https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Sara+Laznik 2026-05-15T15:46:36Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19245 2021-05-17T17:00:14Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> =='''Uvod'''==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, z domeno KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> =='''Nanotelesa in regulatorji kromatina'''==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].<br /> <br /> =='''Rezultati'''==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTetR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve fuzije rTetR z nanotelesom na reporterju. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija rTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo z domeno KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanja signala. Želeni signal je lahko povezan z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> =='''Zaključek'''==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> =='''Viri'''==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19230 2021-05-17T15:09:05Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> =='''Uvod'''==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, z domeno KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> =='''Nanotelesa in regulatorji kromatina'''==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].<br /> <br /> =='''Rezultati'''==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTetR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve fuzije rTetR z nanotelesom na reporterju. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo z domeno KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanja signala. Želeni signal je lahko povezan z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> =='''Zaključek'''==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> =='''Viri'''==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19188 2021-05-17T09:00:40Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> =='''Uvod'''==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, z domeno KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> =='''Nanotelesa in regulatorji kromatina'''==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].<br /> <br /> =='''Rezultati'''==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTetR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo z domeno KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanja signala. Želeni signal je lahko povezan z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> =='''Zaključek'''==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> =='''Viri'''==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19187 2021-05-17T07:03:25Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> =='''Uvod'''==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, z domeno KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> =='''Nanotelesa in regulatorji kromatina'''==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].<br /> <br /> =='''Rezultati'''==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo z domeno KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanja signala. Želeni signal je lahko povezan z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> =='''Zaključek'''==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> =='''Viri'''==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19186 2021-05-17T06:52:14Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> =='''Uvod'''==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, z domeno KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> =='''Nanotelesa in regulatorji kromatina'''==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].<br /> <br /> =='''Rezultati'''==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanja signala. Želeni signal je lahko povezan z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> =='''Zaključek'''==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> =='''Viri'''==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19185 2021-05-17T06:47:19Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> =='''Uvod'''==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> =='''Nanotelesa in regulatorji kromatina'''==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].