Wiki FKKT - User contributions [en]

Reprogramiranje s transpozicijo

2013-06-04T18:20:03Z

SaraLorbek: /* Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev */

==Uvod==
Transpozoni so mobilni genetski elementi, glede na mehanizem transpozicije jih delimo v dve večji skupini:
*'''Retrotranspozoni''': mobilnost dosežejo s prepisom v RNA, ki omogoči integracijo prepisane DNA na drugo mesto v genomu.
*'''DNA transpozoni''': uporabljajo mehanizem »izreži – prilepi«, pri katerem ne pride do prepisa v RNA, zato je tudi zgradba tovrstnega transpozona drugačna od zgradbe retrotranspozona: zapis za protein transpozazo je na obeh koncih obdan z inverznima ponovitvama, ki služita kot vezavni mesti za transpozazo. Slednja izreže element in ga prenese na novo mesto v DNA. Ta proces lahko nadzorujemo z ločitvijo zapisa za transpozazo- namesto katerega lahko vključimo kako drugo (željeno) zaporedje DNA, ki se bo v procesu preneslo- od končnih inverznih ponovitev (ITR- inverted terminal repeats), s čimer ustvarimo neavtonomni element. Ta se lahko prenese le, če zagotovimo dodatni vir proteina transpozaze. Tak dvokomponentni sistem se je med drugim izkazal kot zelo uporaben tudi za reprogramiranje somatskih celic.

==Transpozoni kot orodje za vstavljanje genov==
Osnovni kriteriji, ki jih moramo upoštevati pri izbiranju DNA transpozona in konstruiranju transgenov za manipulacijo celic in organizmov, so:
*'''ustrezna stopnja aktivnosti transpozona v izbrani vrsti''',
*'''izogib mobilizaciji transpozonov, ki so naravno prisotni v tarčnem genomu''',
*'''kapaciteta transpozona'''- transgeni konstrukti pogosto presežejo velikost večih kilobaznih parov, saj poleg željenih kodirajočih regij največkrat vključujejo tudi transkripcijske regulatorne elemente. Kapacitete različnih DNA transpozonov se med seboj močno razlikujejo, piggyBac in Tol2 skupini transpozonov sta se do zdaj izkazali za najbolj kapacitivni. To raziskovalcem omogoča vključitev kompleksnih transgenov med inverzni ponovitvi, pri čemer ne trpi učinkovitost transpozicije.
*'''Priljubljeno mesto integracije'''- večina transpozonov ima za tarčo neko specifično zaporedje DNA, dolgo nekaj baznih parov, za katerim se lahko »prilepi«. Tarča piggyBac transpozona so TTAA zaporedja, izraža tudi preferenco do integracije v bižino mest začetka transkripcije in v introne znotraj genov. DNA transpozoni iz družine Tc1/mariner se vključujejo za dinukleotidi TA; najbolj preučen pripadnik te družine je transpozon Sleeping Beauty, zanj je značilna integracija znotraj palindromskih AT ponovitev. Nekateri transpozoni nimajo priljubljenih integracijskih mest, temveč se navidez naključno vključujejo v gostiteljski genom; tak primer so Tol2 DNA transpozoni in dobro raziskani retrotranspozoni L1.
*'''»Lokalno hopsanje«'''-(lokalno skakanje)- izraz opisuje fenomen transpozicije na kromosomu; zanjo je značilno, da se veliko pogosteje pojavlja na cis-mestih v bližini donorskega lokusa: transpozon se izreže iz donorskega mesta na kromosomu in se prilepi nekam v bližino, najpogosteje pristane znotraj iste verige DNA glede na donorsko mesto. Lokalno hopsanje omeji dostopna mesta za transpozon, saj le-ta, razen izjemoma, ne more skočiti izven določene kromosomske regije, kar je uporabno pri povzročanju nasičenja z mutacijami znotraj omejenih kromosomskih regij in s tem ugotavljanja lokacij genov ter njihovih funkcij. Za oba, PiggyBac (PB) in Sleeping Beauty (SB), je značilno lokalno hopsanje, toda pri PB lahko opazimo bolj naključen integracijski vzorec kot pri SB; to je eden izmed primerov, ki dokazujejo specifičnost vzorca poskakovanja za posamezen tip transpozona. Ta vzorec je različen tudi pri različnih vrstah organizmov in je celo odvisen od donorskega lokusa transpozona na kromosomu. Pri retrotranspozonih ni opaziti težnje po lokalnem hopsanju, kar je najverjetneje povezano z njihovim »življenjskim ciklom«, ki se povsem razlikuje od cikla DNA transpozonov. Le-ti po izrezu ostanejo v jedru, RNA molekula pa, ki je nastala s prepisom retrotranspozona, mora najprej priti v citoplazmo, kjer se prevede v potrebne proteine, ki nato izvršijo transpozicijo, slednja je zato povsem neodvisna od donorskega mesta.

==Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev==
Klasične metode, ki se uporabljajo za prepričevanje celic v izražanje tujih genov (npr. mikroinjekcija DNA v notranjost manipulirane celice), se večinoma soočajo z dvema večjima ovirama, ki ju z uporabo transpozona uspešno premagamo: transpozonsko posredovana dostava genov poveča '''učinkovitost integracije''' DNA v kromosome in povzroči '''vključitev »osamljenih« kopij''' namesto konkatemerov (več združenih, v sosledju nanizanih zaporedij, ki jih dostavljamo v celico). Samostojne enote zaporedij so manj podvržene utišanju kot konkatemerni transgeni, ki se pogosto pojavijo ob uporabi klasičnih metod. Poleg tega se lahko pojavijo težave pri prenosu transgena iz klične celične linije(t.j. iz spolne celice) na naslednjo generacijo, kar pogosto povzroči '''transgeno mozaičnost organizmov''' (vse celice organizma, ki se razvije iz oocita s prehodno injeciranim transgenom, se ne izkažejo pozitivne na transgen- nekatere celice vsebujejo in izražajo vstavljeni gen, druge pa ne). Vzrok tovrstni mozaičnosti je integracija transgena relativno pozno v fazi embrionalnega razvoja, z uporabo transpozona v vlogi vektorja pa lahko integracijo transgena pospešimo: če hkrati s transpozonom, ki smo mu med inverzni 5' ter 3' ponovitvi vstavili željeni gen, injeciramo mRNA, ki kodira transpozazo, zagotovimo hitrejšo dostavo transpozaze in posledično hitrejšo transpozicijo na kromosome tarčnih celic. Eksperimenti potrjujejo, da se s tem poviša odstotek prenosa transgena iz zarodnih celic v naslednjo generacijo, mozaičnost zarodkov pa se znatno zmanjša.

Pogosto je pri eksperimentalnem delu pomembno tudi, da se v vsako celico vključi zadostno število transpozonov, ki nosijo zapis za gen, ki ga želimo izraziti. To število je zelo majhno, če uporabimo zgolj običajno metodo transfekcije, plazmidi se namreč izjemno na redko integrirajo. Če pa poleg donorskega plazmida (tega, ki nosi željene gene), dodamo še ustrezno količino plazmida, ki kodira transpozazo (pomožni plazmid), se število integracij v celični genom ustrezno zviša- % zvišanja je odvisen od količine obeh dodanih plazmidov. Ta sistem omogoča tudi zelo dober '''nadzor nad številom kopij vstavljenih genov'''.
Z eksperimenti so raziskovalci sicer potrdili, da je reprogramiranje učinkovito tudi z insercijo ene same kopije ustrezno sestavljene reprogramacijske kasete (vektorja z geni potrebnimi za reprogramiranje), hkrati pa s tovrstno insercijo '''minimiziramo spremembe na genomu iPS celice'''.

Večinoma so celice uspešno reprogramirali z uporabo virusnih vektorjev, ki so omogočili izraženje določenih, za pluripotentne celice značilnih faktorjev. Slabost te metode je veliko število integriranih virusnih vektorjev v induciranih pluripotentnih matičnih celicah. Za reprogramiranje je zelo zaželjena uporaba metode, ki hkrati '''omogoči tudi popolno eliminacijo eksogenih faktorjev''', ki bi se v nasprotnem primeru lahko nenadzorovano reaktivirali in povzročili displazijo, tvorbo tumorjev,... Z uporabo transpozonskega sistema za dostavo željenih genov piggyBac lahko po uspešno izvedenem reprogramiranju transgene ter sam PB zlahka odstranimo iz genoma.

Ena izmed zanesljivih metod za odstranitev reprogramacijskih faktorjev je uporaba Cre rekombinaze. Gen Cre s transfekcijo spravimo v iPS celice, sintetizirana rekombinaza pa nato izreže repogramacijsko kaseto, ki smo jo že na začetku sestavili tako, da vsebuje tudi mesto lox, na katerega Cre lahko deluje. Za izrez genov vstavljenih z uporabo PB transpozonskega sistema opisanega načina ne potrebujemo, kajti za popolno odstranitev ITR in transgenov zadostuje, da v celice prehodno dovedemo ustrezno količino plazmida z zapisom za transpozazo (ta naj bo pod nadzorom ustreznega promotorja). PB transpozon se je pri tem in podobnih eksperimentih izkazal kot popolnoma obvladljiv, saj ga lahko brez kakršnihkoli nastalih sprememb na originalnem celičnem genomu izrežemo z opisanim postopkom. PB transpozonski sistem za dostavo genov torej omogoča '''indukcijo genetsko nespremenjenih človeških iPS celic''', kar je izjemno izhodišče za napredek regenerativne medicine.

==Transpozicija in reprogramiranje v praksi==
Ekspresija štirih transkripcijskih faktorjev (c-Myc, Klf4, Oct4 in Sox2; MKOS) zadostuje za uspešno reprogramiranje somatskih celic v pluripotentne matične (iPS celice). Le-te so po lastnostih in potencialu za diferenciacijo v odrasle tipe celic podobne embrionalnim matičnim celicam (ES). Obetavna in učinkovita strategija reprogramiranja je uporaba PB transpozon/transpozaza sistema, ki je neodvisen od vrste gostitelja oz. tipa celic, zahteva zgolj konstrukcijo plazmida s transgeni, obdanimi z inverznimi terminalnimi zaporedji, in prehodno ekspresijo encima transpozaze, ki katalizira insercijo-pa tudi izrez- plazmidnega konstrukta. Woltjen in sod. so opisali uspešno reprogramiranje mišjih in človeških embrionalnih fibroblastov z uporabo doksiciklina, ki je omogočil indukcijo transkripcijskih faktorjev MKOS, v celice dovedenih s PB transpozonskim sistemom. Stabilne iPS so izražale karakteristične markerje pluripotentnosti in so se bile sposobne diferencirati v kompleksna funkcionalna tkiva. Dokazali so tudi, da je posamezne integracije PB možno brez morbidnih preostalih sledi odstraniti iz iPS celic.

===Iniciacija reprogramiranja===
Gene MKOS so vključili v PB-TET transpozonski plazmid (PB-TET-mFx, slika 1a), katerega transkripcija je bila pod nadzorom tetraciklina/doksiciklina; katerikoli izmed obeh antibiotikov je lahko z vplivanjem na promotor povzročil indukcijo transgenov MKOS, intenzivnost izražanja je bila s tem odvisna od koncentracije tet./doks., ki jo je v laboratoriju enostavno regulirati. Promotor in MKOS so bili povezani z βgeo (fuzija β-galaktozidaznega gena in gena za odpornost proti neomicinu) preko IRES sekvence, da so lahko zasledovali kako uspešno oz. tesno doksiciklin regulira izražanje transgenov in kasneje ugotavljali sposobnost celic za vzdrževanje pluripotentnosti kljub odtegnitvi eksogenih faktorjev. Mišje embrionalne fibroblaste, ki so vsebovali odzivni protein za doksiciklin, so podvrgli transfekciji s krožnim plazmidnim konstruktom PB-TET-mFx in pomožnim plazmidom z zapisom za PB transpozazo. Celice so gojili v mediju primernem za ES celične kulture, ki je vseboval doksiciklin in v kratkem so fibroblasti začeli tvoriti ES celičnim kolonijam podobne strukture.

===Vzpostavitev in potrditev pluripotentnosti===
Opisanemu je sledil nastanek celičnih linij, ki so imele sposobnost samoobnavljanja in so izražale ključne lastnosti reprogramiranih celic. Število kolonij reprogramiranih celic se je razlikovalo pri različnih koncentracijah doksiciklina- nad standardno koncentracijo (1,5μg/ml) je bilo kolonij znatno več, pod standardno pa drastično manj. Tak rezultat potrjuje, da '''stopnja izražanja štirih faktorjev določa učinkovitost reprogramacije'''. V ekstremnem primeru, ko raziskovalci v gojišče doksiciklina niso dodali, se nobena celica ni reprogramirala, kajti transgeni se niso mogli izraziti. V treh tednih gojenja je večina celic (89%) postala neodvisnih od prisotnosti doksiciklina; celice so bile sposobne avtonomno vzdrževati reprogramirano stanje.

Če je na opisan način doseženo reprogramirano stanje stabilno, bi se v nekaj tednih morali v celicah postopno pojaviti '''značilni markerji''' (sicer naravno prisotni v embrionalnih izvornih celicah); testi so potrdili prisotnost naslednjih (slika 1b): stabilne celice so aktivirale alkalno fosfatazo, SSEA1 je bil prisoten na njihovi površini, Nanog protein (transkripcijski faktor s poglavitno funkcijo vzdrževanja matičnosti celic) je bil prisoten v jedru; aktivni so bili tudi markerji pluripotentnosti Dax1, Eras, Fbxo, Foxd3, Rex1 in Zfp296; v večini celic so bili prisotni tudi proteinski produkti štirih dovedenih transgenov. Z uporabo RT-PCR in preko aktivnosti LacZ (vključen v βgeo reporterski gen na plazmidu) so določili stopnjo izražanja posameznih transgenov v prisotnosti in odsotnosti doksiciklina; po pričakovanju je bilo izražanje (obarvanje) veliko bolj intenzivno v prisotnosti antibiotika (slika 1d). Z metodo so detektirali povprečne aktivnosti transgenov MKOS v posameznih reprogramiranih celičnih populacijah, niso pa zaznali mozaičnih vzorcev izražanja (mozaicizma celic- npr. nekatere celice so izražale minimalno ali celo nič c-Myc, druge celice so ga izražale več).
Povprečno ugotovljeno število integracij PB transpozona (število kopij) je bilo 9 na celico.

===Odstranitev transgenov in celično samoohranjanje pluripotentnosti===
Da bi odstranili transgene iz genoma po uspešnem reprogramiranju, so raziskovalci v celice prehodno dodali večjo količino transpozaze. Pogostost izreza se je pri različnih klonih celic zelo razlikovala, kar nakazuje, da je uspešnost izreza transpozona odvisna od mesta njegove integracije. Z nekaj dodatnimi postopki je raziskovalcem uspelo izolirati 10 kolonij, v katerih ni bilo prisotne nikakršne sledi integracije transpozona. Kljub tovrstni odstranitvi prvotno vstavljenih transgenov, so celice avtonomno izražale gene potrebne za pluripotentnost.

===Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov===
Pluripotentnost s PB reprogramiranih celic je potrdila njihova '''sposobnost razvoja v himerne miške''', zatem ko so jih vbrizgali v blastociste (slika 3a). Dokazali so tudi '''prisotnost LacZ gena''' v vseh treh zarodnih plasteh himernih embrijev, kar je dokaz za pluripotentnost s transpozonom obdelanih fibroblastov (slika 3b). Zarodki pridobljeni izključno iz induciranih pluripotentnih matičnih celic so '''vsebovali tkiva vseh treh zarodnih plasti''', razvili so tudi '''spolne (germinalne) celice'''- njihov nastanek v embrijih je potrdila prisotnost Vasa proteina, ki se specifično izraža v liniji germinalnih celic, samo v ovariju in testisih (slika 3c). '''Tvorba teratomov'''- tumorjev, ki vsebujejo celice vseh treh zarodnih plasti- je dodaten dokaz inducirane pluripotentnosti celic; če namreč pluripotentne matične celice vbrizgamo v imunokompromitirane miške, se razvijejo v teratom, kar je dokaz pluripotentnosti s transpozicijo reprogramiranih fibroblastov.

Dejstvo, da so se bile iz iPS celic sposobne razviti žive himerne miške (slika 3d), potrjuje popolno reprogramiranje fibroblastov z uporabo PB-transpozonskega sistema, ki je sposoben zagotoviti razvoj specializiranih celic, ki tvorijo funkcionalna tkiva.

Povezava do slik: http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html

==Reprogramiranje človeških fibroblastov==
Transpozon PB-CAG-rtTA skupaj s PB-TET-mFx za regulacijo reprogramiranja z doksiciklinom so uspešno uporabili tudi za reprogramiranje človeških embrionalnih fibroblastov. Kolonije induciranih pluripotentnih celic so izbrali med 14 in 28 dnevi starosti. Štiri od petih, ki so dale pozitiven test na alkalno fosfatazo (markerski encim za pluripotentne celice), so po enem tednu postale neodvisne od doksiciklina, torej so ostale pluripotentne tudi po odstranitvi le-tega iz medija. Ekspresija genov za transkripcijske faktorje in markerskih genov za pluripotenco je dosegla tako visoke ravni kot v embrionalnih matičnih celicah. Po odstranitvi bFGF-ja (basic fibroblast growth factor) je v kolonijah prišlo do tvorbe cističnih embrioidnih telesc (skupkov pluripotentnih celic) in do spontane diferenciacije v endodermalne, ektodermalne in mezodermalne celice. Kot kaže, se torej mišje transkripcijske faktorje da uporabiti tudi za reprogramiranje človeških celic.

==Reprogramiranje sekundarnih fibroblastov==
Iz diploidnih himernih (himera – organizem, ki je sestavljen iz celic dveh ali več genetsko različnih osebkov, v tem primeru mišk) induciranih pluripotentnih celičnih linij so pridobili sekundarne fibroblaste in jih poskušali reprogramirati na enak način kot primarne. Od treh celičnih linij fibroblastov, katere so poskusili ponovno preobraziti v pluripotentne, se je ena slabo odzvala na poskus indukcije, drugi dve pa dobro.
Rezultati so pokazali hitro odzivanje le-teh na faktorje in doksiciklin v mediju, veliko hitrejše kot pri poskusih, ki so za indukcijo uporabili lentivirusne sisteme. Test na alkalno fosfatazo je bil pozitiven že drugi dan inkubacije, celice so se tudi intenzivneje delile in 29% posameznih celic je bilo sposobnih tvoriti kolonije.

==Zaključek==
Na splošno se je reprogramiranje s transpozoni izkazalo za uspešno, ima veliko prednosti in pomeni znaten napredek za transfekcijske tehnike vstavljanja genov, in potencialen način za pridobivanje IPC v prihodnosti. Kot prvo omogoča tehnično enostaven in bolj cenovno dostopen način reprogramiranja, saj potrebujemo le plazmidno DNA in komercialne pripomočke za transfekcijo. Ker ne piotrebujemo virusov, ki lahko napadejo samo določene tipe celic, se poveča tudi rang somatskih celic, ki jih lahko uporabimo za indukcijo. Vstavljanje genov s PB-transpozonom tudi omogoča produkcijo induciranih pluripotentnih celic, ki ne vsebujejo ksenobiotikov (substance, ki jih organizem sam ne proizvaja, a so v njem prisotne). In ko celice reprogramiramo lahko z aktivacijo transpozaze tudi odstranimo transpozon.
Poleg samega reprogramiranja celic, ki ima velik potencial v regenerativni medicini, je transpozicija uporabna za preučevanje funkcije genov, lahko bi bila uporabna tudi pri genski terapiji in preprečevanju rasti tumoerjev.

==PiggyBac transpozon==
Prvič so ga našli v mutiranih baculovirusih, ki so okužili celice TN-368 (izvirajo iz vešče vrste Trichoplusia ni). V nekaterih mutantih so opazili del gostiteljske DNA, za katero se je izkazalo, da gre za transpozon.
Ime izvira iz besede piggybacking, izraza, ki pomeni prenašanje čkoveka na hrbtu, s tem da skovanka vsebuje velik B in je brez k-ja, kar označuje povezanost z baculovirusi. Najprej je PB transpozon dobil nezveneče ime IFP2, kasneje pa ga je njegov odkritelj, Malcom J. Fraser, spremenil v piggyBac, da bi tako pritegnil več pozornosti.

==Prilagoditev PB za delo s sesalskimi celicami==
PiggyBac je do nedavnega veljal za uporabnega samo za delo z določenimi rodovi insektov, šele pred kratkim so ga prilagodili za tranpozicijo v sesalskih celicah, natančneje mišjih.
Pri rekonstrukciji PB za mišje celice je bilo potrebno prilagoditi več lastnosti transpozona: sam genetski zapis za transpozazo, terminalna zaporedja in poskrbeti za nadzor nad frekvenco transpozicije.
Najprej so optimizirali nukleotidno zaporedje za PB transpozazo, da je vsebovalo tiste kodone, ki jih pri translaciji preferira mišja celica. S tem so dosegli večjo ekspresijo transpozaze in tako tudi večjo pogostost transpozicije.
Frekvenco transpozicije so poskušali povečati tudi s spreminjanjem terminalnih zaporedij PB transpozona. Zanj je značilno 13 bp dolgo obrnjeno zapoedje na obeh straneh in še dodatna 19 bp dolga obrnjena zaporedja, ki pa so razporejena asimetrično. Eksperiment je pokazal, da je originalna oblika najprimernejša tudi za transpozicijo v mišjih celicah.
Potrebno pa je bilo še poskrbeti za nadzor nad transpozicijo. Zato so na PB transpozon vstavili še gen za ERT2 in tako naredili fuzijski protein PB transpozaze in ERT2. ERT2 je modificirana domena receptorja za estrogen, ki veže ligand in omogoča regulacijo aktivnosti proteina z molekulo 4-hidroksitamoksifen (4-OHT).

==Viri==
*Woltjen, K. in sod. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, vol. 458, str. 766-770.
*Kaji, K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature, 2009, vol. 458, str. 771-775.
*Ivics, Z. in sod. Transposon-mediated Genome Manipulations in Vertebrates. Nat Methods, 2009, štev. 6, str. 415-422.
*Cadiñanos, J.; Bradley, A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nuclei Acids Research, 2007, vol.35(12), e87
*piggyBac [online] [citirano 24.5.2013 ob 17:40] Dostopno na spletnem naslovu: http://piggybac.bio.nd.edu /

Reprogramiranje s transpozicijo

2013-06-02T21:10:49Z

SaraLorbek: /* Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev */

==Uvod==
Transpozoni so mobilni genetski elementi, glede na mehanizem transpozicije jih delimo v dve večji skupini:
*'''Retrotranspozoni''': mobilnost dosežejo s prepisom v RNA, ki omogoči integracijo prepisane DNA na drugo mesto v genomu.
*'''DNA transpozoni''': uporabljajo mehanizem »izreži – prilepi«, pri katerem ne pride do prepisa v RNA, zato je tudi zgradba tovrstnega transpozona drugačna od zgradbe retrotranspozona: zapis za protein transpozazo je na obeh koncih obdan z inverznima ponovitvama, ki služita kot vezavni mesti za transpozazo. Slednja izreže element in ga prenese na novo mesto v DNA. Ta proces lahko nadzorujemo z ločitvijo zapisa za transpozazo- namesto katerega lahko vključimo kako drugo (željeno) zaporedje DNA, ki se bo v procesu preneslo- od končnih inverznih ponovitev (ITR- inverted terminal repeats), s čimer ustvarimo neavtonomni element. Ta se lahko prenese le, če zagotovimo dodatni vir proteina transpozaze. Tak dvokomponentni sistem se je med drugim izkazal kot zelo uporaben tudi za reprogramiranje somatskih celic.

==Transpozoni kot orodje za vstavljanje genov==
Osnovni kriteriji, ki jih moramo upoštevati pri izbiranju DNA transpozona in konstruiranju transgenov za manipulacijo celic in organizmov, so:
*'''ustrezna stopnja aktivnosti transpozona v izbrani vrsti''',
*'''izogib mobilizaciji transpozonov, ki so naravno prisotni v tarčnem genomu''',
*'''kapaciteta transpozona'''- transgeni konstrukti pogosto presežejo velikost večih kilobaznih parov, saj poleg željenih kodirajočih regij največkrat vključujejo tudi transkripcijske regulatorne elemente. Kapacitete različnih DNA transpozonov se med seboj močno razlikujejo, piggyBac in Tol2 skupini transpozonov sta se do zdaj izkazali za najbolj kapacitivni. To raziskovalcem omogoča vključitev kompleksnih transgenov med inverzni ponovitvi, pri čemer ne trpi učinkovitost transpozicije.
*'''Priljubljeno mesto integracije'''- večina transpozonov ima za tarčo neko specifično zaporedje DNA, dolgo nekaj baznih parov, za katerim se lahko »prilepi«. Tarča piggyBac transpozona so TTAA zaporedja, izraža tudi preferenco do integracije v bižino mest začetka transkripcije in v introne znotraj genov. DNA transpozoni iz družine Tc1/mariner se vključujejo za dinukleotidi TA; najbolj preučen pripadnik te družine je transpozon Sleeping Beauty, zanj je značilna integracija znotraj palindromskih AT ponovitev. Nekateri transpozoni nimajo priljubljenih integracijskih mest, temveč se navidez naključno vključujejo v gostiteljski genom; tak primer so Tol2 DNA transpozoni in dobro raziskani retrotranspozoni L1.
*'''»Lokalno hopsanje«'''-(lokalno skakanje)- izraz opisuje fenomen transpozicije na kromosomu; zanjo je značilno, da se veliko pogosteje pojavlja na cis-mestih v bližini donorskega lokusa: transpozon se izreže iz donorskega mesta na kromosomu in se prilepi nekam v bližino, najpogosteje pristane znotraj iste verige DNA glede na donorsko mesto. Lokalno hopsanje omeji dostopna mesta za transpozon, saj le-ta, razen izjemoma, ne more skočiti izven določene kromosomske regije, kar je uporabno pri povzročanju nasičenja z mutacijami znotraj omejenih kromosomskih regij in s tem ugotavljanja lokacij genov ter njihovih funkcij. Za oba, PiggyBac (PB) in Sleeping Beauty (SB), je značilno lokalno hopsanje, toda pri PB lahko opazimo bolj naključen integracijski vzorec kot pri SB; to je eden izmed primerov, ki dokazujejo specifičnost vzorca poskakovanja za posamezen tip transpozona. Ta vzorec je različen tudi pri različnih vrstah organizmov in je celo odvisen od donorskega lokusa transpozona na kromosomu. Pri retrotranspozonih ni opaziti težnje po lokalnem hopsanju, kar je najverjetneje povezano z njihovim »življenjskim ciklom«, ki se povsem razlikuje od cikla DNA transpozonov. Le-ti po izrezu ostanejo v jedru, RNA molekula pa, ki je nastala s prepisom retrotranspozona, mora najprej priti v citoplazmo, kjer se prevede v potrebne proteine, ki nato izvršijo transpozicijo, slednja je zato povsem neodvisna od donorskega mesta.

==Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev==
Klasične metode, ki se uporabljajo za prepričevanje celic v izražanje tujih genov (npr. mikroinjekcija DNA v notranjost manipulirane celice), se večinoma soočajo z dvema večjima ovirama, ki ju z uporabo transpozona uspešno premagamo: transpozonsko posredovana dostava genov poveča '''učinkovitost integracije''' DNA v kromosome in povzroči '''vključitev »osamljenih« kopij''' namesto konkatemerov (več združenih, v sosledju nanizanih zaporedij, ki jih dostavljamo v celico). Samostojne enote zaporedij so manj podvržene utišanju kot konkatemerni transgeni, ki se pogosto pojavijo ob uporabi klasičnih metod. Poleg tega se lahko pojavijo težave pri prenosu transgena iz klične celične linije(t.j. iz spolne celice) na naslednjo generacijo, kar pogosto povzroči '''transgeno mozaičnost organizmov''' (vse celice organizma, ki se razvije iz oocita s prehodno injeciranim transgenom, se ne izkažejo pozitivne na transgen- nekatere celice vsebujejo in izražajo vstavljeni gen, druge pa ne). Vzrok tovrstni mozaičnosti je integracija transgena relativno pozno v fazi embrionalnega razvoja, z uporabo transpozona v vlogi vektorja pa lahko integracijo transgena pospešimo: če hkrati s transpozonom, ki smo mu med inverzni 5' ter 3' ponovitvi vstavili željeni gen, injeciramo mRNA, ki kodira transpozazo, zagotovimo hitrejšo dostavo transpozaze in posledično hitrejšo transpozicijo na kromosome tarčnih celic. Eksperimenti potrjujejo, da se s tem poviša odstotek prenosa transgena iz zarodnih celic v naslednjo generacijo, mozaičnost zarodkov pa se znatno zmanjša.

Pogosto je pri eksperimentalnem delu pomembno je tudi, da se v vsako celico vključi zadostno število transpozonov, ki nosijo zapis za gen, ki ga želimo izraziti. To število je zelo majhno, če uporabimo zgolj običajno metodo transfekcije, plazmidi se namreč izjemno na redko integrirajo. Če pa poleg donorskega plazmida (tega, ki nosi željene gene), dodamo še ustrezno količino plazmida, ki kodira transpozazo (pomožni plazmid), se število integracij v celični genom ustrezno zviša- % zvišanja je odvisen od količine obeh dodanih plazmidov. Ta sistem omogoča tudi zelo dober '''nadzor nad številom kopij vstavljenih genov'''.
Z eksperimenti so raziskovalci sicer potrdili, da je reprogramiranje učinkovito tudi z insercijo ene same kopije ustrezno sestavljene reprogramacijske kasete (vektorja z geni potrebnimi za reprogramiranje), hkrati pa s tovrstno insercijo '''minimiziramo spremembe na genomu iPS celice'''.

Večinoma so celice uspešno reprogramirali z uporabo virusnih vektorjev, ki so omogočili izraženje določenih, za pluripotentne celice značilnih faktorjev. Slabost te metode je veliko število integriranih virusnih vektorjev v induciranih pluripotentnih matičnih celicah. Za reprogramiranje je zelo zaželjena uporaba metode, ki hkrati '''omogoči tudi popolno eliminacijo eksogenih faktorjev''', ki bi se v nasprotnem primeru lahko nenadzorovano reaktivirali in povzročili displazijo, tvorbo tumorjev,... Z uporabo transpozonskega sistema za dostavo željenih genov piggyBac lahko po uspešno izvedenem reprogramiranju transgene ter sam PB zlahka odstranimo iz genoma.

Ena izmed zanesljivih metod za odstranitev reprogramacijskih faktorjev je uporaba Cre rekombinaze. Gen Cre s transfekcijo spravimo v iPS celice, sintetizirana rekombinaza pa nato izreže repogramacijsko kaseto, ki smo jo že na začetku sestavili tako, da vsebuje tudi mesto lox, na katerega Cre lahko deluje. Za izrez genov vstavljenih z uporabo PB transpozonskega sistema opisanega načina ne potrebujemo, kajti za popolno odstranitev ITR in transgenov zadostuje, da v celice prehodno dovedemo ustrezno količino plazmida z zapisom za transpozazo (ta naj bo pod nadzorom ustreznega promotorja). PB transpozon se je pri tem in podobnih eksperimentih izkazal kot popolnoma obvladljiv, saj ga lahko brez kakršnihkoli nastalih sprememb na originalnem celičnem genomu izrežemo z opisanim postopkom. PB transpozonski sistem za dostavo genov torej omogoča '''indukcijo genetsko nespremenjenih človeških iPS celic''', kar je izjemno izhodišče za napredek regenerativne medicine.

==Transpozicija in reprogramiranje v praksi==
Ekspresija štirih transkripcijskih faktorjev (c-Myc, Klf4, Oct4 in Sox2; MKOS) zadostuje za uspešno reprogramiranje somatskih celic v pluripotentne matične (iPS celice). Le-te so po lastnostih in potencialu za diferenciacijo v odrasle tipe celic podobne embrionalnim matičnim celicam (ES). Obetavna in učinkovita strategija reprogramiranja je uporaba PB transpozon/transpozaza sistema, ki je neodvisen od vrste gostitelja oz. tipa celic, zahteva zgolj konstrukcijo plazmida s transgeni, obdanimi z inverznimi terminalnimi zaporedji, in prehodno ekspresijo encima transpozaze, ki katalizira insercijo-pa tudi izrez- plazmidnega konstrukta. Woltjen in sod. so opisali uspešno reprogramiranje mišjih in človeških embrionalnih fibroblastov z uporabo doksiciklina, ki je omogočil indukcijo transkripcijskih faktorjev MKOS, v celice dovedenih s PB transpozonskim sistemom. Stabilne iPS so izražale karakteristične markerje pluripotentnosti in so se bile sposobne diferencirati v kompleksna funkcionalna tkiva. Dokazali so tudi, da je posamezne integracije PB možno brez morbidnih preostalih sledi odstraniti iz iPS celic.

