Wiki FKKT - User contributions [en]

Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)

2021-06-06T19:20:01Z

Sasa.slabe:

<h3>Molekularne značilnosti SARS-CoV-2</h3>

Koronavirusi (CoV) sodijo v družino ''Coronaviridae'', ki se deli na štiri skupine: ''Alphacoronavirus'', ''Gammacoronavirus'', ''Deltacoronavirus'' in ''Betacoronavirus'', kamor uvrščamo SARS-CoV-2, ki povzroča koronavirusno bolezen oziroma COVID-19. Pri človeku povzročata bolezni skupin alfa in beta. Povzročajo dihalna obolenja pri ljudeh in gastrointestinalna obolenja pri živalih. Pri ljudeh so simptomi v glavnem blagi, z izjemoma pri imunokopromitiranih osebah kjer se lahko razvije pljučnica ali bronhitis. Vse do prve epidemije leta 2003, povzročene s strani SARS-CoV, so okužbe s koronavirusi veljale za nesmrtonosne. CoV je prešel preko direktnega kontakta iz živali, netopirjev, na človeka – torej gre za zoonotski prenos.

'''Struktura genoma SARS-CoV-2'''

Genom SARS-CoV-2 je enovijačna, pozitivno usmerjena RNA, dolga 29 903 nt, in zapisuje ~ 14 odprtih bralnih okvirjev – ORF ter ~ 29 proteinov. RNA zapis vsebuje 3' in 5' neprevajajoči regiji, 5'-kapo in poli(A)-rep na 3' koncu. Na 5' koncu se nahaja ORF1a/b, ki znaša približno dve tretjini celotne dolžine genoma ter zapisuje poliprotein 1a (pp1a) in poliprotein 1ab (pp1ab). Ostali ORF-ji, ki se nahajajo na 3' koncu zapisujejo strukturne proteine: protein bodice (S), membranski protein (M), proteini ovojnice (E) in proteini nukleokapside (N). Po vstopu viriona v tarčno celico se genomska RNA takoj prevede v dva polipretina 1a in 1ab, ki se procesirata v 16 nestrukturnih proteinov, ki skupaj tvorijo replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki se nahaja v dvojno-membranskih veziklih. Nastali kompleks vzame pozitivno usmerjeno genomsko RNA kot matrico za sintezo nove negativno usmerjene RNA, ki lahko služi kot matrica za transkripcijo pozitivno usmerjene subgenomske mRNA ali kot matrica za replikacijo genomske RNA. V zapisu za subgenomsko mRNA najdemo START kodon, zaporedje AUG, sam zapis pa po dolžini ni enak genomski RNA in služi kot mRNA za sintezo virusnih proteinov, ki se ne nahajajo v ORF1a/b. Če primerjamo genom SARS-CoV-2 z ostalimi koronavirus opazimo 54 % identičnost.

'''Protein S'''

Glikoprotein, ki je ključen v patogenezi SARS-CoV-2, saj se preko receptor vezavne domene RBD, na podenoti S1, veže na ACE2, ki je na gostiteljski celici. Regija RBD velja za najbolj variabilen dela SARS-CoV-2. Celoten protein je zgrajen iz 1273 aminokislinskih ostankov in sestavljen iz dveh podenot: S1 in S2. Podenota S1 je vključena v pritrditev viriona na gostiteljsko celico preko ACE2, sledi vstop virona v celico. Med vstopanjem v celico pride do konformacijskih sprememb proteina S. Podenota S2 sodeluje pri fuziji viriona in membrane tarčne celice. Tekom tega procesa se podenota S2 nahaja v treh različnih konformacijah.

<h3>Aktualne mutante in njihov pomen</h3>

Pri podvojevanju virusov stalno prihaja do napak, ki se zaradi odsotnosti popravljalnih mehanizmov ne popravijo in vodijo v mutacije, s tem pa v nastajanje novih sevov, ki imajo lahko pomembne implikacije za globalno zdravstvo. Nove porajajoče mutante SARS-CoV-2 se lahko hitreje širijo med ljudmi, lahko povzročajo spremenjeno obliko bolezni, se izognejo nekaterim diagnostičnim testom in zmanjšajo učinkovitost tarčnih zdravil in/ali cepiv. Virus SARS-CoV-2 sodi med viruse z dednim zapisov v obliki RNA, za katere je značilno, da pridobijo cca. eno napako na cikel podvojevanja. Koronavirusi sicer zaradi prisotnosti popravljalnega encima eksoribonukleaze mutirajo s ½ hitrostjo virusa gripe in ¼ hitrost virusa HIV. V januarju 2020 se je pojavila mutacija D614G, ki se je hitro razširila po svetu in do junija 2020 nadomestila prvi identificirani sev na Kitajskem, katerega izvor še ni natančno preučen. Ta mutacija omogoča hitrejše in učinkovitejše pritrjevanje virusa na receptor na človeških celicah.

Britanski sev se je pojavil septembra 2020 v Angliji in je povezan s hitrejšim širjenjem bolezni, ki pa ne poteka v težji obliki. Sev definira 23 mutacij, od katerih je najpomembnejša N501Y na mestu, kjer se protein S povezuje z receptorjem ACE2 in povzroči boljše povezovanje in tako večjo verjetnost okužbe. Druge pomembne mutacije so še del69/70, ki prav tako spremeni interakcijo z ACE2, in P681H, ki pripomore k hitrejšemu nastajanju proteina S v celicah.

Južnoafriški sev se je prvič pojavil v oktobru 2020. Trenutno ni dokazov, ki bi kazali da je povezan s težjim potekom bolezni, vendar pa se zaradi mutacij v regiji za vezavo na receptor lahko izogne protitelesom. Poleg mutacije N501Y, ki je enaka kot pri britanskem sevu, ima še dve pomembni mutaciji v regiji, ki se povezuje z receptorjem – K417N in E484K. Kombinacija teh mutacij spremeni obliko vezavnega dela in poveča možnost za pobeg imunskemu sistemu.

Brazilski sev so prvič karakterizirali v januarju 2021 in ima 17 unikatnih mutacij, najbolj značilne pa so mutacije, ki so prisotne tudi pri drugih sevih – K417T, E484K in N501Y. Različica je zelo podobna južnoafriškemu sevu in ima spremenjeno vezavo na receptor ACE2, hkrati pa analize kažejo večjo možnost ponovne infekcije s tem virusom po že preboleli bolezni.

Nigerijski sev so prvič odkrili avgusta 2020. Zanj je značilna mutacija P681H, ki je prisotna tudi pri britanskem sevu, a nima nobene druge mutacije značilne za britansko varianto. Trenutno ni nobenih dokazov, da bi se ta sev širil hitreje, povzročal težjo bolezen ali vplival na delovanje cepiv.

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:40:21Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 ('''2021'''). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7
 Avtorica povzetka: Saša Slabe

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije [1, 2].

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3 [1, 3].
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice [1].
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju [1].

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen [1].

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje [1]. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa [4]. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α [1].

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE [1].
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG [1].
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna [1].
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami [1].
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju [1].