<br /> <br /> =='''Rezultati'''==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanja signala. Želeni signal je lahko povezan z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> =='''Zaključek'''==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> =='''Viri'''==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19184 2021-05-16T22:39:28Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> =='''Uvod'''==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> =='''Nanotelesa in regulatorji kromatina'''==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].<br /> <br /> =='''Rezultati'''==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. Uporaba nanoteles za pritegnitev endogenih regulatorjev kromatina v gen, ki je pomemben za uravnavanje transkripcije, bi lahko ponudilo boljšo priložnost za privabljanje celotnih kromatinskih kompleksov, pri čemer bi izkoristili vse domene, ki so bistvene za aktivnost in njihove interakcije.<br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanja signala. Želeni signal je lahko povezan z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> =='''Zaključek'''==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> =='''Viri'''==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19183 2021-05-16T22:36:37Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> =='''Uvod'''==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> =='''Nanotelesa in regulatorji kromatina'''==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].<br /> <br /> =='''Rezultati'''==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. Uporaba nanoteles za pritegnitev endogenih regulatorjev kromatina v gen, ki je pomemben za uravnavanje transkripcije, bi lahko ponudilo boljšo priložnost za privabljanje celotnih kromatinskih kompleksov, pri čemer bi izkoristili vse domene, ki so bistvene za aktivnost in njihove interakcije.<br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> =='''Zaključek'''==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> =='''Viri'''==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19182 2021-05-16T22:32:52Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. Uporaba nanoteles za pritegnitev endogenih regulatorjev kromatina v gen, ki je pomemben za uravnavanje transkripcije, bi lahko ponudilo boljšo priložnost za privabljanje celotnih kromatinskih kompleksov, pri čemer bi izkoristili vse domene, ki so bistvene za aktivnost in njihove interakcije.<br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> ==Viri==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19181 2021-05-16T22:29:45Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in de novo metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visoko zmogljivih metod. V članku opisani sistemi, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. Uporaba nanoteles za pritegnitev endogenih regulatorjev kromatina v gen, ki je pomemben za uravnavanje transkripcije, bi lahko ponudilo boljšo priložnost za privabljanje celotnih kromatinskih kompleksov, pri čemer bi izkoristili vse domene, ki so bistvene za aktivnost in njihove interakcije.<br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. <br /> <br /> Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> ==Viri==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19180 2021-05-16T22:06:28Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in de novo metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki se vežejo in privabijo endogene regulatorje kromatina.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. Uporaba nanoteles za pritegnitev endogenih regulatorjev kromatina v gen, ki je pomemben za uravnavanje transkripcije, bi lahko ponudilo boljšo priložnost za privabljanje celotnih kromatinskih kompleksov, pri čemer bi izkoristili vse domene, ki so bistvene za aktivnost in njihove interakcije.<br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. <br /> <br /> Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> ==Viri==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19179 2021-05-16T21:59:34Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in de novo metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki se vežejo in privabijo endogene regulatorje kromatina.