===Iniciacija reprogramiranja===
Gene MKOS so vključili v PB-TET transpozonski plazmid (PB-TET-mFx, slika 1a), katerega transkripcija je bila pod nadzorom tetraciklina/doksiciklina; katerikoli izmed obeh antibiotikov je lahko z vplivanjem na promotor povzročil indukcijo transgenov MKOS, intenzivnost izražanja je bila s tem odvisna od koncentracije tet./doks., ki jo je v laboratoriju enostavno regulirati. Promotor in MKOS so bili povezani z βgeo (fuzija β-galaktozidaznega gena in gena za odpornost proti neomicinu) preko IRES sekvence, da so lahko zasledovali kako uspešno oz. tesno doksiciklin regulira izražanje transgenov in kasneje ugotavljali sposobnost celic za vzdrževanje pluripotentnosti kljub odtegnitvi eksogenih faktorjev. Mišje embrionalne fibroblaste, ki so vsebovali odzivni protein za doksiciklin, so podvrgli transfekciji s krožnim plazmidnim konstruktom PB-TET-mFx in pomožnim plazmidom z zapisom za PB transpozazo. Celice so gojili v mediju primernem za ES celične kulture, ki je vseboval doksiciklin in v kratkem so fibroblasti začeli tvoriti ES celičnim kolonijam podobne strukture.

===Vzpostavitev in potrditev pluripotentnosti===
Opisanemu je sledil nastanek celičnih linij, ki so imele sposobnost samoobnavljanja in so izražale ključne lastnosti reprogramiranih celic. Število kolonij reprogramiranih celic se je razlikovalo pri različnih koncentracijah doksiciklina- nad standardno koncentracijo (1,5μg/ml) je bilo kolonij znatno več, pod standardno pa drastično manj. Tak rezultat potrjuje, da '''stopnja izražanja štirih faktorjev določa učinkovitost reprogramacije'''. V ekstremnem primeru, ko raziskovalci v gojišče doksiciklina niso dodali, se nobena celica ni reprogramirala, kajti transgeni se niso mogli izraziti. V treh tednih gojenja je večina celic (89%) postala neodvisnih od prisotnosti doksiciklina; celice so bile sposobne avtonomno vzdrževati reprogramirano stanje.

Če je na opisan način doseženo reprogramirano stanje stabilno, bi se v nekaj tednih morali v celicah postopno pojaviti '''značilni markerji''' (sicer naravno prisotni v embrionalnih izvornih celicah); testi so potrdili prisotnost naslednjih (slika 1b): stabilne celice so aktivirale alkalno fosfatazo, SSEA1 je bil prisoten na njihovi površini, Nanog protein (transkripcijski faktor s poglavitno funkcijo vzdrževanja matičnosti celic) je bil prisoten v jedru; aktivni so bili tudi markerji pluripotentnosti Dax1, Eras, Fbxo, Foxd3, Rex1 in Zfp296; v večini celic so bili prisotni tudi proteinski produkti štirih dovedenih transgenov. Z uporabo RT-PCR in preko aktivnosti LacZ (vključen v βgeo reporterski gen na plazmidu) so določili stopnjo izražanja posameznih transgenov v prisotnosti in odsotnosti doksiciklina; po pričakovanju je bilo izražanje (obarvanje) veliko bolj intenzivno v prisotnosti antibiotika (slika 1d). Z metodo so detektirali povprečne aktivnosti transgenov MKOS v posameznih reprogramiranih celičnih populacijah, niso pa zaznali mozaičnih vzorcev izražanja (mozaicizma celic- npr. nekatere celice so izražale minimalno ali celo nič c-Myc, druge celice so ga izražale več).
Povprečno ugotovljeno število integracij PB transpozona (število kopij) je bilo 9 na celico.

===Odstranitev transgenov in celično samoohranjanje pluripotentnosti===
Da bi odstranili transgene iz genoma po uspešnem reprogramiranju, so raziskovalci v celice prehodno dodali večjo količino transpozaze. Pogostost izreza se je pri različnih klonih celic zelo razlikovala, kar nakazuje, da je uspešnost izreza transpozona odvisna od mesta njegove integracije. Z nekaj dodatnimi postopki je raziskovalcem uspelo izolirati 10 kolonij, v katerih ni bilo prisotne nikakršne sledi integracije transpozona. Kljub tovrstni odstranitvi prvotno vstavljenih transgenov, so celice avtonomno izražale gene potrebne za pluripotentnost.

===Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov===
Pluripotentnost s PB reprogramiranih celic je potrdila njihova '''sposobnost razvoja v himerne miške''', zatem ko so jih vbrizgali v blastociste (slika 3a). Dokazali so tudi '''prisotnost LacZ gena''' v vseh treh zarodnih plasteh himernih embrijev, kar je dokaz za pluripotentnost s transpozonom obdelanih fibroblastov (slika 3b). Zarodki pridobljeni izključno iz induciranih pluripotentnih matičnih celic so '''vsebovali tkiva vseh treh zarodnih plasti''', razvili so tudi '''spolne (germinalne) celice'''- njihov nastanek v embrijih je potrdila prisotnost Vasa proteina, ki se specifično izraža v liniji germinalnih celic, samo v ovariju in testisih (slika 3c). '''Tvorba teratomov'''- tumorjev, ki vsebujejo celice vseh treh zarodnih plasti- je dodaten dokaz inducirane pluripotentnosti celic; če namreč pluripotentne matične celice vbrizgamo v imunokompromitirane miške, se razvijejo v teratom, kar je dokaz pluripotentnosti s transpozicijo reprogramiranih fibroblastov.

Dejstvo, da so se bile iz iPS celic sposobne razviti žive himerne miške (slika 3d), potrjuje popolno reprogramiranje fibroblastov z uporabo PB-transpozonskega sistema, ki je sposoben zagotoviti razvoj specializiranih celic, ki tvorijo funkcionalna tkiva.

Povezava do slik: http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html

==Reprogramiranje človeških fibroblastov==
Transpozon PB-CAG-rtTA skupaj s PB-TET-mFx za regulacijo reprogramiranja z doksiciklinom so uspešno uporabili tudi za reprogramiranje človeških embrionalnih fibroblastov. Kolonije induciranih pluripotentnih celic so izbrali med 14 in 28 dnevi starosti. Štiri od petih, ki so dale pozitiven test na alkalno fosfatazo (markerski encim za pluripotentne celice), so po enem tednu postale neodvisne od doksiciklina, torej so ostale pluripotentne tudi po odstranitvi le-tega iz medija. Ekspresija genov za transkripcijske faktorje in markerskih genov za pluripotenco je dosegla tako visoke ravni kot v embrionalnih matičnih celicah. Po odstranitvi bFGF-ja (basic fibroblast growth factor) je v kolonijah prišlo do tvorbe cističnih embrioidnih telesc (skupkov pluripotentnih celic) in do spontane diferenciacije v endodermalne, ektodermalne in mezodermalne celice. Kot kaže, se torej mišje transkripcijske faktorje da uporabiti tudi za reprogramiranje človeških celic.

==Reprogramiranje sekundarnih fibroblastov==
Iz diploidnih himernih (himera – organizem, ki je sestavljen iz celic dveh ali več genetsko različnih osebkov, v tem primeru mišk) induciranih pluripotentnih celičnih linij so pridobili sekundarne fibroblaste in jih poskušali reprogramirati na enak način kot primarne. Rezultati so pokazali hitrejše odzivanje le-teh na faktorje in doksiciklin v mediju, npr. test na alkalno fosfatazo je bil pozitiven že drugi dan inkubacije. Tako hiter odziv morda kaže na določeno mero nestabilnosti tovrstnega načina reprogramiranja.

==Zaključek==
Na splošno se je reprogramiranje s transpozoni izkazalo za uspešno, ima veliko prednosti in pomeni znaten napredek za transfekcijske tehnike vstavljanja genov, in potencialen način za pridobivanje IPC v prihodnosti. Kot prvo omogoča tehnično enostaven in bolj cenovno dostopen način reprogramiranja, saj potrebujemo le plazmidno DNA in komercialne pripomočke za transfekcijo. Ker ne piotrebujemo virusov, ki lahko napadejo samo določene tipe celic, se poveča tudi rang somatskih celic, ki jih lahko uporabimo za indukcijo. Vstavljanje genov s PB-transpozonom tudi omogoča produkcijo induciranih pluripotentnih celic, ki ne vsebujejo ksenobiotikov (substance, ki jih organizem sam ne proizvaja, a so v njem prisotne). In ko celice reprogramiramo lahko z aktivacijo transpozaze tudi odstranimo transpozon.
Poleg samega reprogramiranja celic, ki ima velik potencial v regenerativni medicini, je transpozicija uporabna za preučevanje funkcije genov, lahko bi bila uporabna tudi pri genski terapiji in preprečevanju rasti tumoerjev.

==PiggyBac transpozon==
Prvič so ga našli v mutiranih baculovirusih, ki so okužili celice TN-368 (izvirajo iz vešče vrste Trichoplusia ni). V nekaterih mutantih so opazili del gostiteljske DNA, za katero se je izkazalo, da gre za transpozon.
Ime izvira iz besede piggybacking, izraza, ki pomeni prenašanje čkoveka na hrbtu, s tem da skovanka vsebuje velik B in je brez k-ja, kar označuje povezanost z baculovirusi. Najprej je PB transpozon dobil nezveneče ime IFP2, kasneje pa ga je njegov odkritelj, Malcom J. Fraser, spremenil v piggyBac, da bi tako pritegnil več pozornosti.

==Prilagoditev PB za delo s sesalskimi celicami==
PiggyBac je do nedavnega veljal za uporabnega samo za delo z določenimi rodovi insektov, šele pred kratkim so ga prilagodili za tranpozicijo v sesalskih celicah, natančneje mišjih.
Pri rekonstrukciji PB za mišje celice je bilo potrebno prilagoditi več lastnosti transpozona: sam genetski zapis za transpozazo, terminalna zaporedja in poskrbeti za nadzor nad frekvenco transpozicije.
Najprej so optimizirali nukleotidno zaporedje za PB transpozazo, da je vsebovalo tiste kodone, ki jih pri translaciji preferira mišja celica. S tem so dosegli večjo ekspresijo transpozaze in tako tudi večjo pogostost transpozicije.
Frekvenco transpozicije so poskušali povečati tudi s spreminjanjem terminalnih zaporedij PB transpozona. Zanj je značilno 13 bp dolgo obrnjeno zapoedje na obeh straneh in še dodatna 19 bp dolga obrnjena zaporedja, ki pa so razporejena asimetrično. Eksperiment je pokazal, da je originalna oblika najprimernejša tudi za transpozicijo v mišjih celicah.
Potrebno pa je bilo še poskrbeti za nadzor nad transpozicijo. Zato so na PB transpozon vstavili še gen za ERT2 in tako naredili fuzijski protein PB transpozaze in ERT2. ERT2 je modificirana domena receptorja za estrogen, ki veže ligand in omogoča regulacijo aktivnosti proteina z molekulo 4-hidroksitamoksifen (4-OHT).

==Viri==
*Woltjen, K. in sod. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, vol. 458, str. 766-770.
*Kaji, K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature, 2009, vol. 458, str. 771-775.
*Ivics, Z. in sod. Transposon-mediated Genome Manipulations in Vertebrates. Nat Methods, 2009, štev. 6, str. 415-422.
*Cadiñanos, J.; Bradley, A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nuclei Acids Research, 2007, vol.35(12), e87
*piggyBac [online] [citirano 24.5.2013 ob 17:40] Dostopno na spletnem naslovu: http://piggybac.bio.nd.edu /

Reprogramiranje s transpozicijo

2013-05-30T20:25:10Z

SaraLorbek: /* Prilagoditev PB za delo z sesalskimi celicami */

==Uvod==
Transpozoni so mobilni genetski elementi, glede na mehanizem transpozicije jih delimo v dve večji skupini:
*'''Retrotranspozoni''': mobilnost dosežejo s prepisom v RNA, ki omogoči integracijo prepisane DNA na drugo mesto v genomu.
*'''DNA transpozoni''': uporabljajo mehanizem »izreži – prilepi«, pri katerem ne pride do prepisa v RNA, zato je tudi zgradba tovrstnega transpozona drugačna od zgradbe retrotranspozona: zapis za protein transpozazo je na obeh koncih obdan z inverznima ponovitvama, ki služita kot vezavni mesti za transpozazo. Slednja izreže element in ga prenese na novo mesto v DNA. Ta proces lahko nadzorujemo z ločitvijo zapisa za transpozazo- namesto katerega lahko vključimo kako drugo (željeno) zaporedje DNA, ki se bo v procesu preneslo- od končnih inverznih ponovitev (ITR- inverted terminal repeats), s čimer ustvarimo neavtonomni element. Ta se lahko prenese le, če zagotovimo dodatni vir proteina transpozaze. Tak dvokomponentni sistem se je med drugim izkazal kot zelo uporaben tudi za reprogramiranje somatskih celic.

==Transpozoni kot orodje za vstavljanje genov==
Osnovni kriteriji, ki jih moramo upoštevati pri izbiranju DNA transpozona in konstruiranju transgenov za manipulacijo celic in organizmov, so:
*'''ustrezna stopnja aktivnosti transpozona v izbrani vrsti''',
*'''izogib mobilizaciji transpozonov, ki so naravno prisotni v tarčnem genomu''',
*'''kapaciteta transpozona'''- transgeni konstrukti pogosto presežejo velikost večih kilobaznih parov, saj poleg željenih kodirajočih regij največkrat vključujejo tudi transkripcijske regulatorne elemente. Kapacitete različnih DNA transpozonov se med seboj močno razlikujejo, piggyBac in Tol2 skupini transpozonov sta se do zdaj izkazali za najbolj kapacitivni. To raziskovalcem omogoča vključitev kompleksnih transgenov med inverzni ponovitvi, pri čemer ne trpi učinkovitost transpozicije.
*'''Priljubljeno mesto integracije'''- večina transpozonov ima za tarčo neko specifično zaporedje DNA, dolgo nekaj baznih parov, za katerim se lahko »prilepi«. Tarča piggyBac transpozona so TTAA zaporedja, izraža tudi preferenco do integracije v bižino mest začetka transkripcije in v introne znotraj genov. DNA transpozoni iz družine Tc1/mariner se vključujejo za dinukleotidi TA; najbolj preučen pripadnik te družine je transpozon Sleeping Beauty, zanj je značilna integracija znotraj palindromskih AT ponovitev. Nekateri transpozoni nimajo priljubljenih integracijskih mest, temveč se navidez naključno vključujejo v gostiteljski genom; tak primer so Tol2 DNA transpozoni in dobro raziskani retrotranspozoni L1.
*'''»Lokalno hopsanje«'''-(lokalno skakanje)- izraz opisuje fenomen transpozicije na kromosomu; zanjo je značilno, da se veliko pogosteje pojavlja na cis-mestih v bližini donorskega lokusa: transpozon se izreže iz donorskega mesta na kromosomu in se prilepi nekam v bližino, najpogosteje pristane znotraj iste verige DNA glede na donorsko mesto. Lokalno hopsanje omeji dostopna mesta za transpozon, saj le-ta, razen izjemoma, ne more skočiti izven določene kromosomske regije, kar je uporabno pri povzročanju nasičenja z mutacijami znotraj omejenih kromosomskih regij in s tem ugotavljanja lokacij genov ter njihovih funkcij. Za oba, PiggyBac (PB) in Sleeping Beauty (SB), je značilno lokalno hopsanje, toda pri PB lahko opazimo bolj naključen integracijski vzorec kot pri SB; to je eden izmed primerov, ki dokazujejo specifičnost vzorca poskakovanja za posamezen tip transpozona. Ta vzorec je različen tudi pri različnih vrstah organizmov in je celo odvisen od donorskega lokusa transpozona na kromosomu. Pri retrotranspozonih ni opaziti težnje po lokalnem hopsanju, kar je najverjetneje povezano z njihovim »življenjskim ciklom«, ki se povsem razlikuje od cikla DNA transpozonov. Le-ti po izrezu ostanejo v jedru, RNA molekula pa, ki je nastala s prepisom retrotranspozona, mora najprej priti v citoplazmo, kjer se prevede v potrebne proteine, ki nato izvršijo transpozicijo, slednja je zato povsem neodvisna od donorskega mesta.

==Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev==
Klasične metode, ki se uporabljajo za prepričevanje celic v izražanje tujih genov (npr. mikroinjekcija DNA v notranjost manipulirane celice), se večinoma soočajo z dvema večjima ovirama, ki ju z uporabo transpozona uspešno premagamo: transpozonsko posredovana dostava genov poveča '''učinkovitost integracije''' DNA v kromosome in povzroči '''vključitev »osamljenih« kopij''' namesto konkatemerov (več združenih, v sosledju nanizanih zaporedij, ki jih dostavljamo v celico). Samostojne enote zaporedij so manj podvržene utišanju kot konkatemerni transgeni, ki se pogosto pojavijo ob uporabi klasičnih metod. Poleg tega se lahko pojavijo težave pri prenosu transgena iz klične celične linije(t.j. iz spolne celice) na naslednjo generacijo, kar pogosto povzroči '''transgeno mozaičnost organizmov''' (vse celice organizma, ki se razvije iz oocitov s prehodno injeciranim transgenom, se ne izkažejo pozitivne na transgen- nekatere celice vsebujejo in izražajo vstavljeni gen, druge pa ne). Vzrok tovrstni mozaičnosti je integracija transgena relativno pozno v fazi embrionalnega razvoja, z uporabo transpozona v vlogi vektorja pa lahko integracijo transgena pospešimo: če hkrati s transpozonom, ki smo mu med inverzni 5' ter 3' ponovitvi vstavili željeni gen, injeciramo mRNA, ki kodira transpozazo, zagotovimo hitrejšo dostavo transpozaze in posledično hitrejšo transpozicijo na kromosome tarčnih celic. Eksperimenti potrjujejo, da se s tem poviša odstotek prenosa transgena iz zarodnih celic v naslednjo generacijo, mozaičnost zarodkov pa se znatno zmanjša.

Pogosto je pri eksperimentalnem delu pomembno je tudi, da se v vsako celico vključi zadostno število transpozonov, ki nosijo zapis za gen, ki ga želimo izraziti. To število je zelo majhno, če uporabimo zgolj običajno metodo transfekcije, plazmidi se namreč izjemno na redko integrirajo. Če pa poleg donorskega plazmida (tega, ki nosi željene gene), dodamo še ustrezno količino plazmida, ki kodira transpozazo (pomožni plazmid), se število integracij v celični genom ustrezno zviša- % zvišanja je odvisen od količine obeh dodanih plazmidov. Ta sistem omogoča tudi zelo dober '''nadzor nad številom kopij vstavljenih genov'''.
Z eksperimenti so raziskovalci sicer potrdili, da je reprogramiranje učinkovito tudi z insercijo ene same kopije ustrezno sestavljene reprogramacijske kasete (vektorja z geni potrebnimi za reprogramiranje), hkrati pa s tovrstno insercijo '''minimiziramo spremembe na genomu iPS celice'''.

Večinoma so celice uspešno reprogramirali z uporabo virusnih vektorjev, ki so omogočili izraženje določenih, za pluripotentne celice značilnih faktorjev. Slabost te metode je veliko število integriranih virusnih vektorjev v induciranih pluripotentnih matičnih celicah. Za reprogramiranje je zelo zaželjena uporaba metode, ki hkrati '''omogoči tudi popolno eliminacijo eksogenih faktorjev''', ki bi se v nasprotnem primeru lahko nenadzorovano reaktivirali in povzročili displazijo, tvorbo tumorjev,... Z uporabo transpozonskega sistema za dostavo željenih genov piggyBac lahko po uspešno izvedenem reprogramiranju transgene ter sam PB zlahka odstranimo iz genoma.

Ena izmed zanesljivih metod za odstranitev reprogramacijskih faktorjev je uporaba Cre rekombinaze. Gen Cre s transfekcijo spravimo v iPS celice, sintetizirana rekombinaza pa nato izreže repogramacijsko kaseto, ki smo jo že na začetku sestavili tako, da vsebuje tudi mesto lox, na katerega Cre lahko deluje. Za izrez genov vstavljenih z uporabo PB transpozonskega sistema opisanega načina ne potrebujemo, kajti za popolno odstranitev ITR in transgenov zadostuje, da v celice prehodno dovedemo ustrezno količino plazmida z zapisom za transpozazo (ta naj bo pod nadzorom ustreznega promotorja). PB transpozon se je pri tem in podobnih eksperimentih izkazal kot popolnoma obvladljiv, saj ga lahko brez kakršnihkoli nastalih sprememb na originalnem celičnem genomu izrežemo z opisanim postopkom. PB transpozonski sistem za dostavo genov torej omogoča '''indukcijo genetsko nespremenjenih človeških iPS celic''', kar je izjemno izhodišče za napredek regenerativne medicine.

==Transpozicija in reprogramiranje v praksi==
Ekspresija štirih transkripcijskih faktorjev (c-Myc, Klf4, Oct4 in Sox2; MKOS) zadostuje za uspešno reprogramiranje somatskih celic v pluripotentne matične (iPS celice). Le-te so po lastnostih in potencialu za diferenciacijo v odrasle tipe celic podobne embrionalnim matičnim celicam (ES). Obetavna in učinkovita strategija reprogramiranja je uporaba PB transpozon/transpozaza sistema, ki je neodvisen od vrste gostitelja oz. tipa celic, zahteva zgolj konstrukcijo plazmida s transgeni, obdanimi z inverznimi terminalnimi zaporedji, in prehodno ekspresijo encima transpozaze, ki katalizira insercijo-pa tudi izrez- plazmidnega konstrukta. Woltjen in sod. so opisali uspešno reprogramiranje mišjih in človeških embrionalnih fibroblastov z uporabo doksiciklina, ki je omogočil indukcijo transkripcijskih faktorjev MKOS, v celice dovedenih s PB transpozonskim sistemom. Stabilne iPS so izražale karakteristične markerje pluripotentnosti in so se bile sposobne diferencirati v kompleksna funkcionalna tkiva. Dokazali so tudi, da je posamezne integracije PB možno brez morbidnih preostalih sledi odstraniti iz iPS celic.

===Iniciacija reprogramiranja===
Gene MKOS so vključili v PB-TET transpozonski plazmid (PB-TET-mFx, slika 1a), katerega transkripcija je bila pod nadzorom tetraciklina/doksiciklina; katerikoli izmed obeh antibiotikov je lahko z vplivanjem na promotor povzročil indukcijo transgenov MKOS, intenzivnost izražanja je bila s tem odvisna od koncentracije tet./doks., ki jo je v laboratoriju enostavno regulirati. Promotor in MKOS so bili povezani z βgeo (fuzija β-galaktozidaznega gena in gena za odpornost proti neomicinu) preko IRES sekvence, da so lahko zasledovali kako uspešno oz. tesno doksiciklin regulira izražanje transgenov in kasneje ugotavljali sposobnost celic za vzdrževanje pluripotentnosti kljub odtegnitvi eksogenih faktorjev. Mišje embrionalne fibroblaste, ki so vsebovali odzivni protein za doksiciklin, so podvrgli transfekciji s krožnim plazmidnim konstruktom PB-TET-mFx in pomožnim plazmidom z zapisom za PB transpozazo. Celice so gojili v mediju primernem za ES celične kulture, ki je vseboval doksiciklin in v kratkem so fibroblasti začeli tvoriti ES celičnim kolonijam podobne strukture.

===Vzpostavitev in potrditev pluripotentnosti===
Opisanemu je sledil nastanek celičnih linij, ki so imele sposobnost samoobnavljanja in so izražale ključne lastnosti reprogramiranih celic. Število kolonij reprogramiranih celic se je razlikovalo pri različnih koncentracijah doksiciklina- nad standardno koncentracijo (1,5μg/ml) je bilo kolonij znatno več, pod standardno pa drastično manj. Tak rezultat potrjuje, da '''stopnja izražanja štirih faktorjev določa učinkovitost reprogramacije'''. V ekstremnem primeru, ko raziskovalci v gojišče doksiciklina niso dodali, se nobena celica ni reprogramirala, kajti transgeni se niso mogli izraziti. V treh tednih gojenja je večina celic (89%) postala neodvisnih od prisotnosti doksiciklina; celice so bile sposobne avtonomno vzdrževati reprogramirano stanje.

Če je na opisan način doseženo reprogramirano stanje stabilno, bi se v nekaj tednih morali v celicah postopno pojaviti '''značilni markerji''' (sicer naravno prisotni v embrionalnih izvornih celicah); testi so potrdili prisotnost naslednjih (slika 1b): stabilne celice so aktivirale alkalno fosfatazo, SSEA1 je bil prisoten na njihovi površini, Nanog protein (transkripcijski faktor s poglavitno funkcijo vzdrževanja matičnosti celic) je bil prisoten v jedru; aktivni so bili tudi markerji pluripotentnosti Dax1, Eras, Fbxo, Foxd3, Rex1 in Zfp296; v večini celic so bili prisotni tudi proteinski produkti štirih dovedenih transgenov. Z uporabo RT-PCR in preko aktivnosti LacZ (vključen v βgeo reporterski gen na plazmidu) so določili stopnjo izražanja posameznih transgenov v prisotnosti in odsotnosti doksiciklina; po pričakovanju je bilo izražanje (obarvanje) veliko bolj intenzivno v prisotnosti antibiotika (slika 1d). Z metodo so detektirali povprečne aktivnosti transgenov MKOS v posameznih reprogramiranih celičnih populacijah, niso pa zaznali mozaičnih vzorcev izražanja (mozaicizma celic- npr. nekatere celice so izražale minimalno ali celo nič c-Myc, druge celice so ga izražale več).
Povprečno ugotovljeno število integracij PB transpozona (število kopij) je bilo 9 na celico.

===Odstranitev transgenov in celično samoohranjanje pluripotentnosti===
Da bi odstranili transgene iz genoma po uspešnem reprogramiranju, so raziskovalci v celice prehodno dodali večjo količino transpozaze. Pogostost izreza se je pri različnih klonih celic zelo razlikovala, kar nakazuje, da je uspešnost izreza transpozona odvisna od mesta njegove integracije. Z nekaj dodatnimi postopki je raziskovalcem uspelo izolirati 10 kolonij, v katerih ni bilo prisotne nikakršne sledi integracije transpozona. Kljub tovrstni odstranitvi prvotno vstavljenih transgenov, so celice avtonomno izražale gene potrebne za pluripotentnost.

===Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov===
Pluripotentnost s PB reprogramiranih celic je potrdila njihova '''sposobnost razvoja v himerne miške''', zatem ko so jih vbrizgali v blastociste (slika 3a). Dokazali so tudi '''prisotnost LacZ gena''' v vseh treh zarodnih plasteh himernih embrijev, kar je dokaz za pluripotentnost s transpozonom obdelanih fibroblastov (slika 3b). Zarodki pridobljeni izključno iz induciranih pluripotentnih matičnih celic so '''vsebovali tkiva vseh treh zarodnih plasti''', razvili so tudi '''spolne (germinalne) celice'''- njihov nastanek v embrijih je potrdila prisotnost Vasa proteina, ki se specifično izraža v liniji germinalnih celic, samo v ovariju in testisih (slika 3c). '''Tvorba teratomov'''- tumorjev, ki vsebujejo celice vseh treh zarodnih plasti- je dodaten dokaz inducirane pluripotentnosti celic; če namreč pluripotentne matične celice vbrizgamo v imunokompromitirane miške, se razvijejo v teratom, kar je dokaz pluripotentnosti s transpozicijo reprogramiranih fibroblastov.

Dejstvo, da so se bile iz iPS celic sposobne razviti žive himerne miške (slika 3d), potrjuje popolno reprogramiranje fibroblastov z uporabo PB-transpozonskega sistema, ki je sposoben zagotoviti razvoj specializiranih celic, ki tvorijo funkcionalna tkiva.

Povezava do slik: http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html

==Reprogramiranje človeških fibroblastov==
Transpozon PB-CAG-rtTA skupaj s PB-TET-mFx za regulacijo reprogramiranja z doksiciklinom so uspešno uporabili tudi za reprogramiranje človeških embrionalnih fibroblastov. Kolonije induciranih pluripotentnih celic so izbrali med 14 in 28 dnevi starosti. Štiri od petih, ki so dale pozitiven test na alkalno fosfatazo (markerski encim za pluripotentne celice), so po enem tednu postale neodvisne od doksiciklina, torej so ostale pluripotentne tudi po odstranitvi le-tega iz medija. Ekspresija genov za transkripcijske faktorje in markerskih genov za pluripotenco je dosegla tako visoke ravni kot v embrionalnih matičnih celicah. Po odstranitvi bFGF-ja (basic fibroblast growth factor) je v kolonijah prišlo do tvorbe cističnih embrioidnih telesc (skupkov pluripotentnih celic) in do spontane diferenciacije v endodermalne, ektodermalne in mezodermalne celice. Kot kaže, se torej mišje transkripcijske faktorje da uporabiti tudi za reprogramiranje človeških celic.

==Reprogramiranje sekundarnih fibroblastov==
Iz diploidnih himernih (himera – organizem, ki je sestavljen iz celic dveh ali več genetsko različnih osebkov, v tem primeru mišk) induciranih pluripotentnih celičnih linij so pridobili sekundarne fibroblaste in jih poskušali reprogramirati na enak način kot primarne. Rezultati so pokazali hitrejše odzivanje le-teh na faktorje in doksiciklin v mediju, npr. test na alkalno fosfatazo je bil pozitiven že drugi dan inkubacije. Tako hiter odziv morda kaže na določeno mero nestabilnosti tovrstnega načina reprogramiranja.

==Zaključek==
Na splošno se je reprogramiranje s transpozoni izkazalo za uspešno, ima veliko prednosti in pomeni znaten napredek za transfekcijske tehnike vstavljanja genov, in potencialen način za pridobivanje IPC v prihodnosti. Kot prvo omogoča tehnično enostaven in bolj cenovno dostopen način reprogramiranja, saj potrebujemo le plazmidno DNA in komercialne pripomočke za transfekcijo. Ker ne piotrebujemo virusov, ki lahko napadejo samo določene tipe celic, se poveča tudi rang somatskih celic, ki jih lahko uporabimo za indukcijo. Vstavljanje genov s PB-transpozonom tudi omogoča produkcijo induciranih pluripotentnih celic, ki ne vsebujejo ksenobiotikov (substance, ki jih organizem sam ne proizvaja, a so v njem prisotne). In ko celice reprogramiramo lahko z aktivacijo transpozaze tudi odstranimo transpozon.
Poleg samega reprogramiranja celic, ki ima velik potencial v regenerativni medicini, je transpozicija uporabna za preučevanje funkcije genov, lahko bi bila uporabna tudi pri genski terapiji in preprečevanju rasti tumoerjev.

==PiggyBac transpozon==
Prvič so ga našli v mutiranih baculovirusih, ki so okužili celice TN-368 (izvirajo iz vešče vrste Trichoplusia ni). V nekaterih mutantih so opazili del gostiteljske DNA, za katero se je izkazalo, da gre za transpozon.
Ime izvira iz besede piggybacking, izraza, ki pomeni prenašanje čkoveka na hrbtu, s tem da skovanka vsebuje velik B in je brez k-ja, kar označuje povezanost z baculovirusi. Najprej je PB transpozon dobil nezveneče ime IFP2, kasneje pa ga je njegov odkritelj, Malcom J. Fraser, spremenil v piggyBac, da bi tako pritegnil več pozornosti.

==Prilagoditev PB za delo s sesalskimi celicami==
PiggyBac je do nedavnega veljal za uporabnega samo za delo z določenimi rodovi insektov, šele pred kratkim so ga prilagodili za tranpozicijo v sesalskih celicah, natančneje mišjih.
Pri rekonstrukciji PB za mišje celice je bilo potrebno prilagoditi več lastnosti transpozona: sam genetski zapis za transpozazo, terminalna zaporedja in poskrbeti za nadzor nad frekvenco transpozicije.
Najprej so optimizirali nukleotidno zaporedje za PB transpozazo, da je vsebovalo tiste kodone, ki jih pri translaciji preferira mišja celica. S tem so dosegli večjo ekspresijo transpozaze in tako tudi večjo pogostost transpozicije.
Frekvenco transpozicije so poskušali povečati tudi s spreminjanjem terminalnih zaporedij PB transpozona. Zanj je značilno 13 bp dolgo obrnjeno zapoedje na obeh straneh in še dodatna 19 bp dolga obrnjena zaporedja, ki pa so razporejena asimetrično. Eksperiment je pokazal, da je originalna oblika najprimernejša tudi za transpozicijo v mišjih celicah.
Potrebno pa je bilo še poskrbeti za nadzor nad transpozicijo. Zato so na PB transpozon vstavili še gen za ERT2 in tako naredili fuzijski protein PB transpozaze in ERT2. ERT2 je modificirana domena receptorja za estrogen, ki veže ligand in omogoča regulacijo aktivnosti proteina z molekulo 4-hidroksitamoksifen (4-OHT).