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==
[1] Greenshpan, Y. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun. Biol.'' 4, 1–11 ('''2021''').
 [2] Stoiber, S. ''idr.'' Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. ''Cells'' 8, 472 ('''2019''').
 [3] Gargett, T. & Brown, M. P. The inducible caspase-9 suicide gene system as a „safety switch“ to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T-cells. ''Front. Pharmacol.'' 5 ('''2014''').
 [4] Arcot, S. S., Flemingtons, E. K. & Deiningerj, P. L. The Human Thymidine Kinase Gene Promoter. ''Journal of Biological Chemistry'' 264 ('''1989''').

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:40:07Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.
 

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 ('''2021'''). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7
 Avtorica povzetka: Saša Slabe

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije [1, 2].

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3 [1, 3].
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice [1].
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju [1].

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen [1].

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje [1]. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa [4]. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α [1].

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE [1].
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG [1].
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna [1].
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami [1].
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju [1].

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==
[1] Greenshpan, Y. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun. Biol.'' 4, 1–11 ('''2021''').
 [2] Stoiber, S. ''idr.'' Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. ''Cells'' 8, 472 ('''2019''').
 [3] Gargett, T. & Brown, M. P. The inducible caspase-9 suicide gene system as a „safety switch“ to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T-cells. ''Front. Pharmacol.'' 5 ('''2014''').
 [4] Arcot, S. S., Flemingtons, E. K. & Deiningerj, P. L. The Human Thymidine Kinase Gene Promoter. ''Journal of Biological Chemistry'' 264 ('''1989''').

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:39:44Z

Sasa.slabe: /* Literatura */

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:39:19Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 ('''2021'''). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7
 Avtorica povzetka: Saša Slabe

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije [1, 2].

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3 [1, 3].
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice [1].
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju [1].

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen [1].

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje [1]. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa [4]. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α [1].

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE [1].
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG [1].
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna [1].
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami [1].
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju [1].

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==

 [1] Greenshpan, Y. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun. Biol.'' 4, 1–11 ('''2021''').
 [2] Stoiber, S. ''idr.'' Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. ''Cells'' 8, 472 ('''2019''').
 [3] Gargett, T. & Brown, M. P. The inducible caspase-9 suicide gene system as a „safety switch“ to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T-cells. ''Front. Pharmacol.'' 5 ('''2014''').
 [4] Arcot, S. S., Flemingtons, E. K. & Deiningerj, P. L. The Human Thymidine Kinase Gene Promoter. ''Journal of Biological Chemistry'' 264 ('''1989''').

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:38:55Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 ('''2021'''). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7 
 Avtorica povzetka: Saša Slabe

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije [1, 2].

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3 [1, 3].
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice [1].
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju [1].

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen [1].

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje [1]. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa [4]. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α [1].

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE [1].
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG [1].
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna [1].
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami [1].
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju [1].

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==

 [1] Greenshpan, Y. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun. Biol.'' 4, 1–11 ('''2021''').
 [2] Stoiber, S. ''idr.'' Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. ''Cells'' 8, 472 ('''2019''').
 [3] Gargett, T. & Brown, M. P. The inducible caspase-9 suicide gene system as a „safety switch“ to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T-cells. ''Front. Pharmacol.'' 5 ('''2014''').
 [4] Arcot, S. S., Flemingtons, E. K. & Deiningerj, P. L. The Human Thymidine Kinase Gene Promoter. ''Journal of Biological Chemistry'' 264 ('''1989''').

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:38:39Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 ('''2021'''). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7 
Avtorica povzetka: Saša Slabe

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije [1, 2].

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3 [1, 3].
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice [1].
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju [1].

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen [1].

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje [1]. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa [4]. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α [1].

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE [1].
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG [1].
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna [1].
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami [1].
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju [1].

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==

 [1] Greenshpan, Y. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun. Biol.'' 4, 1–11 ('''2021''').
 [2] Stoiber, S. ''idr.'' Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. ''Cells'' 8, 472 ('''2019''').
 [3] Gargett, T. & Brown, M. P. The inducible caspase-9 suicide gene system as a „safety switch“ to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T-cells. ''Front. Pharmacol.'' 5 ('''2014''').
 [4] Arcot, S. S., Flemingtons, E. K. & Deiningerj, P. L. The Human Thymidine Kinase Gene Promoter. ''Journal of Biological Chemistry'' 264 ('''1989''').

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:38:23Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 ('''2021'''). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7 
Avtorica povzetka: Saša Slabe

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije [1, 2].

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3 [1, 3].
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice [1].
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju [1].

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen [1].

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje [1]. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa [4]. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α [1].

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE [1].
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG [1].
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna [1].
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami [1].
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju [1].

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==

 [1] Greenshpan, Y. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun. Biol.'' 4, 1–11 ('''2021''').
 [2] Stoiber, S. ''idr.'' Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. ''Cells'' 8, 472 ('''2019''').
 [3] Gargett, T. & Brown, M. P. The inducible caspase-9 suicide gene system as a „safety switch“ to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T-cells. ''Front. Pharmacol.'' 5 ('''2014''').
 [4] Arcot, S. S., Flemingtons, E. K. & Deiningerj, P. L. The Human Thymidine Kinase Gene Promoter. ''Journal of Biological Chemistry'' 264 ('''1989''').

Seminarji SB 2020/21

2021-05-17T16:36:34Z

Sasa.slabe:

[http://www.example.com link title]V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) 
# [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) 
#[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_humanih_CAR_imunskih_celic_z_napredno_logiko_in_porazdeljenim_računalništvom Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom] (Tjaša Mlakar) 
# [[Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu]] (Anže Karlek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Translacijski_nadzor_izražanja_encima_odstranjevalca_preko_s_toksinom_induciranega_miRNA_stikala Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala] (Ernestina Lavrih) 
# [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
# [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
# [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
# [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
# [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
# [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
# [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
# [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 
# [[Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače]] (Sabina Sladič Oblak) 
 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:35:54Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 ('''2021'''). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7 

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije [1, 2].

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3 [1, 3].
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice [1].
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju [1].

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen [1].

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje [1]. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa [4]. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α [1].

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE [1].
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG [1].
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna [1].
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami [1].
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju [1].

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==

 [1] Greenshpan, Y. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun. Biol.'' 4, 1–11 ('''2021''').
 [2] Stoiber, S. ''idr.'' Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. ''Cells'' 8, 472 ('''2019''').
 [3] Gargett, T. & Brown, M. P. The inducible caspase-9 suicide gene system as a „safety switch“ to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T-cells. ''Front. Pharmacol.'' 5 ('''2014''').
 [4] Arcot, S. S., Flemingtons, E. K. & Deiningerj, P. L. The Human Thymidine Kinase Gene Promoter. ''Journal of Biological Chemistry'' 264 ('''1989''').

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:34:58Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 ('''2021'''). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7 

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije [1,2].

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3 [1,3].
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice [1].
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici [1].
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju [1].

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen [1].

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje [1]. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa [4]. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α [1].

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE [1].
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG [1].
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna [1].
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami [1].
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju [1].

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==

 [1] Greenshpan, Y. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun. Biol.'' 4, 1–11 ('''2021''').
 [2] Stoiber, S. ''idr.'' Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. ''Cells'' 8, 472 ('''2019''').
 [3] Gargett, T. & Brown, M. P. The inducible caspase-9 suicide gene system as a „safety switch“ to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T-cells. ''Front. Pharmacol.'' 5 ('''2014''').
 [4] Arcot, S. S., Flemingtons, E. K. & Deiningerj, P. L. The Human Thymidine Kinase Gene Promoter. ''Journal of Biological Chemistry'' 264 ('''1989''').