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev. Uporaba nanoteles za pritegnitev endogenih regulatorjev kromatina v gen, ki je pomemben za uravnavanje transkripcije, bi lahko ponudilo boljšo priložnost za privabljanje celotnih kromatinskih kompleksov, pri čemer bi izkoristili vse domene, ki so bistvene za aktivnost in njihove interakcije.<br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> ==Viri==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19178 2021-05-16T21:46:38Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in de novo metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki se vežejo in privabijo endogene regulatorje kromatina.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> ==Viri==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19176 2021-05-16T21:37:24Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še nekaterih drugih regulatorjev kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in ''de novo'' metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki se vežejo in privabijo endogene regulatorje kromatina.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti DNMT1 in HP1 za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Nato so naredili fuzijo dveh nanoteles s fleksibilnim linkerjem, da bi videli učinek na utišanje gena in izboljšanje epigenetskega spomina. Fuzija rTetR-antiDNMT1-antiHP1 je povzročila utišanje pri 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo vsako posamezno nanotelo. Ugotovili so, da je fuzija antiDNMT1-antiHP1 izboljšala epigenetski spomin v primerjavi z močnim represorjem KRAB. Ti rezultati kažejo, da lahko izražanje fuzije nanoteles povzroči utišanje reporterjev in izboljša epigenetski spomin.<br /> <br /> ===Vpliv nanotelesa antiDNMT1 na povečanje hitrosti utišanja gena in izboljšanja epigenetskega spomina ostalih regulatorjev kromatina===<br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost odstotka utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> [2] O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> [3] N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19175 2021-05-16T21:31:45Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še nekaterih drugih regulatorjev kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in de novo metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki se vežejo in privabijo endogene regulatorje kromatina.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Nato so naredili fuzijo dveh nanoteles s fleksibilnim linkerjem, da bi videli učinek na utišanje gena in izboljšanje epigenetskega spomina. Fuzija rTetR-antiDNMT1-antiHP1 je povzročila utišanje pri 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo vsako posamezno nanotelo. Ugotovili so, da je fuzija antiDNMT1-antiHP1 izboljšala epigenetski spomin v primerjavi z močnim represorjem KRAB. Ti rezultati kažejo, da lahko izražanje fuzije nanoteles povzroči utišanje reporterjev in izboljša epigenetski spomin.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost odstotka utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> ==Viri==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19174 2021-05-16T21:29:17Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še nekaterih drugih regulatorjev kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in de novo metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki se vežejo in privabijo endogene regulatorje kromatina.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti DNMT1 in HP1 za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Nato so naredili fuzijo dveh nanoteles s fleksibilnim linkerjem, da bi videli učinek na utišanje gena in izboljšanje epigenetskega spomina. Fuzija rTetR-antiDNMT1-antiHP1 je povzročila utišanje pri 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo vsako posamezno nanotelo. Ugotovili so, da je fuzija antiDNMT1-antiHP1 izboljšala epigenetski spomin v primerjavi z močnim represorjem KRAB. Ti rezultati kažejo, da lahko izražanje fuzije nanoteles povzroči utišanje reporterjev in izboljša epigenetski spomin.