje betaksantinskega reporterskega sistema dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov, je bilo regulirano z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1). Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot z GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca, so omogočili izražanje heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za receptorje drugih vrst patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo konstitutivnega promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev PK2-1C, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco, ob dodajanju faktorja Ca, s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12 – torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali in opisali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke Sc-G1.0-Ca so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju nativnega transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih patogenov je potrebovala receptor za zaznavo tarčnih molekul; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T17:47:50Z

Sašo Jakob: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot z GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot z GPCR in galaktozni regulon ter v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot z GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverili z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Izražanje betaksantinskega reporterskega sistema dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov, je bilo regulirano z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1). Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot z GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca, so omogočili izražanje heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za receptorje drugih vrst patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo konstitutivnega promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev PK2-1C, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco, ob dodajanju faktorja Ca, s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12 – torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke Sc-G1.0-Ca so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju nativnega transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih patogenov je potrebovala receptor za zaznavo tarčnih molekul; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T16:38:11Z

Sašo Jakob: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot z GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot z GPCR in galaktozni regulon ter v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot z GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverili z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Izražanje betaksantinskega reporterskega sistema dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov, je bilo regulirano z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1). Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot z GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca, so omogočili izražanje heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za receptorje drugih vrst patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo konstitutivnega promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev PK2-1C, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco, ob dodajanju faktorja Ca, s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12 – torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke Sc-G1.0-Ca so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju nativnega transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T16:36:45Z

Sašo Jakob: /* Osnove genetskega vezja */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot z GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverili z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Izražanje betaksantinskega reporterskega sistema dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov, je bilo regulirano z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1). Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot z GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca, so omogočili izražanje heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za receptorje drugih vrst patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo konstitutivnega promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev PK2-1C, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco, ob dodajanju faktorja Ca, s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12 – torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke Sc-G1.0-Ca so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju nativnega transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T16:32:03Z

Sašo Jakob: /* Signalna pot GPCR */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot z GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca, so omogočili izražanje heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za receptorje drugih vrst patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo konstitutivnega promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev PK2-1C, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco, ob dodajanju faktorja Ca, s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12 – torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke Sc-G1.0-Ca so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju nativnega transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T16:31:14Z

Sašo Jakob: /* 1. generacija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca, so omogočili izražanje heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za receptorje drugih vrst patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo konstitutivnega promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev PK2-1C, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco, ob dodajanju faktorja Ca, s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12 – torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke Sc-G1.0-Ca so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju nativnega transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T16:24:04Z

Sašo Jakob: /* 2. generacija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke Sc-G1.0-Ca so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju nativnega transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T16:20:27Z

Sašo Jakob: /* 3. in 4. generacija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju nativnega transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T16:19:42Z

Sašo Jakob: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti z GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T15:53:49Z

Sašo Jakob: /* Signalna pot GPCR */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T15:40:16Z

Sašo Jakob: /* 2. generacija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku uvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T15:39:31Z

Sašo Jakob: /* Betaksantinski reporterski sistem */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno v skladu z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T15:26:42Z

Sašo Jakob: /* Betaksantinski reporterski sistem */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da betalaminsko kislino izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T15:25:15Z

Sašo Jakob: /* 1. generacija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-05-24T15:18:38Z

Sašo Jakob: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteini povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-15T16:24:27Z

Sašo Jakob: /* Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:32:06Z

Sašo Jakob:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:28:58Z

Sašo Jakob:

Izhodiščni članek: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:28:37Z

Sašo Jakob:

Izhodiščni članek: [ https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub ]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:27:04Z

Sašo Jakob: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje ''C. albicans''. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz ''C. albicans''. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:22:30Z

Sašo Jakob: /* Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo ''k''. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno ''C. albicans''. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje ''k''. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:21:00Z

Sašo Jakob: /* 3. in 4. generacija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji ''k'', kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:18:28Z

Sašo Jakob: /* 2. generacija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je ''k'' povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:17:11Z

Sašo Jakob: /* 1. generacija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz ''C. albicans'' (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (''k''). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, ''k'' pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:12:47Z

Sašo Jakob: /* Signalna pot GPCR */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako ''in vivo'' kot ''in silico''. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:11:11Z

Sašo Jakob: /* Osnove genetskega vezja */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah ''E. coli''.1,2

==Signalna pot GPCR==

GPCR signalno pot je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako in vivo kot in silico. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:09:41Z

Sašo Jakob: /* Viri */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah E. coli.1,2

==Signalna pot GPCR==

GPCR signalno pot je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako in vivo kot in silico. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:09:23Z

Sašo Jakob: /* Osnove genetskega vezja */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev ''S. cerevisiae'' PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah E. coli.1,2

==Signalna pot GPCR==

GPCR signalno pot je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako in vivo kot in silico. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).
2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).
3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:07:27Z

Sašo Jakob: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – ''Saccharomyces cerevisiae''. V kvasovkah ''S. cerevisiae'' je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici ''S. cerevisiae'' omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive ''Candide albicans''. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida ''C. albicans'' (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev S. cerevisiae PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah E. coli.1,2

==Signalna pot GPCR==

GPCR signalno pot je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako in vivo kot in silico. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).
2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).
3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:04:44Z

Sašo Jakob: /* Signalna pot GPCR pri S. cerevisiae */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – Saccharomyces cerevisiae. V kvasovkah S. cerevisiae je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici S. cerevisiae omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive Candide albicans. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida C. albicans (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev S. cerevisiae PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah E. coli.1,2

==Signalna pot GPCR==

GPCR signalno pot je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako in vivo kot in silico. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).
2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).
3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T20:04:15Z

Sašo Jakob: /* Signalna pot GPCR pri S. cerevisiae */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – Saccharomyces cerevisiae. V kvasovkah S. cerevisiae je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici S. cerevisiae omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive Candide albicans. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida C. albicans (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev S. cerevisiae PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah E. coli.1,2

==Signalna pot GPCR pri ''S. cerevisiae''==

GPCR signalno pot je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako in vivo kot in silico. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).
2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).
3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T19:59:11Z

Sašo Jakob:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – Saccharomyces cerevisiae. V kvasovkah S. cerevisiae je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici S. cerevisiae omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive Candide albicans. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida C. albicans (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev S. cerevisiae PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah E. coli.1,2

==Signalna pot GPCR pri S. cerevisiae==

GPCR signalno pot je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako in vivo kot in silico. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==Viri==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).
2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).
3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T19:56:48Z

Sašo Jakob:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub]

==Uvod==

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – Saccharomyces cerevisiae. V kvasovkah S. cerevisiae je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici S. cerevisiae omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive Candide albicans. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida C. albicans (faktor Ca).1,2

==Osnove genetskega vezja==

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev S. cerevisiae PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah E. coli.1,2

==Signalna pot GPCR pri S. cerevisiae==

GPCR signalno pot je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako in vivo kot in silico. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

==Rezultati in diskusija==

===1. generacija===

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

===2. generacija===

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

===3. in 4. generacija===

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja Gal4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja Gal4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

===Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji===

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drugo največjo k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

===Betaksantinski reporterski sistem===

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

==Zaključek==

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

==VIRI:==

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).
2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).
3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).

Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

2024-04-14T19:48:38Z

Sašo Jakob: Created page with "Izhodiščni članek: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub"

Izhodiščni članek: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324000617?via%3Dihub

Seminarji SB 2023/24

2024-04-14T19:46:01Z

Sašo Jakob:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

PhaseOut

2024-04-08T07:58:20Z

Sašo Jakob:

== Towards Sustainable Agriculture: PHAse Out Microplastics from Our Food Chain, ali 'Na poti do trajnostnega kmetijstva' ==

Prisotnost mikroplastike v naravi prinaša vedno več vprašanj in skrbi glede vpliva, ki ga lahko ima na človeško zdravje. Nekatere raziskave pravijo, da ljudje pojemo do 5 gramov mikroplastike na teden in da velik delež te mikroplastike prihaja iz naslova kmetijstva. Mikroplastika je definirana kot majen plastični delec, ki nastane z mehansko razgradnjo plastik, ki niso biorazgradljive. Težava zaužitja ni le plastika sama, ampak tudi vse snovi, ki se na to plastiko adsorbirajo in se akumulirajo v rastlinah in v živalih. Takšne snovi so lahko toksične težke kovine ali pa različne kemikalije, ki se uporabljajo v kmetijstvu. Vir te mikroplastike so velikokrat plastične zastirke za zatiranje pleveli in ogrevanje zemlje in gnojila s kontroliranim sproščanjem. Čeprav njihova uporaba pomeni sproščanje mikroplastike, je njihova uporaba nepogrešljiva za produktivnost kmetijskega sektorja, zato so inovativna nadomestila takšnih tehnik kmetovanja zelo pomembne teme raziskovanja.