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:24:17Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''et al.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 (2021). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7 

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije.

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3.
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice.
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju.

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen.

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α.

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE.
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG.
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna.
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami.
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju.

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:16:45Z

Sasa.slabe:

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop CAR-T celične terapije oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev CAR-T terapije so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib tega učinka so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na tumorske celice.

Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''et al.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 (2021). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7 

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom za CAR. PO pomnoževanju celice le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije.

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v prestavljeni študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev. Vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ta gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3.
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice.
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju.

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se Greenshpan in sod. težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse pristne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen.

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector) in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α.

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6 – enega GCPRE odzivnega elementa in skrajšanega KCPRE.
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona.
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna.
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami.
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju.

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. 
 Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==

Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

2021-05-17T16:15:21Z

Sasa.slabe: New page: Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki po...

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop CAR-T celične terapije oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
Velika omejitev CAR-T terapije so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib tega učinka so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na tumorske celice.

Povzeto po članku: 

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom za CAR. PO pomnoževanju celice le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije.

S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v prestavljeni študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev. Vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme:
 a) Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T. Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ta gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3.
 b) Inhibicija delovanja celice CAR-T. Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice.
 c) Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR. Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
 d) Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR. Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju.

== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se Greenshpan in sod. težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse pristne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen.

Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector) in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje. 

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α.

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6 – enega GCPRE odzivnega elementa in skrajšanega KCPRE.
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ====
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona.
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ====
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna.
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ====
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami.
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ====
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju.

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.

Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. 
 Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. 

== Literatura ==

Seminarji SB 2020/21

2021-05-14T11:18:37Z

Sasa.slabe:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) 
# [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) 
# [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) 
 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
# [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
# [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
# [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
# [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
# [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
# [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
# [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 
 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum

2021-04-13T19:54:09Z

Sasa.slabe: /* Literatura */

N-metilantranilat (NMA) je N-funkcionalizirana aminokislina, ki je pri rastlinah intermediat biosinteze akridonskih alkaloidov. Nastane z od S-adenozil metionina (SAM) odvisno metilacijo in inducira sintezo N-metiliranih akridonskih alkaloidov in avenacina v rastlinah. Industrijsko se uporablja kot prekurzor bioaktivnih komponent, kot so protirakave učinkovine akridonski alkaloidi, ki delujejo kot inhibitorji topoizomeraze, protibolečinski alkaloid O-izopropil-NMA, aromatična spojina O-metil-NMA ali kot gradniki peptidnih zdravil [1].

== N-funkcionalizacija aminokislin ==
Proces N-funkcionalizacije najdemo v vseh domenah življenja, produkti le te pa so vključeni v številne biološke vloge. Tehnološko je dobro poznana kemična sinteza N-alkiliranih aminokislin, ki pa ima nizke izkoristke, uporablja toksične reagente, pride pa tudi do prekomerne metilacije in nezadostne čistosti nastalih enantiomerov. Encimski postopek z N-metiltransferazami na drugi strani pa je močno odvisen od sistema za regeneracijo kofaktorjev. V predstavljenem delu so avtorji pripravili sistem za proizvodnjo NMA preko metabolnega inženirstva bakterije ''Corynebacterium glutamicum'' transformirane z genom za antranilat N-metiltransferazo (ANMT) iz vinske rutice [1].

== Izbor sevov za eksperimentalno delo ==
V raziskavi so uporabljali ''C. glutamicum'', ki je zelo pogosto uporabljena bakterija za industrijsko proizvodnjo aminokislin. Gre za G+ talno bakterijo, ki raste na preprostih gojiščih z dodanimi mineralnimi snovmi, kot vir ogljika pa lahko uporabi različne sladkorje, citrat in alkohole. Specifični sev, ki so ga uporabili, je ''C. glutamicum'' C1* z za 13,4 % zmanjšanim genomom in robustno odpornostjo na okoljske strese [1, 2, 3].
Plazmide so konstruirali v celicah ''E. coli'' DH5α in ''E.coli'' S17. Pripravili so dva tipa plazmidov in sicer pGold, kot prenosljivi ekspresijski vektor s prepoznavnim mestom za BsaI, in pK19mobsacB, ki je bil uporabljen za konstrukcijo insercij in delecij v ''C. glutamicum'' C1* [1, 4].

== Potek eksperimentalnega dela ==
''C. glutamicum'' je pogosto uporabljena za fermentacijsko proizvodnjo aminokislin, ampak še ni bila spremenjena za proizvodnjo NMA, zato so morali sprva preveriti, če bakterija sploh lahko raste pri visokih koncentracijah antranilata in NMA. Preverjali so rast pri različnih koncentracijah in ugotovili, da sev ni pretvarjal dodanih snovi, koncentracije pa so ostajale podobne tekom kultivacije. Zaključili so, da je sev primeren za produkcijo NMA [1].

Antranilat je intermediat šikimatne sintezne poti, zato so sev ''C. glutamicum'' C1* optimizirali za nastajanje intermediatov, odstranili ozka grla in zmanjšali nastajanje stranskih produktov. Izvedli so homologne rekombinacije z uporabo vektorja pK19mobsacB. Homologne predele so pridobili iz wt ''C. glutamicum'' in jih preko Gibsonovega sestavljanja vstavili v razrezani vektor. Prenos pripravljenega vektorja v bakterije so izvedli s transkonjugacijo iz ''E. coli'' S17. Selekcija je potekala preko kanamicinske rezistence in preko neobčutljivosti na sukrozo [1, 4].

Najprej so v genom vstavili gen ''aroG'' in nadalje deletirali ''ldhA'' gen za laktat dehidrogenazo-A. Deletirali so regulatorni ''sugR'' gen ter s tem povečali ekspresijo genov glikolize in privzem sladkorjev in dodali še gen ''aroR'' za translacijski regulatorni vodilni peptid gena ''aroF'' – tako so se znebili negativne translacijske kontrole izražanja. Operon ''qsuABCD'' so nadomestili s ''qsuC'' z močnim konstitutivnim Ptuf promotorjem. Gen za fosfoenolpiruvat karboksilazo ''ppc'' so zamenjali z dodatno kopijo endogenega ''aroB'', kar je povečalo dovajanje fosfoenol piruvata v šikimatno pot. Da bi povečali sintezo drugega prekurzorja šikimatne poti eritroze-4-fosfata, so nativni promotor gena za transketolazo ''tkt'' nadomestili s Ptuf promotorjem. Zamenjali so še gen ''iolR'', v odsotnosti katerega je dereguliran operon za katabolizen inozitola, in ''pck'' gen za fosfoenolpiruvat karbokinazo. Nazadnje so v genom še vrnili gen za ''sugR'' transkripcijski regulator. Tako so z metabolnim inženirstvom dobili sev, ki proizvaja več antranilata [1].

NMA se sintetizira iz antranilata v enostopenjski reakciji z ANMT. Gen za ANMT so vstavili preko vektorja pGold, ki so ga pripravili s spremembo pEC-XK99E, da je postal uporaben za Golden Gate modularno sestavljanje. Naravno zaporedje gena ''ANMT'' so kodonsko optimizirali in sestavili s kompatibilnimi previsnimi konci. Dodali so še ''sahH'' gen za S-adenozil homocisteinazo in ga z elektroporacijo vnesli v celice [1].