<br /> <br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost odstotka utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> ==Viri==<br /> # M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> # O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> # N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19170 2021-05-16T21:21:58Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še nekaterih drugih regulatorjev kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in de novo metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki se vežejo in privabijo endogene regulatorje kromatina.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov===<br /> Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTrtR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve rTetR fuzije z nanotelesom na reporter. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija tTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5. <br /> <br /> ===Nanotelesa proti DNMT1 in HP1 za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina===<br /> Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.<br /> <br /> Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.<br /> <br /> Nato so naredili fuzijo dveh nanoteles s fleksibilnim linkerjem, da bi videli učinek na utišanje gena in izboljšanje epigenetskega spomina. Fuzija rTetR-antiDNMT1-antiHP1 je povzročila utišanje pri 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo vsako posamezno nanotelo. Ugotovili so, da je fuzija antiDNMT1-antiHP1 izboljšala epigenetski spomin v primerjavi z močnim represorjem KRAB. Ti rezultati kažejo, da lahko izražanje fuzije nanoteles povzroči utišanje reporterjev in izboljša epigenetski spomin.<br /> <br /> ===Vpliv nanotelesa antiDNMT1 na povečanje hitrosti utišanja gena in izboljšanja epigenetskega spomina ostalih regulatorjev kromatina===<br /> Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo s proteinom KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina. <br /> <br /> ===S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina===<br /> Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanje signala. Želeni signal se lahko poveže z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost odstotka utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.<br /> [2] O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.<br /> [3] N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19156 2021-05-16T21:00:27Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še nekaterih drugih regulatorjev kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, s proteinom KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in de novo metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].<br /> <br /> ==Nanotelesa in regulatorji kromatina==<br /> Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki se vežejo in privabijo endogene regulatorje kromatina.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uravnavanje_izra%C5%BEanja_genov_s_pomo%C4%8Djo_nanoteles_in_njihov_vpliv_na_epigenetski_spomin&diff=19153 2021-05-16T20:51:13Z

<p>Sara Laznik: New page: &#039;&#039;Povzeto po članku:&#039;&#039; &#039;&#039; M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P...</p> <hr /> <div>''Povzeto po članku:'' '' M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7822885/]''<br /> <br /> ==Uvod==<br /> Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija skuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V ta namen so v omenjenem članku pokazali, kako so s svojo tehnologijo prišli do perspektivnih zaključkov, ki bodo prikazani v nadaljevanju.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2020/21&diff=19118 2021-05-15T15:52:56Z

<p>Sara Laznik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) &lt;br&gt;<br /> # [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) &lt;br&gt;<br /> # [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) &lt;br&gt;<br /> #[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) &lt;br&gt;<br /> &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) &lt;br&gt;<br /> # [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) &lt;br&gt;<br /> # [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) &lt;br&gt;<br /> # [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) &lt;br&gt;<br /> # [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) &lt;br&gt;<br /> # [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) &lt;br&gt;<br /> # [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) &lt;br&gt;<br /> # [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) &lt;br&gt;<br /> &lt;br&gt;<br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BNT-seminar&diff=18588 2021-04-21T21:23:21Z