Skupina projekta PHAse Out leidenske univerze se je tega problema lotila s ciljem, da plastike iz fosilnih virov zamenja za polihidroalkanoate (PHA), ki so trajnostni in cenovno ugodni za uporabnike, prav tako pa so kompatibilni s proizvodnimi procesi za plastike iz fosilnih virov. Težava proizvodnje takšne bioplastike je, da tradicionalen vir ogljika – sladkor, ni trajnosten vir in je hkrati del človeške prehrane, posledično pa je ekonomsko manj stabilna. Projekt PHAse Out zato za vir ogljika uporablja t.i. zeleni metanol, ki je pridelan iz obnovljivih virov, kot je CO2 ali rastlinska biomasa.

=== Kaj je zeleni metanol? ===

Zeleni metanol je kemijsko enak navadnemu metanolu. Od njega se razlikuje v načinu pridobivanja. Medtem ko metanol, ki ga srečujemo npr. v laboratoriju nastane s procesiranjem zemeljskega plina, nastane zeleni metanol iz obnovljivih virov in procesov. Pri njegovem procesiranju se uporablja le elektrika iz obnovljivih virov energije. Poznamo dve vrsti zelenega metanola - eden je biometanol, ki nastane s procesiranjem rastlinske in živalske biomase, drugi pa e-metanol, ki za vir vodika uporablja zeleni vodik in ujet ogljikov dioksid. Pri obeh procesih se za okolje škodljivi plini reciklirajo.

Za organizem, s katerim bi producirali PHA, so v projektu izbrali Metilobacterium extorquens, ki metanol uporablja kot edini vir ogljika. S sinteznobiološkimi tehnikami so poskušali izboljšati učinkovitost proizvodnje PHA skozi izboljšanje biosinteze in ekstrakcije. Uporabili so štiri različne pristope. Prvi je bil optimizacija promotorja, drugi prekomerno izražanje genov v sintezni poti PHA, tretji izbitje poti biosinteze karotenoidov, četrti pa izbira sistema inducirane avtolize iz bakteriofagnega sistema. Analogno so raziskavo razdelili na cikle A, B, C in D.

=== Cikel A – izbira promotorja ===
V ciklu A so testirali učinkovitost različnih konstitutivnih in inducibilnih promoterjev tako, da so konstruirali plazmide na osnovi vektorja pTE100, v katerih promoterjem sledi mesto RBS in reporterski protein mCherry, katerega fluorescenco so merili.

V prvem delu so testirali delovanje konstitutivnih promotorjev za prekomerno izražanje phaC in groES/EL. Iz literature so izvedeli, da je promotor, ki povzroča najbolj intenzivno izražanje proteinov v M. Extorquens, promotor PmxaF, ki nadzira izražanje gena, ki zapisuje za veliko podenoto metanol dehidrogenaze. Ta promotor je aktiven pri visoki koncentraciji metanola v mediju, zato je v tem eksperimentu konstitutivno aktiven. Poleg PmxaF so testirali še promotorje, ki inducirajo nižje izražanje od njega – preizkusili so PfumC, ki ima 5-15% promotorsko moč, relativno na PmxaF; PcoxB, s 40-50% moči relativno na PmxaF in Ptuf, ki ima 70-100% moč glede na promotor PmxaF.

Za namene induciranja avtolize so testirali različne inducibilne promotorje. PA1/O4/O3 in PL/O4/A1, ki ju inducira IPTG; PQ5 and PQ2148, ki ju inducira kumat; PV106, ki ga inducira vanilat in pCinR, ki ga inducira OHC14. Ti promotorji imajo podobne strukture in v okolju brez indukcijskih molekul, se izražajo represorski geni, katerih produkti se vežejo na operatorsko regijo. V prisotnosti molekul, ki njihovo delovanje inducirajo, se represor inaktivira in omogoča izražanje reporterskega proteina mCherry. Želeli so identificirati promotor, ki čim manj pušča, da bi lahko nadziral izražanje avtolizne regije, ki bi povzročila lizo bakterij v prisotnosti induktorja.

Po izdelavni konstruktov so testirali njihovo produktivnost z merjenjem fluorescence, ki jo povzroča reporterski protein mCherry. Najintenzivnejša fluorescenca je bila izmerjena pri vzorcu s promotorjem PmxaF. Vsi rezultati so prikazani na sliki xxx.

Rezultati za inducibilne promotorje so precej slabi, ker so pri eksperimentu naredili napako – pri pCinR so za indukcijo uporabili IPTG namesto OHC14. Najintenzivnejšo fluorescenco so pri induktivnih promotorjih izmerili pri PL/O4/A1,ki so ga uporabili tudi kasneje, v ciklu D.

=== Cikel B – povečanje produkcije PHA s prekomernim izražanjem genov ===

V ciklu B so se osredotočili na optimizacijo prekomernega izražanja genov phaC, groEL in groES. PhaC zapisuje za sintazo PHA, groEL in groES pa za kompleks groEL/ES, ki je šaperon in sodeluje pri zvijanju PhaC. Pripravili so konstrukt vseh promotorjev z phaC, groES/EL in z obema, kot je predstavljeno na spodnji shemi. Na koncu zapisov za proteine so dodali zapis za HIS-tag za ekstrakcijo. Ugotovili so, da je za vsak genski konstrukt, ki ga bakterije producirajo in prepisujejo, optimalen drugačen promotor. Prav tako so ugotovili, da je prekomerno izražanje bolj učinkovito, če je na konstruktu zapis za phaC in groEL/ES hkrati. Za kvantitativno primerjavo ekspresije so tekoče kulture pobarvali z barvilom Nile-red, ki obarva PHA. Kvalitativno so obarvanje opazovali tudi s fluorescenčnim mikroskopom. Fotografije so predstavljene na spodnji sliki.

=== Cikel C – izbitje genov za biosintezo karotenoidov ===

V ciklu C so želeli zmanjšati metabolni napor, ki ga prinašajo metabolne poti, ki bakteriji v industrijskem okolju ne koristijo. Izbrali so biosintezno pot za karotenoide. Karotenoidi celicam v naravi dajejo zaščito pred UV-sevanjem, kar pa v kontekstu biološke proizvodnje ni relevantna težava, ker kulture v bioreaktorjih niso izpostavljene UV-sevanju. Poskusili so izbiti tri različne gene – dxr, ispA in crtI. To so storili s postopkom dvojne rekombinacije s plazmidom, ki je vseboval gen za odpornost na kanamicin, ki je na začetku in na koncu imel 750bp dolg zapis za 3' in 5' konca gena, ki so ga izbijali. Navzgor od zapisa za odpornost in končne regije so vstavili tudi zapis za mCherry. Potek dvojne rekombinacije so zagotvaljali z gojenjem na gojišču z antibiotikom in hkrati z merjenjem fluorescence. Bakterije, ki so zrasle na gojišču s kanamicinom in hkrati niso fluorescirale, so zanesljivo imele izbit tarčni gen.

Uspelo jim je le izbitje gena crtI, niso pa izvedli kvantifikacije produkcije PHA po izbitju tega gena. S kvantifikacijo bi lahko bolje opisali posledico izbijanja sistema biosinteze karotenoidov na količino proizvedenega PHA.

=== Cikel D - izbira optimalnega sistema inducibilne avtolize ===

Za ta namen so poskusili v bakterijah izraziti bakteriofagni sistem lize, ki bi povzročil lizo bakterij. Bakteriofagi, ki bi specifično okužili M. extorquens še niso bili identificirani, zato so uporabili 5 različnih genskih konstruktov iz fagov, ki okužijo bakterije, ki so filogenetsko blizu M. extorquens. Konstrukti so prikazani na spodnji shemi.

Največjo smrtnost – torej zmanjšanje števila CFU v primerjavi z negativno kontrolo – so opazili pri sistemih Gp110 iz salmonele in EJ1 iz pnevmokokov. So pa pri vseh opazili tudi, da ni pomembne razlike v vzorcih z ali brez induktorja, kar pomeni, da inducibilni promotorji ne delujejo oz. zelo močno puščajo. Zaradi neuspelega poskusa niso mogli kvantificirati vpliva avtoliznega sistema na učinkovitost ekstrakcije PHA.