== Priložnosti za prihodnost ==
S tem delom so pripravili sistem za učinkovito proizvodnjo NMA z rastlinskim genom za encim ANMT v ''C. glutamicum'', kar lahko predstavlja pomemben nov način priprave NMA in drugih industrijsko in medicinsko pomembnih snovi, ki jih dobimo iz tega prekurzorja. V metabolizmu ''C. glutamicum'' so še vedno prisotna nekatera ozka grla, kot sta nepopolna konverzija šikimata v antranilat, in nepopolna N-metilacija antranilata z od-SAM-odvisno ANMT. To raziskovalno delo je odlična točka za nadaljnje spremembe, ki bi naslovile še obstoječe težave in optimizirale proizvodnjo NMA, ki sedaj dosega 0,34 g/L [1].

== Literatura ==
[1] Walter T, Al Medani N, Burgardt A, et al. Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. ''Microorganisms''. '''2020''';8(6):866.

[2] Gopinath V, Nampoothiri KM. ''Corynebacterium glutamicum''. Encyclopedia of Food Microbiology: Second Edition. ''Elsevier Inc''.; '''2014''':504–517.

[3] Baumgart M, Unthan S, Kloß R, et al. ''Corynebacterium glutamicum'' Chassis C1∗: Building and Testing a Novel Platform Host for Synthetic Biology and Industrial Biotechnology. ''ACS Synth Biol''. '''2018''';7(1):132–144.

[4] Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the ''Escherichia coli'' plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of ''Corynebacterium glutamicum''. ''Gene''. '''1994''';145(1):69–73.

Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum

2021-04-13T19:53:31Z

Sasa.slabe: /* Literatura */

N-metilantranilat (NMA) je N-funkcionalizirana aminokislina, ki je pri rastlinah intermediat biosinteze akridonskih alkaloidov. Nastane z od S-adenozil metionina (SAM) odvisno metilacijo in inducira sintezo N-metiliranih akridonskih alkaloidov in avenacina v rastlinah. Industrijsko se uporablja kot prekurzor bioaktivnih komponent, kot so protirakave učinkovine akridonski alkaloidi, ki delujejo kot inhibitorji topoizomeraze, protibolečinski alkaloid O-izopropil-NMA, aromatična spojina O-metil-NMA ali kot gradniki peptidnih zdravil [1].

== N-funkcionalizacija aminokislin ==
Proces N-funkcionalizacije najdemo v vseh domenah življenja, produkti le te pa so vključeni v številne biološke vloge. Tehnološko je dobro poznana kemična sinteza N-alkiliranih aminokislin, ki pa ima nizke izkoristke, uporablja toksične reagente, pride pa tudi do prekomerne metilacije in nezadostne čistosti nastalih enantiomerov. Encimski postopek z N-metiltransferazami na drugi strani pa je močno odvisen od sistema za regeneracijo kofaktorjev. V predstavljenem delu so avtorji pripravili sistem za proizvodnjo NMA preko metabolnega inženirstva bakterije ''Corynebacterium glutamicum'' transformirane z genom za antranilat N-metiltransferazo (ANMT) iz vinske rutice [1].

== Izbor sevov za eksperimentalno delo ==
V raziskavi so uporabljali ''C. glutamicum'', ki je zelo pogosto uporabljena bakterija za industrijsko proizvodnjo aminokislin. Gre za G+ talno bakterijo, ki raste na preprostih gojiščih z dodanimi mineralnimi snovmi, kot vir ogljika pa lahko uporabi različne sladkorje, citrat in alkohole. Specifični sev, ki so ga uporabili, je ''C. glutamicum'' C1* z za 13,4 % zmanjšanim genomom in robustno odpornostjo na okoljske strese [1, 2, 3].
Plazmide so konstruirali v celicah ''E. coli'' DH5α in ''E.coli'' S17. Pripravili so dva tipa plazmidov in sicer pGold, kot prenosljivi ekspresijski vektor s prepoznavnim mestom za BsaI, in pK19mobsacB, ki je bil uporabljen za konstrukcijo insercij in delecij v ''C. glutamicum'' C1* [1, 4].

== Potek eksperimentalnega dela ==
''C. glutamicum'' je pogosto uporabljena za fermentacijsko proizvodnjo aminokislin, ampak še ni bila spremenjena za proizvodnjo NMA, zato so morali sprva preveriti, če bakterija sploh lahko raste pri visokih koncentracijah antranilata in NMA. Preverjali so rast pri različnih koncentracijah in ugotovili, da sev ni pretvarjal dodanih snovi, koncentracije pa so ostajale podobne tekom kultivacije. Zaključili so, da je sev primeren za produkcijo NMA [1].

Antranilat je intermediat šikimatne sintezne poti, zato so sev ''C. glutamicum'' C1* optimizirali za nastajanje intermediatov, odstranili ozka grla in zmanjšali nastajanje stranskih produktov. Izvedli so homologne rekombinacije z uporabo vektorja pK19mobsacB. Homologne predele so pridobili iz wt ''C. glutamicum'' in jih preko Gibsonovega sestavljanja vstavili v razrezani vektor. Prenos pripravljenega vektorja v bakterije so izvedli s transkonjugacijo iz ''E. coli'' S17. Selekcija je potekala preko kanamicinske rezistence in preko neobčutljivosti na sukrozo [1, 4].

Najprej so v genom vstavili gen ''aroG'' in nadalje deletirali ''ldhA'' gen za laktat dehidrogenazo-A. Deletirali so regulatorni ''sugR'' gen ter s tem povečali ekspresijo genov glikolize in privzem sladkorjev in dodali še gen ''aroR'' za translacijski regulatorni vodilni peptid gena ''aroF'' – tako so se znebili negativne translacijske kontrole izražanja. Operon ''qsuABCD'' so nadomestili s ''qsuC'' z močnim konstitutivnim Ptuf promotorjem. Gen za fosfoenolpiruvat karboksilazo ''ppc'' so zamenjali z dodatno kopijo endogenega ''aroB'', kar je povečalo dovajanje fosfoenol piruvata v šikimatno pot. Da bi povečali sintezo drugega prekurzorja šikimatne poti eritroze-4-fosfata, so nativni promotor gena za transketolazo ''tkt'' nadomestili s Ptuf promotorjem. Zamenjali so še gen ''iolR'', v odsotnosti katerega je dereguliran operon za katabolizen inozitola, in ''pck'' gen za fosfoenolpiruvat karbokinazo. Nazadnje so v genom še vrnili gen za ''sugR'' transkripcijski regulator. Tako so z metabolnim inženirstvom dobili sev, ki proizvaja več antranilata [1].

NMA se sintetizira iz antranilata v enostopenjski reakciji z ANMT. Gen za ANMT so vstavili preko vektorja pGold, ki so ga pripravili s spremembo pEC-XK99E, da je postal uporaben za Golden Gate modularno sestavljanje. Naravno zaporedje gena ''ANMT'' so kodonsko optimizirali in sestavili s kompatibilnimi previsnimi konci. Dodali so še ''sahH'' gen za S-adenozil homocisteinazo in ga z elektroporacijo vnesli v celice [1].