==Viri==
*Woltjen, K. in sod. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, vol. 458, str. 766-770.
*Kaji, K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature, 2009, vol. 458, str. 771-775.
*Ivics, Z. in sod. Transposon-mediated Genome Manipulations in Vertebrates. Nat Methods, 2009, štev. 6, str. 415-422.
*Cadiñanos, J.; Bradley, A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nuclei Acids Research, 2007, vol.35(12), e87
*piggyBac [online] [citirano 24.5.2013 ob 17:40] Dostopno na spletnem naslovu: http://piggybac.bio.nd.edu /

Reprogramiranje s transpozicijo

2013-05-30T20:24:28Z

SaraLorbek: /* Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov */

==Uvod==
Transpozoni so mobilni genetski elementi, glede na mehanizem transpozicije jih delimo v dve večji skupini:
*'''Retrotranspozoni''': mobilnost dosežejo s prepisom v RNA, ki omogoči integracijo prepisane DNA na drugo mesto v genomu.
*'''DNA transpozoni''': uporabljajo mehanizem »izreži – prilepi«, pri katerem ne pride do prepisa v RNA, zato je tudi zgradba tovrstnega transpozona drugačna od zgradbe retrotranspozona: zapis za protein transpozazo je na obeh koncih obdan z inverznima ponovitvama, ki služita kot vezavni mesti za transpozazo. Slednja izreže element in ga prenese na novo mesto v DNA. Ta proces lahko nadzorujemo z ločitvijo zapisa za transpozazo- namesto katerega lahko vključimo kako drugo (željeno) zaporedje DNA, ki se bo v procesu preneslo- od končnih inverznih ponovitev (ITR- inverted terminal repeats), s čimer ustvarimo neavtonomni element. Ta se lahko prenese le, če zagotovimo dodatni vir proteina transpozaze. Tak dvokomponentni sistem se je med drugim izkazal kot zelo uporaben tudi za reprogramiranje somatskih celic.

==Transpozoni kot orodje za vstavljanje genov==
Osnovni kriteriji, ki jih moramo upoštevati pri izbiranju DNA transpozona in konstruiranju transgenov za manipulacijo celic in organizmov, so:
*'''ustrezna stopnja aktivnosti transpozona v izbrani vrsti''',
*'''izogib mobilizaciji transpozonov, ki so naravno prisotni v tarčnem genomu''',
*'''kapaciteta transpozona'''- transgeni konstrukti pogosto presežejo velikost večih kilobaznih parov, saj poleg željenih kodirajočih regij največkrat vključujejo tudi transkripcijske regulatorne elemente. Kapacitete različnih DNA transpozonov se med seboj močno razlikujejo, piggyBac in Tol2 skupini transpozonov sta se do zdaj izkazali za najbolj kapacitivni. To raziskovalcem omogoča vključitev kompleksnih transgenov med inverzni ponovitvi, pri čemer ne trpi učinkovitost transpozicije.
*'''Priljubljeno mesto integracije'''- večina transpozonov ima za tarčo neko specifično zaporedje DNA, dolgo nekaj baznih parov, za katerim se lahko »prilepi«. Tarča piggyBac transpozona so TTAA zaporedja, izraža tudi preferenco do integracije v bižino mest začetka transkripcije in v introne znotraj genov. DNA transpozoni iz družine Tc1/mariner se vključujejo za dinukleotidi TA; najbolj preučen pripadnik te družine je transpozon Sleeping Beauty, zanj je značilna integracija znotraj palindromskih AT ponovitev. Nekateri transpozoni nimajo priljubljenih integracijskih mest, temveč se navidez naključno vključujejo v gostiteljski genom; tak primer so Tol2 DNA transpozoni in dobro raziskani retrotranspozoni L1.
*'''»Lokalno hopsanje«'''-(lokalno skakanje)- izraz opisuje fenomen transpozicije na kromosomu; zanjo je značilno, da se veliko pogosteje pojavlja na cis-mestih v bližini donorskega lokusa: transpozon se izreže iz donorskega mesta na kromosomu in se prilepi nekam v bližino, najpogosteje pristane znotraj iste verige DNA glede na donorsko mesto. Lokalno hopsanje omeji dostopna mesta za transpozon, saj le-ta, razen izjemoma, ne more skočiti izven določene kromosomske regije, kar je uporabno pri povzročanju nasičenja z mutacijami znotraj omejenih kromosomskih regij in s tem ugotavljanja lokacij genov ter njihovih funkcij. Za oba, PiggyBac (PB) in Sleeping Beauty (SB), je značilno lokalno hopsanje, toda pri PB lahko opazimo bolj naključen integracijski vzorec kot pri SB; to je eden izmed primerov, ki dokazujejo specifičnost vzorca poskakovanja za posamezen tip transpozona. Ta vzorec je različen tudi pri različnih vrstah organizmov in je celo odvisen od donorskega lokusa transpozona na kromosomu. Pri retrotranspozonih ni opaziti težnje po lokalnem hopsanju, kar je najverjetneje povezano z njihovim »življenjskim ciklom«, ki se povsem razlikuje od cikla DNA transpozonov. Le-ti po izrezu ostanejo v jedru, RNA molekula pa, ki je nastala s prepisom retrotranspozona, mora najprej priti v citoplazmo, kjer se prevede v potrebne proteine, ki nato izvršijo transpozicijo, slednja je zato povsem neodvisna od donorskega mesta.

==Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev==
Klasične metode, ki se uporabljajo za prepričevanje celic v izražanje tujih genov (npr. mikroinjekcija DNA v notranjost manipulirane celice), se večinoma soočajo z dvema večjima ovirama, ki ju z uporabo transpozona uspešno premagamo: transpozonsko posredovana dostava genov poveča '''učinkovitost integracije''' DNA v kromosome in povzroči '''vključitev »osamljenih« kopij''' namesto konkatemerov (več združenih, v sosledju nanizanih zaporedij, ki jih dostavljamo v celico). Samostojne enote zaporedij so manj podvržene utišanju kot konkatemerni transgeni, ki se pogosto pojavijo ob uporabi klasičnih metod. Poleg tega se lahko pojavijo težave pri prenosu transgena iz klične celične linije(t.j. iz spolne celice) na naslednjo generacijo, kar pogosto povzroči '''transgeno mozaičnost organizmov''' (vse celice organizma, ki se razvije iz oocitov s prehodno injeciranim transgenom, se ne izkažejo pozitivne na transgen- nekatere celice vsebujejo in izražajo vstavljeni gen, druge pa ne). Vzrok tovrstni mozaičnosti je integracija transgena relativno pozno v fazi embrionalnega razvoja, z uporabo transpozona v vlogi vektorja pa lahko integracijo transgena pospešimo: če hkrati s transpozonom, ki smo mu med inverzni 5' ter 3' ponovitvi vstavili željeni gen, injeciramo mRNA, ki kodira transpozazo, zagotovimo hitrejšo dostavo transpozaze in posledično hitrejšo transpozicijo na kromosome tarčnih celic. Eksperimenti potrjujejo, da se s tem poviša odstotek prenosa transgena iz zarodnih celic v naslednjo generacijo, mozaičnost zarodkov pa se znatno zmanjša.

Pogosto je pri eksperimentalnem delu pomembno je tudi, da se v vsako celico vključi zadostno število transpozonov, ki nosijo zapis za gen, ki ga želimo izraziti. To število je zelo majhno, če uporabimo zgolj običajno metodo transfekcije, plazmidi se namreč izjemno na redko integrirajo. Če pa poleg donorskega plazmida (tega, ki nosi željene gene), dodamo še ustrezno količino plazmida, ki kodira transpozazo (pomožni plazmid), se število integracij v celični genom ustrezno zviša- % zvišanja je odvisen od količine obeh dodanih plazmidov. Ta sistem omogoča tudi zelo dober '''nadzor nad številom kopij vstavljenih genov'''.
Z eksperimenti so raziskovalci sicer potrdili, da je reprogramiranje učinkovito tudi z insercijo ene same kopije ustrezno sestavljene reprogramacijske kasete (vektorja z geni potrebnimi za reprogramiranje), hkrati pa s tovrstno insercijo '''minimiziramo spremembe na genomu iPS celice'''.

Večinoma so celice uspešno reprogramirali z uporabo virusnih vektorjev, ki so omogočili izraženje določenih, za pluripotentne celice značilnih faktorjev. Slabost te metode je veliko število integriranih virusnih vektorjev v induciranih pluripotentnih matičnih celicah. Za reprogramiranje je zelo zaželjena uporaba metode, ki hkrati '''omogoči tudi popolno eliminacijo eksogenih faktorjev''', ki bi se v nasprotnem primeru lahko nenadzorovano reaktivirali in povzročili displazijo, tvorbo tumorjev,... Z uporabo transpozonskega sistema za dostavo željenih genov piggyBac lahko po uspešno izvedenem reprogramiranju transgene ter sam PB zlahka odstranimo iz genoma.

Ena izmed zanesljivih metod za odstranitev reprogramacijskih faktorjev je uporaba Cre rekombinaze. Gen Cre s transfekcijo spravimo v iPS celice, sintetizirana rekombinaza pa nato izreže repogramacijsko kaseto, ki smo jo že na začetku sestavili tako, da vsebuje tudi mesto lox, na katerega Cre lahko deluje. Za izrez genov vstavljenih z uporabo PB transpozonskega sistema opisanega načina ne potrebujemo, kajti za popolno odstranitev ITR in transgenov zadostuje, da v celice prehodno dovedemo ustrezno količino plazmida z zapisom za transpozazo (ta naj bo pod nadzorom ustreznega promotorja). PB transpozon se je pri tem in podobnih eksperimentih izkazal kot popolnoma obvladljiv, saj ga lahko brez kakršnihkoli nastalih sprememb na originalnem celičnem genomu izrežemo z opisanim postopkom. PB transpozonski sistem za dostavo genov torej omogoča '''indukcijo genetsko nespremenjenih človeških iPS celic''', kar je izjemno izhodišče za napredek regenerativne medicine.

==Transpozicija in reprogramiranje v praksi==
Ekspresija štirih transkripcijskih faktorjev (c-Myc, Klf4, Oct4 in Sox2; MKOS) zadostuje za uspešno reprogramiranje somatskih celic v pluripotentne matične (iPS celice). Le-te so po lastnostih in potencialu za diferenciacijo v odrasle tipe celic podobne embrionalnim matičnim celicam (ES). Obetavna in učinkovita strategija reprogramiranja je uporaba PB transpozon/transpozaza sistema, ki je neodvisen od vrste gostitelja oz. tipa celic, zahteva zgolj konstrukcijo plazmida s transgeni, obdanimi z inverznimi terminalnimi zaporedji, in prehodno ekspresijo encima transpozaze, ki katalizira insercijo-pa tudi izrez- plazmidnega konstrukta. Woltjen in sod. so opisali uspešno reprogramiranje mišjih in človeških embrionalnih fibroblastov z uporabo doksiciklina, ki je omogočil indukcijo transkripcijskih faktorjev MKOS, v celice dovedenih s PB transpozonskim sistemom. Stabilne iPS so izražale karakteristične markerje pluripotentnosti in so se bile sposobne diferencirati v kompleksna funkcionalna tkiva. Dokazali so tudi, da je posamezne integracije PB možno brez morbidnih preostalih sledi odstraniti iz iPS celic.

===Iniciacija reprogramiranja===
Gene MKOS so vključili v PB-TET transpozonski plazmid (PB-TET-mFx, slika 1a), katerega transkripcija je bila pod nadzorom tetraciklina/doksiciklina; katerikoli izmed obeh antibiotikov je lahko z vplivanjem na promotor povzročil indukcijo transgenov MKOS, intenzivnost izražanja je bila s tem odvisna od koncentracije tet./doks., ki jo je v laboratoriju enostavno regulirati. Promotor in MKOS so bili povezani z βgeo (fuzija β-galaktozidaznega gena in gena za odpornost proti neomicinu) preko IRES sekvence, da so lahko zasledovali kako uspešno oz. tesno doksiciklin regulira izražanje transgenov in kasneje ugotavljali sposobnost celic za vzdrževanje pluripotentnosti kljub odtegnitvi eksogenih faktorjev. Mišje embrionalne fibroblaste, ki so vsebovali odzivni protein za doksiciklin, so podvrgli transfekciji s krožnim plazmidnim konstruktom PB-TET-mFx in pomožnim plazmidom z zapisom za PB transpozazo. Celice so gojili v mediju primernem za ES celične kulture, ki je vseboval doksiciklin in v kratkem so fibroblasti začeli tvoriti ES celičnim kolonijam podobne strukture.

===Vzpostavitev in potrditev pluripotentnosti===
Opisanemu je sledil nastanek celičnih linij, ki so imele sposobnost samoobnavljanja in so izražale ključne lastnosti reprogramiranih celic. Število kolonij reprogramiranih celic se je razlikovalo pri različnih koncentracijah doksiciklina- nad standardno koncentracijo (1,5μg/ml) je bilo kolonij znatno več, pod standardno pa drastično manj. Tak rezultat potrjuje, da '''stopnja izražanja štirih faktorjev določa učinkovitost reprogramacije'''. V ekstremnem primeru, ko raziskovalci v gojišče doksiciklina niso dodali, se nobena celica ni reprogramirala, kajti transgeni se niso mogli izraziti. V treh tednih gojenja je večina celic (89%) postala neodvisnih od prisotnosti doksiciklina; celice so bile sposobne avtonomno vzdrževati reprogramirano stanje.

Če je na opisan način doseženo reprogramirano stanje stabilno, bi se v nekaj tednih morali v celicah postopno pojaviti '''značilni markerji''' (sicer naravno prisotni v embrionalnih izvornih celicah); testi so potrdili prisotnost naslednjih (slika 1b): stabilne celice so aktivirale alkalno fosfatazo, SSEA1 je bil prisoten na njihovi površini, Nanog protein (transkripcijski faktor s poglavitno funkcijo vzdrževanja matičnosti celic) je bil prisoten v jedru; aktivni so bili tudi markerji pluripotentnosti Dax1, Eras, Fbxo, Foxd3, Rex1 in Zfp296; v večini celic so bili prisotni tudi proteinski produkti štirih dovedenih transgenov. Z uporabo RT-PCR in preko aktivnosti LacZ (vključen v βgeo reporterski gen na plazmidu) so določili stopnjo izražanja posameznih transgenov v prisotnosti in odsotnosti doksiciklina; po pričakovanju je bilo izražanje (obarvanje) veliko bolj intenzivno v prisotnosti antibiotika (slika 1d). Z metodo so detektirali povprečne aktivnosti transgenov MKOS v posameznih reprogramiranih celičnih populacijah, niso pa zaznali mozaičnih vzorcev izražanja (mozaicizma celic- npr. nekatere celice so izražale minimalno ali celo nič c-Myc, druge celice so ga izražale več).
Povprečno ugotovljeno število integracij PB transpozona (število kopij) je bilo 9 na celico.

===Odstranitev transgenov in celično samoohranjanje pluripotentnosti===
Da bi odstranili transgene iz genoma po uspešnem reprogramiranju, so raziskovalci v celice prehodno dodali večjo količino transpozaze. Pogostost izreza se je pri različnih klonih celic zelo razlikovala, kar nakazuje, da je uspešnost izreza transpozona odvisna od mesta njegove integracije. Z nekaj dodatnimi postopki je raziskovalcem uspelo izolirati 10 kolonij, v katerih ni bilo prisotne nikakršne sledi integracije transpozona. Kljub tovrstni odstranitvi prvotno vstavljenih transgenov, so celice avtonomno izražale gene potrebne za pluripotentnost.

===Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov===
Pluripotentnost s PB reprogramiranih celic je potrdila njihova '''sposobnost razvoja v himerne miške''', zatem ko so jih vbrizgali v blastociste (slika 3a). Dokazali so tudi '''prisotnost LacZ gena''' v vseh treh zarodnih plasteh himernih embrijev, kar je dokaz za pluripotentnost s transpozonom obdelanih fibroblastov (slika 3b). Zarodki pridobljeni izključno iz induciranih pluripotentnih matičnih celic so '''vsebovali tkiva vseh treh zarodnih plasti''', razvili so tudi '''spolne (germinalne) celice'''- njihov nastanek v embrijih je potrdila prisotnost Vasa proteina, ki se specifično izraža v liniji germinalnih celic, samo v ovariju in testisih (slika 3c). '''Tvorba teratomov'''- tumorjev, ki vsebujejo celice vseh treh zarodnih plasti- je dodaten dokaz inducirane pluripotentnosti celic; če namreč pluripotentne matične celice vbrizgamo v imunokompromitirane miške, se razvijejo v teratom, kar je dokaz pluripotentnosti s transpozicijo reprogramiranih fibroblastov.

Dejstvo, da so se bile iz iPS celic sposobne razviti žive himerne miške (slika 3d), potrjuje popolno reprogramiranje fibroblastov z uporabo PB-transpozonskega sistema, ki je sposoben zagotoviti razvoj specializiranih celic, ki tvorijo funkcionalna tkiva.

Povezava do slik: http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html

==Reprogramiranje človeških fibroblastov==
Transpozon PB-CAG-rtTA skupaj s PB-TET-mFx za regulacijo reprogramiranja z doksiciklinom so uspešno uporabili tudi za reprogramiranje človeških embrionalnih fibroblastov. Kolonije induciranih pluripotentnih celic so izbrali med 14 in 28 dnevi starosti. Štiri od petih, ki so dale pozitiven test na alkalno fosfatazo (markerski encim za pluripotentne celice), so po enem tednu postale neodvisne od doksiciklina, torej so ostale pluripotentne tudi po odstranitvi le-tega iz medija. Ekspresija genov za transkripcijske faktorje in markerskih genov za pluripotenco je dosegla tako visoke ravni kot v embrionalnih matičnih celicah. Po odstranitvi bFGF-ja (basic fibroblast growth factor) je v kolonijah prišlo do tvorbe cističnih embrioidnih telesc (skupkov pluripotentnih celic) in do spontane diferenciacije v endodermalne, ektodermalne in mezodermalne celice. Kot kaže, se torej mišje transkripcijske faktorje da uporabiti tudi za reprogramiranje človeških celic.

==Reprogramiranje sekundarnih fibroblastov==
Iz diploidnih himernih (himera – organizem, ki je sestavljen iz celic dveh ali več genetsko različnih osebkov, v tem primeru mišk) induciranih pluripotentnih celičnih linij so pridobili sekundarne fibroblaste in jih poskušali reprogramirati na enak način kot primarne. Rezultati so pokazali hitrejše odzivanje le-teh na faktorje in doksiciklin v mediju, npr. test na alkalno fosfatazo je bil pozitiven že drugi dan inkubacije. Tako hiter odziv morda kaže na določeno mero nestabilnosti tovrstnega načina reprogramiranja.

==Zaključek==
Na splošno se je reprogramiranje s transpozoni izkazalo za uspešno, ima veliko prednosti in pomeni znaten napredek za transfekcijske tehnike vstavljanja genov, in potencialen način za pridobivanje IPC v prihodnosti. Kot prvo omogoča tehnično enostaven in bolj cenovno dostopen način reprogramiranja, saj potrebujemo le plazmidno DNA in komercialne pripomočke za transfekcijo. Ker ne piotrebujemo virusov, ki lahko napadejo samo določene tipe celic, se poveča tudi rang somatskih celic, ki jih lahko uporabimo za indukcijo. Vstavljanje genov s PB-transpozonom tudi omogoča produkcijo induciranih pluripotentnih celic, ki ne vsebujejo ksenobiotikov (substance, ki jih organizem sam ne proizvaja, a so v njem prisotne). In ko celice reprogramiramo lahko z aktivacijo transpozaze tudi odstranimo transpozon.
Poleg samega reprogramiranja celic, ki ima velik potencial v regenerativni medicini, je transpozicija uporabna za preučevanje funkcije genov, lahko bi bila uporabna tudi pri genski terapiji in preprečevanju rasti tumoerjev.

==PiggyBac transpozon==
Prvič so ga našli v mutiranih baculovirusih, ki so okužili celice TN-368 (izvirajo iz vešče vrste Trichoplusia ni). V nekaterih mutantih so opazili del gostiteljske DNA, za katero se je izkazalo, da gre za transpozon.
Ime izvira iz besede piggybacking, izraza, ki pomeni prenašanje čkoveka na hrbtu, s tem da skovanka vsebuje velik B in je brez k-ja, kar označuje povezanost z baculovirusi. Najprej je PB transpozon dobil nezveneče ime IFP2, kasneje pa ga je njegov odkritelj, Malcom J. Fraser, spremenil v piggyBac, da bi tako pritegnil več pozornosti.

==Prilagoditev PB za delo z sesalskimi celicami==
PiggyBac je do nedavnega veljal za uporabnega samo za delo z določenimi rodovi insektov, šele pred kratkim so ga prilagodili za tranpozicijo v sesalskih celicah, natančneje mišjih.
Pri rekonstrukciji PB za mišje celice je bilo potrebno prilagoditi več lastnosti transpozona: sam genetski zapis za transpozazo, terminalna zaporedja in poskrbeti za nadzor nad frekvenco transpozicije.
Najprej so optimizirali nukleotidno zaporedje za PB transpozazo, da je vsebovalo tiste kodone, ki jih pri translaciji preferira mišja celica. S tem so dosegli večjo ekspresijo transpozaze in tako tudi večjo pogostost transpozicije.
Frekvenco transpozicije so poskušali povečati tudi s spreminjanjem terminalnih zaporedij PB transpozona. Zanj je značilno 13 bp dolgo obrnjeno zapoedje na obeh straneh in še dodatna 19 bp dolga obrnjena zaporedja, ki pa so razporejena asimetrično. Eksperiment je pokazal, da je originalna oblika najprimernejša tudi za transpozicijo v mišjih celicah.
Potrebno pa je bilo še poskrbeti za nadzor nad transpozicijo. Zato so na PB transpozon vstavili še gen za ERT2 in tako naredili fuzijski protein PB transpozaze in ERT2. ERT2 je modificirana domena receptorja za estrogen, ki veže ligand in omogoča regulacijo aktivnosti proteina z molekulo 4-hidroksitamoksifen (4-OHT).

==Viri==
*Woltjen, K. in sod. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, vol. 458, str. 766-770.
*Kaji, K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature, 2009, vol. 458, str. 771-775.
*Ivics, Z. in sod. Transposon-mediated Genome Manipulations in Vertebrates. Nat Methods, 2009, štev. 6, str. 415-422.
*Cadiñanos, J.; Bradley, A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nuclei Acids Research, 2007, vol.35(12), e87
*piggyBac [online] [citirano 24.5.2013 ob 17:40] Dostopno na spletnem naslovu: http://piggybac.bio.nd.edu /

Reprogramiranje s transpozicijo

2013-05-30T19:49:08Z

SaraLorbek: /* Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev */

==Uvod==
Transpozoni so mobilni genetski elementi, glede na mehanizem transpozicije jih delimo v dve večji skupini:
*'''Retrotranspozoni''': mobilnost dosežejo s prepisom v RNA, ki omogoči integracijo prepisane DNA na drugo mesto v genomu.
*'''DNA transpozoni''': uporabljajo mehanizem »izreži – prilepi«, pri katerem ne pride do prepisa v RNA, zato je tudi zgradba tovrstnega transpozona drugačna od zgradbe retrotranspozona: zapis za protein transpozazo je na obeh koncih obdan z inverznima ponovitvama, ki služita kot vezavni mesti za transpozazo. Slednja izreže element in ga prenese na novo mesto v DNA. Ta proces lahko nadzorujemo z ločitvijo zapisa za transpozazo- namesto katerega lahko vključimo kako drugo (željeno) zaporedje DNA, ki se bo v procesu preneslo- od končnih inverznih ponovitev (ITR- inverted terminal repeats), s čimer ustvarimo neavtonomni element. Ta se lahko prenese le, če zagotovimo dodatni vir proteina transpozaze. Tak dvokomponentni sistem se je med drugim izkazal kot zelo uporaben tudi za reprogramiranje somatskih celic.

==Transpozoni kot orodje za vstavljanje genov==
Osnovni kriteriji, ki jih moramo upoštevati pri izbiranju DNA transpozona in konstruiranju transgenov za manipulacijo celic in organizmov, so:
*'''ustrezna stopnja aktivnosti transpozona v izbrani vrsti''',
*'''izogib mobilizaciji transpozonov, ki so naravno prisotni v tarčnem genomu''',
*'''kapaciteta transpozona'''- transgeni konstrukti pogosto presežejo velikost večih kilobaznih parov, saj poleg željenih kodirajočih regij največkrat vključujejo tudi transkripcijske regulatorne elemente. Kapacitete različnih DNA transpozonov se med seboj močno razlikujejo, piggyBac in Tol2 skupini transpozonov sta se do zdaj izkazali za najbolj kapacitivni. To raziskovalcem omogoča vključitev kompleksnih transgenov med inverzni ponovitvi, pri čemer ne trpi učinkovitost transpozicije.
*'''Priljubljeno mesto integracije'''- večina transpozonov ima za tarčo neko specifično zaporedje DNA, dolgo nekaj baznih parov, za katerim se lahko »prilepi«. Tarča piggyBac transpozona so TTAA zaporedja, izraža tudi preferenco do integracije v bižino mest začetka transkripcije in v introne znotraj genov. DNA transpozoni iz družine Tc1/mariner se vključujejo za dinukleotidi TA; najbolj preučen pripadnik te družine je transpozon Sleeping Beauty, zanj je značilna integracija znotraj palindromskih AT ponovitev. Nekateri transpozoni nimajo priljubljenih integracijskih mest, temveč se navidez naključno vključujejo v gostiteljski genom; tak primer so Tol2 DNA transpozoni in dobro raziskani retrotranspozoni L1.
*'''»Lokalno hopsanje«'''-(lokalno skakanje)- izraz opisuje fenomen transpozicije na kromosomu; zanjo je značilno, da se veliko pogosteje pojavlja na cis-mestih v bližini donorskega lokusa: transpozon se izreže iz donorskega mesta na kromosomu in se prilepi nekam v bližino, najpogosteje pristane znotraj iste verige DNA glede na donorsko mesto. Lokalno hopsanje omeji dostopna mesta za transpozon, saj le-ta, razen izjemoma, ne more skočiti izven določene kromosomske regije, kar je uporabno pri povzročanju nasičenja z mutacijami znotraj omejenih kromosomskih regij in s tem ugotavljanja lokacij genov ter njihovih funkcij. Za oba, PiggyBac (PB) in Sleeping Beauty (SB), je značilno lokalno hopsanje, toda pri PB lahko opazimo bolj naključen integracijski vzorec kot pri SB; to je eden izmed primerov, ki dokazujejo specifičnost vzorca poskakovanja za posamezen tip transpozona. Ta vzorec je različen tudi pri različnih vrstah organizmov in je celo odvisen od donorskega lokusa transpozona na kromosomu. Pri retrotranspozonih ni opaziti težnje po lokalnem hopsanju, kar je najverjetneje povezano z njihovim »življenjskim ciklom«, ki se povsem razlikuje od cikla DNA transpozonov. Le-ti po izrezu ostanejo v jedru, RNA molekula pa, ki je nastala s prepisom retrotranspozona, mora najprej priti v citoplazmo, kjer se prevede v potrebne proteine, ki nato izvršijo transpozicijo, slednja je zato povsem neodvisna od donorskega mesta.

==Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev==
Klasične metode, ki se uporabljajo za prepričevanje celic v izražanje tujih genov (npr. mikroinjekcija DNA v notranjost manipulirane celice), se večinoma soočajo z dvema večjima ovirama, ki ju z uporabo transpozona uspešno premagamo: transpozonsko posredovana dostava genov poveča '''učinkovitost integracije''' DNA v kromosome in povzroči '''vključitev »osamljenih« kopij''' namesto konkatemerov (več združenih, v sosledju nanizanih zaporedij, ki jih dostavljamo v celico). Samostojne enote zaporedij so manj podvržene utišanju kot konkatemerni transgeni, ki se pogosto pojavijo ob uporabi klasičnih metod. Poleg tega se lahko pojavijo težave pri prenosu transgena iz klične celične linije(t.j. iz spolne celice) na naslednjo generacijo, kar pogosto povzroči '''transgeno mozaičnost organizmov''' (vse celice organizma, ki se razvije iz oocitov s prehodno injeciranim transgenom, se ne izkažejo pozitivne na transgen- nekatere celice vsebujejo in izražajo vstavljeni gen, druge pa ne). Vzrok tovrstni mozaičnosti je integracija transgena relativno pozno v fazi embrionalnega razvoja, z uporabo transpozona v vlogi vektorja pa lahko integracijo transgena pospešimo: če hkrati s transpozonom, ki smo mu med inverzni 5' ter 3' ponovitvi vstavili željeni gen, injeciramo mRNA, ki kodira transpozazo, zagotovimo hitrejšo dostavo transpozaze in posledično hitrejšo transpozicijo na kromosome tarčnih celic. Eksperimenti potrjujejo, da se s tem poviša odstotek prenosa transgena iz zarodnih celic v naslednjo generacijo, mozaičnost zarodkov pa se znatno zmanjša.

Pogosto je pri eksperimentalnem delu pomembno je tudi, da se v vsako celico vključi zadostno število transpozonov, ki nosijo zapis za gen, ki ga želimo izraziti. To število je zelo majhno, če uporabimo zgolj običajno metodo transfekcije, plazmidi se namreč izjemno na redko integrirajo. Če pa poleg donorskega plazmida (tega, ki nosi željene gene), dodamo še ustrezno količino plazmida, ki kodira transpozazo (pomožni plazmid), se število integracij v celični genom ustrezno zviša- % zvišanja je odvisen od količine obeh dodanih plazmidov. Ta sistem omogoča tudi zelo dober '''nadzor nad številom kopij vstavljenih genov'''.
Z eksperimenti so raziskovalci sicer potrdili, da je reprogramiranje učinkovito tudi z insercijo ene same kopije ustrezno sestavljene reprogramacijske kasete (vektorja z geni potrebnimi za reprogramiranje), hkrati pa s tovrstno insercijo '''minimiziramo spremembe na genomu iPS celice'''.

Večinoma so celice uspešno reprogramirali z uporabo virusnih vektorjev, ki so omogočili izraženje določenih, za pluripotentne celice značilnih faktorjev. Slabost te metode je veliko število integriranih virusnih vektorjev v induciranih pluripotentnih matičnih celicah. Za reprogramiranje je zelo zaželjena uporaba metode, ki hkrati '''omogoči tudi popolno eliminacijo eksogenih faktorjev''', ki bi se v nasprotnem primeru lahko nenadzorovano reaktivirali in povzročili displazijo, tvorbo tumorjev,... Z uporabo transpozonskega sistema za dostavo željenih genov piggyBac lahko po uspešno izvedenem reprogramiranju transgene ter sam PB zlahka odstranimo iz genoma.

Ena izmed zanesljivih metod za odstranitev reprogramacijskih faktorjev je uporaba Cre rekombinaze. Gen Cre s transfekcijo spravimo v iPS celice, sintetizirana rekombinaza pa nato izreže repogramacijsko kaseto, ki smo jo že na začetku sestavili tako, da vsebuje tudi mesto lox, na katerega Cre lahko deluje. Za izrez genov vstavljenih z uporabo PB transpozonskega sistema opisanega načina ne potrebujemo, kajti za popolno odstranitev ITR in transgenov zadostuje, da v celice prehodno dovedemo ustrezno količino plazmida z zapisom za transpozazo (ta naj bo pod nadzorom ustreznega promotorja). PB transpozon se je pri tem in podobnih eksperimentih izkazal kot popolnoma obvladljiv, saj ga lahko brez kakršnihkoli nastalih sprememb na originalnem celičnem genomu izrežemo z opisanim postopkom. PB transpozonski sistem za dostavo genov torej omogoča '''indukcijo genetsko nespremenjenih človeških iPS celic''', kar je izjemno izhodišče za napredek regenerativne medicine.

==Transpozicija in reprogramiranje v praksi==
Ekspresija štirih transkripcijskih faktorjev (c-Myc, Klf4, Oct4 in Sox2; MKOS) zadostuje za uspešno reprogramiranje somatskih celic v pluripotentne matične (iPS celice). Le-te so po lastnostih in potencialu za diferenciacijo v odrasle tipe celic podobne embrionalnim matičnim celicam (ES). Obetavna in učinkovita strategija reprogramiranja je uporaba PB transpozon/transpozaza sistema, ki je neodvisen od vrste gostitelja oz. tipa celic, zahteva zgolj konstrukcijo plazmida s transgeni, obdanimi z inverznimi terminalnimi zaporedji, in prehodno ekspresijo encima transpozaze, ki katalizira insercijo-pa tudi izrez- plazmidnega konstrukta. Woltjen in sod. so opisali uspešno reprogramiranje mišjih in človeških embrionalnih fibroblastov z uporabo doksiciklina, ki je omogočil indukcijo transkripcijskih faktorjev MKOS, v celice dovedenih s PB transpozonskim sistemom. Stabilne iPS so izražale karakteristične markerje pluripotentnosti in so se bile sposobne diferencirati v kompleksna funkcionalna tkiva. Dokazali so tudi, da je posamezne integracije PB možno brez morbidnih preostalih sledi odstraniti iz iPS celic.