=== Zaključki ===
PHAse Out je imel za glavni cilj ustvariti cenovno ugodno in trajnostno rešitev za biološko proizvodnjo PHA v organizmu M. extorquens z uporabo zelenega metanola kot glavnega vira ogljika. Uspešno so izmerili učinkovitost konstitutivnih in inducibilnih promotorjev v takšnem sistemu. Uspešno so določili tudi kako prekomerno izražanje genov za sintazo PHA in šaperonskih proteinov vpliva na produkcijo PHA. Delno so tudi kvantificirali delovanje fagnih sistemov za namene avtolize, vendar jim ni uspelo ustvariti inducibilnega konstrukta z zanemarljivim puščanjem promotorja.

=== Viri ===
1 Green methanol: the fuel that can accelerate the energy transition in shipping (https://www.iberdrola.com/about-us/what-we-do/green-hydrogen/green-methanol)
2 PHAse out (https://2023.igem.wiki/leiden/)

PhaseOut

2024-04-05T10:26:42Z

Sašo Jakob:

== Towards Sustainable Agriculture: PHAse Out Microplastics from Our Food Chain, ali 'Na poti do trajnostnega kmetijstva' ==

Prisotnost mikroplastike v naravi prinaša vedno več vprašanj in skrbi glede vpliva, ki ga lahko ima na človeško zdravje. Nekatere raziskave pravijo, da ljudje pojemo do 5 gramov mikroplastike na teden in da velik delež te mikroplastike prihaja iz naslova kmetijstva. Mikroplastika je definirana kot majen plastični delec, ki nastane z mehansko razgradnjo plastik, ki niso biorazgradljive. Težava zaužitja ni le plastika sama, ampak tudi vse snovi, ki se na to plastiko adsorbirajo in se akumulirajo v rastlinah in v živalih. Takšne snovi so lahko toksične težke kovine ali pa različne kemikalije, ki se uporabljajo v kmetijstvu. Vir te mikroplastike so velikokrat plastične zastirke za zatiranje pleveli in ogrevanje zemlje in gnojila s kontroliranim sproščanjem. Čeprav njihova uporaba pomeni sproščanje mikroplastike, je njihova uporaba nepogrešljiva za produktivnost kmetijskega sektorja, zato so inovativna nadomestila takšnih tehnik kmetovanja zelo pomembne teme raziskovanja.

Skupina projekta PHAse Out leidenske univerze se je tega problema lotila s ciljem, da plastike iz fosilnih virov zamenja za polihidroalkanoate (PHA), ki so trajnostni in cenovno ugodni za uporabnike, prav tako pa so kompatibilni s proizvodnimi procesi za plastike iz fosilnih virov. Težava proizvodnje takšne bioplastike je, da tradicionalen vir ogljika – sladkor, ni trajnosten vir in je hkrati del človeške prehrane, posledično pa je ekonomsko manj stabilna. Projekt PHAse Out zato za vir ogljika uporablja t.i. zeleni metanol, ki je pridelan iz obnovljivih virov, kot je CO2 ali rastlinska biomasa.

Za organizem, s katerim bi producirali PHA, so v projektu izbrali Metilobacterium extorquens, ki metanol uporablja kot edini vir ogljika. S sinteznobiološkimi tehnikami so poskušali izboljšati učinkovitost proizvodnje PHA skozi izboljšanje biosinteze in ekstrakcije. Uporabili so štiri različne pristope. Prvi je bil optimizacija promotorja, drugi prekomerno izražanje genov v sintezni poti PHA, tretji izbitje poti biosinteze karotenoidov, četrti pa izbira sistema inducirane avtolize. Analogno so raziskavo razdelili na cikle A, B, C in D.

=== Cikel A – izbira promotorja ===
V ciklu A so testirali učinkovitost različnih konstitutivnih in inducibilnih promoterjev tako, da so konstruirali plazmide na osnovi vektorja pTE100, v katerih promoterjem sledi mesto RBS in reporterski protein mCherry, katerega fluorescenco so merili.

V prvem delu so testirali delovanje konstitutivnih promotorjev za prekomerno izražanje phaC in groES/EL. Iz literature so izvedeli, da je promotor, ki povzroča najbolj intenzivno izražanje proteinov v M. Extorquens, promotor PmxaF, ki nadzira izražanje gena, ki zapisuje za veliko podenoto metanol dehidrogenaze. Ta promotor je aktiven pri visoki koncentraciji metanola v mediju, zato je v tem eksperimentu konstitutivno aktiven. Poleg PmxaF so testirali še promotorje, ki inducirajo nižje izražanje od njega – preizkusili so PfumC, ki ima 5-15% promotorsko moč, relativno na PmxaF; PcoxB, s 40-50% moči relativno na PmxaF in Ptuf, ki ima 70-100% moč glede na promotor PmxaF.

Za namene induciranja avtolize so testirali različne inducibilne promotorje. PA1/O4/O3 in PL/O4/A1, ki ju inducira IPTG; PQ5 and PQ2148, ki ju inducira kumat; PV106, ki ga inducira vanilat in pCinR, ki ga inducira OHC14. Ti promotorji imajo podobne strukture in v okolju brez indukcijskih molekul, se izražajo represorski geni, katerih produkti se vežejo na operatorsko regijo. V prisotnosti molekul, ki njihovo delovanje inducirajo, se represor inaktivira in omogoča izražanje reporterskega proteina mCherry. Želeli so identificirati promotor, ki čim manj pušča, da bi lahko nadziral izražanje avtolizne regije, ki bi povzročila lizo bakterij v prisotnosti induktorja.

Po izdelavni konstruktov so testirali njihovo produktivnost z merjenjem fluorescence, ki jo povzroča reporterski protein mCherry. Najintenzivnejša fluorescenca je bila izmerjena pri vzorcu s promotorjem PmxaF. Vsi rezultati so prikazani na sliki xxx.

Rezultati za inducibilne promotorje so precej slabi, ker so pri eksperimentu naredili napako – pri pCinR so za indukcijo uporabili IPTG namesto OHC14. Najintenzivnejšo fluorescenco so pri induktivnih promotorjih izmerili pri PL/O4/A1,ki so ga uporabili tudi kasneje, v ciklu D.

=== Cikel B – povečanje produkcije PHA s prekomernim izražanjem genov ===

V ciklu B so se osredotočili na optimizacijo prekomernega izražanja genov phaC, groEL in groES. PhaC zapisuje za sintazo PHA, groEL in groES pa za kompleks groEL/ES, ki je šaperon in sodeluje pri zvijanju PhaC. Pripravili so konstrukt vseh promotorjev z phaC, groES/EL in z obema, kot je predstavljeno na spodnji shemi. Na koncu zapisov za proteine so dodali zapis za HIS-tag za ekstrakcijo. Ugotovili so, da je za vsak genski konstrukt, ki ga bakterije producirajo in prepisujejo, optimalen drugačen promotor. Prav tako so ugotovili, da je prekomerno izražanje bolj učinkovito, če je na konstruktu zapis za phaC in groEL/ES hkrati. Za kvantitativno primerjavo ekspresije so tekoče kulture pobarvali z barvilom Nile-red, ki obarva PHA. Kvalitativno so obarvanje opazovali tudi s fluorescenčnim mikroskopom. Fotografije so predstavljene na spodnji sliki.

=== Cikel C – izbitje genov za biosintezo karotenoidov ===

V ciklu C so želeli zmanjšati metabolni napor, ki ga prinašajo metabolne poti, ki bakteriji v industrijskem okolju ne koristijo. Izbrali so biosintezno pot za karotenoide. Karotenoidi celicam v naravi dajejo zaščito pred UV-sevanjem, kar pa v kontekstu biološke proizvodnje ni relevantna težava, ker kulture v bioreaktorjih niso izpostavljene UV-sevanju. Poskusili so izbiti tri različne gene – dxr, ispA in crtI. To so storili s postopkom dvojne rekombinacije s plazmidom, ki je vseboval gen za odpornost na kanamicin, ki je na začetku in na koncu imel 750bp dolg zapis za 3' in 5' konca gena, ki so ga izbijali. Navzgor od zapisa za odpornost in končne regije so vstavili tudi zapis za mCherry. Potek dvojne rekombinacije so zagotvaljali z gojenjem na gojišču z antibiotikom in hkrati z merjenjem fluorescence. Bakterije, ki so zrasle na gojišču s kanamicinom in hkrati niso fluorescirale, so zanesljivo imele izbit tarčni gen.

Uspelo jim je le izbitje gena crtI, niso pa izvedli kvantifikacije produkcije PHA po izbitju tega gena

=== Cikel D - izbira optimalnega sistema inducibilne avtolize ===

Za ta namen so poskusili v bakterijah izraziti bakteriofagni sistem lize, ki bi povzročil lizo bakterij. Bakteriofagi, ki bi specifično okužili M. extorquens še niso bili identificirani, zato so uporabili 5 različnih genskih konstruktov iz fagov, ki okužijo bakterije, ki so filogenetsko blizu M. extorquens. Konstrukti so prikazani na spodnji shemi.