== Priložnosti za prihodnost ==
S tem delom so pripravili sistem za učinkovito proizvodnjo NMA z rastlinskim genom za encim ANMT v ''C. glutamicum'', kar lahko predstavlja pomemben nov način priprave NMA in drugih industrijsko in medicinsko pomembnih snovi, ki jih dobimo iz tega prekurzorja. V metabolizmu ''C. glutamicum'' so še vedno prisotna nekatera ozka grla, kot sta nepopolna konverzija šikimata v antranilat, in nepopolna N-metilacija antranilata z od-SAM-odvisno ANMT. To raziskovalno delo je odlična točka za nadaljnje spremembe, ki bi naslovile še obstoječe težave in optimizirale proizvodnjo NMA, ki sedaj dosega 0,34 g/L [1].

== Literatura ==
[1] Walter T, Al Medani N, Burgardt A, et al. Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. ''Microorganisms''. '''2020''';8(6):866. doi:[10.3390/microorganisms8060866]

[2] Gopinath V, Nampoothiri KM. ''Corynebacterium glutamicum''. Encyclopedia of Food Microbiology: Second Edition. ''Elsevier Inc''.; '''2014''':504–517. doi:[10.1016/B978-0-12-384730-0.00076-8]

[3] Baumgart M, Unthan S, Kloß R, et al. ''Corynebacterium glutamicum'' Chassis C1∗: Building and Testing a Novel Platform Host for Synthetic Biology and Industrial Biotechnology. ''ACS Synth Biol''. '''2018''';7(1):132–144. doi:[10.1021/acssynbio.7b00261]

[4] Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the ''Escherichia coli'' plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of ''Corynebacterium glutamicum''. ''Gene''. '''1994''';145(1):69–73. doi:[10.1016/0378-1119(94)90324-7]

Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum

2021-04-13T19:47:58Z

Sasa.slabe: /* Potek eksperimentalnega dela */

N-metilantranilat (NMA) je N-funkcionalizirana aminokislina, ki je pri rastlinah intermediat biosinteze akridonskih alkaloidov. Nastane z od S-adenozil metionina (SAM) odvisno metilacijo in inducira sintezo N-metiliranih akridonskih alkaloidov in avenacina v rastlinah. Industrijsko se uporablja kot prekurzor bioaktivnih komponent, kot so protirakave učinkovine akridonski alkaloidi, ki delujejo kot inhibitorji topoizomeraze, protibolečinski alkaloid O-izopropil-NMA, aromatična spojina O-metil-NMA ali kot gradniki peptidnih zdravil [1].

== N-funkcionalizacija aminokislin ==
Proces N-funkcionalizacije najdemo v vseh domenah življenja, produkti le te pa so vključeni v številne biološke vloge. Tehnološko je dobro poznana kemična sinteza N-alkiliranih aminokislin, ki pa ima nizke izkoristke, uporablja toksične reagente, pride pa tudi do prekomerne metilacije in nezadostne čistosti nastalih enantiomerov. Encimski postopek z N-metiltransferazami na drugi strani pa je močno odvisen od sistema za regeneracijo kofaktorjev. V predstavljenem delu so avtorji pripravili sistem za proizvodnjo NMA preko metabolnega inženirstva bakterije ''Corynebacterium glutamicum'' transformirane z genom za antranilat N-metiltransferazo (ANMT) iz vinske rutice [1].

== Izbor sevov za eksperimentalno delo ==
V raziskavi so uporabljali ''C. glutamicum'', ki je zelo pogosto uporabljena bakterija za industrijsko proizvodnjo aminokislin. Gre za G+ talno bakterijo, ki raste na preprostih gojiščih z dodanimi mineralnimi snovmi, kot vir ogljika pa lahko uporabi različne sladkorje, citrat in alkohole. Specifični sev, ki so ga uporabili, je ''C. glutamicum'' C1* z za 13,4 % zmanjšanim genomom in robustno odpornostjo na okoljske strese [1, 2, 3].
Plazmide so konstruirali v celicah ''E. coli'' DH5α in ''E.coli'' S17. Pripravili so dva tipa plazmidov in sicer pGold, kot prenosljivi ekspresijski vektor s prepoznavnim mestom za BsaI, in pK19mobsacB, ki je bil uporabljen za konstrukcijo insercij in delecij v ''C. glutamicum'' C1* [1, 4].

== Potek eksperimentalnega dela ==
''C. glutamicum'' je pogosto uporabljena za fermentacijsko proizvodnjo aminokislin, ampak še ni bila spremenjena za proizvodnjo NMA, zato so morali sprva preveriti, če bakterija sploh lahko raste pri visokih koncentracijah antranilata in NMA. Preverjali so rast pri različnih koncentracijah in ugotovili, da sev ni pretvarjal dodanih snovi, koncentracije pa so ostajale podobne tekom kultivacije. Zaključili so, da je sev primeren za produkcijo NMA [1].

Antranilat je intermediat šikimatne sintezne poti, zato so sev ''C. glutamicum'' C1* optimizirali za nastajanje intermediatov, odstranili ozka grla in zmanjšali nastajanje stranskih produktov. Izvedli so homologne rekombinacije z uporabo vektorja pK19mobsacB. Homologne predele so pridobili iz wt ''C. glutamicum'' in jih preko Gibsonovega sestavljanja vstavili v razrezani vektor. Prenos pripravljenega vektorja v bakterije so izvedli s transkonjugacijo iz ''E. coli'' S17. Selekcija je potekala preko kanamicinske rezistence in preko neobčutljivosti na sukrozo [1, 4].

Najprej so v genom vstavili gen ''aroG'' in nadalje deletirali ''ldhA'' gen za laktat dehidrogenazo-A. Deletirali so regulatorni ''sugR'' gen ter s tem povečali ekspresijo genov glikolize in privzem sladkorjev in dodali še gen ''aroR'' za translacijski regulatorni vodilni peptid gena ''aroF'' – tako so se znebili negativne translacijske kontrole izražanja. Operon ''qsuABCD'' so nadomestili s ''qsuC'' z močnim konstitutivnim Ptuf promotorjem. Gen za fosfoenolpiruvat karboksilazo ''ppc'' so zamenjali z dodatno kopijo endogenega ''aroB'', kar je povečalo dovajanje fosfoenol piruvata v šikimatno pot. Da bi povečali sintezo drugega prekurzorja šikimatne poti eritroze-4-fosfata, so nativni promotor gena za transketolazo ''tkt'' nadomestili s Ptuf promotorjem. Zamenjali so še gen ''iolR'', v odsotnosti katerega je dereguliran operon za katabolizen inozitola, in ''pck'' gen za fosfoenolpiruvat karbokinazo. Nazadnje so v genom še vrnili gen za ''sugR'' transkripcijski regulator. Tako so z metabolnim inženirstvom dobili sev, ki proizvaja več antranilata [1].

NMA se sintetizira iz antranilata v enostopenjski reakciji z ANMT. Gen za ANMT so vstavili preko vektorja pGold, ki so ga pripravili s spremembo pEC-XK99E, da je postal uporaben za Golden Gate modularno sestavljanje. Naravno zaporedje gena ''ANMT'' so kodonsko optimizirali in sestavili s kompatibilnimi previsnimi konci. Dodali so še ''sahH'' gen za S-adenozil homocisteinazo in ga z elektroporacijo vnesli v celice [1].