===Iniciacija reprogramiranja===
Gene MKOS so vključili v PB-TET transpozonski plazmid (PB-TET-mFx, slika 1a), katerega transkripcija je bila pod nadzorom tetraciklina/doksiciklina; katerikoli izmed obeh antibiotikov je lahko z vplivanjem na promotor povzročil indukcijo transgenov MKOS, intenzivnost izražanja je bila s tem odvisna od koncentracije tet./doks., ki jo je v laboratoriju enostavno regulirati. Promotor in MKOS so bili povezani z βgeo (fuzija β-galaktozidaznega gena in gena za odpornost proti neomicinu) preko IRES sekvence, da so lahko zasledovali kako uspešno oz. tesno doksiciklin regulira izražanje transgenov in kasneje ugotavljali sposobnost celic za vzdrževanje pluripotentnosti kljub odtegnitvi eksogenih faktorjev. Mišje embrionalne fibroblaste, ki so vsebovali odzivni protein za doksiciklin, so podvrgli transfekciji s krožnim plazmidnim konstruktom PB-TET-mFx in pomožnim plazmidom z zapisom za PB transpozazo. Celice so gojili v mediju primernem za ES celične kulture, ki je vseboval doksiciklin in v kratkem so fibroblasti začeli tvoriti ES celičnim kolonijam podobne strukture.

===Vzpostavitev in potrditev pluripotentnosti===
Opisanemu je sledil nastanek celičnih linij, ki so imele sposobnost samoobnavljanja in so izražale ključne lastnosti reprogramiranih celic. Število kolonij reprogramiranih celic se je razlikovalo pri različnih koncentracijah doksiciklina- nad standardno koncentracijo (1,5μg/ml) je bilo kolonij znatno več, pod standardno pa drastično manj. Tak rezultat potrjuje, da '''stopnja izražanja štirih faktorjev določa učinkovitost reprogramacije'''. V ekstremnem primeru, ko raziskovalci v gojišče doksiciklina niso dodali, se nobena celica ni reprogramirala, kajti transgeni se niso mogli izraziti. V treh tednih gojenja je večina celic (89%) postala neodvisnih od prisotnosti doksiciklina; celice so bile sposobne avtonomno vzdrževati reprogramirano stanje.

Če je na opisan način doseženo reprogramirano stanje stabilno, bi se v nekaj tednih morali v celicah postopno pojaviti '''značilni markerji''' (sicer naravno prisotni v embrionalnih izvornih celicah); testi so potrdili prisotnost naslednjih (slika 1b): stabilne celice so aktivirale alkalno fosfatazo, SSEA1 je bil prisoten na njihovi površini, Nanog protein (transkripcijski faktor s poglavitno funkcijo vzdrževanja matičnosti celic) je bil prisoten v jedru; aktivni so bili tudi markerji pluripotentnosti Dax1, Eras, Fbxo, Foxd3, Rex1 in Zfp296; v večini celic so bili prisotni tudi proteinski produkti štirih dovedenih transgenov. Z uporabo RT-PCR in preko aktivnosti LacZ (vključen v βgeo reporterski gen na plazmidu) so določili stopnjo izražanja posameznih transgenov v prisotnosti in odsotnosti doksiciklina; po pričakovanju je bilo izražanje (obarvanje) veliko bolj intenzivno v prisotnosti antibiotika (slika 1d). Z metodo so detektirali povprečne aktivnosti transgenov MKOS v posameznih reprogramiranih celičnih populacijah, niso pa zaznali mozaičnih vzorcev izražanja (mozaicizma celic- npr. nekatere celice so izražale minimalno ali celo nič c-Myc, druge celice so ga izražale več).
Povprečno ugotovljeno število integracij PB transpozona (število kopij) je bilo 9 na celico.

===Odstranitev transgenov in celično samoohranjanje pluripotentnosti===
Da bi odstranili transgene iz genoma po uspešnem reprogramiranju, so raziskovalci v celice prehodno dodali večjo količino transpozaze. Pogostost izreza se je pri različnih klonih celic zelo razlikovala, kar nakazuje, da je uspešnost izreza transpozona odvisna od mesta njegove integracije. Z nekaj dodatnimi postopki je raziskovalcem uspelo izolirati 10 kolonij, v katerih ni bilo prisotne nikakršne sledi integracije transpozona. Kljub tovrstni odstranitvi prvotno vstavljenih transgenov, so celice avtonomno izražale gene potrebne za pluripotentnost.

===Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov===
Pluripotentnost s PB reprogramiranih celic je potrdila njihova '''sposobnost razvoja v himerne miške''' (slika 3a). Dokazali so tudi '''prisotnost LacZ gena''' v vseh treh zarodnih plasteh himernih embrijev, kar je dokaz za pluripotentnost s transpozonom obdelanih fibroblastov (slika 3b). Zarodki pridobljeni izključno iz induciranih pluripotentnih matičnih celic so '''vsebovali tkiva vseh treh zarodnih plasti''', razvili so tudi '''spolne (germinalne) celice'''- njihov nastanek v embrijih je potrdila prisotnost Vasa proteina, ki se specifično izraža v liniji germinalnih celic, samo v ovariju in testisih (slika 3c). '''Tvorba teratomov'''- tumorjev, ki vsebujejo celice vseh treh zarodnih plasti- je dodaten dokaz inducirane pluripotentnosti celic; če namreč pluripotentne matične celice vbrizgamo v imunokompromitirane miške, se razvijejo v teratom, kar je dokaz pluripotentnosti s transpozicijo reprogramiranih fibroblastov.

Dejstvo, da so se bile iz iPS celic sposobne razviti žive himerne miške (slika 3d), potrjuje popolno reprogramiranje fibroblastov z uporabo PB-transpozonskega sistema, ki je sposoben zagotoviti razvoj specializiranih celic, ki tvorijo funkcionalna tkiva.

Povezava do slik: http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html

==Reprogramiranje človeških fibroblastov==
Transpozon PB-CAG-rtTA skupaj s PB-TET-mFx za regulacijo reprogramiranja z doksiciklinom so uspešno uporabili tudi za reprogramiranje človeških embrionalnih fibroblastov. Kolonije induciranih pluripotentnih celic so izbrali med 14 in 28 dnevi starosti. Štiri od petih, ki so dale pozitiven test na alkalno fosfatazo (markerski encim za pluripotentne celice), so po enem tednu postale neodvisne od doksiciklina, torej so ostale pluripotentne tudi po odstranitvi le-tega iz medija. Ekspresija genov za transkripcijske faktorje in markerskih genov za pluripotenco je dosegla tako visoke ravni kot v embrionalnih matičnih celicah. Po odstranitvi bFGF-ja (basic fibroblast growth factor) je v kolonijah prišlo do tvorbe cističnih embrioidnih telesc (skupkov pluripotentnih celic) in do spontane diferenciacije v endodermalne, ektodermalne in mezodermalne celice. Kot kaže, se torej mišje transkripcijske faktorje da uporabiti tudi za reprogramiranje človeških celic.

==Reprogramiranje sekundarnih fibroblastov==
Iz diploidnih himernih (himera – organizem, ki je sestavljen iz celic dveh ali več genetsko različnih osebkov, v tem primeru mišk) induciranih pluripotentnih celičnih linij so pridobili sekundarne fibroblaste in jih poskušali reprogramirati na enak način kot primarne. Rezultati so pokazali hitrejše odzivanje le-teh na faktorje in doksiciklin v mediju, npr. test na alkalno fosfatazo je bil pozitiven že drugi dan inkubacije. Tako hiter odziv morda kaže na določeno mero nestabilnosti tovrstnega načina reprogramiranja.

==Zaključek==
Na splošno se je reprogramiranje s transpozoni izkazalo za uspešno, ima veliko prednosti in pomeni znaten napredek za transfekcijske tehnike vstavljanja genov, in potencialen način za pridobivanje IPC v prihodnosti. Kot prvo omogoča tehnično enostaven in bolj cenovno dostopen način reprogramiranja, saj potrebujemo le plazmidno DNA in komercialne pripomočke za transfekcijo. Ker ne piotrebujemo virusov, ki lahko napadejo samo določene tipe celic, se poveča tudi rang somatskih celic, ki jih lahko uporabimo za indukcijo. Vstavljanje genov s PB-transpozonom tudi omogoča produkcijo induciranih pluripotentnih celic, ki ne vsebujejo ksenobiotikov (substance, ki jih organizem sam ne proizvaja, a so v njem prisotne). In ko celice reprogramiramo lahko z aktivacijo transpozaze tudi odstranimo transpozon.
Poleg samega reprogramiranja celic, ki ima velik potencial v regenerativni medicini, je transpozicija uporabna za preučevanje funkcije genov, lahko bi bila uporabna tudi pri genski terapiji in preprečevanju rasti tumoerjev.

==PiggyBac transpozon==
Prvič so ga našli v mutiranih baculovirusih, ki so okužili celice TN-368 (izvirajo iz vešče vrste Trichoplusia ni). V nekaterih mutantih so opazili del gostiteljske DNA, za katero se je izkazalo, da gre za transpozon.
Ime izvira iz besede piggybacking, izraza, ki pomeni prenašanje čkoveka na hrbtu, s tem da skovanka vsebuje velik B in je brez k-ja, kar označuje povezanost z baculovirusi. Najprej je PB transpozon dobil nezveneče ime IFP2, kasneje pa ga je njegov odkritelj, Malcom J. Fraser, spremenil v piggyBac, da bi tako pritegnil več pozornosti.

==Prilagoditev PB za delo z sesalskimi celicami==
PiggyBac je do nedavnega veljal za uporabnega samo za delo z določenimi rodovi insektov, šele pred kratkim so ga prilagodili za tranpozicijo v sesalskih celicah, natančneje mišjih.
Pri rekonstrukciji PB za mišje celice je bilo potrebno prilagoditi več lastnosti transpozona: sam genetski zapis za transpozazo, terminalna zaporedja in poskrbeti za nadzor nad frekvenco transpozicije.
Najprej so optimizirali nukleotidno zaporedje za PB transpozazo, da je vsebovalo tiste kodone, ki jih pri translaciji preferira mišja celica. S tem so dosegli večjo ekspresijo transpozaze in tako tudi večjo pogostost transpozicije.
Frekvenco transpozicije so poskušali povečati tudi s spreminjanjem terminalnih zaporedij PB transpozona. Zanj je značilno 13 bp dolgo obrnjeno zapoedje na obeh straneh in še dodatna 19 bp dolga obrnjena zaporedja, ki pa so razporejena asimetrično. Eksperiment je pokazal, da je originalna oblika najprimernejša tudi za transpozicijo v mišjih celicah.
Potrebno pa je bilo še poskrbeti za nadzor nad transpozicijo. Zato so na PB transpozon vstavili še gen za ERT2 in tako naredili fuzijski protein PB transpozaze in ERT2. ERT2 je modificirana domena receptorja za estrogen, ki veže ligand in omogoča regulacijo aktivnosti proteina z molekulo 4-hidroksitamoksifen (4-OHT).

==Viri==
*Woltjen, K. in sod. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, vol. 458, str. 766-770.
*Kaji, K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature, 2009, vol. 458, str. 771-775.
*Ivics, Z. in sod. Transposon-mediated Genome Manipulations in Vertebrates. Nat Methods, 2009, štev. 6, str. 415-422.
*Cadiñanos, J.; Bradley, A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nuclei Acids Research, 2007, vol.35(12), e87
*piggyBac [online] [citirano 24.5.2013 ob 17:40] Dostopno na spletnem naslovu: http://piggybac.bio.nd.edu /

Talk:Reprogramiranje s transpozicijo

2013-05-27T16:04:56Z

SaraLorbek: New page: Sara Lorbek: uvod, transpozoni kot orodje za vstavljanje genov, prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev, transpozicija in reprogramiranje v praksi + 4 pripadajoča podpoglavja. B...

Sara Lorbek: uvod, transpozoni kot orodje za vstavljanje genov, prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev, transpozicija in reprogramiranje v praksi + 4 pripadajoča podpoglavja.

Barbara Dušak: reprogramiranje človeških fibroblastov, reprogramiranje sekundarnih fibroblastov, zaključek, ''piggyBac'' transpozon, prilagoditev PB za delo s sesalskimi celicami.

Reprogramiranje celic

2013-05-27T15:59:47Z

SaraLorbek: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijske_zna%C4%8Dilnosti_izvornih_celic Biokemijske značilnosti izvornih celic](Urška Rode)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Epigenetsko_reprogramiranje_celic Epigenetsko reprogramiranje] (Karmen Belšak, Maša Mohar)
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Erik Janežič, Tomaž Rozmarič)
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Ana Kunšek, Nastja Pirman)
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/ (Julija Mazej, Bojana Lazović, Maja Kostanjevec)
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Dejan Marjanovič, Suzana Semič)
# Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/(Griša Prinčič, Erik Mršnik, Jakob Gašper Lavrenčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema Reprogramiranje z dvema faktorjema](Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_s_transpozicijo Reprogramiranje s transpozicijo] (Barbara Dušak, Sara Lorbek)
# Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# Tumorigenost iPSC (Urška Navodnik, Ana Remžgar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_miRNA Reprogramiranje z miRNA] (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Aleksander Benčič, Jernej Pušnik)
# Kombiniranje tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic in genskih modifikacij pri zdravljenju mišične distrofije (Urška Rauter)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.

Reprogramiranje s transpozicijo

2013-05-27T15:54:18Z

SaraLorbek: New page: ==Uvod== Transpozoni so mobilni genetski elementi, glede na mehanizem transpozicije jih delimo v dve večji skupini: *'''Retrotranspozoni''': mobilnost dosežejo s prepisom v RNA, ki omogo...

==Uvod==
Transpozoni so mobilni genetski elementi, glede na mehanizem transpozicije jih delimo v dve večji skupini:
*'''Retrotranspozoni''': mobilnost dosežejo s prepisom v RNA, ki omogoči integracijo prepisane DNA na drugo mesto v genomu.
*'''DNA transpozoni''': uporabljajo mehanizem »izreži – prilepi«, pri katerem ne pride do prepisa v RNA, zato je tudi zgradba tovrstnega transpozona drugačna od zgradbe retrotranspozona: zapis za protein transpozazo je na obeh koncih obdan z inverznima ponovitvama, ki služita kot vezavni mesti za transpozazo. Slednja izreže element in ga prenese na novo mesto v DNA. Ta proces lahko nadzorujemo z ločitvijo zapisa za transpozazo- namesto katerega lahko vključimo kako drugo (željeno) zaporedje DNA, ki se bo v procesu preneslo- od končnih inverznih ponovitev (ITR- inverted terminal repeats), s čimer ustvarimo neavtonomni element. Ta se lahko prenese le, če zagotovimo dodatni vir proteina transpozaze. Tak dvokomponentni sistem se je med drugim izkazal kot zelo uporaben tudi za reprogramiranje somatskih celic.

==Transpozoni kot orodje za vstavljanje genov==
Osnovni kriteriji, ki jih moramo upoštevati pri izbiranju DNA transpozona in konstruiranju transgenov za manipulacijo celic in organizmov, so:
*'''ustrezna stopnja aktivnosti transpozona v izbrani vrsti''',
*'''izogib mobilizaciji transpozonov, ki so naravno prisotni v tarčnem genomu''',
*'''kapaciteta transpozona'''- transgeni konstrukti pogosto presežejo velikost večih kilobaznih parov, saj poleg željenih kodirajočih regij največkrat vključujejo tudi transkripcijske regulatorne elemente. Kapacitete različnih DNA transpozonov se med seboj močno razlikujejo, piggyBac in Tol2 skupini transpozonov sta se do zdaj izkazali za najbolj kapacitivni. To raziskovalcem omogoča vključitev kompleksnih transgenov med inverzni ponovitvi, pri čemer ne trpi učinkovitost transpozicije.
*'''Priljubljeno mesto integracije'''- večina transpozonov ima za tarčo neko specifično zaporedje DNA, dolgo nekaj baznih parov, za katerim se lahko »prilepi«. Tarča piggyBac transpozona so TTAA zaporedja, izraža tudi preferenco do integracije v bižino mest začetka transkripcije in v introne znotraj genov. DNA transpozoni iz družine Tc1/mariner se vključujejo za dinukleotidi TA; najbolj preučen pripadnik te družine je transpozon Sleeping Beauty, zanj je značilna integracija znotraj palindromskih AT ponovitev. Nekateri transpozoni nimajo priljubljenih integracijskih mest, temveč se navidez naključno vključujejo v gostiteljski genom; tak primer so Tol2 DNA transpozoni in dobro raziskani retrotranspozoni L1.
*'''»Lokalno hopsanje«'''-(lokalno skakanje)- izraz opisuje fenomen transpozicije na kromosomu; zanjo je značilno, da se veliko pogosteje pojavlja na cis-mestih v bližini donorskega lokusa: transpozon se izreže iz donorskega mesta na kromosomu in se prilepi nekam v bližino, najpogosteje pristane znotraj iste verige DNA glede na donorsko mesto. Lokalno hopsanje omeji dostopna mesta za transpozon, saj le-ta, razen izjemoma, ne more skočiti izven določene kromosomske regije, kar je uporabno pri povzročanju nasičenja z mutacijami znotraj omejenih kromosomskih regij in s tem ugotavljanja lokacij genov ter njihovih funkcij. Za oba, PiggyBac (PB) in Sleeping Beauty (SB), je značilno lokalno hopsanje, toda pri PB lahko opazimo bolj naključen integracijski vzorec kot pri SB; to je eden izmed primerov, ki dokazujejo specifičnost vzorca poskakovanja za posamezen tip transpozona. Ta vzorec je različen tudi pri različnih vrstah organizmov in je celo odvisen od donorskega lokusa transpozona na kromosomu. Pri retrotranspozonih ni opaziti težnje po lokalnem hopsanju, kar je najverjetneje povezano z njihovim »življenjskim ciklom«, ki se povsem razlikuje od cikla DNA transpozonov. Le-ti po izrezu ostanejo v jedru, RNA molekula pa, ki je nastala s prepisom retrotranspozona, mora najprej priti v citoplazmo, kjer se prevede v potrebne proteine, ki nato izvršijo transpozicijo, slednja je zato povsem neodvisna od donorskega mesta.

==Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev==
Klasične metode, ki se uporabljajo za prepričevanje celic v izražanje tujih genov (npr. mikroinjekcija DNA v notranjost manipulirane celice), se večinoma soočajo z dvema večjima ovirama, ki ju z uporabo transpozona uspešno premagamo: transpozonsko posredovana dostava genov poveča '''učinkovitost integracije''' DNA v kromosome in povzroči '''vključitev »osamljenih« kopij''' namesto konkatemerov (več združenih, v sosledju nanizanih zaporedij, ki jih dostavljamo v celico). Samostojne enote zaporedij so manj podvržene utišanju kot konkatemerni transgeni, ki se pogosto pojavijo ob uporabi klasičnih metod. Poleg tega se lahko pojavijo težave pri prenosu transgena iz klične celične linije(t.j. iz spolne celice) na naslednjo generacijo, kar pogosto povzroči '''transgeno mozaičnost organizmov''' (vse celice organizma, ki se razvije iz oocitov s prehodno injeciranim transgenom, se ne izkažejo pozitivne na transgen- nekatere celice vsebujejo in izražajo vstavljeni gen, druge pa ne). Vzrok tovrstni mozaičnosti je integracija transgena relativno pozno v fazi embrionalnega razvoja, z uporabo transpozona v vlogi vektorja pa lahko integracijo transgena pospešimo: če hkrati s transpozonom, ki smo mu med inverzni 5' ter 3' ponovitvi vstavili željeni gen, injeciramo mRNA, ki kodira transpozazo, zagotovimo hitrejšo dostavo transpozaze in posledično hitrejšo transpozicijo na kromosome tarčnih celic. Eksperimenti potrjujejo, da se s tem poviša odstotek prenosa transgena iz zarodnih celic v naslednjo generacijo, mozaičnost zarodkov pa se znatno zmanjša.

Pogosto je pri eksperimentalnem delu pomembno je tudi, da se v vsako celico vključi zadostno število transpozonov, ki nosijo zapis za gen, ki ga želimo izraziti. To število je zelo majhno, če uporabimo zgolj običajno metodo transfekcije, plazmidi se namreč izjemno na redko integrirajo. Če pa poleg donorskega plazmida (tega, ki nosi željene gene), dodamo še ustrezno količino plazmida, ki kodira transpozazo (pomožni plazmid), se število integracij v celični genom ustrezno zviša- % zvišanja je odvisen od količine obeh dodanih plazmidov. Ta sistem omogoča tudi zelo dober '''nadzor nad številom kopij vstavljenih genov'''.
Z eksperimenti so raziskovalci sicer potrdili, da je reprogramiranje učinkovito tudi z insercijo ene same kopije ustrezno sestavljene reprogramacijske kasete (vektorja z geni potrebnimi za reprogramiranje), hkrati pa s tovrstno insercijo '''minimiziramo spremembe na genomu iPS celice'''.

Večinoma so celice uspešno reprogramirali z uporabo virusnih vektorjev, ki so omogočili izraženje določenih, za pluripotentne celice značilnih faktorjev. Slabost te metode je veliko število integriranih virusnih vektorjev v induciranih pluripotentnih matičnih celicah. Za reprogramiranje je zelo zaželjena uporaba metode, ki hkrati '''omogoči tudi popolno eliminacijo eksogenih faktorjev''', ki bi se v nasprotnem primeru lahko nenadzorovano reaktivirali in povzročili displazijo, tvorbo tumorjev,... Z uporabo transpozonskega sistema za dostavo željenih genov piggyBac lahko po uspešno izvedenem reprogramiranju transgene ter sam PB zlahka odstranimo iz genoma.

Ena izmed zanesljivih metod za odstranitev reprogramacijskih faktorjev je uporaba Cre rekombinaze. Gen Cre s transfekcijo spravimo v iPS celice, sintetizirana rekombinaza pa nato izreže repogramacijsko kaseto (vektor z geni za reprogramiranje in PB inverznima terminalnima zaporedjema), ki smo jo že na začetku sestavili tako, da vsebuje tudi mesto lox, na katerega Cre lahko deluje. PB transpozon se je pri tem in podobnih eksperimentih izkazal kot popolnoma obvladljiv, saj ga lahko brez kakršnihkoli nastalih sprememb na originalnem celičnem genomu izrežemo. PB transpozonski sistem za dostavo genov omogoča tudi '''indukcijo genetsko nespremenjenih človeških iPS celic''', kar je izjemno izhodišče za napredek regenerativne medicine.

==Transpozicija in reprogramiranje v praksi==
Ekspresija štirih transkripcijskih faktorjev (c-Myc, Klf4, Oct4 in Sox2; MKOS) zadostuje za uspešno reprogramiranje somatskih celic v pluripotentne matične (iPS celice). Le-te so po lastnostih in potencialu za diferenciacijo v odrasle tipe celic podobne embrionalnim matičnim celicam (ES). Obetavna in učinkovita strategija reprogramiranja je uporaba PB transpozon/transpozaza sistema, ki je neodvisen od vrste gostitelja oz. tipa celic, zahteva zgolj konstrukcijo plazmida s transgeni, obdanimi z inverznimi terminalnimi zaporedji, in prehodno ekspresijo encima transpozaze, ki katalizira insercijo-pa tudi izrez- plazmidnega konstrukta. Woltjen in sod. so opisali uspešno reprogramiranje mišjih in človeških embrionalnih fibroblastov z uporabo doksiciklina, ki je omogočil indukcijo transkripcijskih faktorjev MKOS, v celice dovedenih s PB transpozonskim sistemom. Stabilne iPS so izražale karakteristične markerje pluripotentnosti in so se bile sposobne diferencirati v kompleksna funkcionalna tkiva. Dokazali so tudi, da je posamezne integracije PB možno brez morbidnih preostalih sledi odstraniti iz iPS celic.

===Iniciacija reprogramiranja===
Gene MKOS so vključili v PB-TET transpozonski plazmid (PB-TET-mFx, slika 1a), katerega transkripcija je bila pod nadzorom tetraciklina/doksiciklina; katerikoli izmed obeh antibiotikov je lahko z vplivanjem na promotor povzročil indukcijo transgenov MKOS, intenzivnost izražanja je bila s tem odvisna od koncentracije tet./doks., ki jo je v laboratoriju enostavno regulirati. Promotor in MKOS so bili povezani z βgeo (fuzija β-galaktozidaznega gena in gena za odpornost proti neomicinu) preko IRES sekvence, da so lahko zasledovali kako uspešno oz. tesno doksiciklin regulira izražanje transgenov in kasneje ugotavljali sposobnost celic za vzdrževanje pluripotentnosti kljub odtegnitvi eksogenih faktorjev. Mišje embrionalne fibroblaste, ki so vsebovali odzivni protein za doksiciklin, so podvrgli transfekciji s krožnim plazmidnim konstruktom PB-TET-mFx in pomožnim plazmidom z zapisom za PB transpozazo. Celice so gojili v mediju primernem za ES celične kulture, ki je vseboval doksiciklin in v kratkem so fibroblasti začeli tvoriti ES celičnim kolonijam podobne strukture.

===Vzpostavitev in potrditev pluripotentnosti===
Opisanemu je sledil nastanek celičnih linij, ki so imele sposobnost samoobnavljanja in so izražale ključne lastnosti reprogramiranih celic. Število kolonij reprogramiranih celic se je razlikovalo pri različnih koncentracijah doksiciklina- nad standardno koncentracijo (1,5μg/ml) je bilo kolonij znatno več, pod standardno pa drastično manj. Tak rezultat potrjuje, da '''stopnja izražanja štirih faktorjev določa učinkovitost reprogramacije'''. V ekstremnem primeru, ko raziskovalci v gojišče doksiciklina niso dodali, se nobena celica ni reprogramirala, kajti transgeni se niso mogli izraziti. V treh tednih gojenja je večina celic (89%) postala neodvisnih od prisotnosti doksiciklina; celice so bile sposobne avtonomno vzdrževati reprogramirano stanje.

Če je na opisan način doseženo reprogramirano stanje stabilno, bi se v nekaj tednih morali v celicah postopno pojaviti '''značilni markerji''' (sicer naravno prisotni v embrionalnih izvornih celicah); testi so potrdili prisotnost naslednjih (slika 1b): stabilne celice so aktivirale alkalno fosfatazo, SSEA1 je bil prisoten na njihovi površini, Nanog protein (transkripcijski faktor s poglavitno funkcijo vzdrževanja matičnosti celic) je bil prisoten v jedru; aktivni so bili tudi markerji pluripotentnosti Dax1, Eras, Fbxo, Foxd3, Rex1 in Zfp296; v večini celic so bili prisotni tudi proteinski produkti štirih dovedenih transgenov. Z uporabo RT-PCR in preko aktivnosti LacZ (vključen v βgeo reporterski gen na plazmidu) so določili stopnjo izražanja posameznih transgenov v prisotnosti in odsotnosti doksiciklina; po pričakovanju je bilo izražanje (obarvanje) veliko bolj intenzivno v prisotnosti antibiotika (slika 1d). Z metodo so detektirali povprečne aktivnosti transgenov MKOS v posameznih reprogramiranih celičnih populacijah, niso pa zaznali mozaičnih vzorcev izražanja (mozaicizma celic- npr. nekatere celice so izražale minimalno ali celo nič c-Myc, druge celice so ga izražale več).
Povprečno ugotovljeno število integracij PB transpozona (število kopij) je bilo 9 na celico.

===Odstranitev transgenov in celično samoohranjanje pluripotentnosti===
Da bi odstranili transgene iz genoma po uspešnem reprogramiranju, so raziskovalci v celice prehodno dodali večjo količino transpozaze. Pogostost izreza se je pri različnih klonih celic zelo razlikovala, kar nakazuje, da je uspešnost izreza transpozona odvisna od mesta njegove integracije. Z nekaj dodatnimi postopki je raziskovalcem uspelo izolirati 10 kolonij, v katerih ni bilo prisotne nikakršne sledi integracije transpozona. Kljub tovrstni odstranitvi prvotno vstavljenih transgenov, so celice avtonomno izražale gene potrebne za pluripotentnost.

===Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov===
Pluripotentnost s PB reprogramiranih celic je potrdila njihova '''sposobnost razvoja v himerne miške''' (slika 3a). Dokazali so tudi '''prisotnost LacZ gena''' v vseh treh zarodnih plasteh himernih embrijev, kar je dokaz za pluripotentnost s transpozonom obdelanih fibroblastov (slika 3b). Zarodki pridobljeni izključno iz induciranih pluripotentnih matičnih celic so '''vsebovali tkiva vseh treh zarodnih plasti''', razvili so tudi '''spolne (germinalne) celice'''- njihov nastanek v embrijih je potrdila prisotnost Vasa proteina, ki se specifično izraža v liniji germinalnih celic, samo v ovariju in testisih (slika 3c). '''Tvorba teratomov'''- tumorjev, ki vsebujejo celice vseh treh zarodnih plasti- je dodaten dokaz inducirane pluripotentnosti celic; če namreč pluripotentne matične celice vbrizgamo v imunokompromitirane miške, se razvijejo v teratom, kar je dokaz pluripotentnosti s transpozicijo reprogramiranih fibroblastov.

Dejstvo, da so se bile iz iPS celic sposobne razviti žive himerne miške (slika 3d), potrjuje popolno reprogramiranje fibroblastov z uporabo PB-transpozonskega sistema, ki je sposoben zagotoviti razvoj specializiranih celic, ki tvorijo funkcionalna tkiva.

Povezava do slik: http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html

==Reprogramiranje človeških fibroblastov==
Transpozon PB-CAG-rtTA skupaj s PB-TET-mFx za regulacijo reprogramiranja z doksiciklinom so uspešno uporabili tudi za reprogramiranje človeških embrionalnih fibroblastov. Kolonije induciranih pluripotentnih celic so izbrali med 14 in 28 dnevi starosti. Štiri od petih, ki so dale pozitiven test na alkalno fosfatazo (markerski encim za pluripotentne celice), so po enem tednu postale neodvisne od doksiciklina, torej so ostale pluripotentne tudi po odstranitvi le-tega iz medija. Ekspresija genov za transkripcijske faktorje in markerskih genov za pluripotenco je dosegla tako visoke ravni kot v embrionalnih matičnih celicah. Po odstranitvi bFGF-ja (basic fibroblast growth factor) je v kolonijah prišlo do tvorbe cističnih embrioidnih telesc (skupkov pluripotentnih celic) in do spontane diferenciacije v endodermalne, ektodermalne in mezodermalne celice. Kot kaže, se torej mišje transkripcijske faktorje da uporabiti tudi za reprogramiranje človeških celic.

==Reprogramiranje sekundarnih fibroblastov==
Iz diploidnih himernih (himera – organizem, ki je sestavljen iz celic dveh ali več genetsko različnih osebkov, v tem primeru mišk) induciranih pluripotentnih celičnih linij so pridobili sekundarne fibroblaste in jih poskušali reprogramirati na enak način kot primarne. Rezultati so pokazali hitrejše odzivanje le-teh na faktorje in doksiciklin v mediju, npr. test na alkalno fosfatazo je bil pozitiven že drugi dan inkubacije. Tako hiter odziv morda kaže na določeno mero nestabilnosti tovrstnega načina reprogramiranja.

==Zaključek==
Na splošno se je reprogramiranje s transpozoni izkazalo za uspešno, ima veliko prednosti in pomeni znaten napredek za transfekcijske tehnike vstavljanja genov, in potencialen način za pridobivanje IPC v prihodnosti. Kot prvo omogoča tehnično enostaven in bolj cenovno dostopen način reprogramiranja, saj potrebujemo le plazmidno DNA in komercialne pripomočke za transfekcijo. Ker ne piotrebujemo virusov, ki lahko napadejo samo določene tipe celic, se poveča tudi rang somatskih celic, ki jih lahko uporabimo za indukcijo. Vstavljanje genov s PB-transpozonom tudi omogoča produkcijo induciranih pluripotentnih celic, ki ne vsebujejo ksenobiotikov (substance, ki jih organizem sam ne proizvaja, a so v njem prisotne). In ko celice reprogramiramo lahko z aktivacijo transpozaze tudi odstranimo transpozon.
Poleg samega reprogramiranja celic, ki ima velik potencial v regenerativni medicini, je transpozicija uporabna za preučevanje funkcije genov, lahko bi bila uporabna tudi pri genski terapiji in preprečevanju rasti tumoerjev.

==PiggyBac transpozon==
Prvič so ga našli v mutiranih baculovirusih, ki so okužili celice TN-368 (izvirajo iz vešče vrste Trichoplusia ni). V nekaterih mutantih so opazili del gostiteljske DNA, za katero se je izkazalo, da gre za transpozon.
Ime izvira iz besede piggybacking, izraza, ki pomeni prenašanje čkoveka na hrbtu, s tem da skovanka vsebuje velik B in je brez k-ja, kar označuje povezanost z baculovirusi. Najprej je PB transpozon dobil nezveneče ime IFP2, kasneje pa ga je njegov odkritelj, Malcom J. Fraser, spremenil v piggyBac, da bi tako pritegnil več pozornosti.