Največjo smrtnost – torej zmanjšanje števila CFU v primerjavi z negativno kontrolo – so opazili pri sistemih Gp110 iz salmonele in EJ1 iz pnevmokokov. So pa pri vseh opazili tudi, da ni pomembne razlike v vzorcih z ali brez induktorja, kar pomeni, da inducibilni promotorji ne delujejo oz. zelo močno puščajo. Zaradi neuspelega poskusa niso mogli kvantificirati vpliva avtoliznega sistema na učinkovitost ekstrakcije PHA.

=== Zaključki ===
PHAse Out je imel za glavni cilj ustvariti cenovno ugodno in trajnostno rešitev za biološko proizvodnjo PHA v organizmu M. extorquens, z uporabo zelenega metanola. Uspešno so izmerili učinkovitost konstitutivnih in inducibilnih promotorjev v takšnem sistemu. Uspešno so določili tudi kako prekomerno izražanje genov za sintazo PHA in šaperonskih proteinov vpliva na produkcijo PHA. Delno so tudi kvantificirali delovanje fagnih sistemov za namene avtolize, vendar jim ni uspelo ustvariti inducibilnega konstrukta z zanemarljivim puščanjem promotorja.

Seminarji SB 2023/24

2024-04-03T07:13:29Z

Sašo Jakob:

PhaseOut

2024-04-02T16:45:32Z

Sašo Jakob: PhaseOut

Seminarji SB 2023/24

2024-04-02T16:36:59Z

Sašo Jakob:

Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh

2020-05-11T23:42:13Z

Sašo Jakob: /* VIRI */

===Začetki zdravljenja z bakteriofagi===
Bakteriofagi so bili odkriti približno 100 let nazaj. Leta 1915 jih je odkril Frederick W. Twort v Londonu, leta 1917 pa Félix d'Hérelle v Parizu. Kmalu po njegovem odkritju je d'Hérelle začel raziskovati uporabo bakteriofagov za zdravljenje nalezljivih bolezni pri živalih. Preučeval je bakterijo imenovano Pasteurella pri vodnih bivolih, salmonelo pri piščancih in bakterijo imenovano Shigella pri zajcih. Ker so bili rezultati obetavni se je odločil preizkusiti zdravljenje na ljudeh. Leta 1921 je poročal o uspešnem zdravljenju hude okužbe otrok z bakterijo Shigella. Bakteriofagna terapija se je v Franciji klinično izvajala vse do leta 1990.

Najbolj pomembne raziskave bakteriofagne terapije izvedene na živalih pa segajo nazaj v osemdeseta leta. Smith in njegovi kolegi so raziskovali terapevtsko uporabo bakteriofagov pri mladih živalih na kmetiji. Predvsem so se osredotočili proti bakterijskim okužbam, ki povzročajo diarejo. Rezultati so bili spodbudni, saj so okužbe zaradi peroralne inokulacije zmesi šestih patogenih sevov E. coli ozdravili z dajanjem enega odmerka 10^5 fagnih delcev, ki so bili aktivni proti njimi. Nižji odmerek (10^2) pa je bil dovolj za preprečevanje diareje. Zanimivo je dejstvo, da so vse potrebne bakteriofage za zdravljene dobili iz odpadne vode.

===Novejše raziskave zdravljenja živali z bakteriofagi===
Nekaj novejših raziskav (novejših v smislu po letu 2000) je obravnavalo okužbo psov z baterijo P. aeruginosa. Vse so potrdile pozitiven vpliv bakteriofagne terapije, ampak zaradi pomanjkanja točnih informacij o tem, kateri bakteriofagi so bili uporabljeni, so za dejansko zdravilo potrebne dodatne raziskave.

Izvedena je bila tudi raziskava infekcije E.coli pri govedu in prašičih. Naredili so poskus na E.coli pri prašičih, kjer so uporabili T4 fag iz družine Myoviridae. Zagotavljal je 100% zaščito v vseh odmerkih; optimalni odmerek je bil določen kot trojno zdravljenje s 10^9 fagov pri enomesečni prašičih. Izvedeni so bili tudi poskusi na teletih in jagnjetih, peroralno okuženih s 3x10^9 E. coli tipa O9: K30.99.57 in noben od 9 telet, ki so bili zdravljeni z odmerkom 10^11 fagov ni dobil obolenj, v primerjavi s kontrolno skupino, kjer je umrlo 93% telet. Fagi sicer niso mogli uničiti E. coli v celoti, so pa lahko zmanjšali količino bakterij na raven pod patogeni prag.

Ena izmed novih raziskav je bila tudi tretiranje Vibrio cholerae pri zajcih. V poskusu so testirali 10 fagov (B1 - B10) (10^10 - 10^11 fag / ml) proti V. Cholerae z uporabo in vivo modela zajcev. Injicirali so jih skupaj s 10^8 CFU ATCC 51352 V. Cholerae v zajčevo črevesje; vendar ni bilo zaznanega niti antibiotičnega niti terapevtskega učinka v nasprotju z uspešnim zdravljenjem fagov za kolero pri človeku. Raziskovalci domnevajo, da bi se to lahko zgodilo, ker bi nekatere komponente v zajčjem črevesju zavirale fagno aktivnost.

Zadnja izmed novejših raziskav, ki bi jo omenil pa je bila namenjena tretiranju miši okuženih z bakterijo Enterokoccus faecium. Fagna terapija je bila preizkušena na vankomicin odpornem Enterococcusu na miših. Miši so okužili s 10^9 CFU enterokoccus faecium. Enkratna intraperitonealna injekcija 45 min po bakterijski okužbi z 3x10^9 fagi je zaščitila vse miši. Ko so zdravljenje s fagi začeli šele, ko je bolezen dosegla vrh (18-24 ur po okužbi), so pred njo lahko rešili le 50% miši. V obeh primerih se je količina patogena v krvi znatno zmanjšala.

===Splošno o terapiji z bakteriofagi===
Za učinkovito antibakterijsko terapijo mora bakteriofag izpolniti nekaj pogojev: imeti mora selektivnost za tarče, torej infecirati mora patogene bakterije, medtem ko drugih, komenzalnih, ne sme. Preživeti mora pot od oralne aplikacije do črevesja. Na replikacijskem mestu patogena mora ostati dovolj dolgo in v dovolj velikem številu, da lahko doseže svojo litično aktivnost. Še posebej pomembno pa je, da ne povzroča stranskih učinkov, ter da ne nosi zapisa za virusna obolenja in rezistenco proti antibiotikom.

Čeprav vrstno specifičnost fagov jemljemo za prednost, je velikokrat problematična njihova previsoka specifičnost – specifičnost na seve – ki jih je v živalskih prebavilih veliko. Zato mora biti v koktejlu za terapijo proti E. coli veliko različnih vrst bakteriofagov

Problemu sevne specifičnosti dobro nasprotujeta seva ΦNUSA-1 in ΦNUSA-10, ki lahko infecirata >80% sevov MRSA in MSSA (na meticilin občutljiv Staphylococus aureus) od skupno 61 preizkušenih (25 MRSA in 36 MSSA).

===Bakteriofagi in S. Aureus===
Proti meticilinu odporni Staphylococcus aureus sev oz. MRSA, je po gramu pozitivna bakterija v obliki kokov. MRSA sevi so znani po tem, da se jih pogosto najde v bolnišnicah. MRSA ponavadi niso odporni samo na meticilin, ampak tudi na številne druge antibiotike. Povzročajo lahko življenjsko nevarne okužbe (pljučnica, okužbe krvi, okužbe na mestu operativnega posega), njihovo zdravljenje pa je bolj zapleteno od zdravljenja bolezni, ki jih povzročajo neodporne bakterije.

Še vedno proti njim delujejo glikopeptidna zdravila, naprimer vankomicin, ampak vedno več je tudi bakterij, ki so odporne proti tem antibiotikom – zato je pomemben razvoj bakteriofagnih terapij.

Okužbe s S. Aureus so problematine tudi pri prostetičnih sklepih. Povzroča okužbo teh sklepov in posledično oteklino in vnetje. Bakteriofagni koktejli so sposobni znižati količino bakterij v tkivu v okolici sklepa 5x, vankomicin pa 6,2x. Kombinacija obeh zdravil ima veliko močnejši učinek - število bakterij v tkivu okoli sklepa lahko zniža za kar 22,5x.

S. Aureus in MRSA povzročajo tudi okužbe kosti, oziroma osteomielitis. Trenutno je standard zdravljenja odstranjevanje okuženega tkiva in dolgotrajna antibiotična terapija. In vivo rezultati testiranja zdravljenja osteomielitisa z bakteriofagi zaenkrat še niso uporabni za terapijo, obstajajo pa dokazi, da je takšna terapija lahko uporabna pri zdravljenju okužb mehkih tkiv.