== Priložnosti za prihodnost ==
S tem delom so pripravili sistem za učinkovito proizvodnjo NMA z rastlinskim genom za encim ANMT v ''C. glutamicum'', kar lahko predstavlja pomemben nov način priprave NMA in drugih industrijsko in medicinsko pomembnih snovi, ki jih dobimo iz tega prekurzorja. V metabolizmu ''C. glutamicum'' so še vedno prisotna nekatera ozka grla, kot sta nepopolna konverzija šikimata v antranilat, in nepopolna N-metilacija antranilata z od-SAM-odvisno ANMT. To raziskovalno delo je odlična točka za nadaljnje spremembe, ki bi naslovile še obstoječe težave in optimizirale proizvodnjo NMA, ki sedaj dosega 0,34 g/L [1].

== Literatura ==
[1] Walter T, Al Medani N, Burgardt A, idr. Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered Corynebacterium glutamicum.Microogranisms. 2020. doi:10.3390/microorganisms8060866

[2] Gopinath V, Nampoothiri KM. Corynebacterium glutamicum. V: Encyclopedia of Food Microbiology: Second Edition. Elsevier Inc.; 2014:504–517. doi:10.1016/B978-0-12-384730-0.00076-8

[3] Baumgart M, Unthan S, Kloß R, idr. Corynebacterium glutamicum Chassis C1∗: Building and Testing a Novel Platform Host for Synthetic Biology and Industrial Biotechnology. ACS Synth Biol. 2018;7(1):132–144. doi:10.1021/acssynbio.7b00261

[4] Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69–73. doi:10.1016/0378-1119(94)90324-7

Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum

2021-04-13T19:47:08Z

Sasa.slabe: New page: N-metilantranilat (NMA) je N-funkcionalizirana aminokislina, ki je pri rastlinah intermediat biosinteze akridonskih alkaloidov. Nastane z od S-adenozil metionina (SAM) odvisno metilacijo i...

N-metilantranilat (NMA) je N-funkcionalizirana aminokislina, ki je pri rastlinah intermediat biosinteze akridonskih alkaloidov. Nastane z od S-adenozil metionina (SAM) odvisno metilacijo in inducira sintezo N-metiliranih akridonskih alkaloidov in avenacina v rastlinah. Industrijsko se uporablja kot prekurzor bioaktivnih komponent, kot so protirakave učinkovine akridonski alkaloidi, ki delujejo kot inhibitorji topoizomeraze, protibolečinski alkaloid O-izopropil-NMA, aromatična spojina O-metil-NMA ali kot gradniki peptidnih zdravil [1].

== N-funkcionalizacija aminokislin ==
Proces N-funkcionalizacije najdemo v vseh domenah življenja, produkti le te pa so vključeni v številne biološke vloge. Tehnološko je dobro poznana kemična sinteza N-alkiliranih aminokislin, ki pa ima nizke izkoristke, uporablja toksične reagente, pride pa tudi do prekomerne metilacije in nezadostne čistosti nastalih enantiomerov. Encimski postopek z N-metiltransferazami na drugi strani pa je močno odvisen od sistema za regeneracijo kofaktorjev. V predstavljenem delu so avtorji pripravili sistem za proizvodnjo NMA preko metabolnega inženirstva bakterije ''Corynebacterium glutamicum'' transformirane z genom za antranilat N-metiltransferazo (ANMT) iz vinske rutice [1].

== Izbor sevov za eksperimentalno delo ==
V raziskavi so uporabljali ''C. glutamicum'', ki je zelo pogosto uporabljena bakterija za industrijsko proizvodnjo aminokislin. Gre za G+ talno bakterijo, ki raste na preprostih gojiščih z dodanimi mineralnimi snovmi, kot vir ogljika pa lahko uporabi različne sladkorje, citrat in alkohole. Specifični sev, ki so ga uporabili, je ''C. glutamicum'' C1* z za 13,4 % zmanjšanim genomom in robustno odpornostjo na okoljske strese [1, 2, 3].
Plazmide so konstruirali v celicah ''E. coli'' DH5α in ''E.coli'' S17. Pripravili so dva tipa plazmidov in sicer pGold, kot prenosljivi ekspresijski vektor s prepoznavnim mestom za BsaI, in pK19mobsacB, ki je bil uporabljen za konstrukcijo insercij in delecij v ''C. glutamicum'' C1* [1, 4].

== Potek eksperimentalnega dela ==
''C. glutamicum'' je pogosto uporabljena za fermentacijsko proizvodnjo aminokislin, ampak še ni bila spremenjena za proizvodnjo NMA, zato so morali sprva preveriti, če bakterija sploh lahko raste pri visokih koncentracijah antranilata in NMA. Preverjali so rast pri različnih koncentracijah in ugotovili, da sev ni pretvarjal dodanih snovi, koncentracije pa so ostajale podobne tekom kultivacije. Zaključili so, da je sev primeren za produkcijo NMA [1].

Antranilat je intermediat šikimatne sintezne poti, zato so sev ''C. glutamicum'' C1* optimizirali za nastajanje intermediatov, odstranili ozka grla in zmanjšali nastajanje stranskih produktov. Izvedli so homologne rekombinacije z uporabo vektorja pK19mobsacB. Homologne predele so pridobili iz wt ''C. glutamicum'' in jih preko Gibsonovega sestavljanja vstavili v razrezani vektor. Prenos pripravljenega vektorja v bakterije so izvedli s transkonjugacijo iz ''E. coli'' S17. Selekcija je potekala preko kanamicinske rezistence in preko neobčutljivosti na sukrozo [1, 4].

Najprej so v genom vstavili gen ''aroG'' in nadalje deletirali ''ldhA'' gen za laktat dehidrogenazo-A. Deletirali so regulatorni ''sugR'' gen ter s tem povečali ekspresijo genov glikolize in privzem sladkorjev in dodali še gen ''aroR'' za translacijski regulatorni vodilni peptid gena ''aroF'' – tako so se znebili negativne translacijske kontrole izražanja. Operon ''qsuABCD'' so nadomestili s ''qsuC'' z močnim konstitutivnim Ptuf promotorjem. Gen za fosfoenolpiruvat karboksilazo ''ppc'' so zamenjali z dodatno kopijo endogenega ''aroB'', kar je povečalo dovajanje fosfoenol piruvata v šikimatno pot. Da bi povečali sintezo drugega prekurzorja šikimatne poti t.j. eritroze-4-fosfata, so nativni promotor gena za transketolazo ''tkt'' nadomestili s Ptuf promotorjem. Zamenjali so še gen ''iolR'', v odsotnosti katerega je dereguliran operon za katabolizen inozitola, in ''pck'' gen za fosfoenolpiruvat karbokinazo. Nazadnje so v genom še vrnili gen za ''sugR'' transkripcijski regulator. Tako so z metabolnim inženirstvom dobili sev, ki proizvaja več antranilata [1].

NMA se sintetizira iz antranilata v enostopenjski reakciji z ANMT. Gen za ANMT so vstavili preko vektorja pGold, ki so ga pripravili s spremembo pEC-XK99E, da je postal uporaben za Golden Gate modularno sestavljanje. Naravno zaporedje gena ''ANMT'' so kodonsko optimizirali in sestavili s kompatibilnimi previsnimi konci. Dodali so še ''sahH'' gen za S-adenozil homocisteinazo in ga z elektroporacijo vnesli v celice [1].