==Prilagoditev PB za delo z sesalskimi celicami==
PiggyBac je do nedavnega veljal za uporabnega samo za delo z določenimi rodovi insektov, šele pred kratkim so ga prilagodili za tranpozicijo v sesalskih celicah, natančneje mišjih.
Pri rekonstrukciji PB za mišje celice je bilo potrebno prilagoditi več lastnosti transpozona: sam genetski zapis za transpozazo, terminalna zaporedja in poskrbeti za nadzor nad frekvenco transpozicije.
Najprej so optimizirali nukleotidno zaporedje za PB transpozazo, da je vsebovalo tiste kodone, ki jih pri translaciji preferira mišja celica. S tem so dosegli večjo ekspresijo transpozaze in tako tudi večjo pogostost transpozicije.
Frekvenco transpozicije so poskušali povečati tudi s spreminjanjem terminalnih zaporedij PB transpozona. Zanj je značilno 13 bp dolgo obrnjeno zapoedje na obeh straneh in še dodatna 19 bp dolga obrnjena zaporedja, ki pa so razporejena asimetrično. Eksperiment je pokazal, da je originalna oblika najprimernejša tudi za transpozicijo v mišjih celicah.
Potrebno pa je bilo še poskrbeti za nadzor nad transpozicijo. Zato so na PB transpozon vstavili še gen za ERT2 in tako naredili fuzijski protein PB transpozaze in ERT2. ERT2 je modificirana domena receptorja za estrogen, ki veže ligand in omogoča regulacijo aktivnosti proteina z molekulo 4-hidroksitamoksifen (4-OHT).

==Viri==
*Woltjen, K. in sod. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, vol. 458, str. 766-770.
*Kaji, K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature, 2009, vol. 458, str. 771-775.
*Ivics, Z. in sod. Transposon-mediated Genome Manipulations in Vertebrates. Nat Methods, 2009, štev. 6, str. 415-422.
*Cadiñanos, J.; Bradley, A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nuclei Acids Research, 2007, vol.35(12), e87
*piggyBac [online] [citirano 24.5.2013 ob 17:40] Dostopno na spletnem naslovu: http://piggybac.bio.nd.edu /

Reprogramiranje celic

2013-03-20T15:54:38Z

SaraLorbek: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# Biokemijske značilnosti izvornih celic
# Epigenetsko reprogramiranje
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006)
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela, Zala, Ajda)
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Dejan Marjanovič, Suzana Semič)
# Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema
# Reprogramiranje s transpozicijo (Barbara Dušak, Sara Lorbek)
# Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# Tumorigenost iPSC (Urška Navodnik, Ana Remžgar)
# Reprogramiranje z miRNA (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Urška Rauter)
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.

BIO2 Povzetki seminarjev 2012

2012-12-21T20:26:12Z

SaraLorbek: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2012 stran]

===Griša Prinčič: Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice ===

S pomočjo EM je bilo mogoče podrobneje prepoznati in opisati tip III sekrecijski sistem in njegove komponente. Identificirali so vsaj pet različnih strukturnih komponent, njihovo proteinsko sestavo in delovanje.Več kot 20 različnih proteinov (YopD, YopB, YscF, YscP, YscR, YscS, YscT, YscU, YscV...) je potrebnih za učinkovito funkcioniranje T3SS-a, od katerih jih veliko kaže sekvenčno podobnost pri različnih vrstah. T3SS je sestavljen iz: igelnega dela , ki sestoji iz sekvenčno različnega proteina in tvori zvonasto ali filamentozno strukturo, zunajmembranskega kompleksa, znotrajmembranskega kompleksa in regulatornih komponent.

Efektorji, ki jih bakterija »dostavi« v celico modulirajo različne signalne poti. Blokirajo lahko MAPK in MAPKK (ospF, YopJ), kar zavre imunski odziv celice in prepreči vnetne procese. Pospešijo ali upočasnijo ubiquitinacijo (Cif in CHBP), za kar koristnost in učinkovitost še ni znana. Blokirajo majhne GTP-aze (IbpA), kar povzroči spremembe v aktinskem citoskeletu in moten membranski transport. Nekatere bakterije se v gostiteljski celisi razmnožujejo s pomočjo vakuol. SifA in SseJ sta bakterijska proteina, ki omogočata učinkovito tvorjenje tovrstnih struktur. Nekateri efektorji motijo tudi sintezo maščobnih kislin, nekateri poškodujejo pomembne celične strukture kot je na primer golgijev aparat. Vsi bakterijski efektorji delujejo na principu kovalentne modifikacije, torej trajno spremenijo strukturo in s tem inaktivirajo proteine – preprečijo kaskadno verigo.

===Erik Janežič: Hippo signalna pot in matične celice ===

Hippo signalna pot je ena glavnih regulatornih sistemov, ki preprečujejo tumorogenezo, nadzorujejo rast organov in sodelujejo pri diferneciaciji in vzdrževanju stalne gostote zarodnih celic. Hippo, drugače imenovana tudi Salvador/warts/hippo (SWH), je dobila takšno ime, ker mutacije v mehanizmu peljejo do preraščanja tkiva, kar lahko s tujko imenujemo »Hippopotamus «like phenotype. Prvič je bila opazovana v vinski mušici Drosophilia in večina ključnih raziskav je potekala prav na tem modelnem organizmu. Znanje pridobljeno z opazovanjem mehanizma mušic pa lahko direktno prenesemo tudi na lastnosti Hippo signalizacije sesalcev. Študije so namreč pokazale, da imajo vse ključne komponente pri mušici direktne ortologe v sesalcih in drugih organizmih. Smiselen se zdi sklep, da je bila Hippo signalna pot v veliki meri takšna kakor jo poznamo danes, prisotna že v prvih večceličnih organizmih,kar je tudi logično saj je pravilna diferenciacija in usmerjanje celic ključnega pomena za nastanke funkcionalnih celičnih enot (organov).
V preteklem desetletju s številne raziskave s Hippo področja zagotovile dobro poznavanje osrednje kinazne kaskade, katere funkcija je inaktivacija oziroma aktivacija YAP/TAZ transkripcijskih kofaktorjev proteinov družine TEA. Pri Hippo signalizaciji poleg osrednje kaskade sodelujejo tudi številni membranski in citoskeletni proteini, ki imajo veliko funkcij tudi pri kontaktni inhibiciji. Ogromno eksperimentalnih dokazov kaže neposredno povezanost nepravilnega delovanja Hippo signalizacije in nastankom raka, kar je verjetno razlog za intenzivne raziskave na tem področju v današnjem času.

===Dejan Marjanovič: Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov===

Vimentina, glavni predstavnik intermediarnih filamentov (IF) , je izražen v normalnih mezenhimskih celicah, in je znano, da ohrani celovitost celic in zagotavlja odpornost proti stresu. Povečano koncentracijo vimentina, so poročali v različnih rakavih epitelih, vključno raka prostate, tumorjev prebavil, tumorjev centralnega živčnega sistema, raka dojke, pljučnega raka in druge vrste raka. Prekomerno izražanje vimentina v raku je povezano tudi z večjo rastjo tumorja, vendar je vloga vimentina v napredovanju raka še vedno nejasna.
Na podlagi njegovega prekomernega izražanja v rakavih obolenjih in njegovo vlogo pri posredovanju v različnih tumorgenih dogodkih, vimentin služi kot privlačen cilj za zdravljenje raka. Poleg tega naj bi raziskave, usmerjene k pojasnjevanju vloge vimentina v različnih signalnih poteh, odpirale številne nove pristope za razvoj obetavnih zdravil za zdravljenje.

Ker pa je moje širše področje signalizacija,se bom bolj podrobno usmeril za signalizacijske poti, razjasnitev številnih mehanizmov in vmesnih sodelujočih proteinov, encimov itd. Vimentin je znan po tem, da interagira z velikim številom proteinov in sodeluje v različnih celičnih funkcijah. Poleg tega vimentin sodeluje tudi v številnih drugih procesih, ki vključujejo oblikovanje kompleksov z več signalnimi molekulami in drugimi proteini.

Iz te študije je razvidno, da vimentin ne deluje le kot ogrodni protein, temveč tudi posreduje pri večih poteh sporočanja in v celičnih procesih. Prav tako bi bilo zanimivo izvedeti, druge funkcije vimentina v jedru in morebitne vloge pri posredovanju v procesih celičnega cikla. Poleg tega bi lahko zunajcelični vimentin sodeloval pri posredovanje pri več signalnih procesih z vezavo na specifične receptorje, ki jih je treba še raziskati.

===Estera Merljak: Vpliv PKM2 na rakave celice===

Piruvat kinaza M2 (PKM2) ima zelo pomembno vlogo pri rakavih celicah. je ena izmed oblik piruvat kinaze, ki katalizira pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat, pri čemer se fosfatna skupina iz PEP prenese na ADP ter s tem dobimo ATP. PKM2 je v izražena v celicah, ki se hitro delijo, kot so zarodne in rakave celice. Izražanje omogoča veliko transkripcijskih faktrojev, posebno pomembni pa so transkripcijski faktorji iz družine heterogenih jedernih ribonukleoproteinov (hnRNPs), ki dajejo prednost sintezi PKM2 z neposrednim vplivanjem na mRNA.
Vpliv PKM2 na celičen metabolizem je zelo pomembna, saj lahko v celici prehaja med neaktivno dimerno obliko in aktivno tetramerno obliko, kar privede do različnih produktov. Aktivnost PKM2 je regulirana s strani mnogih snovi, med drugim intermediatov glikolize, ki lahko povečajo ali zmanjšajo aktivnost piruvat kinaze M2. Prav tako na aktivnost vplivajo razne post-translacijske spremembe aminokislin v samem proteinu, ki so rezultat kompleksnih reakcij v celici. S takimi procesi celica regulira sintezo energije in sintezo drugih prekurzorjev za množitev celic.
Poznavanje teh procesov ima velik medicinski pomen, saj lahko pripelje do oznajdbe specifičnih zdravil za zdravljenje raka, ki bi napadale in uničile le rakave celice, zdravih pa ne.

===Maja Kostanjevec: Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah===

Glukoza je pomemben vir energije, ki ureja marsikatero metabolno pot. Njena vloga se razlikuje od celice do celice glede na to, kakšne naloge opravlja. Posledično so se v evoluciji razvili različni mehanizmi njenega zaznavanja in prenosa signalov.

Preučevanje zaznavnih mehanizmov glukoze je zapleteno, saj ima poleg hranilne vloge tudi signalno, ki pa jo včasih težko ločimo od ostalih procesov, v katerih sodeluje. Trenutno so najbolj raziskani mehanizmi v kvasovkah, saj gre za najenostavnejše evkarionte. V njih so odkrili štiri različne signalne poti: glavno represivno pot, cAMP pot ter inducirani poti, ki sta odvisni od senzorjev Snf3 in Rgt2 oz. od fosforilacije.

Veliko bolj zahtevna je regulacija glukoze v rastlinah. V njih skrbi za izražanje različnih genov, ki urejajo procese fotosinteze, metabolizma, rasti… V modelni rastlini Arabidopisis thaliana so bili raziskani trije različni mehanizmi zaznavanja. Prvi je odvisen od heksokinaze in represira fotosintetske gene, drugi je od heksokinaze neodvisen in vsebuje še neznan receptor ter tretji, ki temelji na procesu glikolize in njenih vmesnih produktov.

Zaznavanje glukoze pri sesalcih ima posebne lastnosti, ki se razlikujejo tako od tistih v kvasovkah kot v rastlinah. Ti mehanizmi so najbolje preučeni v beta celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke, ki skrbijo za izločanje inzulina. Znano je, da je pri tem potreben obsežen metabolizem glukoze, kot glavni mediator pa nastopa ATP.

===Julija Mazej: Metabolizem glukoze v živčnih celicah===

Glukoza je preferenčno gorivo za možganske celice. Čeprav možgani predstavljajo le 2% celotne telesne mase, za svoje delovanje porabijo kar 25% zaužite glukoze. Možganske celice lahko kot energijski substrat uporabijo tudi: laktat, piruvat, glutamin in glutamat. Kakršnakoli ovira pri energijski oskrbi, je zelo rizična in se lahko konča z nezavestjo ali celo komo v manj kot 10 sekundah. V izogib takšnemu izidu so nekatere celice sposobne nadomestiti primanjkljaj energije oz. ATP z intenzivnejšo glikolizo. To velja za nevroglijalne celice, ki z glikolizo proizvajajo laktat. Vendar pa povišana glikoliza nima enakega vpliva na vse živčne celice. Nevroni zaradi povišane glikolize manj glukoze oksidirajo po pentoza-fosfatni poti, ki tam sicer poteka v normalnih razmerah. Ta metabolična pot je za nevrone zelo pomembna, ker se pri pretvorbi glukoza-6-fosfata v ribozo-5-fosfat regenerira NADPH. To je pomemben antioksidant, ki regenerira reduciran glutation in tako varuje nevrone pred poškodbami, zaradi reaktivnih kisikovih spojin. Glikolizo v nevro celicah stimulirajo hipoksični pogoji, nevrotoksične snovi, mutacije v respiratorni verigi.. Anomalije v metabolizmu glukoze so prisotne v mnogih nevrodegenerativnih boleznih, npr. Alzheimerjevi, Parkinsonovi, Huntingtonovi bolezni. Tu se kaže aplikativen pomen raziskav povezanih z metabolizmom glukoze v možganih. Velik problem pri razumevanju metabolizma v živčnih celicah predstavljajo nepojasnjene interakcije med glija celicami in nevroni .

===Jernej Pušnik: Uravnavanje metabolizma z acetilacijo proteinov===

V svoji seminarski nalogi bom predstavil pomen posttranslacijske modifikacije-acetilacije pri uravnavanju celotnega celičnega metabolizma. Kot že verjetno vsi veste, je večina reakcij, ki so del neke metabolne poti, kataliziranih z encimi. Ti pa so v osnovi proteinske makromolekule, sestavljene iz dvajsetih različnih aminokislin. Ena izmed teh aminokislin je lizin in vsebuje dve amino skupini. S prvo se povezuje v peptidno vez, druga, ki se nahaja na koncu ogljikovodikove verige pa je tarča acetilacije. Ko se acetilna skupina enkrat veže na lizinski ostanek, to povzroči določene spremembe v strukturi proteinske molekule, s tem pa se tudi spremeni encimska aktivnost. Na ta način so regulirani skoraj vsi encimi metabolizma. V seminarju sem opisal kako pride do same acetilacije in deacetilacije, da je pri tem potrebna prisotnost določenih encimov, kako se spremeni delovanje encimov delujočih v glikolizi, glukoneogenezi, citratnem ciklu, oksidaciji maščobnih kislin, oksidaciji aminokislin in ciklu sečnine. Ker je acetilacija tako razširjena modifikacija pri nadzorovanju metabolizma, imajo raziskave na tem področju velik potencial za odkritje novih terapevtskih pristopov k zdravljenju bolezni srca in ožilja, diabetesa, debelosti, itd.

===Rok Razpotnik: Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija===

V dani seminarski nalogi bom predstavil osnovne lastnosti rakavih celic, tipe celic, ki se nahajajo v tumorskem mikrookolju, ter podrobneje predstavil nekatere osnovne lastnosti metabolizma rakastih celic ter njene regulacije. Mutacije onkogenov in tumor supresorskih genov povzročijo spremembe v signalizacijskih poteh, katere povzročijo spremembe metabolizma rakastega tkiva. Metabolizem deluje v prid celični rasti, intenzivni celični delitvi, zaviranju apoptoze itd. Sam metabolizem rakastih celicah temelji na treh osnovnih temeljih: povečani produkciji energije, zadostni biosintezi potrebnih makromolekul in vzdrževanju redoks stanja. Da izpolnjujejo vse tri pogoje se rakaste celice poslužujejo mnogih regulacij metabolizma, z različnimi strateškimi potmi, npr. proteoliza skeletnih mišic, lipoliza maščobnega tkiva, intratumorna simbioza med laktat-proizvajajočimi in laktat-porabnimi celicami, upočasnevanje glikolize in usmerjanje intermediatov v pentoza fosfatno pot itd. Ker pa je mikrookolje, ki obkroža rakasto tkivo zelo dinamično, je za rakaste celice značilna metabolična fleksibilnost. Raziskave in razumevanje metabolične fleksibilnosti bi doprinesle k novim možnim strategijam zdravljenja. Učinek na reguliran metabolizem rakastega tkiva, bi imel ogromen vpliv na viabilnost rakastega tkiva, saj je metabolizem sklopljen s številnimi lastnostmi rakastih celic.

===Ajda Rojc: Metabolizem skeletnih mišic===

Mišice so največji porabnik energije v telesu, saj nam omogočajo vrsto različnih dejavnosti pri katerih se porablja energija. V našem telesu potekata dva različna sistema metabolizma – anaerobni in aerobni. Pri anaerobnem metabolizmu imata pomembno vlogo kreatin fosfat in glikogen. Zaloge ATP je v mišicah zelo malo, zato takoj nastopi cepitev visokoenergetskih vezi v kreatin fosfatu. Po porabi te energije se v glikolizi razgradi glikogen, ki se pri pomanjkanju kisika v mišicah namesto v piruvat, pretvori v laktat in to povzroča bolečine v mišicah. Druga vrsta metabolizma pa deluje kadar je kisika dovolj in to je aerobni metabolizem. Poleg glukoze se pri tej vrsti presnove razgrajujejo tudi maščobne kisline, ki se v β-oksidaciji reducirajo do vodika in acetil-CoA, ta pa vstopi v Krebsov cikel, kjer se proizvede energija ATP. Večja razpoložljivost maščobnih kislin vpliva na nalaganje znotrajmišičnega prostega Pi in AMP med vadbo. Pi in AMP sta odgovorna za regulacijo encima glikogen fosforilaze, ki cepi glikogen. Torej, če se njune koncentracije znižajo pride do manjšega števila cepitev glikogena na glukozo. Pri znatnem povišanju dostopnosti maščobnih kislin je glikogen fosforilaza inhibirana. To je le eden od načinov regulacije substratov v mišičnem metabolizmu. Domnevajo, da je oksidacija maščob regulirana s podobnimi faktorji (npr. adrenalin, Ca2+, ADP, AMP, Pi; AMPK, pH, acetil-CoA) kot razgradnja ogljikovih hidratov, vendar je glede tega, kako te faktorji vplivajo na regulacijo maščobnih kislin in oksidacijo maščob ter kaj je njihova vloga še veliko nejasnosti.

===Janez Meden: NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo===

Celično dihanje je sestavljeno iz glikolize, citratnega ciklusa in verige za prenos elektronov. Večina energije nastane, v obliki ATP pri zadnji stopnji celičnega dihanja, torej pri prenosu elektronov skozi komplekse I, II, III, IV in nastanku ATP-ja v kompleksu V – ATP-sintazi. Zadnja stopnja pa je mogoča le v prisotnosti O2.
Pa vendar življenje obstaja tudi v hipoksičnem okolju. Posebna oblika energijskega metabolizma, ki je značilno za nekatere bakterije, notranje zajedavce in školjke ter celo rakave celice je fumaratsko dihanje. Ta način metabolizma omogoča nekoliko boljši izkoristek energije. Pri njem sodelujeta le dva kompleksa I in II. Kompleks II je povezan s citratnim ciklusom – TCA in verigo za prenos elektronov. Prenašalec med kompleksoma je kvinon z nizkim redoks potencialom, kot je npr. rodokvinon pri A. suum, ali pa menakvinon, znan kot vitamin K.
Z razumevanjem mehanizma fumaratskega dihanja bi lahko razvili zdravila, ki bi inhibirala ali celo onemogočila delovanje tega mehanizma. Primerna tarča novih zdravil bi lahko bila Fp podenota kompleksa II ali pa bi zdravilo lahko delovalo tudi kot kompetitivni inhibitor kvinona.

===Ana Kunšek: Večfunkcionalnost akonitaze===

Akonitaza je protein, ki katalizira drugo stopnjo Krebsovega cikla, torej pretvorbo citrata v izocitrat. Vendar je tudi eden izmed "moonlighting" proteinov, torej proteinov, ki imajo poleg glavne tudi druge funkcije. Prav zato, ker ima toliko funkcij je njena vloga v celici še toliko bolj pomembna, nepravilno delovanje pa lahko pripelje tudi do pojava diabetesa in miopatije.

Akonitaza poleg kataliziranja omenjene pretvorbe citrata v izocitrat pomaga tudi pri uravnavanju koncentracije železa v celici, stabilizaciji oz. destabilizaciji mitohondrijske DNA ter pri odgovoru na oksidativni stres. Pri uravnavanju koncentracije železa se veže na mRNA in s tem zaustavi sintezo feritina (proteina, ki veže železo) ter s tem pomaga pri uravnavanju homeostaze. Mitohondrijsko DNA destabilizira, kar ji pomaga za lažje podvojevanje, pri oksidativnem stresu pa je ključni faktor pri uravnavanju pravilnega pH-ja v celici, brez katerega encimi ne morejo pravilni delovati.

Že samo s temi funkcijami smo ugotovili, da je akonitaza zelo pomembna v našem življenju, vendar verjetno še vedno ne poznamo vseh njenih funkcij, saj je odkrivanje "moonlighting" proteinov in njihovih ostalih funkcij zelo težko in zahteva veliko eksperimentalnega dela. Vendar bi lahko z vedenjem vseh funkcij proteinov iznašli tudi takšna zdravila, ki stranskih učinkov ne bi imela, saj bi zablokirala ali pospešila sintezo le tistega proteina, za katerega je to potrebno in ne bi s tem vplivala tudi na ostale funkcije proteina v organizmu.

===Tomaž Rozmarič: Warburg in Crabtree efekt===

Znanstveniki so ugotovili, da rakave celice, kljub prisotnosti kisika, ne izvajajo aerobnih procesov. Namesto tega so se usmerile v glikolizo. Temu se reče Warburg efekt. Kaj so rakave celice s tem pridobile, še ni čisto raziskano. Obstajajo pa hipoteze, da so zaradi tega veliko bolj invazivne, se sposobne deliti pri nizkih koncentracijah kisika in se izogniti apoptozi. Warburgov efekt je reguliran na večih stopnjah metabolne poti, s prekomerno izraženimi in prekomerno aktivnimi encimi, ki vzpodbujajo glikolizo ter inhibicijo proteinov, ki spodbujajo aerobni metabolizem.
Zraven Warburgovega efekta poznamo še Crabtree efekt. Ta mehanizem rakavi celici omogoča preklop na aerobni metabolizem pri pomanjkanju glukoze in obratno pri velikih koncentracijah. Brez poznavanja obeh mehanizmov in prekinitvi obeh hkrati je uspešnost zdravljenja raka zelo majhna.
Znanstveniki so našli vrsto kvasovke, ki ima skoraj identični metabolizem, kot ga ima rakava in je Crabtree pozitivna. Pri nizkih koncentracijah glukoze izvaja anaerobni metabolizem, v prisotnosti visoke koncentracije pa aerobni. Zaradi navedenih lastnosti je idealna za študijo rakavih celic.
Ko bodo znanstveniki natančno proučili Warburg in Crabtree efekt, se bodo lahko razvila tarčna zdravila, katera bi bistveno izboljšala kakovost našega življenja.

===Erik Mršnik: Adrenolevkodistrofija===

X-vezana adrenolevkodistrofija je precej redka bolezen, ki pa ima zelo hude posledice. Te v večini primerov vodijo v zgodnjo smrt. Z razumevanjem biokemijskega in genetskega ozadja te bolezni so v zadnjih letih naredili velik korak naprej v odkrivanju in preprečevanju te bolezni.
V osnovi gre za napako (mutacije so v večini primerov dedne - 90 %) na genu ABCD1, kar se odraža na ALDP (adrenolevkodistrofični protein), ki je peroksisomalni transportni protein. Če ne deluje, je otežena oziroma onemogočena β-oksidacija VLCFAs (dolgih maščobnih kislin), ki se nabirajo v tkivih in povzročajo velike težave v delovanju možganov in živčevja ter nadledvične žleze. Bolezen se odraža v različnih fenotipih, ki prizadenejo predvsem moške (otroke in moške srednjih let), ženske so navadno le prenašalke, lahko pa se tudi pri njih izrazijo blažji simptomi. Če se bolezen odkrije že v zgodnji fazi, je možnost pomoči večja. Predvsem uspešna je presaditev krvotvronih matičnih celic. Velikokrat pregledajo že dojenčke (t.i. newborn screening), za katere vejo (zaradi dednosti), da so podvrženi tej bolezni, kar bistveno pripomore k pravilnemu pristopu pri izbiri terapije.

===Katja Leben: Tia-maščobne kisline===

Tia-maščobne kisline so umetno sintetizirane nasičene maščobne kisline, ki se od ostalih razlikujejo po vsebnosti heterogenega žveplovega atoma. Zaradi posebnega metabolizma – žveplov atom preprečuje za maščobe običajno β-oksidacijo – in zadostnih podobnosti z naravnimi maščobnimi kislinami so nekatere tia-maščobne kisline široko farmakološko uporabne, saj imajo veliko različnih aplikativnih vplivov na bio sisteme.

Katabolizem tia-maščobnih kislin do β-oksidacije poteka običajno, ko pa se žveplov atom približa aktivnemu mestu se proces ustavi. Pri 4-tiamaščobnih kislinah pride do inhibicije drugega encima v obratu β-oksidacije, kar negativno vpliva na metabolizem maščobnih kislin, med tem, ko 3-tia-maščobne kisline sploh ne morejo vstopiti v β-oksidacijo in se razgradijo po ω-oksidativni poti. Vse sode nasičene tia-maščobne kisline se po nekaj obratih β pretvorijo v 4-tia-maščobne kisline, zato tudi reagirajo enako, vse lihe nasičene tia-maščobne kisline pa se z β-oksidacijo lahko pretvorijo v 3-tia-maščobne kisline in nato reagirajo enako.
Zaradi posebnega metabolizma so tia-maščobne kisline uporabili tudi za proučevanje delovanja in regulacijie različnih celičnih procesov povezanih z metabolizmom lipidov. Njihov vpliv je močno odvisen od lege žveplovega atoma v ogljikovem skeletu. Tako 4-tia-maščobne kisline zavirajo oksidacijo maščobnih kislin, 3-tia-maščobne kisline pa jo pospešujejo, kar je zaželjeno pri regulaciji bolezenskih stanj, ko je v celici povečana količina maščobnih kislin.

Biološki odzivi na tia-maščobne kisline obsegajo vpliv na transkripcijski faktor PPARα (peroksisom proliferator aktiviran receptor), mitohondrijsko proliferacijo, antiadipoznost, antioksidativne lastnosti, zmanjšanje proliferacije hitro delečih se celic in celično diferenciacijo. Zadnje raziskave kažejo, da tia-maščobne kisline niso škodljive za naš organizem tudi ob dolgotrajnem uživanju in bi se torej lahko uporabljale kot zdravila.

===Ana Cirnski: Peroksisomalna razgradnja maščobnih kislin===

Maščobne kisline se razgrajujejo do enostavnejših snovi v procesu, imenovanem β-oksidacija. Ta poteka v mitohondriju, pa tudi v peroksisomu. Peroksisomalna in mitohondrijska β-oksidacija se poleg kraja, kjer poteka razgradnja, razlikujeta še v encimih, ki reakcije katalizirajo in v substratih, ki se oksidirajo.

Rastline razgrajujejo tudi take maščobne kisline, ki jih živali in ljudje ne moremo. Za razliko od nas, lahko maščobne kisline popolnoma razgradijo (saj so peroksisomi edino mesto razgradnje), mi pa v peroksisomih razgrajujemo le zelo dolge maščobne kisline do ustreznih intermediatov, ki se dokončno razgradijo v mitohondriju.

Oksidacija nenasičenih maščobnih kislin v višje razvitih rastlinah je pomembna za proizvodnjo mnogih spojin, med njimi so bioaktivne molekule, imenovane oksilipini. Mednje spadajo tudi jasmonska kislina in njeni derivati, ki so pomembne signalne molekule in sodelujejo pri obrambi, komunikaciji, signalizaciji in odgovoru na različne biotske in abiotske stresorje. Povzročajo tudi staranje rastline in odpadanje listov.

Jasmonska kislina se sintetizira v oktadekanojski poti iz α-linolenske kisline (18:3). Pretvorba se začne v kloroplastu, kjer se pretvori v 12-okso-fitodienojsko kislino (OPDA). Ta potuje v peroksisom, kjer nastane oksofitoenojska kislina (OPC:8), ki vstopi v β-oksidacijo in se oksidira v jasmonsko kislino.

Danes se jasmonska kislina in njeni derivati že uporabljajo v aplikativni znanosti.

===Zala Gluhić : Hiperamoniemija===

Hiperamoniemija je povišana koncentracija v krvi raztopljenega amoniaka. Lahko je posledica motene presnove v ciklu sečnine (na primer zaradi nepravilnega delovanja katerega izmed encimov) – ali pa gre za pridobljeno motnjo zaradi jetrnih bolezni (npr. jetrna odpoved).
Amoniak je še posebno škodljiv za možgane. V krvi raztopljen amoniak prestopa možgansko-žilno pregrado in kadar je njegova koncentracija previsoka, lahko pride do nepopravljive škode pri razvoju centralnega živčnega sistema ali do možganskega edema. Ker v možganih ni vseh za cikel sečnine potrebnih encimov, imajo glavo nalogo pri odstranjevanju odvečnega amoniaka astrociti, vrsta nevroglijskih celic. Koncentracije uravnavajo s pomočjo sinteze glutamina. V primeru hiperamoniemije pride v njih do številnih morfoloških sprememb in sprememb v izražanju različnih proteinov (npr. spremembe v aktivnosti prenašalcev EAAT1 in 2, izražanju GFAP proteinov itd.). Prekomerno sintezo glutamina je mogoče uravnavati z MSO (metionin sulfoksimidom).

===Bojana Lazović : Novi farmakološki šaperoni za zdravljenje fenilketonurije===

Fenilketonurija (PKU) je redka avtosomno recesivna genska bolezen do katere pride, če je okvarjen jetrni encim fenilalanin-4-hidroksilaza (PAH), ki je odgovoren za pretvorbo fenilalanina v tirozin. Ker tako ne more prihajati do razgradnje fenilalanina, se le ta akumulira v telesu in spremeni v fenilpiruvat. To ima toksičen učinek na telo, posebej možgane, saj se pri teh bolnikih lahko razvije težka umska zaostalost. Bolniki se lahko temu izognejo tako, da se že od rojstva držijo stroge diete, po kateri se lahko prehranjujejo le z nebeljakovinsko hrano (sadje in zelenjava). Ostale esencialne aminokisline dobijo v obliki praška, ki vsebuje vse AK razen fenilalanina. Toda raziskave kažejo, da taka dieta pogosto vodi v podhranjenost in psihološke težave bolnikov. Pred nekaj leti je na tržišče prišlo zdravilo Kuvan oz. sintetični naravni kofaktor encima PAH, katerega pomanjkanje je lahko razlog bolezni. Njegova draga sinteza in pri določenih genotipih PKU, slaba učinkovitost, pa je znanstvenike spodbudila k iskanju novih sintetičnih kofaktorjev encima PAH, ki hkrati delujejo kot farmakološki šaperoni. V raziskavi, ki jo opisujem so odkrili dva nova farmakološka šaperona primerna za zdravljenje PKU.

===Matic Kovačič : Sirtuin 3 ob dieti spodbuja cikel sečnine in oksidacijo maščobnih kislin ===
Pri dieti ali stradanju pridobimo s hrano veliko manj ali nič energije, zato mora telo dobiti iz svojih zalo, kar naredi z metabolizmom aminokislin in maščobnih kislin. Pri oksidaciji aminokislin dobimo amoniak, ki se mora zaradi svoje toksičnosti v ciklu sečnine pretvoriti v sečnino. V seminarski nalogi bom predstavil vpliv proteina Sirtuin 3 (Sirt3) na povečano delovanje cikla sečnine in metabolizma maščobnih kislin. Sirt3 je encim deacetilaza, ki se nahaja v mitohondriju in s svojim delovanjem vpliva na veliko mitohondrijskih encimov. Mutacije ali odsotnost tega proteina ima za organizem smrtne posledice, zaradi nepravilnega delovanja cikla sečnine in tudi drugih procesov. Povedal bom še nekaj o napaki cikla sečnine, ki jo povzroči pomanjkanje encima ornitin transkarbamoilaze in kakšne posledice ima lahko to na organizem.

===Špela Tomaž: Inhibicija fotosinteze===
Čeprav je svetloba bistvena za reakcije fotosinteze, ima nanje tudi uničujoče učinke. Predvsem sta inhibiciji fotosinteze izpostavljena fotosistema II in I, pri katerih lahko intenzivne osvetlitve povzročijo strukturne in funkcijske okvare. Ena izmed aktualnih hipotez o mehanizmu fotoinhibicije fotosistema II (PSII) predvideva dvostopenjski sistem. V prvem koraku je udeležen kompleks, ki v fotosintezi cepi vodo (OEC) – z absorpcijo svetlobe nizkih valovnih dolžin pride do njegovih poškodb, ki omogočijo drugi korak inhibicije. V tem delu se inhibira reakcijski center fotosistema, na kar vpliva svetloba daljših valovnih dolžin. Posledično se tvorijo škodljive reaktivne kisikove spojine (ROS). Proces svetlobnega delovanja sproži popravljalne mehanizme poškodovanih struktur. Fotoinhibicija PSII je pogosta, saj so fototrofi čez dan razmeroma konstantno osvetljeni. Popravljalni cikel PSII je tako pogosto aktiviran in skrbi za to, da ne pride do ustavitve fotosinteze. ROS zavirajo obnovitev aparatov in so na nek način glavni krivci okvar zaradi fotoinhibicije. Sodelujejo tudi v inhibiciji fotosistema I (PSI), ki pa je dosti redkejša in je pogojena s posebnimi razmerami. Njegova regeneracija ni najbolj učinkovita, zato je njegova okvara toliko bolj usodna. Seveda pa so fototrofi razvili mnoge mehanizme različnih oblik, ki fotosisteme ščitijo. Fotoinhibicija je regulirana tudi z mnogimi zunanjimi in notranjimi vplivi na organizem.

