Wiki FKKT - User contributions [en]

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:40:04Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom ''in vitro'' adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov<ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref><ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike<ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref><ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike<ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref><ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike<ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref><ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje<ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov<ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti<ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne ''in vitro'' evolucije<ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih<ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant bo v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov<ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije<ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref><ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji<ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako<ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutantov, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref><ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>. Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur<ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V ''in vitro'' adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
Pri klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during ''in vitro'' evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se, označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene, torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta. Računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during ''in vitro'' evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>.
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam ''omik'' in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metod, kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim genskim doprinosom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu genskemu doprinosu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:37:19Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom ''in vitro'' adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov<ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref><ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike<ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref><ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike<ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref><ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike<ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref><ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje<ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov<ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti<ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne ''in vitro''''Italic text'' evolucije<ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih<ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant bo v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov<ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije<ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref><ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji<ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako<ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutantov, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref><ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>. Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur<ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V ''in vitro'' adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
Pri klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during ''in vitro'' evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se, označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene, torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta. Računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during ''in vitro'' evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>.
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam ''omik'' in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metod, kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim genskim doprinosom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu genskemu doprinosu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:35:53Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov<ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref><ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike<ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref><ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike<ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref><ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike<ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref><ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje<ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov<ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti<ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije<ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih<ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant bo v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov<ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije<ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref><ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji<ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako<ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutantov, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref><ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>. Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur<ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
Pri klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se, označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene, torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta. Računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>.
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metod, kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim genskim doprinosom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu genskemu doprinosu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:28:02Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant bo v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutantov, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>. Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
Pri klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se, označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene, torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>.
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metod, kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:24:17Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant bo v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutantov, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>. Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
Pri klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se, označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene, torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:22:48Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant bo v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutantov, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>. Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
Pri klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se, označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:20:51Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant bo v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutantov, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>. Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
Pri klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:19:06Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant bo v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutantov, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>. Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:14:52Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant bo v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:12:31Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright leta 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:09:55Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:04:31Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T21:02:02Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:57:56Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

==Reference==
<references/>

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:56:29Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

==Zaključek==
Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:55:22Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==
V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo.
Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang.
Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa.
Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>..
Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:50:13Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

==Vizualizacija evolucije v realnem času==

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:49:27Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:47:39Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov (Conrad et al., 2011).

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:45:48Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture (Gresham et al., 2008).
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov (Conrad et al., 2011).

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:43:50Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.
Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur (Elena and Lenski, 2003) in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture (Gresham et al., 2008).
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov (Conrad et al., 2011).

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:43:08Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.
Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur (Elena and Lenski, 2003) in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture (Gresham et al., 2008).
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov (Conrad et al., 2011).

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:41:53Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref>( Gresham et al., 2008; Barrick et al., 2009).<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>
Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur (Elena and Lenski, 2003) in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture (Gresham et al., 2008).
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov (Conrad et al., 2011).

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:39:44Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref>( Gresham et al., 2008; Barrick et al., 2009).<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref>
Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur (Elena and Lenski, 2003) in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture (Gresham et al., 2008).
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov (Conrad et al., 2011).

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:34:59Z

SamoZakotnik:

==Uvod==
Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo.
Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,
and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov.
Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari,
E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb.
CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>.
V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

==Adaptivna krajina==
Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>.
Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

==Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo==
Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,andStephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>.
Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>.
V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

==Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije==
Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme (Elena and Lenski, 2003; Gresham et al., 2008; Barrick et al., 2009).
Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo.
Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur (Elena and Lenski, 2003) in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture (Gresham et al., 2008).
Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov (Conrad et al., 2011).

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:31:52Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:31:33Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:29:30Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:27:58Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:24:18Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:14:55Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:12:43Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:11:54Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:11:14Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T20:07:02Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T19:59:29Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:35:01Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:34:26Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:33:34Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:27:51Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:23:29Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:21:15Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:16:17Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:12:21Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:09:57Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:06:11Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T15:02:19Z

SamoZakotnik:

Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

2015-12-14T14:52:24Z

SamoZakotnik: New page: ==Uvod== Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov ...

Seminarji SB 2015/16

2015-12-14T14:44:32Z

SamoZakotnik:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli (Ajda Rojc) 
* New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)
* Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” (Nastja Pirman)
* Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation (Monika Praznik)
* Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy (Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* Towards engineering biological systems in a broader context (Aleksander Benčič)
* Synthetic biology: Novel approaches for microbiology (Daša Janeš)
* Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism (Jure Zabret)
* Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)
* Better together: engineering and application of microbial symbioses (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates (Mojca Banič)
* Synthetic biology of fungal natural products (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors (Benjamin Bajželj)
* How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application (Ana Grom & Ana Unkovič)
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)
* Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications (Maša Mirkovič)
* Synthetic biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)

