Wiki FKKT - User contributions [en]

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T19:22:14Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako prooblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije provnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic<ref name = "prvi"/>.
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens. Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo. Z vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP <ref> TSP: ''Total soluble protein'' - celokupna količina topnih proteinov </ref>. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, v katerem se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
Kot novoodkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T19:17:18Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako prooblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije provnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic<ref name = "prvi"/>.
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens. Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo. Z vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, v katerem se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
Kot novoodkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T18:46:16Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic<ref name = "prvi"/>.
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens. Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo. Z vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T18:45:59Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic<ref name = "prvi"/>.
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens. Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo. Z vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil, prvo tako zdravilo <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T18:44:07Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic<ref name = "prvi"/>.
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »''triparental mating''«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T18:36:08Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.

<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »''triparental mating''«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T18:35:27Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.

<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »''triparental mating''«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.

<h2>Viri</h2>
<references/>

MBT seminarji 2019

2019-03-11T18:35:00Z

Smalensek:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec)<br>
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec)<br>
# Rok Miklavčič
# Blaž Lebar
# Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april)<br>
# Eva Rajh
# Elvira Boršič
# Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april)<br>
# Vida Štrancar
# Ana Halužan Vasle
# Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april)<br>
# Nina Kobe
# Iza Oblak
# Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april)<br>
# Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj)<br>
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj)<br>
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj)<br>
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj)<br>
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-03-11T18:33:09Z

Smalensek:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec)<br>
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec)<br>
# Rok Miklavčič
# Blaž Lebar
# Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april)<br>
# Eva Rajh
# Elvira Boršič
# Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april)<br>
# Vida Štrancar
# Ana Halužan Vasle
# Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april)<br>
# Nina Kobe
# Iza Oblak
# Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april)<br>
# Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj)<br>
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj)<br>
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj)<br>
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj)<br>
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T18:29:09Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva.<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.

<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »''triparental mating''«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T18:16:02Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.

<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »''triparental mating''«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida.
Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T18:13:35Z

Smalensek:

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva
Prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα), v študijah na transgenih miših je to vodilo v »profilakso« pred srčno ishemijo ali ishemičnimi poškodbami jeter. Dodatek IL-37 mišim prepreči psoriazo, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.

Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37 predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni.
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije s sesalskimi patogeni / bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.

<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>

<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »''triparental mating''«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo.

<h3>Karakterizacija produktov</h3>

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida.
Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.

Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

2019-03-11T17:18:56Z

Smalensek: New page: Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzo...

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva
Prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα), v študijah na transgenih miših je to vodilo v »profilakso« pred srčno ishemijo ali ishemičnimi poškodbami jeter. Dodatek IL-37 mišim prepreči psoriazo, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic. Kot novo-odkriti protivnetni citokin predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni.
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije s sesalskimi patogeni / bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>
Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija
V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b:
• Prekurzorska oblika: proIL-37b (celotna dolžina)
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
• Zrela oblika: matIL-37b (brez nativnega signalnega peptida)
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
• Fuzijski protein: SBA-IL-37b (fuzija z aglutininom iz soje)
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.
Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »triparental mating«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »agrobacterium-mediated leaf disc method«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo.
<h2>Karakterizacija produktov</h2>
Prenos Western vzorcev s proIL-37b je pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Pri matIL-37b in SBA-IL37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (19kDa), dimerne oblike ni bilo.
Pri pro-obliki so dosegli zelo visoko izražanje (1% TSP), količina zrele oblike pa je bila precej nižja. Verjetno to nakazuje, da ER ni primerno mesto za lokalizacijo zrele oblike produkta (s humanim IL-4, IL-13, oranžnim fluorescenčnim proteinom je bilo pokazano, da lokalizacija v ER poveča izplen in stabilnost produkta). Pro-oblika je za razliko od zrele/fuzijske oblike ostala v citoplazmi – verjetno rastlinska celica ne prepozna nativnega N-končnega signalnega peptida, prisotnost slednjega pa je verjetno razlog večjemu izplenu pro-IL37b. Sumi se, da ima nativni signalni peptid stabilizacijsko vlogo. IL-37b je v splošnem nestabilni protein, saj vsebuje funkcionalne elemente mRNA za »nestabilnost«. Ti imajo vlogo negativne povratne zanke pri regulaciji izražanja mRNA/proteina, njihov izbris pa vodi v povečanje izražanja.
Izplen matIL-37b so povečali s fuzijo s SBA na primerljiv nivo s pro-obliko (1% TSP). SBA je tetramerni glikoprotein, za katerega je značilna visoka stopnja stabilnosti. Kot fuzijski partner tako poveča nivo izražanja tarčnega proteina. Je lektin, ki se specifično veže na N-acetil-D-galaktozamin, kar olajša čiščenje produkta z afinitetno kromatografijo na agarozni koloni, povezani z izbranim sladkorjem. Ločitev tarčnega proteina od fuzijskega partnerja jim je omogočilo vmesno TEV-prepoznavno mesto in endoproteolitska restrikcija s proteazo TEV.
Biološko aktivnost produktov so preizkušali in vitro na mišjih primarnih renalnih celicah iz epitela ledvičnega korteksa. Celice so podvrgli različnim koncentracijam IL-37b, kot standard so uporabili komercialni rekombinantni IL-37b in nato z endotoksinom LPS inducirali sintezo pro-vnetnih citokinov. V supernatantih kultur so nato analizirali koncentracijo TNF α. Sintezo slednje bi prisotnost IL-37b morala znižati.
Tako matIL-37b kot tudi pro-IL37b sta biološko aktivna, zrela oblika toliko bolj zaradi neprisotnosti nativnega signalnega peptida – konformacijsko ugodnejša oblika pripomore k boljši vezavi na receptor.
<h2>Pomen študije</h2>

RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

2018-11-29T06:46:37Z

Smalensek:

<h2>Predhodni riboregulatorji</h2>
Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistemov: zmanjša število nepredvidenih / nezaželenih interakcij bioloških komponent v kompleksnem celičnem okolju. Na osnovi naravnih regulatorjev so bili razviti ''pretvorniki mRNA'' (prevedejo vhodni signal majhne molekule / proteinskega liganda v izhodni proteinski signal) in ''riboregulatorji'', ki nadzirajo procesa prepisovanja in prevajanja genetskega materiala<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.10.002 A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.1073/pnas.1203808109 J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012]</ref>.

Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA - sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions)<ref name="tretji">[https://doi.org/10.1093/nar/gkt452 J. M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013]</ref>. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10<sup>18</sup> različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji tega sekvenčnega prostora ne izkoriščajo in imajo (zato) manjši dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij. Toizvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju, saj temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja izvira iz inhibicije mesta RBS (tvorba dsRNA), sprožilec pa sestoji iz zaporedja, komplementarnega RBS, ki ob vezavi nadomesti represor <ref name="drugi" /> <ref name="tretji" />.

<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, pomembna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo ''in silico'' razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi<ref name="prvi" />.

Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, povezuje ju 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal<ref name="prvi" />.

Komponente stikal so okarakterizirali v ''E. coli'' BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA<ref name="prvi" />.

Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔG<sub>RBS-linker</sub> in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔG<sub>RBS-linker</sub> pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij<ref name="prvi" />.

<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »''napačna''« načela razvoja regulatorjev:

#Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
#Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
#Sprožilec se veže na mesto RBS

Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA<ref name="prvi" />. Dostopno je [https://yiplab.cse.cuhk.edu.hk/toehold/ spletno orodje] za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo<ref name="cetrti">[https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty216 A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018]</ref>.

<h2>Primeri uporabe</h2>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo sprožilca na domeno toehold in kasneje, vezavo ribosoma. To so razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporter na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža (bazni signal). To omogoča simultano merjenje tako fluorescence GFP (izhodni signal; delovanje stikala) kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja<ref name="prvi" />. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika<ref name="peti">[https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.04.059 K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016]</ref>.

<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor<ref name="prvi" />.

Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev<ref name="prvi" />.

<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali<ref name="prvi" />.