===Uporaba bakteriofagov za prenos tovora v celice===
Virusne delce je možno uporabljati kot izolirane znotrajcelične kompartmente z encimskimi funkcijami. Assembler plasmid P22 vsebuje gen za kapsidni protein in gen za ogrodne proteine, ki ga lahko spreminjamo. V raziskavi so O'Neil in sodelavci v klonirno mesto vstavili gene za fluorescirajoč protein in bakteriofage vstavili v E. Coli. Novonastali bakteriofagi so bili strukturno praktično nespremenjeni, razen s spremenjeno strukturo ogrodnih proteinov. S spreminjanjem gena za ogrodne proteine bi lahko v celice vnašali različne proteine, še posebej uporabni bi bili encimi pri spreminjanju procesov v organizmih, ker bi to lahko imelo terapevtske potenciale.

===Pseudomonas aeruginosa===
Pseudomonas aeruginosa je bakterija, ki se pojavi pri različnih boleznih tako pri živalih kot tudi ljudeh. Ko govorimo o človeku, jo pogosto najdemo pri boleznih kot so pnevmonija (cistična fibroza), okužbah urinalnega trakta ter raznih okužbah na koži oziroma mehkem tkivu, kjer je prišlo do odrgnin ali opeklin ter razne razjede na koži. Glavna lastnost, ki ji daje zmožnost dolgotrajnega obstoja je odpornost na antibiotike in spada med MDS (multi-drugs resistance) bakterije.

Trenutno poteka veliko raziskav in-vivo na živalih, ter tudi in-vitro na človeških celicah. Zaenkrat je težko postaviti neko splošno hipotezo, kako zdraviti, saj obstaja več različnih sevov in v posameznih raziskavah tretirajo posamezne seve z določenimi bakteriofagi. Možnost zdravljenja raznih ran lahko poteka na različne načine kot so direktno na rano oziroma preko oralne zaužitve ali intravenoznega načina. Pri cistični fibrozi so trenutno v raziskave vključeni načini inhalacij aerosola skozi nos poleg oralnega zdravljenja, ter prav tako tudi potencialne suhe praške z bakteriofagi, ki so bolj obstojni in dlje časa zdržijo na mestu.

Obstajajo različni načini, kako lahko uničimo bakterije, ter različni obrambni mehanizme na katere vplivamo.

====Obrambni mehanizmi====
Med pomembnejšimi obrambnimi mehanizmi, na katere različne raziskave ciljajo so adherencijska inhibicija, ki onemogoči vezavo bakteriofaga na bakterijo, s tem ko pomaknejo receptorje v notranjost zunanje membrane zaradi spremembe pritiska ob vezavi.

Drugi pomemben mehanizem je CRISPR/Cas sistem. Bakterija vsebuje večkratno palindromsko zaporedje, z vmesnimi praznimi zaporedji, ki se ujema z nukleotidnim zaporedjem bakteriofagov. Ob prisotnosti bakteriofagov celica zazna to in začne sintetizirati to csRNA (crisper RNA), ki se nato prepisana poveže z Cas proteini. Ta kompleks se veže na encime bakterije in prepreči prepis dednega materiala bakteriofaga in s tem prepreči sintezo virusnih delov.

====Načini zdravljenja====
Eden izmed načinov zdravljenja je predčasno oziroma preventivno vbrizgavanje ustreznih bakteriofagov v organizem. Problem je v tem, ker težko napovemo kdaj se bo bolezen pojavila in o katerem sevu govorimo, vendar so v raziskavah potrdili, če bi poznali ta dva podatka bi bila ta metoda lahko zelo uspešna in uničila bakterije v prvi stopnji, ko poteka najbolj razširjeno razmnoževanje. S tem bi zelo olajšali bolezen.

Drugi način je istočasno zdravljenje z antibiotiki in bakteriofagi. Pri tem je poudarek na tem, da bakteriofag ob vezavi na bakterije sproži obrambni mehanizem in pri tem se bakterija obrani pred bakteriofagom, vendar je zelo občutljiva za ostale napade. Tako bi z dodatkom različnih antibiotiokov ti vstopili v bakterije in opravili svojo nalogo, brez da bi bakterija odgovorila nanje.

Primer za Pseudomonas aeruginosa so bakteriofagi OMKO1 (družina miovirusov), ki se vežejo na receptor OprM na zunanji membrani bakterije. Ta protein tvori skupaj s proteinoma MexA in MexB kanal skozi membrane za izločanje antibiotikov. Ob vezavi bakteriofagov pa se struktura tega kanalčka spremeni in izločanje antibiotikov je omejeno. Tako lahko ob istočasnem zdravljenjem antibiotiki neovirano delujejo, brez da bi jih bakterija izločila, saj se ne more braniti pred bakteriofagom in antibiotikom hkrati. Na ta način bi lahko že prej znani delujoči antibiotiki uničili bakterijo.
Raziskovalci poznajo že nekatere obrambne mehanizme in delovanje bakterije Pseudomonas aeruginosa, vendar je težko zaenkrat izvajati kakšne resne poskuse in-vivo na človeku, saj je lahko veliko stranskih kaskad in prilagajanj, ki še niso znana in specifike posameznih sevov, vendar je kljub temu zelo potencialen način zdravljenja bakterijskih okužb.

===VIRI===

Chan B, Sistrom M, Wertz J, Kortright K, Narayan D, Turner P; Phage selection restores antibiotic sensitivity in MDR Pseudomonas aeruginosa; Scientific Reports, vol. 6 (2016) Published by Nature Publishing Group; DOI: 10.1038/srep26717

Chatterjee M, Anju C, Biswas L, Anil Kumar V, Gopi Mohan C, Biswas R; Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options; International Journal of Medical Microbiology, vol. 306 (2016) pp. 48-58 Published by Elsevier GmbH; DOI: 10.1016/j.ijmm.2015.11.004

R.A. Squires (2018); Bacteriophage therapy for management of bacterial infections in veterinary practice: what was once old is new again, New Zeland Veterinary Journal, DOI: 10.1080/00480169.2018.1491348

Emmanuel D, Anne B, Caroline B, Catherine N, Harald B, Sophie L (2009); T4 Phages Against Escherichia Coli Diarrhea: Potential and Problems, Virology, DOI:10.1016/j.virol.2009.03.009.

Jodie L M (2019); Evaluation of bacteriophage as an adjunct therapy for treatment of peri-prosthetic joint infection caused by Staphylococcus aureus, PLOS, DOI: 10.1371/journal.pone.0226574

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh

2020-05-11T19:07:20Z

Sašo Jakob: New page: Tim Nograšek: Pseudomonas aeruginosa

Tim Nograšek: Pseudomonas aeruginosa

Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh

2020-05-11T19:02:22Z

Sašo Jakob: /* VIRI */

===Splošno o terapiji z bakteriofagi===
Za učinkovito antibakterijsko terapijo mora bakteriofag izpolniti nekaj pogojev: imeti mora selektivnost za tarče, torej infecirati mora patogene bakterije, medtem ko drugih, komenzalnih, ne sme. Preživeti mora pot od oralne aplikacije do črevesja. Na replikacijskem mestu patogena mora ostati dovolj dolgo in v dovolj velikem številu, da lahko doseže svojo litično aktivnost. Še posebej pomembno pa je, da ne povzroča stranskih učinkov, ter da ne nosi zapisa za virusna obolenja in rezistenco proti antibiotikom.

Čeprav vrstno specifičnost fagov jemljemo za prednost, je velikokrat problematična njihova previsoka specifičnost – specifičnost na seve – ki jih je v živalskih prebavilih veliko. Zato mora biti v koktejlu za terapijo proti E. coli veliko različnih vrst bakteriofagov

Problemu sevne specifičnosti dobro nasprotujeta seva ΦNUSA-1 in ΦNUSA-10, ki lahko infecirata >80% sevov MRSA in MSSA (na meticilin občutljiv Staphylococus aureus) od skupno 61 preizkušenih (25 MRSA in 36 MSSA).

===Bakteriofagi in S. Aureus===
Proti meticilinu odporni Staphylococcus aureus sev oz. MRSA, je po gramu pozitivna bakterija v obliki kokov. MRSA sevi so znani po tem, da se jih pogosto najde v bolnišnicah. MRSA ponavadi niso odporni samo na meticilin, ampak tudi na številne druge antibiotike. Povzročajo lahko življenjsko nevarne okužbe (pljučnica, okužbe krvi, okužbe na mestu operativnega posega), njihovo zdravljenje pa je bolj zapleteno od zdravljenja bolezni, ki jih povzročajo neodporne bakterije.

Še vedno proti njim delujejo glikopeptidna zdravila, naprimer vankomicin, ampak vedno več je tudi bakterij, ki so odporne proti tem antibiotikom – zato je pomemben razvoj bakteriofagnih terapij.