== Priložnosti za prihodnost ==
S tem delom so pripravili sistem za učinkovito proizvodnjo NMA z rastlinskim genom za encim ANMT v ''C. glutamicum'', kar lahko predstavlja pomemben nov način priprave NMA in drugih industrijsko in medicinsko pomembnih snovi, ki jih dobimo iz tega prekurzorja. V metabolizmu ''C. glutamicum'' so še vedno prisotna nekatera ozka grla, kot sta nepopolna konverzija šikimata v antranilat, in nepopolna N-metilacija antranilata z od-SAM-odvisno ANMT. To raziskovalno delo je odlična točka za nadaljnje spremembe, ki bi naslovile še obstoječe težave in optimizirale proizvodnjo NMA, ki sedaj dosega 0,34 g/L [1].

== Literatura ==
[1] Walter T, Al Medani N, Burgardt A, idr. Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered Corynebacterium glutamicum.Microogranisms. 2020. doi:10.3390/microorganisms8060866

[2] Gopinath V, Nampoothiri KM. Corynebacterium glutamicum. V: Encyclopedia of Food Microbiology: Second Edition. Elsevier Inc.; 2014:504–517. doi:10.1016/B978-0-12-384730-0.00076-8

[3] Baumgart M, Unthan S, Kloß R, idr. Corynebacterium glutamicum Chassis C1∗: Building and Testing a Novel Platform Host for Synthetic Biology and Industrial Biotechnology. ACS Synth Biol. 2018;7(1):132–144. doi:10.1021/acssynbio.7b00261

[4] Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69–73. doi:10.1016/0378-1119(94)90324-7

MBT seminarji 2021

2021-04-08T21:00:25Z

Sasa.slabe:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

MBT seminarji 2021

2021-04-08T20:56:40Z

Sasa.slabe:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno ''Corynebacterium glutamicum.'']] Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

BNT-seminar

2021-03-17T22:24:50Z

Sasa.slabe: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30170022 
30200303 
30200310 
30200319 
30170222 
30019057 
30170131 
30170078 
30019040 
30170177 
30200324 
30200315 
30019063 
30200312 
30019363 
30170002 
30170103 
30019056 
30200309 
30200322 
30200320 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30200317 
30170193 
30200307 
30200321 
30200314 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
20.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
20.4.2020 
20.4.2020 
6.4.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
13.4.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
18.5.2021 
18.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Matija Ruparčič 
Urban Hribar 
Irma Zeljković 
Martin Špendl 
Urška Pečarič Strnad 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Ajda Godec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Urša Lovše 
Sara Laznik 
Neža Pvko 
Sabina S. Oblak 
Doroteja Armič 
Martina Lokar 
Špela Supej 
Saša Slabe 
Eva Keber 
Mateja Žvipelj 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Anže Karlek 
Luka Gnidovec 
Almina Tahirović 
Mirsad Mešić 
Paula Horvat 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Ernestina Lavrih 
Liza Ulčakar 
Paula Horvat 
Almina Tahirović 
Anže Karlek 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Eva Keber 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Mirsad Mešić 
Urša Lovše 
Anamarija Agnič 
Urša Štrancar 
Neža Pavko 
Mateja Žvipelj 
Saša Slabe 
Nika Mikulič Vernik 
Martina Lokar 
Urška Fajdiga 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Sabina S. Oblak 
Urban Hribar 
Tina Kolenc Milavec 
Tadej Medved 
Doroteja Armič 
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-11T23:31:10Z

Sasa.slabe: /* Bionanotehnologija 2021- seminar */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30200303 
30019363 
30019057 
30170131 
30170078 
30019040 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
30200317 
30170193 
30200315 

| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
11.5.2021 
13.4.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Ajda Godec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
Luka Gnidovec 
Urša Lovše 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Eva Keber 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
Urban Hribar 
Mirsad Mešić 

|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)

2021-03-10T17:59:18Z

Sasa.slabe:

<h3>Molekularne značilnosti SARS-CoV-2</h3>

Koronavirusi (CoV) sodijo v družino Coronaviridae, ki se deli na štiri skupine: Alphacoronavirus, Gammacoronavirus, Deltacoronavirus in Betacoronavirus, kamor uvrščamo SARS-CoV-2, ki povzroča koronavirusno bolezen oziroma COVID-19. Pri človeku povzročata bolezni skupin alfa in beta. Povzročajo dihalna obolenja pri ljudeh in gastrointestinalna obolenja pri živalih. Pri ljudeh so simptomi v glavnem blagi, z izjemoma pri imunokopromitiranih osebah kjer se lahko razvije pljučnica ali bronhitis. Vse do prve epidemije leta 2003, povzročene s strani SARS-CoV, so okužbe s koronavirusi veljale za nesmrtonosne. CoV je prešel preko direktnega kontakta iz živali, netopirjev, na človeka – torej gre za zoonotski prenos.

'''Struktura genoma SARS-CoV-2'''

Genom SARS-CoV-2 je enovijačna, pozitivno usmerjena RNA, dolga 29 903 nt, in zapisuje ~ 14 odprtih bralnih okvirjev – ORF ter ~ 29 proteinov. RNA zapis vsebuje 3' in 5' neprevajajoči regiji, 5'-kapo in poli(A)-rep na 3' koncu. Na 5' koncu se nahaja ORF1a/b, ki znaša približno dve tretjini celotne dolžine genoma ter zapisuje poliprotein 1a (pp1a) in poliprotein 1ab (pp1ab). Ostali ORF-ji, ki se nahajajo na 3' koncu zapisujejo strukturne proteine: protein bodice (S), membranski protein (M), proteini ovojnice (E) in proteini nukleokapside (N). Po vstopu viriona v tarčno celico se genomska RNA takoj prevede v dva polipretina 1a in 1ab, ki se procesirata v 16 nestrukturnih proteinov, ki skupaj tvorijo replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki se nahaja v dvojno-membranskih veziklih. Nastali kompleks vzame pozitivno usmerjeno genomsko RNA kot matrico za sintezo nove negativno usmerjene RNA, ki lahko služi kot matrica za transkripcijo pozitivno usmerjene subgenomske mRNA ali kot matrica za replikacijo genomske RNA. V zapisu za subgenomsko mRNA najdemo START kodon, zaporedje AUG, sam zapis pa po dolžini ni enak genomski RNA in služi kot mRNA za sintezo virusnih proteinov, ki se ne nahajajo v ORF1a/b. Če primerjamo genom SARS-CoV-2 z ostalimi koronavirus opazimo 54 % identičnost.

'''Protein S'''

Glikoprotein, ki je ključen v patogenezi SARS-CoV-2, saj se preko receptor vezavne domene RBD, na podenoti S1, veže na ACE2, ki je na gostiteljski celici. Regija RBD velja za najbolj variabilen dela SARS-CoV-2. Celoten protein je zgrajen iz 1273 aminokislinskih ostankov in sestavljen iz treh podenot: S1, S2 in S2'. Podenota S1 je vključena v pritrditev viriona na gostiteljsko celico preko ACE2, sledi vstop virona v celico. Med vstopanjem v celico pride do konformacijskih sprememb proteina S. Podenota S2 sodeluje pri fuziji viriona in membrane tarčne celice. Tekom tega procesa se podenota S2 nahaja v treh različnih konformacijah. Podenota S2' proteolitično cepi vez med podenotama S1 in S2.