<h2>Zaključek</h2>
Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune<ref name="sesti">[https://doi.org/10.1038/nature23271 A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017]</ref>
. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov<ref name="prvi" />.

<h2>Viri</h2>
<references/>

RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

2018-11-28T20:46:33Z

Smalensek:

<h2>Predhodni riboregulatorji</h2>
Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistemov: zmanjša število nepredvidenih / nezaželenih interakcij bioloških komponent v kompleksnem celičnem okolju. Na osnovi naravnih regulatorjev so bili razviti ''pretvorniki mRNA'' (prevedejo vhodni signal majhne molekule / proteinskega liganda v izhodni proteinski signal) in ''riboregulatorji'', ki nadzirajo procesa prepisovanja in prevajanja genetskega materiala<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.10.002 A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.1073/pnas.1203808109 J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012]</ref>.

Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA in sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions)<ref name="tretji">[https://doi.org/10.1093/nar/gkt452 J. M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013]</ref>. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10<sup>18</sup> različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji tega sekvenčnega prostora ne izkoriščajo in imajo (zato) manjši dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij. Toizvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju, saj temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja izvira iz inhibicije mesta RBS (tvorba dsRNA), sprožilec pa sestoji iz zaporedja, komplementarnega RBS, ki ob vezavi nadomesti represor <ref name="drugi" /> <ref name="tretji" />.

<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, pomembna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo ''in silico'' razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi<ref name="prvi" />.

Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, povezuje ju 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal<ref name="prvi" />.

Komponente stikal so okarakterizirali v ''E. coli'' BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA<ref name="prvi" />.

Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔG<sub>RBS-linker</sub> in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔG<sub>RBS-linker</sub> pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij<ref name="prvi" />.

<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »''napačna''« načela razvoja regulatorjev:

#Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
#Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
#Sprožilec se veže na mesto RBS

Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA<ref name="prvi" />. Dostopno je [https://yiplab.cse.cuhk.edu.hk/toehold/ spletno orodje] za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo<ref name="cetrti">[https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty216 A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018]</ref>.

<h2>Primeri uporabe</h2>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo sprožilca na domeno toehold in kasneje, vezavo ribosoma. To so razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporter na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža (bazni signal). To omogoča simultano merjenje tako fluorescence GFP (izhodni signal; delovanje stikala) kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja<ref name="prvi" />. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika<ref name="peti">[https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.04.059 K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016]</ref>.

<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor<ref name="prvi" />.

Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev<ref name="prvi" />.

<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali<ref name="prvi" />.

<h2>Zaključek</h2>
Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune<ref name="sesti">[https://doi.org/10.1038/nature23271 A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017]</ref>
. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov<ref name="prvi" />.

<h2>Viri</h2>
<references/>

RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

2018-11-28T16:46:38Z

Smalensek:

<h2>Predhodni riboregulatorji</h2>
Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistemov: zmanjša število nepredvidenih / nezaželenih interakcij bioloških komponent v kompleksnem celičnem okolju. Na osnovi naravnih regulatorjev so bili razviti ''pretvorniki mRNA'' (prevedejo vhodni signal majhne molekule / proteinskega liganda v izhodni proteinski signal) in ''riboregulatorji'', ki nadzirajo procesa prepisovanja in prevajanja genetskega materiala<ref name="prvi">A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014</ref> <ref name="drugi">J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012</ref>.

Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA in sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions)<ref name="tretji">J. M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013</ref>. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10<sup>18</sup> različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji tega sekvenčnega prostora ne izkoriščajo in imajo (zato) manjši dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij. Toizvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju, saj temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja izvira iz inhibicije mesta RBS (tvorba dsRNA), sprožilec pa sestoji iz zaporedja, komplementarnega RBS, ki ob vezavi nadomesti represor <ref name="drugi" /> <ref name="tretji" />.

<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, pomembna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo ''in silico'' razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi<ref name="prvi" />.

Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, povezuje ju 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal<ref name="prvi" />.

Komponente stikal so okarakterizirali v ''E. coli'' BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA<ref name="prvi" />.

Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔG<sub>RBS-linker</sub> in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔG<sub>RBS-linker</sub> pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij<ref name="prvi" />.

<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »''napačna''« načela razvoja regulatorjev:

#Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
#Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
#Sprožilec se veže na mesto RBS

Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA<ref name="prvi" />. Dostopno je [https://yiplab.cse.cuhk.edu.hk/toehold/ spletno orodje] za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo<ref name="cetrti">A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018</ref>.

<h2>Primeri uporabe</h2>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo sprožilca na domeno toehold in kasneje, vezavo ribosoma. To so razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporter na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža (bazni signal). To omogoča simultano merjenje tako fluorescence GFP (izhodni signal; delovanje stikala) kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja<ref name="prvi" />. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika<ref name="peti">K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016</ref>.

<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor<ref name="prvi" />.

Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev<ref name="prvi" />.

<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali<ref name="prvi" />.

<h2>Zaključek</h2>
Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune<ref name="sesti">A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017</ref>
. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov<ref name="prvi" />.

<h2>Viri</h2>
<references/>

Seminarji SB 2018/19

2018-11-28T13:04:24Z

Smalensek:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br>

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11.<br>
1 <br>
2 Valentina Levak <br>

27.11.<br>
1 <br>
2 <br>
3 <br>
4 <br>

29.11.<br>
1 Matej Kolarič<br>
2 Špela Malenšek<br>
3 <br>
4 <br>

4.12.<br>
1 Urška Kašnik<br>
2 Fran Krstanovic<br>
3 <br>
4 Gašper Žun<br>

6.12.<br>
1 Urška Jelenovec<br>
2 Ernest Šprager<br>
3 Rok Miklavčič <br>
4 <br>

11.12.<br>
1 Jerneja Ovčar<br>
2 Neža Koritnik<br>
3 Gašper Virant<br>
4 Gašper Marinšek<br>

18.12.<br>
1 Tina Požun<br>
2 Anamarija Habič<br>
3 Roberta Mulac<br>
4 Kity Požek<br>

3.1.<br>
1 <br>
2 Nina Mavec<br>
3 Primož Tič<br>
4 Milena Stojkovska<br>

8.1.<br>
1 Marija Atanasova<br>
2 Bine Tršavec<br>
3 Peter Pečan<br>
4 Tjaša Sorčan<br>

10.1.<br>
1 Špela Koren<br>
2 Natalija Pucihar<br>
3 Karmen Žbogar<br>
4 Uroš Zavrtanik<br>

15.1.<br>
1 Jerneja Kocutar<br>
2 Blaž Lebar<br>
3 Tadej Satler<br>
4 Miha Koprivnikar Krajnc<br>

Seminarji SB 2018/19

2018-11-28T13:03:51Z

Smalensek:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov] (Špela Malenšek)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br>

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11.<br>
1 <br>
2 Valentina Levak <br>

27.11.<br>
1 <br>
2 <br>
3 <br>
4 <br>

29.11.<br>
1 Matej Kolarič<br>
2 Špela Malenšek<br>
3 <br>
4 <br>

4.12.<br>
1 Urška Kašnik<br>
2 Fran Krstanovic<br>
3 <br>
4 Gašper Žun<br>

6.12.<br>
1 Urška Jelenovec<br>
2 Ernest Šprager<br>
3 Rok Miklavčič <br>
4 <br>

11.12.<br>
1 Jerneja Ovčar<br>
2 Neža Koritnik<br>
3 Gašper Virant<br>
4 Gašper Marinšek<br>

18.12.<br>
1 Tina Požun<br>
2 Anamarija Habič<br>
3 Roberta Mulac<br>
4 Kity Požek<br>

3.1.<br>
1 <br>
2 Nina Mavec<br>
3 Primož Tič<br>
4 Milena Stojkovska<br>

8.1.<br>
1 Marija Atanasova<br>
2 Bine Tršavec<br>
3 Peter Pečan<br>
4 Tjaša Sorčan<br>

10.1.<br>
1 Špela Koren<br>
2 Natalija Pucihar<br>
3 Karmen Žbogar<br>
4 Uroš Zavrtanik<br>

15.1.<br>
1 Jerneja Kocutar<br>
2 Blaž Lebar<br>
3 Tadej Satler<br>
4 Miha Koprivnikar Krajnc<br>

RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

2018-11-28T13:02:46Z

Smalensek:

<h2>Predhodni riboregulatorji</h2>
Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistemov: zmanjša število nepredvidenih / nezaželenih interakcij bioloških komponent v kompleksnem celičnem okolju. Na osnovi naravnih regulatorjev so bili razviti pretvorniki mRNA (prevedejo vhodni signal majhne molekule / proteinskega liganda v izhodni proteinski signal) in riboregulatorji, ki nadzirajo procesa prepisovanja in prevajanja genetskega materiala<ref name="prvi">A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014</ref> <ref name="drugi">J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012</ref>.

Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA, sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions)<ref name="tretji">J. M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013</ref>. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10^18 različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji ne izkoriščajo tega sekvenčnega prostora in imajo majhen dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij, kar izvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju. Temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja proteina izvira iz vezave na mesto RBS, pri čemer sprožilna RNA sestoji iz zaporedja RBS, ki nadomesti represor <ref name="drugi" /> <ref name="tretji" />.

<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, ključna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo in silico razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi<ref name="prvi" />.

Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, povezuje ju 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal<ref name="prvi" />.

Komponente stikal so okarakterizirali v sevu E. coli BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA<ref name="prvi" />.

Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔGRBS-linker in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔGRBS-linker pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij<ref name="prvi" />.

<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »napačna« načela razvoja regulatorjev:

#Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
#Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
#Sprožilec se veže na mesto RBS

Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA<ref name="prvi" />. Dostopno je spletno orodje za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo<ref name="cetrti">A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018</ref>.

<h2>Primeri uporabe</h2>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo na domene toehold in s tem reakcijo termodinamsko otežijo. To so nekoliko razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporterski gen na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža oz. poda le bazni signal. To omogoča simultano merjenje tako izhodnega signala preko GFP kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja<ref name="prvi" />. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika<ref name="peti">K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016</ref>.

<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor<ref name="prvi" />.

Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev<ref name="prvi" />.

<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali<ref name="prvi" />.

<h2>Zaključek</h2>
Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune<ref name="sesti">A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017</ref>
. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov<ref name="prvi" />.

<h2>Viri</h2>
<references/>

RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

2018-11-28T12:57:10Z

Smalensek:

<h2>Predhodni riboregulatorji</h2>
Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistemov: zmanjša število nepredvidenih / nezaželenih interakcij bioloških komponent v kompleksnem celičnem okolju. Na osnovi naravnih regulatorjev so bili razviti pretvorniki mRNA (prevedejo vhodni signal majhne molekule / proteinskega liganda v izhodni proteinski signal) in riboregulatorji, ki nadzirajo procesa prepisovanja in prevajanja genetskega materiala<ref name="prvi">A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014</ref> [1, 2].

Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA, sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions) [3]. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10^18 različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji ne izkoriščajo tega sekvenčnega prostora in imajo majhen dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij, kar izvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju. Temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja proteina izvira iz vezave na mesto RBS, pri čemer sprožilna RNA sestoji iz zaporedja RBS, ki nadomesti represor [2, 3].

<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, ključna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo in silico razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi<ref name="prvi" />.

Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, povezuje ju 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal<ref name="prvi" />.

Komponente stikal so okarakterizirali v sevu E. coli BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA<ref name="prvi" />.

Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔGRBS-linker in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔGRBS-linker pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij<ref name="prvi" />.

<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »napačna« načela razvoja regulatorjev:

#Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
#Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
#Sprožilec se veže na mesto RBS

Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA<ref name="prvi" />. Dostopno je spletno orodje za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo [4].

<h2>Primeri uporabe</h2>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo na domene toehold in s tem reakcijo termodinamsko otežijo. To so nekoliko razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporterski gen na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža oz. poda le bazni signal. To omogoča simultano merjenje tako izhodnega signala preko GFP kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja<ref name="prvi" />. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika [5].

<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor<ref name="prvi" />.

Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev<ref name="prvi" />.

<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali<ref name="prvi" />.

<h2>Zaključek</h2>
Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune [6]. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov<ref name="prvi" />.

<h2>Viri</h2>
<references/>

ref name="prvi">A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014</ref>

[2] J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012.

[3] M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013.

[4] A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018.

[5] K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016.

[6] A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017.

RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

2018-11-27T15:08:03Z

Smalensek:

<h2>Predhodni riboregulatorji</h2>
Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistemov: zmanjša število nepredvidenih / nezaželenih interakcij bioloških komponent v kompleksnem celičnem okolju. Na osnovi naravnih regulatorjev so bili razviti pretvorniki mRNA (prevedejo vhodni signal majhne molekule / proteinskega liganda v izhodni proteinski signal) in riboregulatorji, ki nadzirajo procesa prepisovanja in prevajanja genetskega materiala <ref>1, 2</ref> [1, 2].

Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA, sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions) [3]. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10^18 različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji ne izkoriščajo tega sekvenčnega prostora in imajo majhen dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij, kar izvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju. Temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja proteina izvira iz vezave na mesto RBS, pri čemer sprožilna RNA sestoji iz zaporedja RBS, ki nadomesti represor [2, 3].

<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, ključna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo in silico razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi [1].

Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, povezuje ju 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal [1].

Komponente stikal so okarakterizirali v sevu E. coli BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA [1].

Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔGRBS-linker in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔGRBS-linker pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij [1].

<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »napačna« načela razvoja regulatorjev:

#Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
#Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
#Sprožilec se veže na mesto RBS

Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA [1]. Dostopno je spletno orodje za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo [4].

<h2>Primeri uporabe</h2>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo na domene toehold in s tem reakcijo termodinamsko otežijo. To so nekoliko razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporterski gen na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža oz. poda le bazni signal. To omogoča simultano merjenje tako izhodnega signala preko GFP kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja [1]. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika [5].

<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor [1].

Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev [1].

<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali [1].

<h2>Zaključek</h2>
Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune [6]. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov [1].

<h2>Viri</h2>

[1] A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014.

[2] J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012.

[3] M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013.

[4] A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018.

[5] K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016.

[6] A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017.

RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

2018-11-27T15:01:48Z

Smalensek:

<h2>Predhodni riboregulatorji</h2>
Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistemov: zmanjša število nepredvidenih / nezaželenih interakcij bioloških komponent v kompleksnem celičnem okolju. Na osnovi naravnih regulatorjev so bili razviti pretvorniki mRNA (prevedejo vhodni signal majhne molekule / proteinskega liganda v izhodni proteinski signal) in riboregulatorji, ki nadzirajo procesa prepisovanja in prevajanja genetskega materiala <ref>1, 2</ref> [1, 2].

Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA, sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions) [3]. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10^18 različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji ne izkoriščajo tega sekvenčnega prostora in imajo majhen dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij, kar izvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju. Temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja proteina izvira iz vezave na mesto RBS, pri čemer sprožilna RNA sestoji iz zaporedja RBS, ki nadomesti represor [2, 3].

<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, ključna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo in silico razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi [1].

Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, povezuje ju 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi in silico (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal [1].

Komponente stikal so okarakterizirali v sevu E. coli BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA [1].

Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔGRBS-linker in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔGRBS-linker pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij [1].

<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »napačna« načela razvoja regulatorjev:

#Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
#Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
#Sprožilec se veže na mesto RBS

Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA [1]. Dostopno je spletno orodje za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo [4].

<h2>Primeri uporabe</h2>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo na domene toehold in s tem reakcijo termodinamsko otežijo. To so nekoliko razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporterski gen na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža oz. poda le bazni signal. To omogoča simultano merjenje tako izhodnega signala preko GFP kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja [1]. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika [5].

<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor [1].

Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev [1].

<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali [1].

<h2>Zaključek</h2>
Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune [6]. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov [1].

<h2>Viri</h2>

[1] A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014.

[2] J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012.

[3] M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013.

[4] A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018.

[5] K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016.

[6] A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017.

RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

2018-11-25T20:08:53Z

Smalensek:

<h2>Predhodni riboregulatorji</h2>
Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistemov: zmanjša število nepredvidenih / nezaželenih interakcij bioloških komponent v kompleksnem celičnem okolju. Na osnovi naravnih regulatorjev so bili razviti pretvorniki mRNA (prevedejo vhodni signal majhne molekule / proteinskega liganda v izhodni proteinski signal) in riboregulatorji, ki nadzirajo procesa prepisovanja in prevajanja genetskega materiala <ref>1, 2</ref> [1, 2].

Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA, sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions) [3]. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10^18 različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji ne izkoriščajo tega sekvenčnega prostora in imajo majhen dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij, kar izvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju. Temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja proteina izvira iz vezave na mesto RBS, pri čemer sprožilna RNA sestoji iz zaporedja RBS, ki nadomesti represor [2, 3].

<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, ključna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo in silico razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi [1].

Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, ki ju s 5'-koncem, kamor se prilega sprožilec, povezuje 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi in silico (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal [1].

Komponente stikal so okarakterizirali v sevu E. coli BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA [1].

Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔGRBS-linker in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔGRBS-linker pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij [1].

<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »napačna« načela razvoja regulatorjev:

#Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
#Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
#Sprožilec se veže na mesto RBS

Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA [1]. Dostopno je spletno orodje za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo [4].

<h2>Primeri uporabe</h2>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo na domene toehold in s tem reakcijo termodinamsko otežijo. To so nekoliko razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporterski gen na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža oz. poda le bazni signal. To omogoča simultano merjenje tako izhodnega signala preko GFP kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja [1]. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika [5].

<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor [1].

Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev [1].

<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali [1].

<h2>Zaključek</h2>
Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune [6]. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov [1].

<h2>Viri</h2>

[1] A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014.

[2] J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012.

[3] M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013.

[4] A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018.

[5] K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016.

[6] A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017.

RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

2018-11-25T19:59:38Z

Smalensek: New page: <h2>Predhodni riboregulatorji</h2> Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistem...

Seminarji SB 2018/19

2018-11-14T19:26:45Z

Smalensek:

Seminarji SB 2018/19

2018-11-14T19:20:35Z

Smalensek:

Popravljanje DNA v kontekstu kromatina

2016-05-29T18:47:52Z

Smalensek:

Ob poškodbi dednega materiala se celica odzove s t.i. '''DDR''' ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2596136/figure/F2/?report=objectonly|''DNA damage response''], ''glej Figure 2''), ki poleg direktnega popravila napake vključuje tudi upočasnitev celičnega cikla, kar celici zagotovi več časa za popravljanje. Slednje je neizogibno povezano s konformacijo DNA, saj je ta večino časa v celici tesno zvita v strukturo, imenovano kromatin, kar vzpostavljajo proteini histoni. Prav kromatinsko stanje, ki tako kot na replikacijo ali transkripcijo vpliva tudi na DDR, je tisto, ki določa in omogoča dostop ključnim popravljalnim proteinom. Ključno za razumevanje popravljanja DNA v kontekstu kromatina je poznavanje celičnega cikla in popravljalnih mehanizmov.
==Celični cikel, NER in DSB==
===Celični cikel===
Celični cikel sestavljajo štiri faze: faza G1, S, G2 in M. V času faze G1 celica raste in ko doseže prvo kontrolno točko, ob prehodu v fazo S, mora biti podvojena določena minimalna količina RNA, proteinov, lipidov ter ogljikovih hidratov, DNA pa ne sme biti poškodovana. V primeru, da je DNA poškodovana, celica preide v fazo G0, kjer pride do popravljanja ali morebitne apoptoze. V fazi S in G2 pride do replikacije DNA in na kontrolni točki med G2 in M mora biti vsa DNA podvojena, nepoškodovana, ključno pa je tudi spodbudno zunajcelično okolje. Celični cikel uravnavajo proteini ciklini in od ciklinov odvisne kinaze, katerih delovanje je močno povezano s kromatinskim statusom DNA.
===NER in DSB===
Eden izmed najbolj znanih tipov popravila DNA pri sesalcih, odvisen od preoblikovanja kromatina, je popravljanje z izrezom nukleotidov (NER - ''nucleotide excision repair''). Mehanizem NER popravi posledice večine enojnih prelomov DNA, ki jih zazna zaostajanje RNA polimeraze II oziroma vezava kompleksa UV-DBB (''UV-damaged DNA binding protein'') oz. kompleksa XPC (''xeroderma pigmentosum group C''). Napačen nukleotid se izreže s pomočjo NER faktorjev, helikaz (XPB, XPD), proteinov SSB (XPA, RPA) in endonukleaz (XPF-ERCC1, XPG). Vrzel se zapolni s sintezo pravilne DNA glede na neokvarjeno matrično komplementarno verigo. Ta korak je izveden s pomočjo replikacijskega kompleksa in DNA ligaze.

Prav tako je dostopnost kromatina pomembna pri popravljanju dvojnih prelomov DNA (''DSB - double strand breaks''), kjer sta poškodovani obe verigi. Popravljanje DSB poteka preko nehomolognega povezovanja koncev (takojšnja povezava prelomljenih koncev DNA) ali pa s homologno rekombinacijo, ki lahko poteče izključno med S in G2 fazami celičnega cikla .
==Kovalentne modifikacije histonov==
Najprej mora priti do zaznave in določitve poškodbe, pri čemer pomaga tudi kromatinski status DNA. Direktna vezava popravljalnih proteinov je namreč pogosto onemogočena, saj so lahko poškodovane regije skrite in zakopane globoko v nukleosomskem jedru. Kovalentne modifikacije, ki omogočijo dostop popravljalnim proteinom, tako vzpostavljajo dinamično ravnotežje, ključno za stabilnost genoma.
===Fosforilacija===

----

====Fosforilacija serina 139====
Ob dvojnem prelomu DNA, poteče [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3634448/figure/f3-ijms-14-04596/?report=objectonly| fosforilacija] (''glej Figure 2'') serina 139 na histonu H2AX. Reakcija je hitra, zgodi se blizu poškodovane regije in katalizirajo jo fosfoinositid-3-kinazi podobna kinaza (PIKK) ATM ter DNA-protein kinaze. Fosforiliran histon, γ-H2AX, je potreben za formacijo IRIF (''ionizig radiation induced foci''). Gre za kromosomsko mikrookolje, ki spodbuja vezavo popravljalnih proteinov, kot so NBS1 in Brca1 ter proteinov kontrolnih točk celičnega cikla, MDC1 in 53BP1. Koncentriranje slednjih tako spodbuja popravljanje, zmanjšuje možnosti mutacij in hkrati služi kot ojačevalec signalov kontrolnih točk celičnega cikla.
====(De)fosforilacija tirozina 142====
V običajnih situacijah je fosforiliran tudi tirozin 142 histona H2AX. Defosforilacijo sprožijo rentgenski žarki s poškodbo DNA, čemur sledi fosforilacija serina 139 ter vezava popravljalnih faktorjev. V primeru, da ne pride do defosforilacije tirozina, se na H2AX veže protein kinaza JNK1, kar sproži apoptozo. (De)fosforilacija tirozina je torej signal celici, da ob poškodbi presodi ali je zmožna popravila ali pa se usmeri v apoptozo.
====Preučevanje fosforilacije ob DSB v kvasovkah====
Vpliv fosforilacije ob nastanku DSB je bil preučevan tudi na kvasovkah, ki vsebujejo galaktozno-inducibilno HO endonukleazo. Ta sproži dvojni prelom na mestu MAT (''active mating type locus''), ko celice rastejo v prisotnosti galaktoze. Sledi mu fosforilacija histona H2AX (značilni motiv slednjega se pojavi na C terminalnem repu, t.i. motiv SQEL/Y) na serinu 129, ki jo katalizirajo kinaze Mec1/Tel1 (homologi sesalskim ATR/ATM kinazam). Nastali γ-H2AX ostane prisoten skozi celoten mehanizem popravljanja poškodbe .
===Acetilacija===