<p>Sara Laznik: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Bionanotehnologija 2021- seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Vpisna številka'''<br /> 30170005 &lt;br /&gt;<br /> 30019058 &lt;br /&gt;<br /> 30170022 &lt;br /&gt;<br /> 30200303 &lt;br /&gt;<br /> 30200310 &lt;br /&gt;<br /> 30200319 &lt;br /&gt;<br /> 30170222 &lt;br /&gt;<br /> 30019057 &lt;br /&gt;<br /> 30170131 &lt;br /&gt;<br /> 30170078 &lt;br /&gt;<br /> 30019040 &lt;br /&gt;<br /> 30170177 &lt;br /&gt;<br /> 30200324 &lt;br /&gt;<br /> 30200315 &lt;br /&gt;<br /> 30019063 &lt;br /&gt;<br /> 30200312 &lt;br /&gt;<br /> 30170002 &lt;br /&gt;<br /> 30170103 &lt;br /&gt;<br /> 30019056 &lt;br /&gt;<br /> 30200309 &lt;br /&gt;<br /> 30200322 &lt;br /&gt;<br /> 30200311 &lt;br /&gt;<br /> 30200306 &lt;br /&gt;<br /> 30170243 &lt;br /&gt;<br /> 30019051 &lt;br /&gt;<br /> 30170141 &lt;br /&gt;<br /> 30170061 &lt;br /&gt;<br /> 30019035 &lt;br /&gt;<br /> 30200316 &lt;br /&gt;<br /> 30200317 &lt;br /&gt;<br /> 30170193 &lt;br /&gt;<br /> 30200307 &lt;br /&gt;<br /> 30200321 &lt;br /&gt;<br /> 30200314 &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum predstavitve'''<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 30.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 30.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2020 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2020 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent1'''<br /> Anamarija Agnič &lt;br /&gt;<br /> Aljaž Bratina &lt;br /&gt;<br /> Matija Ruparčič &lt;br /&gt;<br /> Urban Hribar &lt;br /&gt;<br /> Irma Zeljković &lt;br /&gt;<br /> Martin Špendl &lt;br /&gt;<br /> Urška Pečarič Strnad &lt;br /&gt;<br /> Barbara Slapnik &lt;br /&gt;<br /> Tina Kolenc Milavec &lt;br /&gt;<br /> Klementina Polanec &lt;br /&gt;<br /> Ajda Godec &lt;br /&gt;<br /> Martin Špendl &lt;br /&gt;<br /> Tjaša Mlakar &lt;br /&gt;<br /> Urša Lovše &lt;br /&gt;<br /> Sara Laznik &lt;br /&gt;<br /> Neža Pvko &lt;br /&gt;<br /> Doroteja Armič &lt;br /&gt;<br /> Martina Lokar &lt;br /&gt;<br /> Špela Supej &lt;br /&gt;<br /> Saša Slabe &lt;br /&gt;<br /> Eva Keber &lt;br /&gt;<br /> Urška Fajdiga &lt;br /&gt;<br /> Ernestina Lavrih &lt;br /&gt;<br /> Nika Mikulič Vernik &lt;br /&gt;<br /> Liza Ulčakar &lt;br /&gt;<br /> Urša Štrancar &lt;br /&gt;<br /> Tadej Medved &lt;br /&gt;<br /> Urška Zagorc &lt;br /&gt;<br /> Nina Lukančič &lt;br /&gt;<br /> Anže Karlek &lt;br /&gt;<br /> Luka Gnidovec &lt;br /&gt;<br /> Almina Tahirović &lt;br /&gt;<br /> Mirsad Mešić &lt;br /&gt;<br /> Paula Horvat &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent2'''<br /> Urška Pečarič Strnad &lt;br /&gt;<br /> Urška Zagorc &lt;br /&gt;<br /> Ernestina Lavrih &lt;br /&gt;<br /> Liza Ulčakar &lt;br /&gt;<br /> Paula Horvat &lt;br /&gt;<br /> Almina Tahirović &lt;br /&gt;<br /> Anže Karlek &lt;br /&gt;<br /> Sara Laznik &lt;br /&gt;<br /> Luka Gnidovec &lt;br /&gt;<br /> Irma Zeljković &lt;br /&gt;<br /> Eva Keber &lt;br /&gt;<br /> Jernej Imperl &lt;br /&gt;<br /> Barbara Slapnik &lt;br /&gt;<br /> Mirsad Mešić &lt;br /&gt;<br /> Urša Lovše &lt;br /&gt;<br /> Anamarija Agnič &lt;br /&gt;<br /> Neža Pavko &lt;br /&gt;<br /> Mateja Žvipelj &lt;br /&gt;<br /> Saša Slabe &lt;br /&gt;<br /> Nika Mikulič Vernik &lt;br /&gt;<br /> Martina Lokar &lt;br /&gt;<br /> Klementina Polanec &lt;br /&gt;<br /> Tjaša Mlakar &lt;br /&gt;<br /> Ajda Godec &lt;br /&gt;<br /> Jernej Imperl &lt;br /&gt;<br /> Špela Supej &lt;br /&gt;<br /> Aljaž Bratina &lt;br /&gt;<br /> Nina Lukančič &lt;br /&gt;<br /> Matija Ruparčič &lt;br /&gt;<br /> Sabina S. Oblak &lt;br /&gt;<br /> Urban Hribar &lt;br /&gt;<br /> Tina Kolenc Milavec &lt;br /&gt;<br /> Tadej Medved &lt;br /&gt;<br /> Doroteja Armič &lt;br /&gt;<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.<br /> <br /> Predlagana struktura teksta:<br /> * Uvod<br /> * Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji<br /> * Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze<br /> * Literatura<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura). <br /> * Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:<br /> * 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc<br /> * 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BNT-seminar&diff=17998 2021-03-17T12:02:53Z