<h3>Aktualne mutante in njihov pomen</h3>

Pri podvojevanju virusov stalno prihaja do napak, ki se zaradi odsotnosti popravljalnih mehanizmov ne popravijo in vodijo v mutacije, s tem pa v nastajanje novih sevov, ki imajo lahko pomembne implikacije za globalno zdravstvo. Nove porajajoče mutante SARS-CoV-2 se lahko hitreje širijo med ljudmi, lahko povzročajo spremenjeno obliko bolezni, se izognejo nekaterim diagnostičnim testom in zmanjšajo učinkovitost tarčnih zdravil in/ali cepiv. Virus SARS-CoV-2 sodi med viruse z dednim zapisov v obliki RNA, za katere je značilno, da pridobijo cca. eno napako na cikel podvojevanja. Koronavirusi sicer zaradi prisotnosti popravljalnega encima eksoribonukleaze mutirajo s ½ hitrostjo virusa gripe in ¼ hitrost virusa HIV. V januarju 2020 se je pojavila mutacija D614G, ki se je hitro razširila po svetu in do junija 2020 nadomestila prvi identificirani sev na Kitajskem, katerega izvor še ni natančno preučen. Ta mutacija omogoča hitrejše in učinkovitejše pritrjevanje virusa na receptor na človeških celicah.

Britanski sev se je pojavil septembra 2020 v Angliji in je povezan s hitrejšim širjenjem bolezni, ki pa ne poteka v težji obliki. Sev definira 23 mutacij, od katerih je najpomembnejša N501Y na mestu, kjer se protein S povezuje z receptorjem ACE2 in povzroči boljše povezovanje in tako večjo verjetnost okužbe. Druge pomembne mutacije so še del69/70, ki prav tako spremeni interakcijo z ACE2, in P681H, ki pripomore k hitrejšemu nastajanju proteina S v celicah.

Južnoafriški sev se je prvič pojavil v oktobru 2020. Trenutno ni dokazov, ki bi kazali da je povezan s težjim potekom bolezni, vendar pa se zaradi mutacij v regiji za vezavo na receptor lahko izogne protitelesom. Poleg mutacije N501Y, ki je enaka kot pri britanskem sevu, ima še dve pomembni mutaciji v regiji, ki se povezuje z receptorjem – K417N in E484K. Kombinacija teh mutacij spremeni obliko vezavnega dela in poveča možnost za pobeg imunskemu sistemu.

Brazilski sev so prvič karakterizirali v januarju 2021 in ima 17 unikatnih mutacij, najbolj značilne pa so mutacije, ki so prisotne tudi pri drugih sevih – K417T, E484K in N501Y. Različica je zelo podobna južnoafriškemu sevu in ima spremenjeno vezavo na receptor ACE2, hkrati pa analize kažejo večjo možnost ponovne infekcije s tem virusom po že preboleli bolezni.

Nigerijski sev so prvič odkrili avgusta 2020. Zanj je značilna mutacija P681H, ki je prisotna tudi pri britanskem sevu, a nima nobene druge mutacije značilne za britansko varianto. Trenutno ni nobenih dokazov, da bi se ta sev širil hitreje, povzročal težjo bolezen ali vplival na delovanje cepiv.

Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)

2021-03-10T10:09:04Z

Sasa.slabe: New page: <h3>Molekularne značilnosti SARS-CoV-2</h3> <h3>Aktualne mutante in njihov pomen</h3> Pri podvojevanju virusov stalno prihaja do napak, ki se zaradi odsotnosti popravljalnih mehanizmov ...

<h3>Molekularne značilnosti SARS-CoV-2</h3>

<h3>Aktualne mutante in njihov pomen</h3>

Pri podvojevanju virusov stalno prihaja do napak, ki se zaradi odsotnosti popravljalnih mehanizmov ne popravijo in vodijo v mutacije, s tem pa v nastajanje novih sevov, ki imajo lahko pomembne implikacije za globalno zdravstvo. Nove porajajoče mutante SARS-CoV-2 se lahko hitreje širijo med ljudmi, lahko povzročajo spremenjeno obliko bolezni, se izognejo nekaterim diagnostičnim testom in zmanjšajo učinkovitost tarčnih zdravil in/ali cepiv. Virus SARS-CoV-2 sodi med viruse z dednim zapisov v obliki RNA, za katere je značilno, da pridobijo cca. eno napako na cikel podvojevanja. Koronavirusi sicer zaradi prisotnosti popravljalnega encima eksoribonukleaze mutirajo s ½ hitrostjo virusa gripe in ¼ hitrost virusa HIV. V januarju 2020 se je pojavila mutacija D614G, ki se je hitro razširila po svetu in do junija 2020 nadomestila prvi identificirani sev na Kitajskem, katerega izvor še ni natančno preučen. Ta mutacija omogoča hitrejše in učinkovitejše pritrjevanje virusa na receptor na človeških celicah.

Britanski sev se je pojavil septembra 2020 v Angliji in je povezan s hitrejšim širjenjem bolezni, ki pa ne poteka v težji obliki. Sev definira 23 mutacij, od katerih je najpomembnejša N501Y na mestu, kjer se protein S povezuje z receptorjem ACE2 in povzroči boljše povezovanje in tako večjo verjetnost okužbe. Druge pomembne mutacije so še del69/70, ki prav tako spremeni interakcijo z ACE2, in P681H, ki pripomore k hitrejšemu nastajanju proteina S v celicah.

Južnoafriški sev se je prvič pojavil v oktobru 2020. Trenutno ni dokazov, ki bi kazali da je povezan s težjim potekom bolezni, vendar pa se zaradi mutacij v regiji za vezavo na receptor lahko izogne protitelesom. Poleg mutacije N501Y, ki je enaka kot pri britanskem sevu, ima še dve pomembni mutaciji v regiji, ki se povezuje z receptorjem – K417N in E484K. Kombinacija teh mutacij spremeni obliko vezavnega dela in poveča možnost za pobeg imunskemu sistemu.

Brazilski sev so prvič karakterizirali v januarju 2021 in ima 17 unikatnih mutacij, najbolj značilne pa so mutacije, ki so prisotne tudi pri drugih sevih – K417T, E484K in N501Y. Različica je zelo podobna južnoafriškemu sevu in ima spremenjeno vezavo na receptor ACE2, hkrati pa analize kažejo večjo možnost ponovne infekcije s tem virusom po že preboleli bolezni.

Nigerijski sev so prvič odkrili avgusta 2020. Zanj je značilna mutacija P681H, ki je prisotna tudi pri britanskem sevu, a nima nobene druge mutacije značilne za britansko varianto. Trenutno ni nobenih dokazov, da bi se ta sev širil hitreje, povzročal težjo bolezen ali vplival na delovanje cepiv.

BNT-seminar

2021-03-08T17:06:53Z

Sasa.slabe: /* Bionanotehnologija 2021- seminar */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30170103 
30200319
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
4.5.2021 
23.3.2021
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Martina Lokar 
Martin Špendl
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Mateja Žvipelj 
Almina Tahirović
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-08T17:04:08Z

Sasa.slabe: /* Bionanotehnologija 2021- seminar */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30170103 
30200319
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
4.5.2021 
23.3.2021
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Martina Lokar 
 
Martin Špendl
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Mateja Žvipelj 
Almina Tahirović
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.