2015-bionano-seminar

2015-05-10T12:16:21Z

SamoZakotnik: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Avtor 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Avtor 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
|-
| Anže Prašnikar||Monika Praznik ||||29.03.||31.03.||Aneja Tuljak||Angelika Vižintin
|-
| Varja Božič||Eva Knapič||Razgradljivi kondomi s protimikrobno zaščito||29.03.||31.03.||Eva Udovič||Maja Grdadolnik
|-
| Belkisa Velagić||Aleksander Benčič||Avtomobilski encimski katalizator||29.03.||31.03.||Nika Kurinčič||Tjaša Goričan
|-
| Naja Vrankar||Valter Bergant||||31.03.||02.04.||Nataša Žigante||Luka Smole
|-
| Tilen Volčanšek||Veronika Jarc||||31.03.||02.04.||Anže Prašnikar||Jakob Gašper Lavrenčič
|-
| Tanja Lipec||Iza Ogris||Test občutljivosti na gluten z neprebavljivo kapsulo||31.03.||02.04.||Varja Božič||Klara Tereza Novoselc
|-
| Katja Lovrin||Mitja Crček||Uporaba nitrifikacijskih encimov pri kmetovanju||05.04.||07.04.||Belkisa Velagić||Monika Praznik
|-
| Saša Balažic||Urban Javoršek ||||05.04.||07.04.||Naja Vrankar||Eva Knapič
|-
| Urban Borštnik||Sara Primec||||05.04.||07.04.||Tilen Volčanšek||Aleksander Benčič
|-
| Nives Ahlin||Kim Kos||||12.04.||14.04.||Tanja Lipec||Valter Bergant
|-
| Matic Bevec||Estera Merljak||Antimaček®||12.04.||14.04.||Katja Lovrin||Veronika Jarc
|-
| Vida Špindler||Jernej Pušnik||||12.04.||14.04.||Saša Balažic||Iza Ogris
|-
| Jasmina Sedmak||Maxi Sagmeister||Brezžični zobni nanobiosenzor ||19.04.||21.04.||Urban Borštnik||Mitja Crček
|-
| Sanja Popović||Benjamin Bajželj||||19.04.||21.04.||Nives Ahlin||Urban Javoršek
|-
| Blaž Komar||Alja Zottel||||19.04.||21.04.||Matic Bevec||Sara Primec
|-
| Blaž Perič||Katarina Uršič||Biorazgradljivi žvečilni gumi z antibakterijskimi lastnostmi||03.05.||05.05.||Simon Preložnik||Kim Kos
|-
| Simon Preložnik||Maja Remškar||Preprost dostavni sistem za omega-3 maščobne kisline||03.05.||05.05.||Jasmina Sedmak||Estera Merljak
|-
| Aneja Tuljak||Tina Gregorič||Stekleničke z biosenzorjem za detekcijo ''E.coli''||03.05.||05.05.||Sanja Popović||Jernej Pušnik
|-
| Damir Hamulić||Anita Kustec||Pretvorba CO2 v uporabne proizvode s pomočjo umetne fotosinteze||10.05.||12.05.||Blaž Komar||Maxi Sagmeister
|-
| Janja Fortin||Tina Snoj|| Zaviralec nadležnih posledic komarjevega pika (Antikomarin) ||10.05.||12.05.||Blaž Perič||Benjamin Bajželj
|-
| Rajko Vnuk||Mojca Banič||||10.05.||12.05.||Vida Špindler||Alja Zottel
|-
| Rok Grm||Ajda Rojc||||17.05.||19.05.||Kaja Javoršek||Katarina Uršič
|-
| Kristina Gavranić||Barbara Žužek||Protimikrobni žvečilni gumi s hidroksiapatitnimi nanodelci za remineralizacijo zobne sklenine||17.05.||19.05.||Damir Hamulić||Maja Remškar
|-
| Urška Mohorič||Griša Prinčič||||17.05.||19.05.||Janja Fortin||Tina Gregorič
|-
| Maja Ramić||Nejc Petrišič||||24.05.||26.05.||Rajko Vnuk||Anita Kustec
|-
| Barbara Jeras||Tamara Marić||||24.05.||26.05.||Rok Grm||Tina Snoj
|-
| Matic Urlep||Samo Zakotnik||Uporaba optogenetike za lajšanje simptomov Parkinsonove bolezni||24.05.||26.05.||Kristina Gavranić||Mojca Banič
|-
| Urban Verbič||Angelika Vižintin||||31.05.||02.06.||Urška Mohorič||Ajda Rojc
|-
| Nataša Žigante||Maja Grdadolnik||||31.05.||02.06.||Maja Ramić||Barbara Žužek
|-
| Kaja Javoršek||Tjaša Goričan||||31.05.||02.06.||Barbara Jeras||Griša Prinčič
|-
| Eva Udovič||Luka Smole||||07.06.||09.06.||Matic Urlep||Nejc Petrišič
|-
| Nika Kurinčič||Jakob Gašper Lavrenčič||||07.06.||09.06.||Urban Verbič||Tamara Marić
|-
| Klara Tereza Novoselc||||||07.06.||09.06.||Samo Zakotnik||
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Po dva študenta skupaj pripravita projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 1500 do 2000 besed . Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut, predstavitev pa ne sme biti krajša od 15 minut (popust :-)). Nalogo predstavita oba študenta (razdelita si čas). Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.