<p>Sara Laznik: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Bionanotehnologija 2021- seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Vpisna številka'''<br /> 30170005 &lt;br /&gt;<br /> 30019058 &lt;br /&gt;<br /> 30170022 &lt;br /&gt;<br /> 30200303 &lt;br /&gt;<br /> 30200310 &lt;br /&gt;<br /> 30170222 &lt;br /&gt;<br /> 30019057 &lt;br /&gt;<br /> 30170131 &lt;br /&gt;<br /> 30170078 &lt;br /&gt;<br /> 30019040 &lt;br /&gt;<br /> 30170177 &lt;br /&gt;<br /> 30200324 &lt;br /&gt;<br /> 30200315 &lt;br /&gt;<br /> 30019063 &lt;br /&gt;<br /> 30200312 &lt;br /&gt;<br /> 30019363 &lt;br /&gt;<br /> 30170002 &lt;br /&gt;<br /> 30170103 &lt;br /&gt;<br /> 30019056 &lt;br /&gt;<br /> 30200319 &lt;br /&gt;<br /> 30200309 &lt;br /&gt;<br /> 30200322 &lt;br /&gt;<br /> 30200320 &lt;br /&gt;<br /> 30200311 &lt;br /&gt;<br /> 30200306 &lt;br /&gt;<br /> 30170243 &lt;br /&gt;<br /> 30019051 &lt;br /&gt;<br /> 30170141 &lt;br /&gt;<br /> 30170061 &lt;br /&gt;<br /> 30019035 &lt;br /&gt;<br /> 30200316 &lt;br /&gt;<br /> 30200317 &lt;br /&gt;<br /> 30170193 &lt;br /&gt;<br /> 30200307 &lt;br /&gt;<br /> 30200321 &lt;br /&gt;<br /> 30200314 &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum predstavitve'''<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 30.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 30.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2020 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2020 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent1'''<br /> Anamarija Agnič &lt;br /&gt;<br /> Aljaž Bratina &lt;br /&gt;<br /> Matija Ruparčič &lt;br /&gt;<br /> Urban Hribar &lt;br /&gt;<br /> Irma Zeljković &lt;br /&gt;<br /> Urška Pečarič Strnad &lt;br /&gt;<br /> Barbara Slapnik &lt;br /&gt;<br /> Tina Kolenc Milavec &lt;br /&gt;<br /> Klementina Polanec &lt;br /&gt;<br /> Ajda Godec &lt;br /&gt;<br /> Martin Špendl &lt;br /&gt;<br /> Tjaša Mlakar &lt;br /&gt;<br /> Urša Lovše &lt;br /&gt;<br /> Sara Laznik &lt;br /&gt;<br /> Neža Pvko &lt;br /&gt;<br /> Sabina S. Oblak &lt;br /&gt;<br /> Doroteja Armič &lt;br /&gt;<br /> Martina Lokar &lt;br /&gt;<br /> Špela Supej &lt;br /&gt;<br /> Martin Špendl &lt;br /&gt;<br /> Saša Slabe &lt;br /&gt;<br /> Eva Keber &lt;br /&gt;<br /> Mateja Žvipelj &lt;br /&gt;<br /> Urška Fajdiga &lt;br /&gt;<br /> Ernestina Lavrih &lt;br /&gt;<br /> Nika Mikulič Vernik &lt;br /&gt;<br /> Liza Ulčakar &lt;br /&gt;<br /> Urša Štrancar &lt;br /&gt;<br /> Tadej Medved &lt;br /&gt;<br /> Urška Zagorc &lt;br /&gt;<br /> Nina Lukančič &lt;br /&gt;<br /> Anže Karlek &lt;br /&gt;<br /> Luka Gnidovec &lt;br /&gt;<br /> Almina Tahirović &lt;br /&gt;<br /> Mirsad Mešić &lt;br /&gt;<br /> Paula Horvat &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent2'''<br /> Urška Pečarič Strnad &lt;br /&gt;<br /> Urška Zagorc &lt;br /&gt;<br /> Ernestina Lavrih &lt;br /&gt;<br /> Liza Ulčakar &lt;br /&gt;<br /> Paula Horvat &lt;br /&gt;<br /> Anže Karlek &lt;br /&gt;<br /> Sara Laznik &lt;br /&gt;<br /> Luka Gnidovec &lt;br /&gt;<br /> Irma Zeljković &lt;br /&gt;<br /> Eva Keber &lt;br /&gt;<br /> Jernej Imperl &lt;br /&gt;<br /> Barbara Slapnik &lt;br /&gt;<br /> Mirsad Mešić &lt;br /&gt;<br /> Urša Lovše &lt;br /&gt;<br /> Anamarija Agnič &lt;br /&gt;<br /> Urša Štrancar &lt;br /&gt;<br /> Neža Pavko &lt;br /&gt;<br /> Mateja Žvipelj &lt;br /&gt;<br /> Saša Slabe &lt;br /&gt;<br /> Almina Tahirović &lt;br /&gt;<br /> Nika Mikulič Vernik &lt;br /&gt;<br /> Martina Lokar &lt;br /&gt;<br /> Urška Fajdiga &lt;br /&gt;<br /> Klementina Polanec &lt;br /&gt;<br /> Tjaša Mlakar &lt;br /&gt;<br /> Ajda Godec &lt;br /&gt;<br /> Jernej Imperl &lt;br /&gt;<br /> Špela Supej &lt;br /&gt;<br /> Aljaž Bratina &lt;br /&gt;<br /> Nina Lukančič &lt;br /&gt;<br /> Matija Ruparčič &lt;br /&gt;<br /> Sabina S. Oblak &lt;br /&gt;<br /> Urban Hribar &lt;br /&gt;<br /> Tina Kolenc Milavec &lt;br /&gt;<br /> Tadej Medved &lt;br /&gt;<br /> Doroteja Armič &lt;br /&gt;<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.