----

Acetilacija histonov lahko poteče zaradi sevanja UV žarkov in s tem vzpostavi odprto, aktivnejšo kromatinsko strukturo, ki je dostopnejša in omogoča vezavo popravljalnih proteinov. Acetilirana je kombinacija lizinskih ostankov na N terminalnih repkih histonov H3 in H4, kar nevtralizira sicer pozitivni naboj in s tem zrahlja interakcijo med histoni in DNA. Ključna katalizatorja sta histonski acetiltransferazi p300 in Gcn5.
===Metilacija===

----

Metilacije potečejo na lizinskih in argininskih ostankih, katalizirajo jih histonske metiltransferaze. Histoni so lahko mono-, di- ali trimetilirani, specifično zaporedje metiliranih aminokislinskih ostankov pa naj bi določalo transkripcijsko aktivnost in s tem dostopnost kromatina tako transkripcijskim kot tudi popravljalnim proteinom. Direktne povezave med metilacijami in popravljalnimi mehanizmi sicer niso znane, sta pa bili v primeru poškodb zaradi UV žarkov najdeni metilaciji H3K79me in H4K20me.
===Ubikvitinacija===

----

Vezava ubikvitina, majhnega peptida, ni nujno znak za proteasomsko razgradnjo proteina, ampak je lahko posledica sevanja UV žarkov ali DSB. Ubikvitinacija tako lahko povzroči sproščeno interakcijo med histoni in DNA, kar omogoči vezavo popravljalnih proteinov. Ob poškodbi zaradi UV žarkov pri kvasovkah poteče ubikvitinacija na lizinu 123, na histonu H2B. Katalizira jo kompleks Rad6/Bre1 E2/E3.

Pri sesalcih pride zaradi UV žarkov do ubikvitinacije histona H2A, ki pa naj bi bila bolj posledica NER kot pa povod, saj so nekateri eksperimenti pokazali, da v vseh celicah ni prišlo do modifikacije tega histona ob izpostavitvi UV sevanju. Prav tako se ob prisotnosti kompleksov UV-DDB in CUL4A začasno ubikvitinirata histona H3 in H4, kar ustvari kromatinsko okolje, ki omogoči NER.

Histona H2A in H2AX naj bi bila ubikvitinirana tudi ob dvojnih prelomih, kar katalizirata encima Ubc13 (encim E2) in RNF8 (''E3-ligase RING finger-containing enzyme RNF8''). Ubikvitinacija naj bi potekla zaradi fosforilacije histona H2AX in posledične aktivacije proteina MDC1, kamor se veže RNF8. Kljub temu, da direktno kavzalno sosledje med ubikvitinacijo in popravljalnimi mehanizmi ni dokazano, je eksperimentalno delo pokazalo, da v primeru deubikvitinacije pride do zaostanka poteka faze S in aktivacije kontrolnih točk celičnega cikla.
==Od ATP odvisno preoblikovanje kromatina==
Energija hidrolize ATP se porablja pri zamenjavi ali odstranitvi histonov ter pri premikanju nukleosomov vzdolž DNA. Kromatin-preoblikovalni kompleksi s hidrolizo ATP vplivajo na dostopnost DNA za transkripcijo, translacijo in popravljanje DNA. Kompleksi vsebujejo encime iz štirih različnih družin z motorno ATPazno (''SNF2-like'') podenoto: družina SWI/SNF, družina ISWI, družina NuRD/Mi-2/CHD (''nucleosome remodeling and deacatylation / chromodomain, helicase binding'') in družina INO80 (''inositol requiring 80''). Prvi dve družini sta opaženo stimulirali NER.
===Družina SWI/SNF (''switching defective/sucrose fermenting'')===
Encimi te družine v ''in vitro'' pogojih spreminjajo dostopnost nukleosomov ob poškodbah zaradi UV žarkov. Eden od teh DNA popravljalnih proteinov je protein Cockaynovega sindroma skupine B (CSB), ki in vitro spreminja razporeditev nukleosomov v odvisnosti od ATP. Poleg tega privabi p300/CBP in HMGN1 ter interagira s histoni in DNA. Kvasni homolog CSB je Rad26.
===Družina ISWI (''imitation SWI'')===
Običajno je ta družina vključena v regulacijo transkripcije. Večina transkripcijo stimulira, z izjemo ACF (od ATP odvisni kromatin-povezovalni in preoblikovalni faktor), ki jo zavira. V kvasovkah ACF premika nukleosome brez odstranjevanja histonov in izboljša NER, sploh na povezovalnih regijah med nukleosomi. NER faktorjem (XPC, XPA, RPA) je olajšan izrez 6-4PP lezij.
==Nekromatinski preoblikovalci==
Nekateri nekromatinski proteini lahko spreminjajo kromatin ali se vežejo na modificirane histone. GADD45 se preferenčno veže na hiperacetilirano DNA, ki so jo poškodovali UV žarki, in spremeni dostopnost nukleosomov. Sledi popravilo lezij, ki jih povzroča UV svetloba, z izrezom nukleotidov (NER). Nukleosom vezavni proteini HMGN (''high mobility group N'') se s posredovanjem CSB vežejo na rastoči popravljalni kompleks na poškodovani DNA in spremenijo kromatinske strukture s tarčenjem histonov H1 in H3. Manj HMGN1 v celici zmanjša frekvenco popravil.
==Vrnitev v originalni kromatinski status==
Po popravilu dvojnega zloma se kromatin prestrukturira v prvotno epigenetsko stanje. V tej stopnji sodelujejo histonske deacetilaze (HDAC), ki odstranijo acetilne markerje. Nekatere od njih so na zlomu prisotne že med popravilom mutacije .

Bolj kot deacetilaze so ključni od ATP neodvisni histonski šaperoni, kot so CAF1 (kromatinski povezovalni faktor 1), ki je sestavljen iz podenot p150, p60 in p48 ter močno ohranjen pri evkariontih. Njegova naloga je namestiti nukleosome na novo prepisani DNA med replikacijo ali na pravkar popravljeno DNA po NER. Znano je, da so med popravilom UV-povzročenih lezij (fotolezij) priključeni histoni H3 in H4. Analogno do sedaj še niso bili opaženi H2A/H2B histonski šaperoni v povezavi z NER, a bi bil možen kandidat šaperon FACT zaradi podobne vloge kot H3/H4 šaperon CAF1 med replikacijo in transkripcijo.
CAF1 se veže na DNA v odvisnosti od NER. Dodajanje histona H3.1 na popravljeno, do nedavnega zaradi UV poškodovano, mesto se zgodi šele po NER in s pomočjo CAF1. Slednji se pojavi na poškodovanem mestu šele po prihodu vseh endonukleaznih encimov in po zaključeni ligaciji. Rez na mestu 5' sproži sintezo novega segmenta DNA in hkrati privabi CAF1.

CAF1 poveča uspeh vračanja premeščenih nukleosomov s sodelovanjem s ASF1 – močno ohranjenim histonskim šaperonom, s katerim vmešča H3/H4 dimere in tetramere. ASF1-CAF1 sta aktivna med replikacijo in UV induciranih poškodbah DNA. Pri izbitju enega od genov cac1 (gen za CAF1) in asf1 je še vedno prisotna premeščevalna aktivnost, vendar s slabšim izkoristkom. CAF1 in ASF1 sta torej v osnovah samozadostna.
==Viri==
<p>
1. C. Dinant, A. B. Houtsmuller, and W. Vermeulen, “Chromatin structure and DNA damage repair.,” ''Epigenetics Chromatin'', vol. 1, no. 1, p. 9, 2008. <br/>
2. J. E. Krebs, B. Lewin, E. S. Goldstein, and S. T. Kilpatrick, Lewin’s Essential Genes. Jones and Bartlett Publishers, 2013. <br/>
3. Cook,P.J., Ju,B.G., Telese,F., Wang,X., Glass, C.K., and Rosenfeld,M.G. (2009). Tyrosine dephosphorylation of H2AX modulates apoptosis and survival decisions. ''Nature'' 458, 591-596. <br/>
4. N. C. M. House, M. R. Koch, and C. H. Freudenreich, “Chromatin modifications and DNA repair: Beyond double-strand breaks,” ''Front. Genet.'', 2014. <br/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Popravljanje DNA v kontekstu kromatina