Okužbe s S. Aureus so problematine tudi pri prostetičnih sklepih. Povzroča okužbo teh sklepov in posledično oteklino in vnetje. Bakteriofagni koktejli so sposobni znižati količino bakterij v tkivu v okolici sklepa 5x, vankomicin pa 6,2x. Kombinacija obeh zdravil ima veliko močnejši učinek - število bakterij v tkivu okoli sklepa lahko zniža za kar 22,5x.

S. Aureus in MRSA povzročajo tudi okužbe kosti, oziroma osteomielitis. Trenutno je standard zdravljenja odstranjevanje okuženega tkiva in dolgotrajna antibiotična terapija. In vivo rezultati testiranja zdravljenja osteomielitisa z bakteriofagi zaenkrat še niso uporabni za terapijo, obstajajo pa dokazi, da je takšna terapija lahko uporabna pri zdravljenju okužb mehkih tkiv.

===Uporaba bakteriofagov za prenos tovora v celice===
Virusne delce je možno uporabljati kot izolirane znotrajcelične kompartmente z encimskimi funkcijami. Assembler plasmid P22 vsebuje gen za kapsidni protein in gen za ogrodne proteine, ki ga lahko spreminjamo. V raziskavi so O'Neil in sodelavci v klonirno mesto vstavili gene za fluorescirajoč protein in bakteriofage vstavili v E. Coli. Novonastali bakteriofagi so bili strukturno praktično nespremenjeni, razen s spremenjeno strukturo ogrodnih proteinov. S spreminjanjem gena za ogrodne proteine bi lahko v celice vnašali različne proteine, še posebej uporabni bi bili encimi pri spreminjanju procesov v organizmih, ker bi to lahko imelo terapevtske potenciale.

===Pseudomonas aeruginosa===
Pseudomonas aeruginosa je bakterija, ki se pojavi pri različnih boleznih tako pri živalih kot tudi ljudeh. Ko govorimo o človeku, jo pogosto najdemo pri boleznih kot so pnevmonija (cistična fibroza), okužbah urinalnega trakta ter raznih okužbah na koži oziroma mehkem tkivu, kjer je prišlo do odrgnin ali opeklin ter razne razjede na koži. Glavna lastnost, ki ji daje zmožnost dolgotrajnega obstoja je odpornost na antibiotike in spada med MDS (multi-drugs resistance) bakterije.

Trenutno poteka veliko raziskav in-vivo na živalih, ter tudi in-vitro na človeških celicah. Zaenkrat je težko postaviti neko splošno hipotezo, kako zdraviti, saj obstaja več različnih sevov in v posameznih raziskavah tretirajo posamezne seve z določenimi bakteriofagi. Možnost zdravljenja raznih ran lahko poteka na različne načine kot so direktno na rano oziroma preko oralne zaužitve ali intravenoznega načina. Pri cistični fibrozi so trenutno v raziskave vključeni načini inhalacij aerosola skozi nos poleg oralnega zdravljenja, ter prav tako tudi potencialne suhe praške z bakteriofagi, ki so bolj obstojni in dlje časa zdržijo na mestu.

Obstajajo različni načini, kako lahko uničimo bakterije, ter različni obrambni mehanizme na katere vplivamo.

====Obrambni mehanizmi====
Med pomembnejšimi obrambnimi mehanizmi, na katere različne raziskave ciljajo so adherencijska inhibicija, ki onemogoči vezavo bakteriofaga na bakterijo, s tem ko pomaknejo receptorje v notranjost zunanje membrane zaradi spremembe pritiska ob vezavi.

Drugi pomemben mehanizem je CRISPR/Cas sistem. Bakterija vsebuje večkratno palindromsko zaporedje, z vmesnimi praznimi zaporedji, ki se ujema z nukleotidnim zaporedjem bakteriofagov. Ob prisotnosti bakteriofagov celica zazna to in začne sintetizirati to csRNA (crisper RNA), ki se nato prepisana poveže z Cas proteini. Ta kompleks se veže na encime bakterije in prepreči prepis dednega materiala bakteriofaga in s tem prepreči sintezo virusnih delov.

====Načini zdravljenja====
Eden izmed načinov zdravljenja je predčasno oziroma preventivno vbrizgavanje ustreznih bakteriofagov v organizem. Problem je v tem, ker težko napovemo kdaj se bo bolezen pojavila in o katerem sevu govorimo, vendar so v raziskavah potrdili, če bi poznali ta dva podatka bi bila ta metoda lahko zelo uspešna in uničila bakterije v prvi stopnji, ko poteka najbolj razširjeno razmnoževanje. S tem bi zelo olajšali bolezen.

Drugi način je istočasno zdravljenje z antibiotiki in bakteriofagi. Pri tem je poudarek na tem, da bakteriofag ob vezavi na bakterije sproži obrambni mehanizem in pri tem se bakterija obrani pred bakteriofagom, vendar je zelo občutljiva za ostale napade. Tako bi z dodatkom različnih antibiotiokov ti vstopili v bakterije in opravili svojo nalogo, brez da bi bakterija odgovorila nanje.

Primer za Pseudomonas aeruginosa so bakteriofagi OMKO1 (družina miovirusov), ki se vežejo na receptor OprM na zunanji membrani bakterije. Ta protein tvori skupaj s proteinoma MexA in MexB kanal skozi membrane za izločanje antibiotikov. Ob vezavi bakteriofagov pa se struktura tega kanalčka spremeni in izločanje antibiotikov je omejeno. Tako lahko ob istočasnem zdravljenjem antibiotiki neovirano delujejo, brez da bi jih bakterija izločila, saj se ne more braniti pred bakteriofagom in antibiotikom hkrati. Na ta način bi lahko že prej znani delujoči antibiotiki uničili bakterijo.
Raziskovalci poznajo že nekatere obrambne mehanizme in delovanje bakterije Pseudomonas aeruginosa, vendar je težko zaenkrat izvajati kakšne resne poskuse in-vivo na človeku, saj je lahko veliko stranskih kaskad in prilagajanj, ki še niso znana in specifike posameznih sevov, vendar je kljub temu zelo potencialen način zdravljenja bakterijskih okužb.

===VIRI===

Chan B, Sistrom M, Wertz J, Kortright K, Narayan D, Turner P; Phage selection restores antibiotic sensitivity in MDR Pseudomonas aeruginosa; Scientific Reports, vol. 6 (2016) Published by Nature Publishing Group; DOI: 10.1038/srep26717

Chatterjee M, Anju C, Biswas L, Anil Kumar V, Gopi Mohan C, Biswas R; Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options; International Journal of Medical Microbiology, vol. 306 (2016) pp. 48-58 Published by Elsevier GmbH; DOI: 10.1016/j.ijmm.2015.11.004

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh

2020-05-11T19:01:53Z

Sašo Jakob:

===Splošno o terapiji z bakteriofagi===
Za učinkovito antibakterijsko terapijo mora bakteriofag izpolniti nekaj pogojev: imeti mora selektivnost za tarče, torej infecirati mora patogene bakterije, medtem ko drugih, komenzalnih, ne sme. Preživeti mora pot od oralne aplikacije do črevesja. Na replikacijskem mestu patogena mora ostati dovolj dolgo in v dovolj velikem številu, da lahko doseže svojo litično aktivnost. Še posebej pomembno pa je, da ne povzroča stranskih učinkov, ter da ne nosi zapisa za virusna obolenja in rezistenco proti antibiotikom.

Čeprav vrstno specifičnost fagov jemljemo za prednost, je velikokrat problematična njihova previsoka specifičnost – specifičnost na seve – ki jih je v živalskih prebavilih veliko. Zato mora biti v koktejlu za terapijo proti E. coli veliko različnih vrst bakteriofagov

Problemu sevne specifičnosti dobro nasprotujeta seva ΦNUSA-1 in ΦNUSA-10, ki lahko infecirata >80% sevov MRSA in MSSA (na meticilin občutljiv Staphylococus aureus) od skupno 61 preizkušenih (25 MRSA in 36 MSSA).

===Bakteriofagi in S. Aureus===
Proti meticilinu odporni Staphylococcus aureus sev oz. MRSA, je po gramu pozitivna bakterija v obliki kokov. MRSA sevi so znani po tem, da se jih pogosto najde v bolnišnicah. MRSA ponavadi niso odporni samo na meticilin, ampak tudi na številne druge antibiotike. Povzročajo lahko življenjsko nevarne okužbe (pljučnica, okužbe krvi, okužbe na mestu operativnega posega), njihovo zdravljenje pa je bolj zapleteno od zdravljenja bolezni, ki jih povzročajo neodporne bakterije.

Še vedno proti njim delujejo glikopeptidna zdravila, naprimer vankomicin, ampak vedno več je tudi bakterij, ki so odporne proti tem antibiotikom – zato je pomemben razvoj bakteriofagnih terapij.