<br /> <br /> Predlagana struktura teksta:<br /> * Uvod<br /> * Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji<br /> * Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze<br /> * Literatura<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura). <br /> * Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:<br /> * 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc<br /> * 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Sara Laznik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BNT-seminar&diff=17893 2021-03-09T11:54:49Z

<p>Sara Laznik: /* Bionanotehnologija 2021- seminar */</p> <hr /> <div>= Bionanotehnologija 2021- seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Vpisna številka'''<br /> 30170005 &lt;br /&gt;<br /> 30019058 &lt;br /&gt;<br /> 30200303 &lt;br /&gt;<br /> 30019363 &lt;br /&gt;<br /> 30019057 &lt;br /&gt;<br /> 30170131 &lt;br /&gt;<br /> 30170078 &lt;br /&gt;<br /> 30170177 &lt;br /&gt;<br /> 30200324 &lt;br /&gt;<br /> 30019063 &lt;br /&gt;<br /> 30170103 &lt;br /&gt;<br /> 30170002 &lt;br /&gt;<br /> 30200319 &lt;br /&gt;<br /> 30200309 &lt;br /&gt;<br /> 30200320 &lt;br /&gt;<br /> 30019056 &lt;br /&gt;<br /> 30200311 &lt;br /&gt;<br /> 30200306 &lt;br /&gt;<br /> 30170243 &lt;br /&gt;<br /> 30019051 &lt;br /&gt;<br /> 30170141 &lt;br /&gt;<br /> 30170061 &lt;br /&gt;<br /> 30019035 &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum predstavitve'''<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 30.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2020 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent1'''<br /> Anamarija Agnič &lt;br /&gt;<br /> Aljaž Bratina &lt;br /&gt;<br /> Urban Hribar &lt;br /&gt;<br /> Sabina Sladič Oblak &lt;br /&gt;<br /> Barbara Slapnik &lt;br /&gt;<br /> Tina Kolenc Milavec &lt;br /&gt;<br /> Klementina Polanec &lt;br /&gt;<br /> Martin Špendl &lt;br /&gt;<br /> Tjaša Mlakar &lt;br /&gt;<br /> Sara Laznik &lt;br /&gt;<br /> Martina Lokar &lt;br /&gt;<br /> Doroteja Armič &lt;br /&gt;<br /> Martin Špendl &lt;br /&gt;<br /> Saša Slabe &lt;br /&gt;<br /> Mateja Žvipelj &lt;br /&gt;<br /> Špela Supej &lt;br /&gt;<br /> Urška Fajdiga &lt;br /&gt;<br /> Ernestina Lavrih &lt;br /&gt;<br /> Nika Mikulič Vernik &lt;br /&gt;<br /> Liza Ulčakar &lt;br /&gt;<br /> Urša Štrancar &lt;br /&gt;<br /> Tadej Medved &lt;br /&gt;<br /> Urška Zagorc &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent2'''<br /> Urška Pečarič Strnad &lt;br /&gt;<br /> Urška Zagorc &lt;br /&gt;<br /> Liza Ulčakar &lt;br /&gt;<br /> Urša Štrancar &lt;br /&gt;<br /> Sara Laznik &lt;br /&gt;<br /> Luka Gnidovec &lt;br /&gt;<br /> Irma Zeljković &lt;br /&gt;<br /> Jernej Imperl &lt;br /&gt;<br /> Barbara Slapnik &lt;br /&gt;<br /> Urša Lovše &lt;br /&gt;<br /> Mateja Žvipelj &lt;br /&gt;<br /> Neža Pavko &lt;br /&gt;<br /> Almina Tahirović &lt;br /&gt;<br /> Nika Mikulič Vernik &lt;br /&gt;<br /> Urška Fajdiga &lt;br /&gt;<br /> Saša Slabe &lt;br /&gt;<br /> Klementina Polanec &lt;br /&gt;<br /> Tjaša Mlakar &lt;br /&gt;<br /> Ajda Godec &lt;br /&gt;<br /> Jernej Imperl &lt;br /&gt;<br /> Špela Supej &lt;br /&gt;<br /> Aljaž Bratina &lt;br /&gt;<br /> Nina Lukančič &lt;br /&gt;<br /> |-<br /> <br /> ==Naloga==<br /> Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.<br /> <br /> Predlagana struktura teksta:<br /> * Uvod<br /> * Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji<br /> * Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze<br /> * Literatura<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura). <br /> * Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:<br /> * 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc<br /> * 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Sara Laznik