2016-05-29T18:36:51Z

Smalensek:

Ob poškodbi dednega materiala se celica odzove s t.i. '''DDR''' ([https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1186%2F1756-8935-1-9/MediaObjects/13072_2008_9_MOESM2_ESM.jpeg|''DNA damage response'']), ki poleg direktnega popravila napake vključuje tudi upočasnitev celičnega cikla, kar celici zagotovi več časa za popravljanje. Slednje je neizogibno povezano s konformacijo DNA, saj je ta večino časa v celici tesno zvita v strukturo, imenovano kromatin, kar vzpostavljajo proteini histoni. Prav kromatinsko stanje, ki tako kot na replikacijo ali transkripcijo vpliva tudi na DDR, je tisto, ki določa in omogoča dostop ključnim popravljalnim proteinom. Ključno za razumevanje popravljanja DNA v kontekstu kromatina je poznavanje celičnega cikla in popravljalnih mehanizmov.
==Celični cikel, NER in DSB==
===Celični cikel===
Celični cikel sestavljajo štiri faze: faza G1, S, G2 in M. V času faze G1 celica raste in ko doseže prvo kontrolno točko, ob prehodu v fazo S, mora biti podvojena določena minimalna količina RNA, proteinov, lipidov ter ogljikovih hidratov, DNA pa ne sme biti poškodovana. V primeru, da je DNA poškodovana, celica preide v fazo G0, kjer pride do popravljanja ali morebitne apoptoze. V fazi S in G2 pride do replikacije DNA in na kontrolni točki med G2 in M mora biti vsa DNA podvojena, nepoškodovana, ključno pa je tudi spodbudno zunajcelično okolje. Celični cikel uravnavajo proteini ciklini in od ciklinov odvisne kinaze, katerih delovanje je močno povezano s kromatinskim statusom DNA.
===NER in DSB===
Eden izmed najbolj znanih tipov popravila DNA pri sesalcih, odvisen od preoblikovanja kromatina, je popravljanje z izrezom nukleotidov (NER - ''nucleotide excision repair''). Mehanizem NER popravi posledice večine enojnih prelomov DNA, ki jih zazna zaostajanje RNA polimeraze II oziroma vezava kompleksa UV-DBB (''UV-damaged DNA binding protein'') oz. kompleksa XPC (''xeroderma pigmentosum group C''). Napačen nukleotid se izreže s pomočjo NER faktorjev, helikaz (XPB, XPD), proteinov SSB (XPA, RPA) in endonukleaz (XPF-ERCC1, XPG). Vrzel se zapolni s sintezo pravilne DNA glede na neokvarjeno matrično komplementarno verigo. Ta korak je izveden s pomočjo replikacijskega kompleksa in DNA ligaze.

Prav tako je dostopnost kromatina pomembna pri popravljanju dvojnih prelomov DNA (''DSB - double strand breaks''), kjer sta poškodovani obe verigi. Popravljanje DSB poteka preko nehomolognega povezovanja koncev (takojšnja povezava prelomljenih koncev DNA) ali pa s homologno rekombinacijo, ki lahko poteče izključno med S in G2 fazami celičnega cikla .
==Kovalentne modifikacije histonov==
Najprej mora priti do zaznave in določitve poškodbe, pri čemer pomaga tudi kromatinski status DNA. Direktna vezava popravljalnih proteinov je namreč pogosto onemogočena, saj so lahko poškodovane regije skrite in zakopane globoko v nukleosomskem jedru. Kovalentne modifikacije, ki omogočijo dostop popravljalnim proteinom, tako vzpostavljajo dinamično ravnotežje, ključno za stabilnost genoma.
===Fosforilacija===

----

====Fosforilacija serina 139====
Ob dvojnem prelomu DNA, poteče [http://www.mdpi.com/ijms/ijms-14-04596/article_deploy/html/images/ijms-14-04596f3-1024.png| fosforilacija] serina 139 na histonu H2AX. Reakcija je hitra, zgodi se blizu poškodovane regije in katalizirajo jo fosfoinositid-3-kinazi podobna kinaza (PIKK) ATM ter DNA-protein kinaze. Fosforiliran histon, γ-H2AX, je potreben za formacijo IRIF (''ionizig radiation induced foci''). Gre za kromosomsko mikrookolje, ki spodbuja vezavo popravljalnih proteinov, kot so NBS1 in Brca1 ter proteinov kontrolnih točk celičnega cikla, MDC1 in 53BP1. Koncentriranje slednjih tako spodbuja popravljanje, zmanjšuje možnosti mutacij in hkrati služi kot ojačevalec signalov kontrolnih točk celičnega cikla.
====(De)fosforilacija tirozina 142====
V običajnih situacijah je fosforiliran tudi tirozin 142 histona H2AX. Defosforilacijo sprožijo rentgenski žarki s poškodbo DNA, čemur sledi fosforilacija serina 139 ter vezava popravljalnih faktorjev. V primeru, da ne pride do defosforilacije tirozina, se na H2AX veže protein kinaza JNK1, kar sproži apoptozo. (De)fosforilacija tirozina je torej signal celici, da ob poškodbi presodi ali je zmožna popravila ali pa se usmeri v apoptozo.
====Preučevanje fosforilacije ob DSB v kvasovkah====
Vpliv fosforilacije ob nastanku DSB je bil preučevan tudi na kvasovkah, ki vsebujejo galaktozno-inducibilno HO endonukleazo. Ta sproži dvojni prelom na mestu MAT (''active mating type locus''), ko celice rastejo v prisotnosti galaktoze. Sledi mu fosforilacija histona H2AX (značilni motiv slednjega se pojavi na C terminalnem repu, t.i. motiv SQEL/Y) na serinu 129, ki jo katalizirajo kinaze Mec1/Tel1 (homologi sesalskim ATR/ATM kinazam). Nastali γ-H2AX ostane prisoten skozi celoten mehanizem popravljanja poškodbe .
===Acetilacija===

----

Acetilacija histonov lahko poteče zaradi sevanja UV žarkov in s tem vzpostavi odprto, aktivnejšo kromatinsko strukturo, ki je dostopnejša in omogoča vezavo popravljalnih proteinov. Acetilirana je kombinacija lizinskih ostankov na N terminalnih repkih histonov H3 in H4, kar nevtralizira sicer pozitivni naboj in s tem zrahlja interakcijo med histoni in DNA. Ključna katalizatorja sta histonski acetiltransferazi p300 in Gcn5.
===Metilacija===

----

Metilacije potečejo na lizinskih in argininskih ostankih, katalizirajo jih histonske metiltransferaze. Histoni so lahko mono-, di- ali trimetilirani, specifično zaporedje metiliranih aminokislinskih ostankov pa naj bi določalo transkripcijsko aktivnost in s tem dostopnost kromatina tako transkripcijskim kot tudi popravljalnim proteinom. Direktne povezave med metilacijami in popravljalnimi mehanizmi sicer niso znane, sta pa bili v primeru poškodb zaradi UV žarkov najdeni metilaciji H3K79me in H4K20me.
===Ubikvitinacija===

----

Vezava ubikvitina, majhnega peptida, ni nujno znak za proteasomsko razgradnjo proteina, ampak je lahko posledica sevanja UV žarkov ali DSB. Ubikvitinacija tako lahko povzroči sproščeno interakcijo med histoni in DNA, kar omogoči vezavo popravljalnih proteinov. Ob poškodbi zaradi UV žarkov pri kvasovkah poteče ubikvitinacija na lizinu 123, na histonu H2B. Katalizira jo kompleks Rad6/Bre1 E2/E3.

Pri sesalcih pride zaradi UV žarkov do ubikvitinacije histona H2A, ki pa naj bi bila bolj posledica NER kot pa povod, saj so nekateri eksperimenti pokazali, da v vseh celicah ni prišlo do modifikacije tega histona ob izpostavitvi UV sevanju. Prav tako se ob prisotnosti kompleksov UV-DDB in CUL4A začasno ubikvitinirata histona H3 in H4, kar ustvari kromatinsko okolje, ki omogoči NER.