===Monika Biasizzo: Mitohondrijski razklopni proteini===
Oksidativna fosforilacija je sklopljen proces prenosa protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano (ob prenosu elektronov po dihalni verigi) in sintezo ATP. Mitohondrijski razklopni protein pa ta proces razklopijo s prenosom protonov nazaj v mitohondrijski matriks in s tem znižajo protonski gradient. Poznamo več različnih razklopnih proteinov (UCP), ki so si med seboj bolj ali manj podobni. Prvi odkriti je bil UCP1 – termogenin, ki ima pomembno vlogo v termogenezi in s tem pri vzdrževanju stalne telesne temperature pri sesalcih. UCP2 in UCP3 sta 60-70% homologna UCP1, vendar v celici ne opravljata funkcije termogeneze.

Mehanizem prenosa protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano s pomočjo UCP še ni pojasnjen, vendar obstajajo trije predlagani modeli: flip-flop model, model s kofaktorjem in kompetetivni model.

UCP2 ima pomembno vlogo pri zmanjševanju nastanka reaktivnih kisikovih spojin (ROS). Nastanek ROS je eksponentno odvisen od protonskega gradienta. UCP2 z blago razklopitvijo nekoliko zmanjša protonski gradient, tako da sinteza ATP še vedno nemoteno poteka in s tem tudi zmanjša nastanek ROS. UCP3 je pristonem predvsem v skeletnih mišicah, kjer ima prav tako kot UCP2 pomembno vlogo pri zmanjševanju nastanka ROS, še posebej med športno aktivnostjo.

Regulacija UCP poteka na več različnih nivojih. Aktivnost UCP je regulirana z manjšimi molekulami, kot no di- in trinukleotidi (npr. GDP), ki inhibirajo UCP in maščobnimi kislinami, ki UCP aktivirajo. Regulacija pa poteka tudi na nivoju razgradnje, za katero predvidevajo, da poteka s citosolnim proteosomom, vendar mehanizem še ni pojasnjen.

===Nastja Pirman: Mitohondrij, center celične apoptoze===
Mitohondrij je organel vrvohodec, ki izvaja tako življenske kot smrtne funkcije. Njegova najpomembnejša lastnost je membranska prepustnost, ki odloča, ali se bodo procesi pričeli izvajati v korist ali škodo celice. Na mitohondrijevo odločitev vplivajo inter- in intracelularni faktorji in kot njihova podmnožica tudi stresi.
Ko stres preseže mejo, se sproži eden od treh tipov programirane smrti: apoptoza, avtofagija (ki ne vodi nujno do smrti) in nekroza. Osredotočimo se na človeško apoptozo, kjer družina Bcl-2 proteinov z značilnim BH zaporedjem prejema z apoptozo povezane signale. Deli se na antiapoptotske in proapoptoske proteine, ki z medsebojno kombinacijo in z multimerizacijo posredujejo sporočilo mitohondrijskim ionskim kanalom.
Če signal narekuje apoptozo, se bosta z apoptozo povezana kanala MAC in mPTP široko odprla, spustila Cyt c v citosol in depolarizirala membrano. Koncentracija kalcija sodeluje s procesom. V tem kjučnem koraku se porušita membranski potencial in metabolizem.
Kaspaze-9 v kompleksu z Apaf1 in izpuščenim Cyt c (apoptosom) tačas v citosolu začnejo s kaskadno proteolitsko aktivacijo citosolnih proteinov.
Apoptotski mehanizem ni popoln. Napake povzročijo raka ali bolezenska stanja, ki jih ne bomo mogli zavreti z učinkovinami, dokler ne poznamo vseh povezav med deli mehanizma.

===Barbara Dušak: Sinteza bakterijske celične stene ===
Bakterijske celična stena je sestavljene iz peptidoglkianskih verig, ki se med seboj povezujejo s kratkimi peptidi. Peptidoglikan je veriga N-acetilglukozamina in N-acetilmuramične kisline, povezanih z β(1,4)-glikozidno vezjo, N-acetilmuraminska kislina pa ima vezan še peptid.

Sinteza stene je kompleksen proces, ki poteka v treh delih. Najprej se v citosolu sintetizirajo osnovne komponente stene, reakcije katalizirajoi encimi družine Mur. Nato pride do vezave komponent na undekaprenil fosfat in transporta preko membrane, na koncu pa še do sinteze peptidoglikana in vgradnje v že obstoječo celično stene. Verige nastajajo v procesu transglikozilacije, peptidne povezave pa v procesu transpeptidacije. Ta dva procesa katalizirajo encimi družine PBP (penicillin binding proteins), ki se delijo v več razredov glede na katiltično aktivnost in velikost.
Za vgradnjo nove verige v celično steno, se morajo nekatere vezi tudi razcepiti, za kar so potrebne še dodatne hidrolaze, rast celične stene pa poleg vseh teh encimov uravnava tudi citoskelet, ki določa obliko celice. Obstaja tudi več teorij, kako naj bi vgradnja potekala, temlejiijo pa na tem, da se trdnost stene med samim procesom ne sme zmanjšati.

===Matej Vrhovnik: Biosinteza škroba, saharoza kot substrat za sintezo zelo razvejanih komponent škroba ===
Škrob je rastlinski rezervni polisaharid, za živa bitja pa eden izmed glavnih virov ogljikovih hidratov v hrani, hkrati pa je zelo lahko razgradljiv. Nahaja se v kloroplastih, kjer se skladišči le za kratek čas, da poteši energijske potrebe rastline, ko fotosinteza ne poteka, ali v amiloplastih za daljše obdobje. Zgrajen je iz glukoz, ki se povezujejo z α(1-4)glikozidno vezjov amilozo in iz amilopketina α(1-6) vezi med razvejitvami. Nastane iz odvečnih energijsko bogatih molekul, ki se ustvarijo pri fotosintezi. Na ta način rastlina shrani energijo oziroma energijsko bogate molekule za prihodnje generacije. Škrob sintetizira škrobosintaza, ki lahko nalaga glukoze na nereducirajoči konec verige, lahko pa tudi na reducirajoči, polisahardi pa nastaja tako, da se na dekstrin, oziroma verigo glukoz pripenjajo nove ADP-glukoze. Sinteza je uravnavana z ADP-glukoza pirofosforilazo. Od vsake vrste rastlin posebi je odvisno kakšen škrob nastaja v njej, zelo se razlikujejo v razmerju amiloza:amilopektin, % razvejanosti in dolžini stranskih verig. V raziskavi so odkrili, da je vir glukoze za škrob lahko tudi saharoza. Ta kot substrat vpliva na obliko molekul škroba: molekule amilopektina so veliko bolj razvejane, pri razpadu škroba ob prisotnosti encima α-amilaze pa ostajajo zelo dolgi skupki α-omejeni dekstrini, ki se ne morejo razgraditi.
Molekule škroba se ob prisotnosti pravih encimov in proteinov začnejo zvijat v dvojne helikse, ti pa so sestavljeni skupaj v urejene enote, ki sestavljajo škrobno zrno.

===Jakob Gašper Lavrenčič: Sinteza rastlinske celične stene===
Rastlinaska celična stena je najpogostejši biomaterial na svetu, gradijo jo predvsem polisaharidi, izmed katerih prevladuje predvsem celuloza. Sinteza strukturnih polisaharidov poteka z vezavo sladkornih enot na nastajajočo verigo z α(1-4) glikozidno vezjo, s pomočjo večjih encimskih kompleksov. V zadnjih letih je prišlo do večjih prebojev v razumevanju delovanja teh encimov in načina odlaganja nastajajočih polisaharidov na celično plazmalemo.
Celuloza je linearni polisaharid, ki predstavlja osnovno ogrodje rastlinskih celičnih sten. Celulozne verige so med seboj povezane z hemicelulozo in pektinom, kar povečuje trdnost in odpornost celične stene. Celulozne verige se med seboj povezujejo v mikrofibrile, s tem povečajo svojo trdnost. Sinteza celuloze poteka z pomočjo membranskega encimskega kompleksa znanega kot rozetni terminalni kompleks (RTC), ki se nahaja na celični plazmalemi. Čeprav je bil odkrit v 70-ih letih prejšnjega stoletja so do večjih prebojev v razumevanju njegove strukture in delovanja prišli komaj v zadnjem desetletju. Kljub temu ostajaj še veliko neznanega o poteku sinteze celuloze in njenemu vgrajevanju v celično steno.
Za razliko od celuloze so pektini in hemiceluloze zelo razvejane molekule, katerih sinteza poteka v Golgijevem aparatu. Njihova naloga je, da zamrežijo celulozne mikrofibrile med seboj in z drugimi komponentami celične stene, kot so lignini. Njihova sinteza še ni povsem znana, zato je predmet različnih raziskav.

===Mirjana Malnar: Vloga PPAR in leptina v metabolizmu lipidov===
Metabolizem lipidov je lahko reguliran na ravni izražanja genov. Pri tem so pomembni receptorji, aktivirani s proliferatorjem peroksisomov (PPAR). To so od liganda odvisni transkripcijski faktorji, ki glede na vnos hrane/energije regulirajo izražanje genov, ki kodirajo encime odgovorne za metabolizem vnesenih energetskih molekul. Primeri so PPARα, ki stimulira katabolizem lipidov in PPAR, ki stimulira sintezo lipidov ter adipogenezo. Glede na količino nastalega maščobnega tkiva, to izloča hormone, torej deluje kot endokrini organ. Ti hormoni se imenujejo adipokini. Primer je leptin, ki vpliva na center za apetit v hipotalamusu. S tem regulira vnos hrane v organizem. Pomemben je tudi pri preprečevanju debelosti, ker zmanjša učinkovitost signala inzulina na maščobno tkivo in na ta način prepreči lipogenezo po obroku. Leptin posredno pospeši oksidacijo maščobnih kislin in nastanek ketonskih telesc, zavre pa lipogenezo, sintezo TG in holesterola. Poleg tega leptin stimulira delovanje PPARα in PPAR, ti pa povečajo sintezo vezavnih proteinov maščobnih kislin (FABP). Ti proteini prenašajo maščobne kisline do raznih organelov, odvisno od namena – v mitohondrije, kjer se oksidirajo, do ER, kjer poteka reesterifikacija, do lipidnih kapljic, ki služijo shranjevanju.
Če pride do okvare v mehanizmu delovanja PPAR ali leptina so lahko posledice različne bolezni. Primeri takih bolezni so metabolni sindrom, dislipidemija, inzulinska rezistenca, debelost, diabetes. PPAR so vse bolj aktualne tarče za zdravljenje teh bolezni.

===Samo Zakotnik:Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin in njihova vloga===
V svojem seminarju bom govoril o sintezi n vlogi PUFA - polyunsaturated fatty acid. Gre za biološko zelo pomembno skupino maščobnih kislin. PUFA so ključne za pravilno delovanje celičnih membran, so pomembni prekurzorji za signalne molekule, kot so fosfotidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2), jasmonska kislina in steroidni hormoni. Za človeka sta α-linolenska kislina in linolna kislina esencialni kislini, saj ju ne more sintetizirati sam. Glavni vir PUFA so morski sadeži, ki pa zaradi onesnaževanja in prekomernega izlova izginjajo. Posledično številne raziskovalne skupine iščejo alternativni vir sinteze PUFA. Kot primeren kandidat so se izkazale kvasovke Saccharomyces cerevisiae, na primeru katerih bom predstavil verigo za sintezo PUFA. Na modelu rastline Arabidopsis thaliana pa bom prikazal vlogo PUFA v rastlini in posledice, kaj se zgodi, če prekinemo sintezo PUFA na različnih točkah. PUFA pa so pomembne tudi za embrionalni razvoj in za razvoj centralnega živčevja, zato jih dodajajo prehrani namenjeni dojenčkom (mleko v prahu).

===Ellen Malovrh: Hem, železo in staranje===
Hem je kompleksna organska molekula, sestavljena iz protoporfirinskega obroča (heterocikličen sistem iz 4 pirolovih obročev) in koordinacijsko vezanega železovega iona. Biosinteza hema poteka v mitohondrijih in citosolu celic, v osmih encimsko kataliziranih reakcijah. Zadnjo reakcijo katalizira metaloencim ferokelataza, ki v protoporfirinski obroč vgradi Fe2+ ion.

Kot proteinska prostetična skupina hem sodeluje pri številnih procesih, npr. pri prenašanju kisika in CO2, redoks reakcijah v elektronski prenašalni verigi in regulaciji celičnega metabolizma. Novo področje raziskav pa nakazuje, da je pomanjkanje hema tesno povezano tudi s procesom staranja in nevrodegenerativnimi boleznimi. Inhibicija sinteze hema v celicah povzroči zmanjšano prisotnost kompleksa IV v elektronski prenašalni verigi in posledično motnje v delovanju mitohondrijev, oksidativen stres, motnje v homeostazi železa in propadanje celic. Vse to so tudi karakteristične lastnosti staranja in Alzheimerjeve bolezni. Prihodnje raziskave na tem področju, ki bi utemeljile potek reakcij in metabolnih poti, v katerih sodelujeta hem in železo, bi morda lahko omogočile razvoj novih načinov zdravljenja pomanjkanja železa in starostnih bolezni.

===Suzana Semič: Lesch-Nyhanov sindrom===
Lesch-Nyhanov sindrom ali s kratico LNS je redka dedna motnja presnove purina, ki se deduje X-vezano recesivno in se pojavlja pri enem od 380.000 osebkov moškega spola. Bolezen sta prvič prepoznala in klinično dokazala študent medicine Michael Lesch in mentor, pediater Bill Nyhan. Svoje ugotovitve sta objavila v letu 1964.
Bolezen se pojavi zaradi napake v presnovi purinskih baz v reciklažni poti, povzroča pa jo pomanjkanje encima hipoksantin-gvanin-fosforibozil (GPRT). Zaradi pomanjkanja tega encima se purinski bazi gvanin in hipoksantin pretvarjata v sečno kislino, kar pa privede do hiperurikemije (zvečana koncentracija sečne kisline v krvi), uričnega artitisa, ledvičnih kamnov in odpovedi ledvic. Vse te motnje pa spremljajo še nevrološki problemi, tj. mentalna zaostalost, abnormalni gibi telesa in nagnjenost k samopoškodbam. Vzroki za kopičenje sečne kisline so dobro znani in jih je mogoče zdraviti z zdravili, kot je alopurinol. Razlogi za nevrološke motnje pa so bolj zapleteni. Študije le teh so pokazale, da gre pri LNS za zmanjšano raven dopamina v bazalnih ganglijih, vendar bo potrebno še kar nekaj raziskav o tem, kako vpliva GPRT na dopaminski sistem in zakaj se pojavijo motnje, kot so težnja k samopoškodovanju in mentalna zaostalost.

===Sara Lorbek: Glutaminska odvisnost rakavih celic===
Glutamin je pogojno esencialna aminokislina, ki je za obstoj rakavih celic ključnega pomena. Ima pomembno vlogo v sintezi nukleotidov, neesencialnih aminokislin in sodeluje pri vstopu esencialnih aminokislin v celico. Poleg tega je od prisotnosti glutamina odvisna sinteza glutationa- pomembnega antioksidanta. V rakavi celici je glutamin pomemben vir energije in prekurzorjev za biosintezo celici lastnih molekul, brez katerih se ne bi mogla deliti, bi oslabela in prej ali slej propadla. Mitohondrijski encim, glutaminaza, je v rakavih celicah eden izmed najpomembnejših, zato je tudi njegova aktivnost v primerjavi z zdravimi celicami povečana. Glutaminaza katalizira reakcijo pretvorbe glutamina v glutamat. To je prva stopnja, ki je potrebna za vse nadaljne reakcije pridobivanja energije in nastanka intermediatov, ki so uporabni v različnih biokemijskih sintezah. Rakava celica mora metabolizem prilagoditi svojim potrebam po energiji in sintezi proteinov, nukleotidov,... skratka vseh biomolekul, ki jih potrebuje za preživetje in pospešeno delitev. Na prilagoditev metabolnih poti glutamina pomembno vplivajo: HIF-1, mTORC in onkogen c-Myc. Zanje je značilno, da so v rakavih celicah prisotni v višji koncentraciji oz. v aktivnejši obliki kot v zdravih celicah, njihovo delovanje sem podrobneje opisala v seminarski nalogi. Odkar so raziskovalci bolje spoznali vpliv glutamina na rast in razvoj rakavih celic, so zasnovali tudi nekaj učinkovitih terapij. Le-te temeljijo na različnih metabolnih poteh glutamina in so se izkazale za precej učinkovite v boju proti raku, kar še dodatno potrjuje nenadomestljivost glutamina v tumorskih celicah. Pomembnejše molekule, ki zavirajo rast in proliferacijo s svojim vplivom na presnovo glutamina, in njihove tarče, sem prav tako vključila v svojo seminarsko nalogo, ki vas bo prepričala, da je glutamin na mnogih področjih ena izmed najpomembnejših molekul za rakavo celico.

BIO2 Seminar 2012

2012-10-27T12:25:39Z

SaraLorbek: /* Seznam seminarjev */

== Novice za študente ==
[https://www.google.com/calendar/embed?src=94r835uhlqu6sornlvmnldb5d0%40group.calendar.google.com&ctz=Europe/Belgrade Razpored izpitnih rokov in kolokvijev ter nekaterih kolokvijev iz vaj]

= Biokemijski seminar =
Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 9:00 do 12:00.

Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev == {| {{table}} | align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek''' | align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema*''' | align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja''' | align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1''' | align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2''' | align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3''' | align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje''' | align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije''' | align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve''' |- | Erik Kristian Janežič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892412000694 Hippo signalna pot in matične celice ]||Filip Mihalič||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012 |- | Dejan Marjanovič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482707001450 Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov]||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012 |- | Griša Prinčič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000411001149 Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice]||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||Ajda Rojc||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012 |- | Maja Kostanjevec||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000401018059# Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah]||Sara Lorbek||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012 |- | Julija Mazej||14||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002072 Metabolizem glukoze v živčnih celicah]||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||Ana Kunšek||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012 |- | Estera Merljak||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800041200059X Vloga PKM2 v rakavih celicah]||Suzana Semič||Monika Biasizzo||Janez Meden||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012 |- | Jernej Pušnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410001702 Uravnavanje metabolnih poti z acetilacijo proteinov]||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012 |- | Rok Razpotnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304419X12000534 Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija]||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||Erik Mršnik||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012 |- | Ajda Rojc||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001448271000282X Metabolizem skeletnih mišic]||Ana Grom||Matej Vrhovnik||Katja Leben||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012 |- | Tomaž Rozmarič||16||Moj izbrani naslov||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||Matic Kovačič||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012 |- | Ana Kunšek||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410000745]||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012 |- | Janez Meden||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304416511003059]||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012 |- | Ana Cirnski||17||Moj izbrani naslov||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||Nastja Pirman||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012 |- | Erik Mršnik||17||Moj izbrani naslov||Julija Mazej||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012 |- | Katja Leben||17||Moj izbrani naslov||Estera Merljak||Suzana Semič||Monika Biasizzo||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012 |- | Matic Kovačič||18||Moj izbrani naslov||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012 |- | Zala Gluhić||18||Moj izbrani naslov||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012 |- | Bojana Lazović||18||Moj izbrani naslov||Ajda Rojc||Ana Grom||Matej Vrhovnik||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012 |- | Nastja Pirman||19||Moj izbrani naslov||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012 |- | Špela Tomaž||19||Moj izbrani naslov||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012 |- | Monika Biasizzo||19||Moj izbrani naslov||Janez Meden||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012 |- | Jakob Gašper Lavrenčič||20||Moj izbrani naslov||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012 |- | Barbara Dušak||20||Moj izbrani naslov||Erik Mršnik||Julija Mazej||Ellen Malovrh||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012 |- | Matej Vrhovnik||20||Moj izbrani naslov||Katja Leben||Estera Merljak||Suzana Semič||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012 |- | Filip Mihalič||21||Moj izbrani naslov||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013 |- | Samo Zakotnik||21||Moj izbrani naslov||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013 |- | Mirjana Malnar||21||Moj izbrani naslov||Bojana Lazović||Ajda Rojc||Ana Grom||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013 |- | Sara Lorbek||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410000915 Glutaminska odvisnost rakavih celic]||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013 |- | Ellen Malovrh||22||Moj izbrani naslov||Špela Tomaž||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013 |- | Suzana Semič||22||Moj izbrani naslov||Monika Biasizzo||Janez Meden||Griša Prinčič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013 |- | Katarina Tolar||23||Moj izbrani naslov||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013 |- | Aleksander Benčič||23||Moj izbrani naslov||Barbara Dušak||Erik Mršnik||Julija Mazej||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013 |- | Ana Grom||23||Moj izbrani naslov||Matej Vrhovnik||Katja Leben||Estera Merljak||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013 |} *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti članek iz revije [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS], če tam ne najdete primerne teme, lahko izberete tudi pregledni članek iz kakšne druge revije, ki ima faktor vpliva nad 5. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2012|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli vsakemu od recenzentov in docentu (docentu ga pošljite po e-pošti).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte avtorju in Gunčarju.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1 Povzetki seminarjev 2011

2011-04-04T22:51:11Z

SaraLorbek:

== Alja Zottel: Vloga imunskega sistema pri nastanku ateroskleroze ==
Glavni vzrok nastanka ateroskleroze je imunski odgovor na lipoproteine majhne gostote oz LDL, ki se kopiči pod endotelom arterijskih žil. Apolipoprotein B100, ki je komponenta LDL, se veže na proteoglikane zunajceličnega matriksa in se pod vplivom različnih radikalov oksidira. OxLDL nato aktivira endotelijske celice, da začnejo proizvajati adhezijske beljakovine, kot sta E-selektin in VCAM-1. Te beljakovine skupaj s kemokini povlečejo monocite, T limfocite in in dendritske celice v endotelijsko plast žile. Monociti se nato pod vplivom M-CSF citokina diferencirajo v makrofage. Makrofagi nato začnejo proizvajati odstranjevalne receptorje. Ti tako lahko prepoznajo oxLDL in ga z endocitozo vsrkajo. Makrofagi se zato napihnejo in spremenijo v »foam cell«. Te celice so najštevilčnejše celice v aterosklerotskih plakih. Dejavniki, ki pospešujejo nastanej ateroskleroze so signalni proteini PRR, T levkociti in proteini CRP. T celice pomagalke izločajo interferon gama, ki privlači monocite. Protein CRP se veže na navadni LDL in tako ga lahko makrofagi, ki imajo receptorje za CRP vsrkajo. Dejavniki, ki preprečujejo nastanek ateroskleroze so B limfociti in protein PPAR. PPAR je receptorski protein oz. transkripcijski faktor, ki preprečuje nastanek »foam cell« celic in vsrkavanje LDL v makrofage. Preprečuje tudi razvoj T celic in povečuje količino HDL v krvi.

== Veronika Jarc: Hepatitis C ==
Hepatitis C(HCV) je nalezljiva bolezen, ki napade ljudi, šimpanze ter nekatere majhne modelne živali. HCV spada med RNA viruse z ovojnico.Razvrščen pa je v rod hepacivirus ter družino flaviviridae. Sestavljen je iz 6 genotipov (1-6), ki se razlikujejo v nukleotidni sekvenci od 30-35%, sedmega pa so odkrili leta 2008 (Gottwein et al., 2008). HCV vsebuje pozitiven trak gena (9,6 kb), ki je sestavljen iz 5´-NCR( non-coding region), 3´- NCR in IRES( internal ribosome entry side). IRES vsebuje odprto bralno ogrodje, ki šifrira strukturne in ne strukturne proteine. Med strukturne proteine spadajo proteinsko jedro, virusna RNA ter dva glikoproteina E1 in E2. Sestavni deli ne strukturnih proteinov pa so hidrofoben protein p7, NS2-3 proteaza, NS3 serin proteaza, NS4A polipeptid, NS4B protein, NS5A protein in NS5B RNA odvisna RNA polimeraza (RdRp).
S pomočjo različnih odkritij, kot so HCVpp(sestavljen iz lipidne ovojnice z E1-E2 proteini, na retrovirusni nukleokapsidi), izoliranje kloniranega gena 2a ter s pomočjo tega gena HCVcc( cell-culture produced HCV), so znanstveniki začeli preučevati življenski cikel in celično strukturo hepatitisa C. To so dosegli z preučevanjem različnih eksperimentalnih modelov kot so imunski odzivi, NK celice in dendritske celice.
Poznamo tudi proteine, ki jih HCv sreča v hepatocitski celici in ti so in tegrin RGE/RGD, LDL receptor, HDL receptor, klaudin okludin in tetraspanin CD81.

== Matja Zalar: Protein p53 ==
Protein p53, včasih imenovan tudi varuh genoma, kodira gen TP53 na sedemnajstem kromosomu. Je eden izmed tako imenovanih tumor-supresorskih proteinov, ki, kot to sporoča že samo ime, zavirajo nastanek in rast tumorjev. Na področju razumevanja delovanja, vloge in strukture proteina p53 in njegovih mutantov se izvaja veliko raziskav. Trenutno je p53 najbolj raziskan tumor-supresorski protein, še zdaleč pa ni edini. Gre za protein, ki se kopiči v jedru in z vezavo na DNA v obliki teramera nadzoruje in regulira procese kot so apoptoza, zaustavitev celičnega cikla in popravljanje poškodovane DNA. Za raziskovalce je še posebno zanimiv zaradi dejstva, da v nemutirani obliki zavira nastanek in rast tumojev, njegove GOF mutirane oblike pa pripomorejo k nenadzorovani delitvi celic in nastanku rakastih tkiv. Veliko raziskav se ukvarjaja z iskanjem snovi, ki bi obnovile osnovno obliko p53, oziroma uničile mutantske oblike p53 v rakastih celicah ter s tem uničile tumor. To pa bi lahko bistveno izboljšalo tehnike zdravljenja rakavih obolenj in odziv človeškega organizma na ta zdravljenja. Odkrili so že kar nekaj takšnih snovi (RITA, PRIMA, nutlin3), ki pa jih še vedno testirajo in še niso v redni uporabi pri zdravljenju rakavih obolenj.

== Andrej Vrankar: Androgena alopecija ==
Na podlagi raziskav, ki so jih znanstveniki izvedli na celičnih vzorcih posameznikov z androgeno alopecijo, so ugotovili, da je bila domneva, da je za nastanek AGA kriv propad matičnih celic v lasnem mešičku oziroma, propad samega lasnega mešička napačna. Raziskave so pokazale ravno nasprotno in sicer, da se matične celice tudi v plešastem lasišču posameznika z AGA ohranjajo in da lasni mešički ne propadejo, vendar se le zelo skrčijo. So pa ugotovili, da se število celic imenovanih predniške celice v plešastem lasišču močno zmanjša, kar je eden od glavnih vzrokov za nastanek AGA, saj so prav predniške celice tiste, ki so zaslužene za rast las. Čeprav se dednost smatra kot glavni vzrok za nastanek AGA, pa tudi hormoni igrajo pomembno vlogo. Pri moških je to moški hormon testosteron, ki se s pomočjo encima 5-α-reduktaze v lasno mešičnih celicah pretvarja v svojo bolj aktivno obliko dihidrotestosteron (DHT). Ta se se nato s posebno vezjo veže na androgene receptorje v lasnih mešičkih, kar sproži posebne procese, ki skrajšajo anageno fazo celičnega cikla. Zaradi skrajšanja te faze las prej prestopi v telogeno fazo in izpade. Kako občutljivi so lasni mešički na androgene pa je seveda gensko pogojeno.

== Sandi Botonjić: Tioredoksinu podoben protein (TXNL2) ščiti kancerogene celice pred oksidativnim stresom ==
Kisikovi radikali, ki povzročajo oksidativni stres lahko v skrajnem primeru poškodujejo DNA in tako povzročijo nenadzorovano delitev celic, kar pomeni nastanek raka v organizmu. Hkrati pa je raven kisikovih radikalov v rakastih celicah višja, kot v zdravih, in sicer zaradi onkogenih stimulacij, povečane presnovne aktivnosti ter okvare mitohondrijev. Toda rakave celice imajo, kot protiutež tudi močan antioksidantni mehanizem s katerim zavirajo programirano celično smrt.

Raziskovalci so tekom analiziranja večih tkiv, ki so obolela z različnimi vrstami raka ugotovili, da je pri vseh povečana raven [http://www.thesgc.org/structures/structure_images/2WZ9_400x400.png tioredoksinu podobnega proteina - TXNL2]. Zatem so izvajali poskuse na miših tako, da so jim vbrizgali kancerogene eritrocite in ko so se pojavili simptomi tumorja – so jim vbrizgali še protein TXNL2. Ugotovili so, da protein TXNL2 zavira rast rakavih celic. Proučevali so tudi vpliv proteina TXNL2 v mišjih zarodkih. Prišli so do zaključka, da protein TXNL2 regulira raven kisikovih radikalov tako pri živečih organizmih, kot med embriogenezo.

Znanstveniki so prepričani, da je protein TXNL2 potencialna tarča bioloških zdravil v prihodnosti. Namreč monoklonska protitelesa (med katere spade tudi TXNL2) za zdravljenje raka z vezavo na receptorje za rastne dejavnike blokirajo celično rast in diferenciacijo ter tako zaustavijo rast tumorja. Zaustavijo lahko tudi rast tumorskega ožilja in s tem posredno onemogočajo rast tumorjev in metastaziranje. Med mehanizme delovanja monoklonskih protiteles, spada tudi ciljanje drugih efektorskih molekul na mesta delovanja - kot so npr. kisikovi radikali. Raziskave so potrdile, da to velja tudi za protein TXNL2.

== Ana Dolinar: Prilagojena ali prilagodljiva imunost? Primer naravnih celic ubijalk ==
Naravne celice ubijalke (NK celice) so vrsta levkocitov. V človeškem telesu so zadolžene za uničevanje patogenih organizmov s pomočjo za celice strupenih snovi. Na površini imajo pet skupin receptorjev: aktivacijske, inhibitorne, kemotaksične in citokine ter adhezijske receptorje.

Njihova aktivacija je odvisna od vezave ligandov na površinske receptorje NK celice. Če je vezanih več inhibitornih ligandov kot aktivacijskih, potem se NK celica ne aktivira, ker inhibitorni ligandi zavrejo delovanje NK celice. V primeru, da se veže več aktivacijskih kot inhibitornih ligandov ali pa se slednji sploh ne vežejo, se NK celica aktivira ([http://www.georg-speyer-haus.de/agkoch/research/subframe_en.htm aktivirana NK celica-rumeno, tarčna celica-rdeče]). Vezava kemotaksičnih ligandov vpliva na gibanje molekule zaradi kemičnih signalov, vezava citokinov spodbuja rast celic ali sintezo snovi, ki jih potrebuje imunski sistem, vezava adhezijskih ligandov pa omogoča pritrjanje NK celice na tarčno celico.

Raziskovalci se trudijo, da bi našli optimalno imunoterapijo, pri kateri bi sodelovale NK celice. Te terapije bi bile uporabne predvsem pri rakavih obolenjih, vendar so možnosti tudi pri obolenjih z virusom HIV ali z virusom hepatitisa C. Ta način imunoterapije je mogoč, ker večina tumorskih celic in virusov ne izraža MHC tipa 1, pomembnega inhibitorskega liganda za NK celice. [http://media.wiley.com/CurrentProtocols/IM/ima01n/ima01n-fig-0004-1-full.gif Zgradba MHC-1 molekule, prikazana z Ribbonovim diagramom in vezanim peptidom (A) ter površinska struktura molekule z vezanim peptidom (C). Slika B prikazuje molekulo MHC-2 z vezanim peptidom.]

== Urška Rauter: Razvojne vloge Srf, kortikalnega citoskeleta in celične oblike pri orientaciji epidermalnega vretena ==
Mehanizem nastajanja polariziranega epidermalnega sloja, ki s procesoma stratifikacije in diferenciacije tvori kožo, regulira več različnih med seboj v komplekse povezanih bioloških molekul. Trije najbolj osnovni procesi so delovanje proteinov aktina, orientacija vretena in sistem celične signalizacije. Znanstveniki pa so v obširni raziskavi potrdili tudi pomembno vlogo t. i. Srf proteina (serum response factor protein), transkripcijskega dejavnika, katerega pomembna vloga je regulacija celične diferenciacije.