Okužbe s S. Aureus so problematine tudi pri prostetičnih sklepih. Povzroča okužbo teh sklepov in posledično oteklino in vnetje. Bakteriofagni koktejli so sposobni znižati količino bakterij v tkivu v okolici sklepa 5x, vankomicin pa 6,2x. Kombinacija obeh zdravil ima veliko močnejši učinek - število bakterij v tkivu okoli sklepa lahko zniža za kar 22,5x.

S. Aureus in MRSA povzročajo tudi okužbe kosti, oziroma osteomielitis. Trenutno je standard zdravljenja odstranjevanje okuženega tkiva in dolgotrajna antibiotična terapija. In vivo rezultati testiranja zdravljenja osteomielitisa z bakteriofagi zaenkrat še niso uporabni za terapijo, obstajajo pa dokazi, da je takšna terapija lahko uporabna pri zdravljenju okužb mehkih tkiv.

===Uporaba bakteriofagov za prenos tovora v celice===
Virusne delce je možno uporabljati kot izolirane znotrajcelične kompartmente z encimskimi funkcijami. Assembler plasmid P22 vsebuje gen za kapsidni protein in gen za ogrodne proteine, ki ga lahko spreminjamo. V raziskavi so O'Neil in sodelavci v klonirno mesto vstavili gene za fluorescirajoč protein in bakteriofage vstavili v E. Coli. Novonastali bakteriofagi so bili strukturno praktično nespremenjeni, razen s spremenjeno strukturo ogrodnih proteinov. S spreminjanjem gena za ogrodne proteine bi lahko v celice vnašali različne proteine, še posebej uporabni bi bili encimi pri spreminjanju procesov v organizmih, ker bi to lahko imelo terapevtske potenciale.

===Pseudomonas aeruginosa===
Pseudomonas aeruginosa je bakterija, ki se pojavi pri različnih boleznih tako pri živalih kot tudi ljudeh. Ko govorimo o človeku, jo pogosto najdemo pri boleznih kot so pnevmonija (cistična fibroza), okužbah urinalnega trakta ter raznih okužbah na koži oziroma mehkem tkivu, kjer je prišlo do odrgnin ali opeklin ter razne razjede na koži. Glavna lastnost, ki ji daje zmožnost dolgotrajnega obstoja je odpornost na antibiotike in spada med MDS (multi-drugs resistance) bakterije.

Trenutno poteka veliko raziskav in-vivo na živalih, ter tudi in-vitro na človeških celicah. Zaenkrat je težko postaviti neko splošno hipotezo, kako zdraviti, saj obstaja več različnih sevov in v posameznih raziskavah tretirajo posamezne seve z določenimi bakteriofagi. Možnost zdravljenja raznih ran lahko poteka na različne načine kot so direktno na rano oziroma preko oralne zaužitve ali intravenoznega načina. Pri cistični fibrozi so trenutno v raziskave vključeni načini inhalacij aerosola skozi nos poleg oralnega zdravljenja, ter prav tako tudi potencialne suhe praške z bakteriofagi, ki so bolj obstojni in dlje časa zdržijo na mestu.

Obstajajo različni načini, kako lahko uničimo bakterije, ter različni obrambni mehanizme na katere vplivamo.

====Obrambni mehanizmi====
Med pomembnejšimi obrambnimi mehanizmi, na katere različne raziskave ciljajo so adherencijska inhibicija, ki onemogoči vezavo bakteriofaga na bakterijo, s tem ko pomaknejo receptorje v notranjost zunanje membrane zaradi spremembe pritiska ob vezavi.

Drugi pomemben mehanizem je CRISPR/Cas sistem. Bakterija vsebuje večkratno palindromsko zaporedje, z vmesnimi praznimi zaporedji, ki se ujema z nukleotidnim zaporedjem bakteriofagov. Ob prisotnosti bakteriofagov celica zazna to in začne sintetizirati to csRNA (crisper RNA), ki se nato prepisana poveže z Cas proteini. Ta kompleks se veže na encime bakterije in prepreči prepis dednega materiala bakteriofaga in s tem prepreči sintezo virusnih delov.

====Načini zdravljenja====
Eden izmed načinov zdravljenja je predčasno oziroma preventivno vbrizgavanje ustreznih bakteriofagov v organizem. Problem je v tem, ker težko napovemo kdaj se bo bolezen pojavila in o katerem sevu govorimo, vendar so v raziskavah potrdili, če bi poznali ta dva podatka bi bila ta metoda lahko zelo uspešna in uničila bakterije v prvi stopnji, ko poteka najbolj razširjeno razmnoževanje. S tem bi zelo olajšali bolezen.

Drugi način je istočasno zdravljenje z antibiotiki in bakteriofagi. Pri tem je poudarek na tem, da bakteriofag ob vezavi na bakterije sproži obrambni mehanizem in pri tem se bakterija obrani pred bakteriofagom, vendar je zelo občutljiva za ostale napade. Tako bi z dodatkom različnih antibiotiokov ti vstopili v bakterije in opravili svojo nalogo, brez da bi bakterija odgovorila nanje.

Primer za Pseudomonas aeruginosa so bakteriofagi OMKO1 (družina miovirusov), ki se vežejo na receptor OprM na zunanji membrani bakterije. Ta protein tvori skupaj s proteinoma MexA in MexB kanal skozi membrane za izločanje antibiotikov. Ob vezavi bakteriofagov pa se struktura tega kanalčka spremeni in izločanje antibiotikov je omejeno. Tako lahko ob istočasnem zdravljenjem antibiotiki neovirano delujejo, brez da bi jih bakterija izločila, saj se ne more braniti pred bakteriofagom in antibiotikom hkrati. Na ta način bi lahko že prej znani delujoči antibiotiki uničili bakterijo.
Raziskovalci poznajo že nekatere obrambne mehanizme in delovanje bakterije Pseudomonas aeruginosa, vendar je težko zaenkrat izvajati kakšne resne poskuse in-vivo na človeku, saj je lahko veliko stranskih kaskad in prilagajanj, ki še niso znana in specifike posameznih sevov, vendar je kljub temu zelo potencialen način zdravljenja bakterijskih okužb.

===VIRI===

Chan B, Sistrom M, Wertz J, Kortright K, Narayan D, Turner P; Phage selection restores antibiotic sensitivity in MDR Pseudomonas aeruginosa; Scientific Reports, vol. 6 (2016) Published by Nature Publishing Group; DOI: 10.1038/srep26717

Chatterjee M, Anju C, Biswas L, Anil Kumar V, Gopi Mohan C, Biswas R; Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options; International Journal of Medical Microbiology, vol. 306, issue 1 (2016) pp. 48-58 Published by Elsevier GmbH; DOI: 10.1016/j.ijmm.2015.11.004

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh

2020-05-11T18:58:12Z

Sašo Jakob:

Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh

2020-05-11T18:54:45Z

Sašo Jakob:

===Splošno o terapiji z bakteriofagi===
Za učinkovito antibakterijsko terapijo mora bakteriofag izpolniti nekaj pogojev: imeti mora selektivnost za tarče, torej infecirati mora patogene bakterije, medtem ko drugih, komenzalnih, ne sme. Preživeti mora pot od oralne aplikacije do črevesja. Na replikacijskem mestu patogena mora ostati dovolj dolgo in v dovolj velikem številu, da lahko doseže svojo litično aktivnost. Še posebej pomembno pa je, da ne povzroča stranskih učinkov, ter da ne nosi zapisa za virusna obolenja in rezistenco proti antibiotikom.

Čeprav vrstno specifičnost fagov jemljemo za prednost, je velikokrat problematična njihova previsoka specifičnost – specifičnost na seve – ki jih je v živalskih prebavilih veliko. Zato mora biti v koktejlu za terapijo proti E. coli veliko različnih vrst bakteriofagov

Problemu sevne specifičnosti dobro nasprotujeta seva ΦNUSA-1 in ΦNUSA-10, ki lahko infecirata >80% sevov MRSA in MSSA (na meticilin občutljiv Staphylococus aureus) od skupno 61 preizkušenih (25 MRSA in 36 MSSA).

===Bakteriofagi in S. Aureus===
Proti meticilinu odporni Staphylococcus aureus sev oz. MRSA, je po gramu pozitivna bakterija v obliki kokov. MRSA sevi so znani po tem, da se jih pogosto najde v bolnišnicah. MRSA ponavadi niso odporni samo na meticilin, ampak tudi na številne druge antibiotike. Povzročajo lahko življenjsko nevarne okužbe (pljučnica, okužbe krvi, okužbe na mestu operativnega posega), njihovo zdravljenje pa je bolj zapleteno od zdravljenja bolezni, ki jih povzročajo neodporne bakterije.