Histona H2A in H2AX naj bi bila ubikvitinirana tudi ob dvojnih prelomih, kar katalizirata encima Ubc13 (encim E2) in RNF8 (''E3-ligase RING finger-containing enzyme RNF8''). Ubikvitinacija naj bi potekla zaradi fosforilacije histona H2AX in posledične aktivacije proteina MDC1, kamor se veže RNF8. Kljub temu, da direktno kavzalno sosledje med ubikvitinacijo in popravljalnimi mehanizmi ni dokazano, je eksperimentalno delo pokazalo, da v primeru deubikvitinacije pride do zaostanka poteka faze S in aktivacije kontrolnih točk celičnega cikla.
==Od ATP odvisno preoblikovanje kromatina==
Energija hidrolize ATP se porablja pri zamenjavi ali odstranitvi histonov ter pri premikanju nukleosomov vzdolž DNA. Kromatin-preoblikovalni kompleksi s hidrolizo ATP vplivajo na dostopnost DNA za transkripcijo, translacijo in popravljanje DNA. Kompleksi vsebujejo encime iz štirih različnih družin z motorno ATPazno (''SNF2-like'') podenoto: družina SWI/SNF, družina ISWI, družina NuRD/Mi-2/CHD (''nucleosome remodeling and deacatylation / chromodomain, helicase binding'') in družina INO80 (''inositol requiring 80''). Prvi dve družini sta opaženo stimulirali NER.
===Družina SWI/SNF (''switching defective/sucrose fermenting'')===
Encimi te družine v ''in vitro'' pogojih spreminjajo dostopnost nukleosomov ob poškodbah zaradi UV žarkov. Eden od teh DNA popravljalnih proteinov je protein Cockaynovega sindroma skupine B (CSB), ki in vitro spreminja razporeditev nukleosomov v odvisnosti od ATP. Poleg tega privabi p300/CBP in HMGN1 ter interagira s histoni in DNA. Kvasni homolog CSB je Rad26.
===Družina ISWI (''imitation SWI'')===
Običajno je ta družina vključena v regulacijo transkripcije. Večina transkripcijo stimulira, z izjemo ACF (od ATP odvisni kromatin-povezovalni in preoblikovalni faktor), ki jo zavira. V kvasovkah ACF premika nukleosome brez odstranjevanja histonov in izboljša NER, sploh na povezovalnih regijah med nukleosomi. NER faktorjem (XPC, XPA, RPA) je olajšan izrez 6-4PP lezij.
==Nekromatinski preoblikovalci==
Nekateri nekromatinski proteini lahko spreminjajo kromatin ali se vežejo na modificirane histone. GADD45 se preferenčno veže na hiperacetilirano DNA, ki so jo poškodovali UV žarki, in spremeni dostopnost nukleosomov. Sledi popravilo lezij, ki jih povzroča UV svetloba, z izrezom nukleotidov (NER). Nukleosom vezavni proteini HMGN (''high mobility group N'') se s posredovanjem CSB vežejo na rastoči popravljalni kompleks na poškodovani DNA in spremenijo kromatinske strukture s tarčenjem histonov H1 in H3. Manj HMGN1 v celici zmanjša frekvenco popravil.
==Vrnitev v originalni kromatinski status==
Po popravilu dvojnega zloma se kromatin prestrukturira v prvotno epigenetsko stanje. V tej stopnji sodelujejo histonske deacetilaze (HDAC), ki odstranijo acetilne markerje. Nekatere od njih so na zlomu prisotne že med popravilom mutacije .

Bolj kot deacetilaze so ključni od ATP neodvisni histonski šaperoni, kot so CAF1 (kromatinski povezovalni faktor 1), ki je sestavljen iz podenot p150, p60 in p48 ter močno ohranjen pri evkariontih. Njegova naloga je namestiti nukleosome na novo prepisani DNA med replikacijo ali na pravkar popravljeno DNA po NER. Znano je, da so med popravilom UV-povzročenih lezij (fotolezij) priključeni histoni H3 in H4. Analogno do sedaj še niso bili opaženi H2A/H2B histonski šaperoni v povezavi z NER, a bi bil možen kandidat šaperon FACT zaradi podobne vloge kot H3/H4 šaperon CAF1 med replikacijo in transkripcijo.
CAF1 se veže na DNA v odvisnosti od NER. Dodajanje histona H3.1 na popravljeno, do nedavnega zaradi UV poškodovano, mesto se zgodi šele po NER in s pomočjo CAF1. Slednji se pojavi na poškodovanem mestu šele po prihodu vseh endonukleaznih encimov in po zaključeni ligaciji. Rez na mestu 5' sproži sintezo novega segmenta DNA in hkrati privabi CAF1.

CAF1 poveča uspeh vračanja premeščenih nukleosomov s sodelovanjem s ASF1 – močno ohranjenim histonskim šaperonom, s katerim vmešča H3/H4 dimere in tetramere. ASF1-CAF1 sta aktivna med replikacijo in UV induciranih poškodbah DNA. Pri izbitju enega od genov cac1 (gen za CAF1) in asf1 je še vedno prisotna premeščevalna aktivnost, vendar s slabšim izkoristkom. CAF1 in ASF1 sta torej v osnovah samozadostna.
==Viri==
<p>
1. C. Dinant, A. B. Houtsmuller, and W. Vermeulen, “Chromatin structure and DNA damage repair.,” ''Epigenetics Chromatin'', vol. 1, no. 1, p. 9, 2008. <br/>
2. J. E. Krebs, B. Lewin, E. S. Goldstein, and S. T. Kilpatrick, Lewin’s Essential Genes. Jones and Bartlett Publishers, 2013. <br/>
3. Cook,P.J., Ju,B.G., Telese,F., Wang,X., Glass, C.K., and Rosenfeld,M.G. (2009). Tyrosine dephosphorylation of H2AX modulates apoptosis and survival decisions. ''Nature'' 458, 591-596. <br/>
4. N. C. M. House, M. R. Koch, and C. H. Freudenreich, “Chromatin modifications and DNA repair: Beyond double-strand breaks,” ''Front. Genet.'', 2014. <br/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Popravljanje DNA v kontekstu kromatina

2016-05-29T18:24:49Z

Smalensek:

Ob poškodbi dednega materiala se celica odzove s t.i. '''DDR''' ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2596136/figure/F2/|''DNA damage response'']), ki poleg direktnega popravila napake vključuje tudi upočasnitev celičnega cikla, kar celici zagotovi več časa za popravljanje. Slednje je neizogibno povezano s konformacijo DNA, saj je ta večino časa v celici tesno zvita v strukturo, imenovano kromatin, kar vzpostavljajo proteini histoni. Prav kromatinsko stanje, ki tako kot na replikacijo ali transkripcijo vpliva tudi na DDR, je tisto, ki določa in omogoča dostop ključnim popravljalnim proteinom. Ključno za razumevanje popravljanja DNA v kontekstu kromatina je poznavanje celičnega cikla in popravljalnih mehanizmov.
==Celični cikel, NER in DSB==
===Celični cikel===
Celični cikel sestavljajo štiri faze: faza G1, S, G2 in M. V času faze G1 celica raste in ko doseže prvo kontrolno točko, ob prehodu v fazo S, mora biti podvojena določena minimalna količina RNA, proteinov, lipidov ter ogljikovih hidratov, DNA pa ne sme biti poškodovana. V primeru, da je DNA poškodovana, celica preide v fazo G0, kjer pride do popravljanja ali morebitne apoptoze. V fazi S in G2 pride do replikacije DNA in na kontrolni točki med G2 in M mora biti vsa DNA podvojena, nepoškodovana, ključno pa je tudi spodbudno zunajcelično okolje. Celični cikel uravnavajo proteini ciklini in od ciklinov odvisne kinaze, katerih delovanje je močno povezano s kromatinskim statusom DNA.
===NER in DSB===
Eden izmed najbolj znanih tipov popravila DNA pri sesalcih, odvisen od preoblikovanja kromatina, je popravljanje z izrezom nukleotidov (NER - ''nucleotide excision repair''). Mehanizem NER popravi posledice večine enojnih prelomov DNA, ki jih zazna zaostajanje RNA polimeraze II oziroma vezava kompleksa UV-DBB (''UV-damaged DNA binding protein'') oz. kompleksa XPC (''xeroderma pigmentosum group C''). Napačen nukleotid se izreže s pomočjo NER faktorjev, helikaz (XPB, XPD), proteinov SSB (XPA, RPA) in endonukleaz (XPF-ERCC1, XPG). Vrzel se zapolni s sintezo pravilne DNA glede na neokvarjeno matrično komplementarno verigo. Ta korak je izveden s pomočjo replikacijskega kompleksa in DNA ligaze.