Srf je transkripcijski dejavnik, ki se veže na določen, njemu ustrezen receptorski element; Sre (serum response element), to so predvsem geni v zgodnjem razvoju, geni za razvoj nevronov in mišična gena (proteina) aktin in miozin. Ker je njegova primarna funkcija regulacija ekspresije naštetih genov, odločilno vpliva na celično rast in diferenciacijo, prenos med nevroni in razvoj mišic.

Namen raziskave je obširen. Rezultati obetajoči. Dokazali so pomembno vlogo Srf proteina pri marsikaterem mehanizmu/procesu v embrionalnem razvoju. Tako recimo Srf odločilno vpliva na diferenciacijo celic, saj izguba le-tega povzroči kaotično deljenje in diferenciacijo celic med več plastmi epidermisa. Nadalje vpliva tudi na pravilno vzpostavitev polarnosti bazalne lamine in še najbolj ključno na tvorbo aktinsko-miozinskega skeleta, ki je nujen za pravilno mitozo, posledično za obliko in trdnost celice. Orientacija vretena in asimetrično dedovanje sta po zadnjih raziskavah osrednja mehanizma, ki omogočata matičnim celicam samostojno obnovi in diferenciacijo v pravilni smeri. Rezultati kažejo, da lahko takšne signale pošiljamo preko Srf proteina in aktinsko-miozinskega skeleta, za pravilno tvorbo in nadzirano regulacijo orientacije vretena, asimetrične celične delitve in nasploh usodo posamezne celice. Rezultati razkrivajo nove pojasnitve bioloških procesov, ki sodelujejo pri tvorbi morfologije epidermisa.

== Špela Pohleven: Prioni ==

Prioni so patogeni proteini, ki se od svojih nepatogenih, normalnih, v zaporedju aminokislin enakih dvojnikov, razlikujejo v 3D strukturi – imajo večji del β ploskev. Poznamo več vrst prionov, toda običajno govorimo le o proteinu PrP, ki je prisoten pri ljudeh in živalih. Ostali so namreč značilni za glive, ki so tako primerne za razne raziskave.
Za prione je značilno povezovanje v nitaste polimere, ki jih imenjujemo amiloidi. Znanstveniki domnevajo, da je prav njihova urejena struktura tista, zaradi katere so slabo topni v detergentih in odporni na proteaze.
Najbolj nenavadna lastnost prionov pa je njihova zmožnost širjenja brez potrebe po DNA in RNA. V zvezi s tem potekajo številne raziskave, saj prioni povzročajo številne smrtne bolezni, kot so Creutzfeldt-Jakobova bolezen, smrtonosna družinska nespečnost in druge. Z informacijami, ki jih tako pridobivajo, je možnost za odkritje zdravila večja.
Pri eni od nedavnih raziskav so tako ugotovili, da obstajata dve prionski obliki proteina PrP – infektivna in toksična. Za raziskave so uporabili miši z različnim izražanjem gena PRNP za PrP protein. Vse so okužili s prioni praskavca (ena od prionskih bolezni). Vse so dosegle enak prag infektivnosti, toda smrt ni nastopila istočasno. Iz meritev so znanstveniki prišli do zaključka, da morata obstajati dve različni obliki. To pa je le izhodišče za nove raziskave.

== Maša Mohar: Sladkorna bolezen, kot bolezen imunskega sistema ==

Diabetes mellitus je kronična motnja metabolizma beljakovin, lipidov in ogljikovih hidratov. Nastane zaradi zmanjšane funkcije proizvajanja insulina v telesu. Njen vzrok pa je lahko studi zmanjšana sposobnost telesnih celic za pravilno izkoriščanje insulina. Tip 2 je od insulina neodvisen diabetes (NIDDM). Ta tip ima 80-90% vseh pacientov in se pojavi v odraslem obdobju življenja, spodbudijo ga lahko različni mehanizmi, in za nekatere se še ne ve točno kako pride do tega, je pa res da k temu veliko pripomore nezdrav način življenja in seveda dednost. Prav tako se diabetes tipa 2 deli v dve skupini in sicer na debeli tip, ki ga ima približno 80% vse populacije in na ne debeli tip.
Da je T2D bolezen imunskega sistema pa ugotovimo s tem ko vidimo kako se telo odzovena določene mehanizme, ki sprožijo to bolezen. To so oksidativni stres, stres ER( endoplazemski retikel), lipotoksičnost in glukotoksičnost. Prav tako je potrebno poudariti, da ima diabetes tipa 2 svoje metabolne karakteristike in skupaj s temi patogenimi mehanizmi tvori formulo za nastanek bolezni. Seveda lahko pri T2D pride tudi do dolgoročnih komplikacij, kot so makro in mikro- vaskularne bolezni, problemi z ledvicami, očmi in živci. Te pa so glavni dejavniki za povzročitev hujšega bolezenskega stanja in ne nazadnje tudi smrti zaradi diabetesa.

== Mirjam Kmetič: Regulacija celičnega metabolizma železa ==

Železo je pomemben mikroelement, ki ga vezanega na proteine, vsebujejo skoraj vsa živa bitja. Celice sesalcev potrebujejo zadostno količino železa, da zadovoljijo metabolne potrebe ali dosežejo specializirane funkcije. Vsekakor pa je železo potencialno strupeno, še posebej v obliki Fe2+ ionov, ki katalizirajo pretvorbo vodikovega peroksida v proste radikale, ti pa poškodujejo veliko celičnih struktur (DNA, proteine, lipide...) in posledično celica lahko celo odmre. Vse oblike življenja se temu izognejo tako, da vežejo železove ione na proteine in tako hkrati izkoristijo njegove ugodnosti. Železo se prenaša v tkivo ob pomoči kroženja transferina, prenašalca, ki veže železo v plazmi, katerega predvsem sproščajo črevesne resice in retikuloendotelni makrofagi. Z železom bogat transferin se veže na membranski transferin receptor 1, kar se odraža z endocitozo in sprejemom te kovine. Sprejeto železo se prenese do mitohondrija za sintezo hema ali železo-žveplovih proteinov, ki so bistveni deli mnogih metaloproteinov. Presežno železo se skladišči in detoksificira v feritinu, ki je v citosolu. Metabolizem železa je nadzorovan na različnih nivojih in z raznovrstnimi mehanizmi. Pri uravnavanju je zelo pomemben sistem IRE (iron-responsive element)/IRP (iron-regulatory protein), dobro poznano post-transkripcijsko regulatorno vezje, ki ne le vzdržuje homeostazo v različnih tipih celic, ampak tudi prispeva k sistemskemu ravnovesju železa.

== Lea Kepic: Agonisti adrenoreceptorjev β2 ==

Vloga receptorjev v organizmih je zelo pomembna saj prenaša vse potrebne informacije za delovanje. Delimo jih na ionotropne in metabotropne. Največja skupina metabotropnih receptorjev pripada receptorjem, ki so sklopljeni s proteinom G. Mednje spadajo tudi adrenergični receptorji ali adrenoreceptorji. Adrenoreceptorji so tarčni za katekolamine (fight or flight hormoni) med katere spadajo adrenalin, noradrenalin in dopamin. V svojem seminarju sem se posvetila predvsem podskupini β2 (β2-AR) in njihovim agonistom. Agonisti so spojine, ki se selektivno vežejo na specifične receptorje, ki sprožijo nadaljnji odziv. Njegova naloga je posnemanje naravno obstoječih (endogenih) molekul, kot so na primer hormoni. Najbolj pogost in učinkovit agonist za β2-AR je izoprenalin, med hormoni pa je najboljši adrenalin. S pomočjo eksperimentov znanstveniki raziskujejo posebnosti v zgradbi predvsem kristalnih struktur, tvorbo vezi z različnimi spojinami, konformacijske spremembe, vpliv inhibitorjev, ravnotežna stanja ter energijska pretvarjanja. Rezultati teh raziskav so izhodišče za praktično uporabnost agonistov. Zaradi njihovih lastnosti jih vedno več uporabljamo v medicini za zdravnjenje plujčnih bolezni; predvsem astme in bronhitisa. To področje za enkrat še ni do dobra raziskano zato jih navadno uporabljamo le kot dodatke drugim zdravilom. Raziskani pa so že tudi nekateri negativni učinki na telo.

== Iza Ogris: Zakaj imajo možgani glikogen? ==

Glikogen se v možganih nahaja v precej manjših koncentracijah kot v jetrih in mišicah.Pojavi se vprašanje o njegovi vlogi v možganih in kje se nahaja. Glikogen vsebujejo astrocite- glia celice, ki obdajajo nevrone in skbijo za koncentracijo ionov v izvenceličnem prostoru ter dovajanje določenih snovi nevronom. Ko se med aktivnostjo nevronov v izvenceličnem prostoru kopičijo kalijevi ioni, jih astrocite začnejo privzemati z K/Na ATPazo. Posledično se v astrocitah zviša nivo AMP, kar stimulira delovanje encima glikogen fosforilaze (razgradnja glikogena). Astrocite med nevronsko aktivnostjo privzemajo tudi živnčni prenašalec glutamat iz sinaps, ki tudi posredno povzroča padec energije v astrocitah. Ko se nivo glukoze v dejavnih nevronih znižuje, se medtem v astrocitih povečuje. Koncentracija glukoze je nato v astrocitih večja kot v izvencelični tekočini in nevronih, zato se ustvari koncentracijski gradient kar omogoči pot glukoze iz astrocitov v nevrone. Pri vzdrževanju glukoze se tako razgradnja glikogena izkaže za bolj učinkovito kot le privzem glukoze iz krvi. Razkriva se izvor in usoda glukozne rezerve.

== Ines Kerin: Kanabinoidi za zdravljenje shizofrenije? Uravnotežena nevrokemična sestava za škodljive in terapevtske učinke uživanja konoplje ==

Že desetletja velja prepričanje, da je uživanje konoplje eden pomembnih dejavnikov za nastanek in razvoj shizofrenije. Vendar so v novejših raziskavah odkrili, da naj bi kanabinoidi, psihoaktivne substance v konoplji, izboljšali nevropsihološke učinke in negativne simptome, ter imeli antipsihotične lastnosti pri ljudeh s shizofrenijo. Shizofrenija je huda duševna bolezen iz skupine psihoz. Simptome shizofrenije povzroča spremenjena količina določenih snovi v možganih, in sicer živčnih prenašalcev, ki omogočajo medsebojno komunikacijo možganskih celic. Motnje v komunikaciji pa povzročajo spremembo v delovanju možganov. Pomembno vlogo ima pri bolezni dopamin, ki lahko s prevelikim sproščanjem izzove nekatere simptome.
Shizofrenijo zdravijo s pomočjo antipsihotikov, ki imajo podobne lastnosti kot kanabinoidi v konoplji. Vendar se učinki konoplje od učinkov antipsihotikov nekoliko razlikujejo. Pri negativnih simptomih konoplja, tako kot antipsihotiki, spodbuja sproščanje in delovanje dopamina. Manj znano pa je, ali zavira ali spodbuja delovanje ostalih petih nevrotransmiterjev (serotonina, acetilholina, noradrenalina, glutamina in GABA). Na pozitivne simptome ima konoplja, kot je vidno v tabeli lahko tako koristne kot nekosristne učinke. Simptome lahko izboljša z zaviranjem sproščanja serotonina, acetilholina in noradrenalina. V primeru dopamina, glutamata in GABA ima konoplja negative učinke, saj v nasprotju z antipsihotiki, poveča sproščanje dopamina in zavira delovanje glutamata in GABA. Obstajajo dokazi, da imajo kanabinoidi zdravilne učinke na pozitivne in negativne simptome pri shizofreniji. Vendar to poglavje še ni zaključeno in se izvajajo še nadalnje raziskave v tej smeri.

== Eva Knapič: Kako virusi vodijo delovanje celice. ==
Virusi so geni obdani z zaščitno proteinsko ovojnico. Za izražanje teh genov, da lahko naredijo proteine in podvojijo kromosome, je potrebno, da vstopijo v celico in uporabijo celične mehanizme, saj sami tega niso zmožni. Poznamo več vrst virusov. Posebnost evkariontskih virusov je sposobnost posnemanja kratkih linearnih motivov proteinov poznanih pod kratico SLiMs. To so deli proteinov, ki so odgovorni za posredovanje med nekaterimi celičnimi funkcijami. So zelo kratki, večinoma nekje od 3 do 10 aminokislin. Motivi sodelujejo pri vezavi proteinih, pri prepoznavanju post-translacijske modifikacije encimov, pri usmerjanju proteinov v celične razdelke in pa so prisotni na cepitvenih mestih proteina. S posnemanjem različnih motivov lahko virusi prevzamejo nadzor nad celico. Najpogostejši mehanizmi prevzema nadzora so uporaba celičnega transporta, manipuliranje signalnega transporta, nadzor proteinov v celici, regulacija prepisovanja, sprememba modifikacije gostiteljevega proteina in usmerjanje modifikacije proteinov.
Uporaba proteinskih motivov v celici in lahko posnemanje le teh predstavlja šibkost v celični organiziranosti, saj virusi s pridom izkoriščajo to v svojo korist. Posnemanje motivov virusom omogoča, da sami vodijo delovanje celice in se sami s pomočjo celičnih mehanizmov enostavno razmnožujejo in tako hitro okužijo celoten organizem.
V nadalje bodo potekale raziskave za izkoriščanje posnemanja motivov v namene zdravljenja virusnih okužb.
== Katra Koman: Pomen dendritskih celic (DCs) in celic ubijalk (NK) v imunskem odzivu na okužbo z virusom HIV-1 ==
Dendritske celice (DCs - dendritic cells) in celice ubijalke (NK – natural killer cells) sta dva tipa celic prirojenega imunskega sistema, ki imata zelo pomembno vlogo pri protivirusni odpornosti. Tako dendritske celice, kot tudi celice ubijalke so sicer pomemben del (nespecifičnega) prirojenega imunskega sistema, a hkrati vplivajo tudi na učinkovit razvoj (specifičnega) prilagojenega imunskega odziva. DC so ključnega pomena za aktiviranje za virus specifičnih T celic, kar pa je močno odvisno od prejšnjega, prirojenega imunskega odziva. NK celice pa ovirajo zgodnje širjenje virusov, tako da proizvajajo citokine in s fagocitozo neposredno uničujejo okužene celice. Razumevanje delovanja in funkcije teh celic pa ima pomemben vpliv na razvijanje nove strategije cepiva proti virusu HIV-1, katere uspeh bo odvisen od primernega razumevanja delovanja teh celic.

== Jana Verbančič: Apoptozi podobna smrt v bakterijah, ki jo povzroča HAMLET, lipidno-proteinski kompleks v človeškem mleku ==
Apoptoza oz. programirana celična smrt je eden najpomembnejših procesov v evkariontskih celicah. Organizem je z apoptozo sposoben sam uravnavati število živih celic. Uniči jih lahko, ker so poškodovane, stare ali ker ne opravljajo več svoje naloge, lahko pa uniči tudi popolnoma zdrave celice, ki jih ne potrebuje več (npr. pri embrionalnem razvoju). Pomemben dejavnik pri apoptozi so encimi kaspaze, ki cepijo in aktivirajo druge proteine, vse skupaj pa lahko poteka po dveh poteh. Prva je notranja in vključuje mitohondrije in citokrom c, ki deluje kot signalna molekula v apoptotskem ciklu ter tako sproži delovanje kaspaz in posledično apoptozo. Druga pot je zunanja in vključuje aktivacijo proteinskih receptorjev (t. i. receptorjev smrti) na zunanji strani membrane. Oblikuje se kompleks iz receptorja, adaptorskega proteina in vezane kaspaze (DISC), ki povzroča cepljenje in aktivacijo nadaljnjih kaspaz; to pa spet vodi v apoptozo. V mehanizme so lahko vključeni mnogi drugi proteini ali neproteinski signali.
Programirane celične smrti pa nimajo samo evkarionti, ampak so dokazali, da so tudi prokarionti sposobni procesov, ki so zelo podobni apoptozi. Raziskave so delali na streptokokih in tumorskih celicah, ki so jim dodali kompleks HAMLET (human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells), ki ga lahko najdemo v človeškem mleku. Kompleks je deloval kot signalna molekula za začetek apoptoze v tumorskih celicah oz. za začetek apoptozi podobnega procesa v bakterijah.

== Ana Remžgar: Črevesna absorpcija vitamina D ne poteka le s pasivno difuzijo: dokazi za vpletenost enakih transporterjev kot pri holesterolu ==
Vitamin D je hormon, ki ga telo lahko proizvede samo s pomočjo obsevanja kože z ultravijolično svetlobo, vendar je hipovitaminoza D razširjena v mnogih državah in je pomemben svetovni zdravstveni problem. Vitamin D je nujno potreben za uravnavanje ravnovesja med kalcijem in fosfati v telesu ter za normalno rast kosti.

Dolgo časa je veljalo, da se v črevesju vitamin D absorbira le s pomočjo pasivne difuzije. Znanstveniki so kulturi človeških embrionalnih ledvičnih (HEK) celic dodali vsaj enega od teh membranskih proteinov (SR-BI, CD36, NPC1L1). Ti trije proteini so pomembni pri absorpciji holesterola. Zaradi podobne zgradbe holesterola in vitamina D, so znanstveniki sklepali, da so lahko ti trije proteini pomembni tudi pri absorpciji vitamina D. Ko so HEK celicam dodali te proteine, se je absorpcija vitamina D opazno povečala. Ko pa so HEK celicam dodali poleg proteinov še njihove inhibitorje, se je absorpcija močno zmanjšala.
Vpliv SR-BI so opazovali tudi in vivo. Uporabili so wild type miši ter miši z mnogo bolj izraženim Scavenger receptorjem razreda B tipa I (SR-BI). Tudi tu se je pri SR-BI miših povečala absorpcija vitamina D.

Ti rezultati nam prvič pokažejo, da se vitamin D v črevesju ne absorbira le preko pasivne difuzije vendar je v ta proces vključenih kar nekaj transporterjev.

== Maja Grdadolnik: Jedrni in nejedrni receptorji za estrogene. ==
Receptorji za estrogene oz. estrogenski receptorji so proteinske molekule z vlogo specifičnega mesta vezave ustreznega liganda. Nahajajo se v vseh celicah tkiv, ki so tarčne celice estrogena. Lahko se nahajajo v jedru celice, v neposredni bližini DNA, lahko pa so vezani na posebna mesta na membrani celice, t.i. caveole.
Estrogeni (estron (E1), estradiol (E2), estriol (E3)) so lipidopolarni in brez večjih težav prehajajo skozi lipidni dvosloj. Nato se vežejo na lipoproteine v krvi, ki jih prenesejo do jedra tarčne celice. Tarčne celice so po navadi celice jajčnikov, testisov, nadledvičnih žlez, jeter in prsi. V jedru se nato vežejo na estrogenski receptor, s katerim tvorijo kompleks. Ta ligand-receptor kompleks se nato s posebnim mestom (domeno E) veže na specifično mesto na DNA, imenovano estrogen response element (ESE). S tem sodeluje pri procesu transkripcije in uravnava sintezo ustreznih proteinov.
Nejedrni estrogenski receptorji so vezani na posebna mesta na membrani celice, t.i. caveole. Na ta mesta so vezani z integralnim proteinom, za vezavo pa potrebujejo aminokislinski substrat. Receptorje na membrani lahko povezujemo z interakcijo z različnimi ligandi, imajo pa tudi pomembno vlogo posredne aktivacije endotelijske NO sintaze, ki pozitivno vpliva na srce in ožilje. Nejedrne estrogenske receptorje že povezujejo s procesi, ki blagodejno vplivajo na kardiovaskularne bolezni in tkivo endotelija.

== Andreja Bratovš: Vloga GPCR v patologiji Alzheimerjeve bolezni. ==
Alzheimerjeva bolezen je najpogostejša oblika demence. Zaradi odmiranja nevronov pride do zmanjšanja obsega možganov in pešanja razumskih funkcij. Eden glavnih razlogov za nastanek bolezni so amiloidni plaki. Ti nastajajo s kopičenjem amiloidnih peptidov beta. APP (amyloid precursor protein) je membranski protein, ki ga pri zdravem človeku cepi najprej α-sekretaza (nastane sAPPα), nato pa še γ-sekretaza – nastane topen delec p3. Kadar pa APP cepi β-sekretaza, nastane najprej sAPPβ, po cepitvi z γ-sekretazo pa nastane amiloidni peptid beta.
Pri iskanju zdravila za Alzheimerjevo bolezen se trenutno osredotočajo prav na amiloidne plake oz. na preprečevanje njihovega nastajanja ter njihovo razgradnjo. Alternativen pristop imunoterapiji je regulacija receptorjev, sklopljenih z G-proteini, saj so ti udeleženi v več fazah nastajanja plakov. Možnih je več poti, in sicer: zaviranje nastajanja amiloidnih peptidov beta z regulacijo α-, β- ali γ-sekretaze ter sproščanje encimov za razgradnjo plakov. Pri regulaciji α-sekretaze gre za promoviranje njenega delovanja, saj se tako poleg tega, da ne nastajajo amiloidni peptidi beta, tudi sprošča sAPPα, ki ima vlogo pri zaščiti nevronov. Za β-sekretazo je sicer znanih veliko inhibitorjev, vendar jih iz možganov eksportira P-glikoprotein. Problem pri γ-sekretaze je, da ta sekretaza cepi tudi del proteina Notch, zato bi z njeno inhibicijo vplivali tudi na Notch signalno pot.

== Kaja Javoršek: Potencial matičnih celic pri Parkinsonovi bolezni in molekularni faktorji za tvorbo dopaminskih nevronov. ==
Parkinsonova bolezen je nevrodegenerativna bolezen bazalnih ganglijev. ta bolezen prizadane predvsem telesno gibanje, nastane pa ker se zmanjša koncentracija dopamina v striatumu. Kot posledica tega, začnejo propadati dopaminski nevroni v substanti nigri. Prav propadanje dopaminskih nevronov pa je vrzok za Parkinsonovo bolezen. Vzrok za propadanje teh nevronov pa še vedno ni znan. Znano je da dopaminski nevroni s starostjo pospešeno propadajo. To je tudi razlog, zakaj se ta bolezen pojavlja šele pri starejših ljudeh.
Danes se v medicini uporablja veliko terapij, ki pa le lajšajo simptome in bolezni ne pozdravijo. Prav to je razlog za tako veliko število raziskav povezanih s Parkinsonovo boleznijo. Čeprav mehanizmi razvoja dopaminskih nevronov še niso povsem znani, so raziskovalci odkrili kar nekaj molekularnih faktorjev, ki vplivajo na njihovo tvorbo, na primer Fox proteini in receptor sirota Nurr1. Fox proteini so transkripcijski faktorji, ki vežejo DNA. Med temi proteini igrata najpomembnejšo vlogo v nastanku dopaminskih nevronov FoxA1 in FoxA2 proteina. Receptor sirota Nurr1 pa je pomemben pri nastanku L-DOPE, ki je vmesen produkt pri nastanku dopamina iz L-tirozina. Za nastanek L-DOPE mora biti prisoten encim tirozin hidroksilaza. Za izražanje tega encima pa je pomemben receptor sirota Nurr1 in mutacije tega receptorja so povezane s Parkinsonovo boleznijo in shizofrenijo.
Poleg vseh načinov zdravljenja, pa poskušajo Parkinsonovo bolezen pozdraviti tudi s pomočjo matičnih celic, saj so se zmožne diferencirati v katero koli vrsto celic, vključno z dopaminskimi nevroni.

== Tamara Marić: Organizacija jedra. ==
Organizacija genoma v jedru je zelo kompleksna in dinamična in prav to je znanstvenike privedlo do mišljenja, da ima jedro neko globjo strukturo, kjer mora vladati red. S pomočjo novih tehnoloških metod (3C, FISH, 4C) so odkrili kar nekaj zanimivh stvari o sestavi samega jedra. Jedro si moramo predstavljati kot 3D strukturo, v kateri se neprestano nekaj dogaja. Sestavljen je iz dveh glavnih domen, obrobja in centra. Na obrobju sta še dva pododdelka. Ob jedrnih porah se nahajajo aktivni geni, ki so povezani s številnimi proteini, speči geni pa se nahajajo ob lamini. V centru se pododdelki medseboj razlikujejo po funkcijah. V jedrcu se nahajajo geni za rRNA, v transkripcijskih tovarnah se nahajajo vse »sestavine«, ki jih geni potrebujejo za prepis, polycombska telesca imajo bistveno vlogo pri ohranjevanju represije in perinuklearni prostor je specializiran za replikacijo heterokromatina. Ker pa to ne miruje je logično da kromatinske zanke med seboj interagirajo. Poznamo homologne (kjer gre za podobno zgrajene/iste kromosome) in nehomologne(se med seboj razlikujejo) interkromosomske interakcije. Pri prvi je pomembno, da se podobna kromosoma »zmenita«, kateri bo aktiven, pri drugi pa je diferenciacija celice odvisna od aktivnosti nekega gena.

== Mitja Crček: Matične celice in njihova vloga pri zdravljenju bolezni in poškodb. ==
Regeneracija je proces, pri katerem nadomestimo poškodovane telesne dele. V človeškem telesu imajo to nalogo matične celice (MC), ki skribijo za delno regeneracijo in celjenje poškodb. Matične celice so nediferencirane celice odraslege človeka ali zarodka, ki imajo izjemen potencial, da se defirencirajo v mnogo različnih tipov celic v telesu. V tri do pet dni starih zarodkih iz matičnih celic nastane celotno telo organizma, pri odraslih ljudeh pa nas matične celice ohranjajo pri življenju. Glede na potentnost jih razdelimo v štiri razrede: totipotentne in pluripotentne MC so celice, ki se lahko diferencirajo v praktično vse celice telesa, medtem ko so multipotentne in unipotentne bolj omejene. Drugo delitev lahko opravimo glede na njihov izvor: embrionalne MC izvirajo iz zarodka, medtem ko MC odraslih tkiv in organov najdemo med že diferenciranimi celicami. Zaradi vseh njihovih lastnosti imajo velik potencial pri zdravljenju bolezni, že vrsto let jih uporabljajo za zdravljenje levkemije in limfoma. Z diferenciacijo MC v nevrone bi lahko pozdravili poškodbe hrbtenjače in možganov, ob sproščanju kemičnih signalov iz MC proti lasnim mešičkom bi lahko pozdravili plešavost. V teoriji bi lahko nadomestili tudi izgubljen zob, zdravili slabovidnost in gluhost, pa tudi sladkorno bolezen in neplodnost. Velik potencial imajo tudi pri zdravljenju poškodb kosti in mišic. Pri zlomih ter poškodbah hrustanca in vezi služijo predvsem za hitrejšo regeneracijo, omogočajo pa tudi zdravljenje mišične distrofije ali pa povečanje mišične mase in moči, kar bi lahko s pridom izkoriščali športniki in starejši ljudje.

== Sara Lorbek: Sovplivanje maščobnih kislin ter genov na adipokine in debelost. ==
Belo maščobno tkivo ni namenjeno zgolj shranjevanju zalog maščobe, temveč ima velik vpliv na prisotnost in stopnjo vnetja v telesu, saj na le-to vpliva s sekrecijo adipokinov. Adipokini so proteini, ki se izločajo iz celic maščobnega tkiva, do danes pa je poznanih že več kot 100 različnih. Njihov vpliv je zelo različen, v nalogi pa sem se osredotočila na vpliv aipokinov na vnetje, za katerega velja, da ga sproža debelost. Adipokina, ki odločilno prispevata k vnetnemu stanju sta TNF in interlevkin-6 (IL-6), njuna količina pa je močno odvisna tudi od telesne teže: večja kot je telesna teža posameznika, več je teh dveh adipokinov, ki promovirata vnetje, zato je tudi stopnja vnetja večja pri debelejših osebkih. Maščobne kisline veljajo za snovi, ki so sposobne regulirati proizvodnjo adipokinov in s tem vplivati na stopnjo vnetja, toda natančni molekulski mehanizmi tovrstne aktivnosti maščobnih kislin še niso pojasnjeni. Kljub temu imamo že dovolj dokazov, da lahko z gotovostjo trdimo, da različni tipi maščobnih kislin različno ugodno/neugodno vplivajo na promocijo vnetja v organizmu, tako npr. uživanje večkrat nenasičenih in omega-3 m.k. znižuje količino IL-6 in TNF- torej zavira vnetje, uživanje nasičenih m.k. pa vnetje promovira, saj zvišuje količino IL-6 in TNF v organizmu. Odziv številnih adipokinov na različne m.k. do danes še ni bil raziskan, kar predstavlja nov izziv za področje nutrigenomike.