Še vedno proti njim delujejo glikopeptidna zdravila, naprimer vankomicin, ampak vedno več je tudi bakterij, ki so odporne proti tem antibiotikom – zato je pomemben razvoj bakteriofagnih terapij.

Okužbe s S. Aureus so problematine tudi pri prostetičnih sklepih. Povzroča okužbo teh sklepov in posledično oteklino in vnetje. Bakteriofagni koktejli so sposobni znižati količino bakterij v tkivu v okolici sklepa 5x, vankomicin pa 6,2x. Kombinacija obeh zdravil ima veliko močnejši učinek - število bakterij v tkivu okoli sklepa lahko zniža za kar 22,5x.

S. Aureus in MRSA povzročajo tudi okužbe kosti, oziroma osteomielitis. Trenutno je standard zdravljenja odstranjevanje okuženega tkiva in dolgotrajna antibiotična terapija. In vivo rezultati testiranja zdravljenja osteomielitisa z bakteriofagi zaenkrat še niso uporabni za terapijo, obstajajo pa dokazi, da je takšna terapija lahko uporabna pri zdravljenju okužb mehkih tkiv.

===Uporaba bakteriofagov za prenos tovora v celice===
Virusne delce je možno uporabljati kot izolirane znotrajcelične kompartmente z encimskimi funkcijami. Assembler plasmid P22 vsebuje gen za kapsidni protein in gen za ogrodne proteine, ki ga lahko spreminjamo. V raziskavi so O'Neil in sodelavci v klonirno mesto vstavili gene za fluorescirajoč protein in bakteriofage vstavili v E. Coli. Novonastali bakteriofagi so bili strukturno praktično nespremenjeni, razen s spremenjeno strukturo ogrodnih proteinov. S spreminjanjem gena za ogrodne proteine bi lahko v celice vnašali različne proteine, še posebej uporabni bi bili encimi pri spreminjanju procesov v organizmih, ker bi to lahko imelo terapevtske potenciale.

===Bakteriofagi in Pseudomonas aeruginosa===
Pseudomonas aeruginosa je bakterija, ki se pojavi pri različnih boleznih tako pri živalih kot tudi ljudeh. Ko govorimo o človeku, jo pogosto najdemo pri boleznih kot so pnevmonija (cistična fibroza), okužbah urinalnega trakta ter raznih okužbah na koži oziroma mehkem tkivu, kjer je prišlo do odrgnin ali opeklin ter razne razjede na koži. Glavna lastnost, ki ji daje zmožnost dolgotrajnega obstoja je odpornost na antibiotike in spada med MDS (multi-drugs resistance) bakterije.

Trenutno poteka veliko raziskav in-vivo na živalih, ter tudi in-vitro na človeških celicah. Zaenkrat je težko postaviti neko splošno hipotezo, kako zdraviti, saj obstaja več različnih sevov in v posameznih raziskavah tretirajo posamezne seve z določenimi bakteriofagi. Možnost zdravljenja raznih ran lahko poteka na različne načine kot so direktno na rano oziroma preko oralne zaužitve ali intravenoznega načina. Pri cistični fibrozi so trenutno v raziskave vključeni načini inhalacij aerosola skozi nos poleg oralnega zdravljenja, ter prav tako tudi potencialne suhe praške z bakteriofagi, ki so bolj obstojni in dlje časa zdržijo na mestu.

Obstajajo različni načini, kako lahko uničimo bakterije, ter različni obrambni mehanizme na katere vplivamo.

Med pomembnejšimi obrambnimi mehanizmi, na katere različne raziskave ciljajo so adherencijska inhibicija, ki onemogoči vezavo bakteriofaga na bakterijo, s tem ko pomaknejo receptorje v notranjost zunanje membrane zaradi spremembe pritiska ob vezavi.

Drugi pomemben mehanizem je CRISPR/Cas sistem. Bakterija vsebuje večkratno palindromsko zaporedje, z vmesnimi praznimi zaporedji, ki se ujema z nukleotidnim zaporedjem bakteriofagov. Ob prisotnosti bakteriofagov celica zazna to in začne sintetizirati to csRNA (crisper RNA), ki se nato prepisana poveže z Cas proteini. Ta kompleks se veže na encime bakterije in prepreči prepis dednega materiala bakteriofaga in s tem prepreči sintezo virusnih delov.

Eden izmed načinov zdravljenja je predčasno oziroma preventivno vbrizgavanje ustreznih bakteriofagov v organizem. Problem je v tem, ker težko napovemo kdaj se bo bolezen pojavila in o katerem sevu govorimo, vendar so v raziskavah potrdili, če bi poznali ta dva podatka bi bila ta metoda lahko zelo uspešna in uničila bakterije v prvi stopnji, ko poteka najbolj razširjeno razmnoževanje. S tem bi zelo olajšali bolezen.

Drugi način je istočasno zdravljenje z antibiotiki in bakteriofagi. Pri tem je poudarek na tem, da bakteriofag ob vezavi na bakterije sproži obrambni mehanizem in pri tem se bakterija obrani pred bakteriofagom, vendar je zelo občutljiva za ostale napade. Tako bi z dodatkom različnih antibiotiokov ti vstopili v bakterije in opravili svojo nalogo, brez da bi bakterija odgovorila nanje.

Primer za Pseudomonas aeruginosa so bakteriofagi OMKO1 (družina miovirusov), ki se vežejo na receptor OprM na zunanji membrani bakterije. Ta protein tvori skupaj s proteinoma MexA in MexB kanal skozi membrane za izločanje antibiotikov. Ob vezavi bakteriofagov pa se struktura tega kanalčka spremeni in izločanje antibiotikov je omejeno. Tako lahko ob istočasnem zdravljenjem antibiotiki neovirano delujejo, brez da bi jih bakterija izločila, saj se ne more braniti pred bakteriofagom in antibiotikom hkrati. Na ta način bi lahko že prej znani delujoči antibiotiki uničili bakterijo.
Raziskovalci poznajo že nekatere obrambne mehanizme in delovanje bakterije Pseudomonas aeruginosa, vendar je težko zaenkrat izvajati kakšne resne poskuse in-vivo na človeku, saj je lahko veliko stranskih kaskad in prilagajanj, ki še niso znana in specifike posameznih sevov, vendar je kljub temu zelo potencialen način zdravljenja bakterijskih okužb.

Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh

2020-05-11T17:31:03Z

Sašo Jakob: New page: ===Splošno o terapiji z bakteriofagi=== Za učinkovito antibakterijsko terapijo mora bakteriofag izpolniti nekaj pogojev: imeti mora selektivnost za tarče, torej infecirati mora patogene...

Bakteriofagi

2020-05-11T17:25:08Z

Sašo Jakob:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.

Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Poglavja za seminarje so:

'''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV''' 
https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019) 
1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019) 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via% 
(pregledni, 2018) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via% 
(pregledni, 2020) 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 

'''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA''' 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019) 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063 
9. Interakcija faga z bakterijo 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi 

https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema) 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643 
(pregledni, 2019+2020) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via% 
(pregledni, 2019) 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom 

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013) 
14. Cianofagi 

'''UPORABA BAKTERIOFAGOV''' 

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/ 
(pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 

https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04- 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm 
in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič) 

1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 
5. [[Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda]] (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) 
6. [[Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni]] (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik) 
7. [[Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina]] (Anja Konjc, Tina Logonder, Manca Osolin) 
8. [[Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave]] (Tina Arnšek, Ana Babnik, Greta Junger) 
9. [[Interakcija faga z bakterijo]] (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik, Ana Vičič) 
10.[[Interakcije fagov s človeškimi tkivi]] (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman) 
11. [[Fagi v naravnih in umetnih okoljih]] (Lena Trnovec, Maja Kolar, Liza Praznik) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom (Žan Fortuna, Tevž Levstek, Lara Drinovec) 
14. Cianofagi (Timotej Zgonik, ) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič) 
16. [[Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh]] (Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob) 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje (Maja Mahorič, Ana Potočnik, Maja Trifkovič) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin (Tanja Janko, Špela Šubelj in Matic Krivec) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek, Oskar Nemec) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Bakteriofagi

2020-03-12T19:29:17Z

Sašo Jakob:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.

Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Poglavja za seminarje so:

'''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV''' 
https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019) 
1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019) 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via% 
(pregledni, 2018) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via% 
(pregledni, 2020) 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 

'''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA''' 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019) 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063 
9. Interakcija faga z bakterijo 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi 

https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema) 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643 
(pregledni, 2019+2020) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via% 
(pregledni, 2019) 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom 

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013) 
14. Cianofagi 

'''UPORABA BAKTERIOFAGOV''' 

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/ 
(pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 

https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04- 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm 
in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič) 

1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Nastja Feguš, Nina Varda) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 
9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom 
14. Cianofagi 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič) 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob) 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih 
21. Biotehnološka izraba fagov 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)