BIO1-seminar 2011

2011-04-02T15:09:51Z

SaraLorbek: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Slovenski naslov članka'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Faktor vpliva revije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| BOTONJIĆ SANDI||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Sandi_Botonji.C4.87:_Tioredoksinu_podoben_protein_.28TXNL2.29_.C5.A1.C4.8Diti_kancerogene_celice_pred_oksidativnim_stresom Tioredoksinu podoben protein (TXNL2) ščiti kancerogene celice pred oksidativnim stresom]
||15.387||28.02.||03.03.||07.03.||RODE URŠKA||KERIN INES||OGRIS IZA
|-
| VRANKAR ANDREJ||Število lasno-mešičnih matičnih celic se v plešastem lasišču moških z androgeno alopecijo ohranja za razliko od števila CD200-rich in CD34-positive lasno-mešičnih predniških celic||||28.02.||03.03.||07.03.||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO||JAVORŠEK KAJA
|-
| ZALAR MATJA||Protein p53||||28.02.||03.03.||07.03.||OGRIS IZA||CRČEK MITJA||ZOTTEL ALJA
|-
| ZOTTEL ALJA||Vloga imunskega sistema pri aterosklerozi||31.434||07.03.||10.03.||14.03.||RADOJKOVIĆ MARKO||KERT DOMINIK||HROVAT KARMEN
|-
| DOLINAR ANA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Ana_Dolinar:_Prilagojena_ali_prilagodljiva_imunost.3F_Primer_naravnih_celic_ubijalk Prirojena ali prilagodljiva imunost? Primer naravnih celic ubijalk]||28||07.03.||10.03.||14.03.||RAUTER URŠKA||MOHAR MAŠA||VERBANČIČ JANA
|-
| RAUTER URŠKA||Razvojna vloga Srf, kortikalnega citoskeleta in celične oblike v orientaciji epidermalnega vretena||19.527||07.03.||10.03.||14.03.||MUSTAR JERNEJ||JAVORŠEK KAJA||MOHAR MAŠA
|-
| MOHAR MAŠA||Sladkorna bolezen tipa 2 kot bolezen imunskega sistema||30,006||14.03.||17.03.||21.03.||VENE ROK||RAUTER URŠKA||GORIČAN TJAŠA
|-
| POHLEVEN ŠPELA||Prioni||34||14.03.||17.03.||21.03.||KEPIC LEA||RADOJKOVIĆ MARKO||DOLINAR ANA
|-
| KEPIC LEA||Agonisti adrenoreceptorjev β2||34.48||14.03.||17.03.||21.03.||VRANKAR ANDREJ||BRATOVŠ ANDREJA||MUSTAR JERNEJ
|-
| KMETIČ MIRJAM||Celična regulacija metabolizma železa||5,371||14.03.||17.03.||21.03.||MARIĆ TAMARA||REMŠKAR MAJA||KOMAN KATRA
|-
| JARC VERONIKA||Eksperimentalni modeli za študijo imunobiologije hepatitisa C||3.26||14.03.||21.03.||28.03.||REMŠKAR MAJA||MUSTAR JERNEJ||KEPIC LEA
|-
| KOMAN KATRA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Katra_Koman:_.09Pomen_dendritskih_celic_.28DCs.29_in_celic_ubijalk_.28NK.29_v_imunskem_odzivu_na_oku.C5.BEbo_z_virusom_HIV-1 Pomen dendritskih celic (DCs) in celic ubijalk (NK) v imunskem odzivu na okužbo z virusom HIV-1]||32.245||21.03.||25.03.||28.03.||ČUPOVIĆ VANA||KARNER TAJA||KMETIČ MIRJAM
|-
| OGRIS IZA||Zakaj imajo možgani glikogen?||5,125||14.03.||21.03.||28.03.||KNAPIČ EVA||BRGLEZ ŽIVA||VRANKAR ANDREJ
|-
| KERIN INES||Kanabinoidi za zdravljenje shizofrenije? Uravnotežena nevrokemična sestava za škodljive in terapevtske učinke uživanja konoplje||4.458||14.03.||21.03.||28.03.||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK||KERT DOMINIK
|-
| VERBANČIČ JANA||Apoptozi podobna smrt v bakterijah, ki jo povzroča HAMLET, človeški mlečni lipidno-proteinski kompleks||4.351||21.03.||28.03.||04.04.||KARNER TAJA||ZOTTEL ALJA||KNAPIČ EVA
|-
| KNAPIČ EVA||Kako virusi vodijo delovanje celice.||14.101||21.03.||28.03.||04.04.||ZALAR MATJA||POHLEVEN ŠPELA||LORBEK SARA
|-
| REMŽGAR ANA||Črevesna absorpcija vitamina D ne poteka le s pasivno difuzijo: dokazi za vpletenost enakih transporterjev kot pri holesterolu||4.356||21.03.||28.03.||04.04.||BOTONJIĆ SANDI||LORBEK SARA||ČUPOVIĆ VANA
|-
| GRDADOLNIK MAJA||Jedrni in nejedrni receptorji za estrogene||5.328||21.03.||28.03.||04.04.||MOHAR MAŠA||REMŽGAR ANA||FRANKO NIK
|-
| JAVORŠEK KAJA||Potencial matičnih celic pri Parkinsonovi bolezni in molekularni faktorji za tvorbo dopaminskih nevronov||4.139||28.03.||04.04.||11.04.||GEC KARMEN||MARIĆ TAMARA||RADOJKOVIĆ MARKO
|-
| BRATOVŠ ANDREJA||Vloga GPCR v patologiji Alzheimerjeve bolezni||26||28.03.||04.04.||11.04.||ZOTTEL ALJA||ČUPOVIĆ VANA||GRDADOLNIK MAJA
|-
| CRČEK MITJA||Matične celice in njihova vloga pri zdravljenju bolezni in poškodb||7.365||28.03.||04.04.||11.04.||BOHNEC IVO||KMETIČ MIRJAM||BRATOVŠ ANDREJA
|-
| MARIĆ TAMARA||Organizacija jedra||9.58||28.03.||04.04.||11.04.||NAVODNIK URŠKA||GEC KARMEN||REMŠKAR MAJA
|-
| ŠTEMBERGER ROK||povečano izražanje in imunogenosti HIV proteinov po inaktivaciji encimske aktivnosti||||04.04.||11.04.||18.04.||JAVORŠEK KAJA||VRANKAR ANDREJ||BOTONJIĆ SANDI
|-
| LORBEK SARA||Sovplivanje maščobnih kislin ter genov na adipokine in debelost||3.072||04.04.||11.04.||18.04.||POHLEVEN ŠPELA||KNAPIČ EVA||VENE ROK
|-
| REMŠKAR MAJA||Evolucijska dinamika transponibilnih elementov (TE) v majhnem RNA svetu||8.689||04.04.||11.04.||18.04.||KERIN INES||POVŠE KATJA||CRČEK MITJA
|-
| ČUPOVIĆ VANA||naslov||||04.04.||11.04.||18.04.||REMŽGAR ANA||VERBANČIČ JANA||RODE URŠKA
|-
| RODE URŠKA||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||GRDADOLNIK MAJA||FRANKO NIK||MARIĆ TAMARA
|-
| RADOJKOVIĆ MARKO||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||FRANKO NIK||VENE ROK||POVŠE KATJA
|-
| VENE ROK||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||VERBANČIČ JANA||NAVODNIK URŠKA||ZALAR MATJA
|-
| FRANKO NIK||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||ŠTEMBERGER ROK||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO
|-
| HROVAT KARMEN||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||KERT DOMINIK||JARC VERONIKA||KARNER TAJA
|-
| AMBROŽIČ MATEVŽ||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||LORBEK SARA||KEPIC LEA||REMŽGAR ANA
|-
| NAVODNIK URŠKA||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||AMBROŽIČ MATEVŽ||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK
|-
| BRGLEZ ŽIVA||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||DOLINAR ANA||BOTONJIĆ SANDI||JARC VERONIKA
|-
| KARNER TAJA||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||KOMAN KATRA||OGRIS IZA||NAVODNIK URŠKA
|-
| KERT DOMINIK||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||GORIČAN TJAŠA||GRDADOLNIK MAJA||RAUTER URŠKA
|-
| MUSTAR JERNEJ||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||JARC VERONIKA||AMBROŽIČ MATEVŽ||BRGLEZ ŽIVA
|-
| GEC KARMEN||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||POVŠE KATJA||ZALAR MATJA||AMBROŽIČ MATEVŽ
|-
| GORIČAN TJAŠA||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||KMETIČ MIRJAM||RODE URŠKA||POHLEVEN ŠPELA
|-
| BOHNEC IVO||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||CRČEK MITJA||GORIČAN TJAŠA||ŠTOK ULA
|-
| ŠTOK ULA||Mutacija mitohondrijske DNA v povezavi z rakom debelega črevesa kot posledica abnormalnega delovanja citokroma c oksidaze||||23.05.||30.05.||06.06.||BRGLEZ ŽIVA||DOLINAR ANA||KERIN INES
|-
| nihce ||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||BRATOVŠ ANDREJA||KOMAN KATRA||GEC KARMEN
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega osnova je znanstveni članek s področja biokemije, ki ga po želji izberete v reviji s področja biokemije, ki ima faktor vpliva večji kot 3 in je bil objavljen v letu 2011. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov! http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR
* osnovni članek in naslov pošljete meni, najkasneje pet dni pred rokom za oddajo (rok-5), da ocenim, če je primeren za predstavitev. Naslov vpišete v tabelo, takoj ko ste si ga izbrali!
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. Povezave do slik so dobrodošle, niso pa nujne.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Natisnjen seminar oddajte do roka vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava- 5 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFd3TGhLV3ZSa2xsLVlmMVVUaEFURWc6MA mnenje] najkasneje v treh dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar 2011

2011-04-01T20:34:38Z

SaraLorbek: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Slovenski naslov članka'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Faktor vpliva revije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| BOTONJIĆ SANDI||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Sandi_Botonji.C4.87:_Tioredoksinu_podoben_protein_.28TXNL2.29_.C5.A1.C4.8Diti_kancerogene_celice_pred_oksidativnim_stresom Tioredoksinu podoben protein (TXNL2) ščiti kancerogene celice pred oksidativnim stresom]
||15.387||28.02.||03.03.||07.03.||RODE URŠKA||KERIN INES||OGRIS IZA
|-
| VRANKAR ANDREJ||Število lasno-mešičnih matičnih celic se v plešastem lasišču moških z androgeno alopecijo ohranja za razliko od števila CD200-rich in CD34-positive lasno-mešičnih predniških celic||||28.02.||03.03.||07.03.||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO||JAVORŠEK KAJA
|-
| ZALAR MATJA||Protein p53||||28.02.||03.03.||07.03.||OGRIS IZA||CRČEK MITJA||ZOTTEL ALJA
|-
| ZOTTEL ALJA||Vloga imunskega sistema pri aterosklerozi||31.434||07.03.||10.03.||14.03.||RADOJKOVIĆ MARKO||KERT DOMINIK||HROVAT KARMEN
|-
| DOLINAR ANA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Ana_Dolinar:_Prilagojena_ali_prilagodljiva_imunost.3F_Primer_naravnih_celic_ubijalk Prirojena ali prilagodljiva imunost? Primer naravnih celic ubijalk]||28||07.03.||10.03.||14.03.||RAUTER URŠKA||MOHAR MAŠA||VERBANČIČ JANA
|-
| RAUTER URŠKA||Razvojna vloga Srf, kortikalnega citoskeleta in celične oblike v orientaciji epidermalnega vretena||19.527||07.03.||10.03.||14.03.||MUSTAR JERNEJ||JAVORŠEK KAJA||MOHAR MAŠA
|-
| MOHAR MAŠA||Sladkorna bolezen tipa 2 kot bolezen imunskega sistema||30,006||14.03.||17.03.||21.03.||VENE ROK||RAUTER URŠKA||GORIČAN TJAŠA
|-
| POHLEVEN ŠPELA||Prioni||34||14.03.||17.03.||21.03.||KEPIC LEA||RADOJKOVIĆ MARKO||DOLINAR ANA
|-
| KEPIC LEA||Agonisti adrenoreceptorjev β2||34.48||14.03.||17.03.||21.03.||VRANKAR ANDREJ||BRATOVŠ ANDREJA||MUSTAR JERNEJ
|-
| KMETIČ MIRJAM||Celična regulacija metabolizma železa||5,371||14.03.||17.03.||21.03.||MARIĆ TAMARA||REMŠKAR MAJA||KOMAN KATRA
|-
| JARC VERONIKA||Eksperimentalni modeli za študijo imunobiologije hepatitisa C||3.26||14.03.||21.03.||28.03.||REMŠKAR MAJA||MUSTAR JERNEJ||KEPIC LEA
|-
| KOMAN KATRA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Katra_Koman:_.09Pomen_dendritskih_celic_.28DCs.29_in_celic_ubijalk_.28NK.29_v_imunskem_odzivu_na_oku.C5.BEbo_z_virusom_HIV-1 Pomen dendritskih celic (DCs) in celic ubijalk (NK) v imunskem odzivu na okužbo z virusom HIV-1]||32.245||21.03.||25.03.||28.03.||ČUPOVIĆ VANA||KARNER TAJA||KMETIČ MIRJAM
|-
| OGRIS IZA||Zakaj imajo možgani glikogen?||5,125||14.03.||21.03.||28.03.||KNAPIČ EVA||BRGLEZ ŽIVA||VRANKAR ANDREJ
|-
| KERIN INES||Kanabinoidi za zdravljenje shizofrenije? Uravnotežena nevrokemična sestava za škodljive in terapevtske učinke uživanja konoplje||4.458||14.03.||21.03.||28.03.||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK||KERT DOMINIK
|-
| VERBANČIČ JANA||Apoptozi podobna smrt v bakterijah, ki jo povzroča HAMLET, človeški mlečni lipidno-proteinski kompleks||4.351||21.03.||28.03.||04.04.||KARNER TAJA||ZOTTEL ALJA||KNAPIČ EVA
|-
| KNAPIČ EVA||Kako virusi vodijo delovanje celice.||14.101||21.03.||28.03.||04.04.||ZALAR MATJA||POHLEVEN ŠPELA||LORBEK SARA
|-
| REMŽGAR ANA||Črevesna absorpcija vitamina D ne poteka le s pasivno difuzijo: dokazi za vpletenost enakih transporterjev kot pri holesterolu||4.356||21.03.||28.03.||04.04.||BOTONJIĆ SANDI||LORBEK SARA||ČUPOVIĆ VANA
|-
| GRDADOLNIK MAJA||Jedrni in nejedrni receptorji za estrogene||5.328||21.03.||28.03.||04.04.||MOHAR MAŠA||REMŽGAR ANA||FRANKO NIK
|-
| JAVORŠEK KAJA||Potencial matičnih celic pri Parkinsonovi bolezni in molekularni faktorji za tvorbo dopaminskih nevronov||4.139||28.03.||04.04.||11.04.||GEC KARMEN||MARIĆ TAMARA||RADOJKOVIĆ MARKO
|-
| BRATOVŠ ANDREJA||Vloga GPCR v patologiji Alzheimerjeve bolezni||26||28.03.||04.04.||11.04.||ZOTTEL ALJA||ČUPOVIĆ VANA||GRDADOLNIK MAJA
|-
| CRČEK MITJA||Matične celice in njihova vloga pri zdravljenju bolezni in poškodb||7.365||28.03.||04.04.||11.04.||BOHNEC IVO||KMETIČ MIRJAM||BRATOVŠ ANDREJA
|-
| MARIĆ TAMARA||Organizacija jedra||9.58||28.03.||04.04.||11.04.||NAVODNIK URŠKA||GEC KARMEN||REMŠKAR MAJA
|-
| ŠTEMBERGER ROK||povečano izražanje in imunogenosti HIV proteinov po inaktivaciji encimske aktivnosti||||04.04.||11.04.||18.04.||JAVORŠEK KAJA||VRANKAR ANDREJ||BOTONJIĆ SANDI
|-
| LORBEK SARA||Sovplivanje maščobnih kislin ter genov in debelost||3.072||04.04.||11.04.||18.04.||POHLEVEN ŠPELA||KNAPIČ EVA||VENE ROK
|-
| REMŠKAR MAJA||Evolucijska dinamika transponibilnih elementov (TE) v majhnem RNA svetu||8.689||04.04.||11.04.||18.04.||KERIN INES||POVŠE KATJA||CRČEK MITJA
|-
| ČUPOVIĆ VANA||naslov||||04.04.||11.04.||18.04.||REMŽGAR ANA||VERBANČIČ JANA||RODE URŠKA
|-
| RODE URŠKA||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||GRDADOLNIK MAJA||FRANKO NIK||MARIĆ TAMARA
|-
| RADOJKOVIĆ MARKO||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||FRANKO NIK||VENE ROK||POVŠE KATJA
|-
| VENE ROK||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||VERBANČIČ JANA||NAVODNIK URŠKA||ZALAR MATJA
|-
| FRANKO NIK||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||ŠTEMBERGER ROK||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO
|-
| HROVAT KARMEN||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||KERT DOMINIK||JARC VERONIKA||KARNER TAJA
|-
| AMBROŽIČ MATEVŽ||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||LORBEK SARA||KEPIC LEA||REMŽGAR ANA
|-
| NAVODNIK URŠKA||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||AMBROŽIČ MATEVŽ||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK
|-
| BRGLEZ ŽIVA||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||DOLINAR ANA||BOTONJIĆ SANDI||JARC VERONIKA
|-
| KARNER TAJA||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||KOMAN KATRA||OGRIS IZA||NAVODNIK URŠKA
|-
| KERT DOMINIK||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||GORIČAN TJAŠA||GRDADOLNIK MAJA||RAUTER URŠKA
|-
| MUSTAR JERNEJ||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||JARC VERONIKA||AMBROŽIČ MATEVŽ||BRGLEZ ŽIVA
|-
| GEC KARMEN||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||POVŠE KATJA||ZALAR MATJA||AMBROŽIČ MATEVŽ
|-
| GORIČAN TJAŠA||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||KMETIČ MIRJAM||RODE URŠKA||POHLEVEN ŠPELA
|-
| BOHNEC IVO||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||CRČEK MITJA||GORIČAN TJAŠA||ŠTOK ULA
|-
| ŠTOK ULA||Mutacija mitohondrijske DNA v povezavi z rakom debelega črevesa kot posledica abnormalnega delovanja citokroma c oksidaze||||23.05.||30.05.||06.06.||BRGLEZ ŽIVA||DOLINAR ANA||KERIN INES
|-
| nihce ||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||BRATOVŠ ANDREJA||KOMAN KATRA||GEC KARMEN
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega osnova je znanstveni članek s področja biokemije, ki ga po želji izberete v reviji s področja biokemije, ki ima faktor vpliva večji kot 3 in je bil objavljen v letu 2011. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov! http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR
* osnovni članek in naslov pošljete meni, najkasneje pet dni pred rokom za oddajo (rok-5), da ocenim, če je primeren za predstavitev. Naslov vpišete v tabelo, takoj ko ste si ga izbrali!
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. Povezave do slik so dobrodošle, niso pa nujne.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Natisnjen seminar oddajte do roka vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava- 5 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFd3TGhLV3ZSa2xsLVlmMVVUaEFURWc6MA mnenje] najkasneje v treh dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar 2011

2011-03-30T00:37:53Z

SaraLorbek: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Slovenski naslov članka'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Faktor vpliva revije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| BOTONJIĆ SANDI||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Sandi_Botonji.C4.87:_Tioredoksinu_podoben_protein_.28TXNL2.29_.C5.A1.C4.8Diti_kancerogene_celice_pred_oksidativnim_stresom Tioredoksinu podoben protein (TXNL2) ščiti kancerogene celice pred oksidativnim stresom]
||15.387||28.02.||03.03.||07.03.||RODE URŠKA||KERIN INES||OGRIS IZA
|-
| VRANKAR ANDREJ||Število lasno-mešičnih matičnih celic se v plešastem lasišču moških z androgeno alopecijo ohranja za razliko od števila CD200-rich in CD34-positive lasno-mešičnih predniških celic||||28.02.||03.03.||07.03.||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO||JAVORŠEK KAJA
|-
| ZALAR MATJA||Protein p53||||28.02.||03.03.||07.03.||OGRIS IZA||CRČEK MITJA||ZOTTEL ALJA
|-
| ZOTTEL ALJA||Vloga imunskega sistema pri aterosklerozi||31.434||07.03.||10.03.||14.03.||RADOJKOVIĆ MARKO||KERT DOMINIK||HROVAT KARMEN
|-
| DOLINAR ANA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Ana_Dolinar:_Prilagojena_ali_prilagodljiva_imunost.3F_Primer_naravnih_celic_ubijalk Prirojena ali prilagodljiva imunost? Primer naravnih celic ubijalk]||28||07.03.||10.03.||14.03.||RAUTER URŠKA||MOHAR MAŠA||VERBANČIČ JANA
|-
| RAUTER URŠKA||Razvojna vloga Srf, kortikalnega citoskeleta in celične oblike v orientaciji epidermalnega vretena||19.527||07.03.||10.03.||14.03.||MUSTAR JERNEJ||JAVORŠEK KAJA||MOHAR MAŠA
|-
| MOHAR MAŠA||Sladkorna bolezen tipa 2 kot bolezen imunskega sistema||30,006||14.03.||17.03.||21.03.||VENE ROK||RAUTER URŠKA||GORIČAN TJAŠA
|-
| POHLEVEN ŠPELA||Prioni||34||14.03.||17.03.||21.03.||KEPIC LEA||RADOJKOVIĆ MARKO||DOLINAR ANA
|-
| KEPIC LEA||Agonisti adrenoreceptorjev β2||34.48||14.03.||17.03.||21.03.||VRANKAR ANDREJ||BRATOVŠ ANDREJA||MUSTAR JERNEJ
|-
| KMETIČ MIRJAM||Celična regulacija metabolizma železa||5,371||14.03.||17.03.||21.03.||MARIĆ TAMARA||REMŠKAR MAJA||KOMAN KATRA
|-
| JARC VERONIKA||Eksperimentalni modeli za študijo imunobiologije hepatitisa C||3.26||14.03.||21.03.||28.03.||REMŠKAR MAJA||MUSTAR JERNEJ||KEPIC LEA
|-
| KOMAN KATRA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Katra_Koman:_.09Pomen_dendritskih_celic_.28DCs.29_in_celic_ubijalk_.28NK.29_v_imunskem_odzivu_na_oku.C5.BEbo_z_virusom_HIV-1 Pomen dendritskih celic (DCs) in celic ubijalk (NK) v imunskem odzivu na okužbo z virusom HIV-1]||32.245||21.03.||25.03.||28.03.||ČUPOVIĆ VANA||KARNER TAJA||KMETIČ MIRJAM
|-
| OGRIS IZA||Zakaj imajo možgani glikogen?||5,125||14.03.||21.03.||28.03.||KNAPIČ EVA||BRGLEZ ŽIVA||VRANKAR ANDREJ
|-
| KERIN INES||Kanabinoidi za zdravljenje shizofrenije? Uravnotežena nevrokemična sestava za škodljive in terapevtske učinke uživanja konoplje||4.458||14.03.||21.03.||28.03.||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK||KERT DOMINIK
|-
| VERBANČIČ JANA||Apoptozi podobna smrt v bakterijah, ki jo povzroča HAMLET, človeški mlečni lipidno-proteinski kompleks||4.351||21.03.||28.03.||04.04.||KARNER TAJA||ZOTTEL ALJA||KNAPIČ EVA
|-
| KNAPIČ EVA||Kako virusi vodijo delovanje celice.||14.101||21.03.||28.03.||04.04.||ZALAR MATJA||POHLEVEN ŠPELA||LORBEK SARA
|-
| REMŽGAR ANA||Črevesna absorpcija vitamina D ne poteka le s pasivno difuzijo: dokazi za vpletenost enakih transporterjev kot pri holesterolu||4.356||21.03.||28.03.||04.04.||BOTONJIĆ SANDI||LORBEK SARA||ČUPOVIĆ VANA
|-
| GRDADOLNIK MAJA||Jedrni in nejedrni receptorji za estrogene||5.328||21.03.||28.03.||04.04.||MOHAR MAŠA||REMŽGAR ANA||FRANKO NIK
|-
| JAVORŠEK KAJA||Potencial matičnih celic pri Parkinsonovi bolezni in molekularni faktorji za tvorbo dopaminskih nevronov||4.139||28.03.||04.04.||11.04.||GEC KARMEN||MARIĆ TAMARA||RADOJKOVIĆ MARKO
|-
| BRATOVŠ ANDREJA||Vloga GPCR v patologiji Alzheimerjeve bolezni||26||28.03.||04.04.||11.04.||ZOTTEL ALJA||ČUPOVIĆ VANA||GRDADOLNIK MAJA
|-
| CRČEK MITJA||Matične celice in njihova vloga pri zdravljenju bolezni in poškodb||7.365||28.03.||04.04.||11.04.||BOHNEC IVO||KMETIČ MIRJAM||BRATOVŠ ANDREJA
|-
| MARIĆ TAMARA||Organizacija jedra||9.58||28.03.||04.04.||11.04.||NAVODNIK URŠKA||GEC KARMEN||REMŠKAR MAJA
|-
| ŠTEMBERGER ROK||povečano izražanje in imunogenosti HIV proteinov po inaktivaciji encimske aktivnosti||||04.04.||11.04.||18.04.||JAVORŠEK KAJA||VRANKAR ANDREJ||BOTONJIĆ SANDI
|-
| LORBEK SARA||Sovplivanje maščobnih kislin ter genov, adipokini in debelost||3.072||04.04.||11.04.||18.04.||POHLEVEN ŠPELA||KNAPIČ EVA||VENE ROK
|-
| REMŠKAR MAJA||Evolucijska dinamika transponibilnih elementov (TE) v majhnem RNA svetu||8.689||04.04.||11.04.||18.04.||KERIN INES||POVŠE KATJA||CRČEK MITJA
|-
| ČUPOVIĆ VANA||naslov||||04.04.||11.04.||18.04.||REMŽGAR ANA||VERBANČIČ JANA||RODE URŠKA
|-
| RODE URŠKA||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||GRDADOLNIK MAJA||FRANKO NIK||MARIĆ TAMARA
|-
| RADOJKOVIĆ MARKO||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||FRANKO NIK||VENE ROK||POVŠE KATJA
|-
| VENE ROK||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||VERBANČIČ JANA||NAVODNIK URŠKA||ZALAR MATJA
|-
| FRANKO NIK||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||ŠTEMBERGER ROK||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO
|-
| HROVAT KARMEN||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||KERT DOMINIK||JARC VERONIKA||KARNER TAJA
|-
| AMBROŽIČ MATEVŽ||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||LORBEK SARA||KEPIC LEA||REMŽGAR ANA
|-
| NAVODNIK URŠKA||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||AMBROŽIČ MATEVŽ||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK
|-
| BRGLEZ ŽIVA||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||DOLINAR ANA||BOTONJIĆ SANDI||JARC VERONIKA
|-
| KARNER TAJA||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||KOMAN KATRA||OGRIS IZA||NAVODNIK URŠKA
|-
| KERT DOMINIK||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||GORIČAN TJAŠA||GRDADOLNIK MAJA||RAUTER URŠKA
|-
| MUSTAR JERNEJ||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||JARC VERONIKA||AMBROŽIČ MATEVŽ||BRGLEZ ŽIVA
|-
| GEC KARMEN||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||POVŠE KATJA||ZALAR MATJA||AMBROŽIČ MATEVŽ
|-
| GORIČAN TJAŠA||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||KMETIČ MIRJAM||RODE URŠKA||POHLEVEN ŠPELA
|-
| BOHNEC IVO||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||CRČEK MITJA||GORIČAN TJAŠA||ŠTOK ULA
|-
| ŠTOK ULA||Mutacija mitohondrijske DNA v povezavi z rakom debelega črevesa kot posledica abnormalnega delovanja citokroma c oksidaze||||23.05.||30.05.||06.06.||BRGLEZ ŽIVA||DOLINAR ANA||KERIN INES
|-
| nihce ||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||BRATOVŠ ANDREJA||KOMAN KATRA||GEC KARMEN
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega osnova je znanstveni članek s področja biokemije, ki ga po želji izberete v reviji s področja biokemije, ki ima faktor vpliva večji kot 3 in je bil objavljen v letu 2011. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov! http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR
* osnovni članek in naslov pošljete meni, najkasneje pet dni pred rokom za oddajo (rok-5), da ocenim, če je primeren za predstavitev. Naslov vpišete v tabelo, takoj ko ste si ga izbrali!
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. Povezave do slik so dobrodošle, niso pa nujne.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Natisnjen seminar oddajte do roka vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava- 5 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFd3TGhLV3ZSa2xsLVlmMVVUaEFURWc6MA mnenje] najkasneje v treh dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar 2011

2011-03-15T18:22:07Z

SaraLorbek: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Slovenski naslov članka'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Faktor vpliva revije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| BOTONJIĆ SANDI||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Sandi_Botonji.C4.87:_Tioredoksinu_podoben_protein_.28TXNL2.29_.C5.A1.C4.8Diti_kancerogene_celice_pred_oksidativnim_stresom Tioredoksinu podoben protein (TXNL2) ščiti kancerogene celice pred oksidativnim stresom]
||15.387||28.02.||03.03.||07.03.||RODE URŠKA||KERIN INES||OGRIS IZA
|-
| VRANKAR ANDREJ||Število lasno-mešičnih matičnih celic se v plešastem lasišču moških z androgeno alopecijo ohranja za razliko od števila CD200-rich in CD34-positive lasno-mešičnih predniških celic||||28.02.||03.03.||07.03.||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO||JAVORŠEK KAJA
|-
| ZALAR MATJA||Protein p53||||28.02.||03.03.||07.03.||OGRIS IZA||CRČEK MITJA||ZOTTEL ALJA
|-
| ZOTTEL ALJA||Vloga imunskega sistema pri aterosklerozi||31.434||07.03.||10.03.||14.03.||RADOJKOVIĆ MARKO||KERT DOMINIK||HROVAT KARMEN
|-
| DOLINAR ANA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Ana_Dolinar:_Prilagojena_ali_prilagodljiva_imunost.3F_Primer_naravnih_celic_ubijalk Prirojena ali prilagodljiva imunost? Primer naravnih celic ubijalk]||28||07.03.||10.03.||14.03.||RAUTER URŠKA||MOHAR MAŠA||VERBANČIČ JANA
|-
| RAUTER URŠKA||Razvojna vloga Srf, kortikalnega citoskeleta in celične oblike v orientaciji epidermalnega vretena||19.527||07.03.||10.03.||14.03.||MUSTAR JERNEJ||JAVORŠEK KAJA||MOHAR MAŠA
|-
| MOHAR MAŠA||Sladkorna bolezen tipa 2 kot bolezen imunskega sistema||30,006||14.03.||17.03.||21.03.||VENE ROK||RAUTER URŠKA||GORIČAN TJAŠA
|-
| POHLEVEN ŠPELA||Prioni||34||14.03.||17.03.||21.03.||KEPIC LEA||RADOJKOVIĆ MARKO||DOLINAR ANA
|-
| KEPIC LEA||Agonisti adrenoreceptorjev β2||34.48||14.03.||17.03.||21.03.||VRANKAR ANDREJ||BRATOVŠ ANDREJA||MUSTAR JERNEJ
|-
| KMETIČ MIRJAM||Celična regulacija metabolizma železa||5,371||14.03.||17.03.||21.03.||MARIĆ TAMARA||REMŠKAR MAJA||KOMAN KATRA
|-
| JARC VERONIKA||Eksperimentalni modeli za študijo imunobiologije hepatitisa C||3.26||14.03.||21.03.||28.03.||REMŠKAR MAJA||MUSTAR JERNEJ||KEPIC LEA
|-
| KOMAN KATRA||naslov||||16.03.||21.03.||28.03.||ČUPOVIĆ VANA||KARNER TAJA||KMETIČ MIRJAM
|-
| OGRIS IZA||Zakaj imajo možgani glikogen?||5,125||14.03.||21.03.||28.03.||KNAPIČ EVA||BRGLEZ ŽIVA||VRANKAR ANDREJ
|-
| KERIN INES||Kanabinoidi za zdravljenje shizofrenije? Uravnotežena nevrokemična sestava za škodljive in terapevtske učinke uživanja konoplje||4.458||14.03.||21.03.||28.03.||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK||KERT DOMINIK
|-
| VERBANČIČ JANA||Apoptozi podobna smrt v bakterijah, ki jo povzroča HAMLET, človeški mlečni lipidno-proteinski kompleks||4.351||21.03.||28.03.||04.04.||KARNER TAJA||ZOTTEL ALJA||KNAPIČ EVA
|-
| KNAPIČ EVA||Kako virusi vodijo delovanje celice.||14.101||21.03.||28.03.||04.04.||ZALAR MATJA||POHLEVEN ŠPELA||LORBEK SARA
|-
| REMŽGAR ANA||naslov||||21.03.||28.03.||04.04.||BOTONJIĆ SANDI||LORBEK SARA||ČUPOVIĆ VANA
|-
| GRDADOLNIK MAJA||naslov||||21.03.||28.03.||04.04.||MOHAR MAŠA||REMŽGAR ANA||FRANKO NIK
|-
| JAVORŠEK KAJA||Potencial matične celice pri Parkinsonovi bolezni in molekularni faktorji za tvorbo dopaminergičnih nevronov||4.139||28.03.||04.04.||11.04.||GEC KARMEN||MARIĆ TAMARA||RADOJKOVIĆ MARKO
|-
| BRATOVŠ ANDREJA||Vloga GPCR v patologiji Alzheimerjeve bolezni||26||28.03.||04.04.||11.04.||ZOTTEL ALJA||ČUPOVIĆ VANA||GRDADOLNIK MAJA
|-
| CRČEK MITJA||Matične celice||7.365||28.03.||04.04.||11.04.||BOHNEC IVO||KMETIČ MIRJAM||BRATOVŠ ANDREJA
|-
| MARIĆ TAMARA||ciljanje kemokinskih receptorjev ob alergijskih obolenjih||5.155||28.03.||04.04.||11.04.||NAVODNIK URŠKA||GEC KARMEN||REMŠKAR MAJA
|-
| ŠTEMBERGER ROK||povečano izražanje in imunogenosti HIV proteinov po inaktivaciji encimske aktivnosti||||04.04.||11.04.||18.04.||JAVORŠEK KAJA||VRANKAR ANDREJ||BOTONJIĆ SANDI
|-
| LORBEK SARA||Interakcije maščobna kislina - gen, adipokini in debelost||3.072||04.04.||11.04.||18.04.||POHLEVEN ŠPELA||KNAPIČ EVA||VENE ROK
|-
| REMŠKAR MAJA||naslov||||04.04.||11.04.||18.04.||KERIN INES||POVŠE KATJA||CRČEK MITJA
|-
| ČUPOVIĆ VANA||naslov||||04.04.||11.04.||18.04.||REMŽGAR ANA||VERBANČIČ JANA||RODE URŠKA
|-
| RODE URŠKA||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||GRDADOLNIK MAJA||FRANKO NIK||MARIĆ TAMARA
|-
| RADOJKOVIĆ MARKO||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||FRANKO NIK||VENE ROK||POVŠE KATJA
|-
| VENE ROK||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||VERBANČIČ JANA||NAVODNIK URŠKA||ZALAR MATJA
|-
| FRANKO NIK||naslov||||24.04.||03.05.||09.05.||ŠTEMBERGER ROK||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO
|-
| HROVAT KARMEN||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||KERT DOMINIK||JARC VERONIKA||KARNER TAJA
|-
| AMBROŽIČ MATEVŽ||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||LORBEK SARA||KEPIC LEA||REMŽGAR ANA
|-
| NAVODNIK URŠKA||naslov||||04.05.||09.05.||16.05.||AMBROŽIČ MATEVŽ||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK
|-
| BRGLEZ ŽIVA||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||DOLINAR ANA||BOTONJIĆ SANDI||JARC VERONIKA
|-
| KARNER TAJA||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||KOMAN KATRA||OGRIS IZA||NAVODNIK URŠKA
|-
| KERT DOMINIK||naslov||||09.05.||16.05.||23.05.||GORIČAN TJAŠA||GRDADOLNIK MAJA||RAUTER URŠKA
|-
| MUSTAR JERNEJ||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||JARC VERONIKA||AMBROŽIČ MATEVŽ||BRGLEZ ŽIVA
|-
| GEC KARMEN||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||POVŠE KATJA||ZALAR MATJA||AMBROŽIČ MATEVŽ
|-
| GORIČAN TJAŠA||naslov||||16.05.||23.05.||30.05.||KMETIČ MIRJAM||RODE URŠKA||POHLEVEN ŠPELA
|-
| BOHNEC IVO||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||CRČEK MITJA||GORIČAN TJAŠA||ŠTOK ULA
|-
| ŠTOK ULA||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||BRGLEZ ŽIVA||DOLINAR ANA||KERIN INES
|-
| nihce ||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||BRATOVŠ ANDREJA||KOMAN KATRA||GEC KARMEN
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega osnova je znanstveni članek s področja biokemije, ki ga po želji izberete v reviji s področja biokemije, ki ima faktor vpliva večji kot 3 in je bil objavljen v letu 2011. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov! http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR
* osnovni članek in naslov pošljete meni, najkasneje pet dni pred rokom za oddajo (rok-5), da ocenim, če je primeren za predstavitev. Naslov vpišete v tabelo, takoj ko ste si ga izbrali!
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. Povezave do slik so dobrodošle, niso pa nujne.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Natisnjen seminar oddajte do roka vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava- 5 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFd3TGhLV3ZSa2xsLVlmMVVUaEFURWc6MA mnenje] najkasneje v treh dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar 2011

2011-02-24T19:43:07Z

SaraLorbek: /* Seznam seminarjev */