Prav tako je dostopnost kromatina pomembna pri popravljanju dvojnih prelomov DNA (''DSB - double strand breaks''), kjer sta poškodovani obe verigi. Popravljanje DSB poteka preko nehomolognega povezovanja koncev (takojšnja povezava prelomljenih koncev DNA) ali pa s homologno rekombinacijo, ki lahko poteče izključno med S in G2 fazami celičnega cikla .
==Kovalentne modifikacije histonov==
Najprej mora priti do zaznave in določitve poškodbe, pri čemer pomaga tudi kromatinski status DNA. Direktna vezava popravljalnih proteinov je namreč pogosto onemogočena, saj so lahko poškodovane regije skrite in zakopane globoko v nukleosomskem jedru. Kovalentne modifikacije, ki omogočijo dostop popravljalnim proteinom, tako vzpostavljajo dinamično ravnotežje, ključno za stabilnost genoma.
===Fosforilacija===

----

====Fosforilacija serina 139====
Ob dvojnem prelomu DNA, poteče [http://www.mdpi.com/ijms/ijms-14-04596/article_deploy/html/images/ijms-14-04596f3-1024.png| fosforilacija] serina 139 na histonu H2AX. Reakcija je hitra, zgodi se blizu poškodovane regije in katalizirajo jo fosfoinositid-3-kinazi podobna kinaza (PIKK) ATM ter DNA-protein kinaze. Fosforiliran histon, γ-H2AX, je potreben za formacijo IRIF (''ionizig radiation induced foci''). Gre za kromosomsko mikrookolje, ki spodbuja vezavo popravljalnih proteinov, kot so NBS1 in Brca1 ter proteinov kontrolnih točk celičnega cikla, MDC1 in 53BP1. Koncentriranje slednjih tako spodbuja popravljanje, zmanjšuje možnosti mutacij in hkrati služi kot ojačevalec signalov kontrolnih točk celičnega cikla.
====(De)fosforilacija tirozina 142====
V običajnih situacijah je fosforiliran tudi tirozin 142 histona H2AX. Defosforilacijo sprožijo rentgenski žarki s poškodbo DNA, čemur sledi fosforilacija serina 139 ter vezava popravljalnih faktorjev. V primeru, da ne pride do defosforilacije tirozina, se na H2AX veže protein kinaza JNK1, kar sproži apoptozo. (De)fosforilacija tirozina je torej signal celici, da ob poškodbi presodi ali je zmožna popravila ali pa se usmeri v apoptozo.
====Preučevanje fosforilacije ob DSB v kvasovkah====
Vpliv fosforilacije ob nastanku DSB je bil preučevan tudi na kvasovkah, ki vsebujejo galaktozno-inducibilno HO endonukleazo. Ta sproži dvojni prelom na mestu MAT (''active mating type locus''), ko celice rastejo v prisotnosti galaktoze. Sledi mu fosforilacija histona H2AX (značilni motiv slednjega se pojavi na C terminalnem repu, t.i. motiv SQEL/Y) na serinu 129, ki jo katalizirajo kinaze Mec1/Tel1 (homologi sesalskim ATR/ATM kinazam). Nastali γ-H2AX ostane prisoten skozi celoten mehanizem popravljanja poškodbe .
===Acetilacija===

----

Acetilacija histonov lahko poteče zaradi sevanja UV žarkov in s tem vzpostavi odprto, aktivnejšo kromatinsko strukturo, ki je dostopnejša in omogoča vezavo popravljalnih proteinov. Acetilirana je kombinacija lizinskih ostankov na N terminalnih repkih histonov H3 in H4, kar nevtralizira sicer pozitivni naboj in s tem zrahlja interakcijo med histoni in DNA. Ključna katalizatorja sta histonski acetiltransferazi p300 in Gcn5.
===Metilacija===

----

Metilacije potečejo na lizinskih in argininskih ostankih, katalizirajo jih histonske metiltransferaze. Histoni so lahko mono-, di- ali trimetilirani, specifično zaporedje metiliranih aminokislinskih ostankov pa naj bi določalo transkripcijsko aktivnost in s tem dostopnost kromatina tako transkripcijskim kot tudi popravljalnim proteinom. Direktne povezave med metilacijami in popravljalnimi mehanizmi sicer niso znane, sta pa bili v primeru poškodb zaradi UV žarkov najdeni metilaciji H3K79me in H4K20me.
===Ubikvitinacija===

----

Vezava ubikvitina, majhnega peptida, ni nujno znak za proteasomsko razgradnjo proteina, ampak je lahko posledica sevanja UV žarkov ali DSB. Ubikvitinacija tako lahko povzroči sproščeno interakcijo med histoni in DNA, kar omogoči vezavo popravljalnih proteinov. Ob poškodbi zaradi UV žarkov pri kvasovkah poteče ubikvitinacija na lizinu 123, na histonu H2B. Katalizira jo kompleks Rad6/Bre1 E2/E3.

Pri sesalcih pride zaradi UV žarkov do ubikvitinacije histona H2A, ki pa naj bi bila bolj posledica NER kot pa povod, saj so nekateri eksperimenti pokazali, da v vseh celicah ni prišlo do modifikacije tega histona ob izpostavitvi UV sevanju. Prav tako se ob prisotnosti kompleksov UV-DDB in CUL4A začasno ubikvitinirata histona H3 in H4, kar ustvari kromatinsko okolje, ki omogoči NER.

Histona H2A in H2AX naj bi bila ubikvitinirana tudi ob dvojnih prelomih, kar katalizirata encima Ubc13 (encim E2) in RNF8 (''E3-ligase RING finger-containing enzyme RNF8''). Ubikvitinacija naj bi potekla zaradi fosforilacije histona H2AX in posledične aktivacije proteina MDC1, kamor se veže RNF8. Kljub temu, da direktno kavzalno sosledje med ubikvitinacijo in popravljalnimi mehanizmi ni dokazano, je eksperimentalno delo pokazalo, da v primeru deubikvitinacije pride do zaostanka poteka faze S in aktivacije kontrolnih točk celičnega cikla.
==Od ATP odvisno preoblikovanje kromatina==
Energija hidrolize ATP se porablja pri zamenjavi ali odstranitvi histonov ter pri premikanju nukleosomov vzdolž DNA. Kromatin-preoblikovalni kompleksi s hidrolizo ATP vplivajo na dostopnost DNA za transkripcijo, translacijo in popravljanje DNA. Kompleksi vsebujejo encime iz štirih različnih družin z motorno ATPazno (''SNF2-like'') podenoto: družina SWI/SNF, družina ISWI, družina NuRD/Mi-2/CHD (''nucleosome remodeling and deacatylation / chromodomain, helicase binding'') in družina INO80 (''inositol requiring 80''). Prvi dve družini sta opaženo stimulirali NER.
===Družina SWI/SNF (''switching defective/sucrose fermenting'')===
Encimi te družine v ''in vitro'' pogojih spreminjajo dostopnost nukleosomov ob poškodbah zaradi UV žarkov. Eden od teh DNA popravljalnih proteinov je protein Cockaynovega sindroma skupine B (CSB), ki in vitro spreminja razporeditev nukleosomov v odvisnosti od ATP. Poleg tega privabi p300/CBP in HMGN1 ter interagira s histoni in DNA. Kvasni homolog CSB je Rad26.
===Družina ISWI (''imitation SWI'')===
Običajno je ta družina vključena v regulacijo transkripcije. Večina transkripcijo stimulira, z izjemo ACF (od ATP odvisni kromatin-povezovalni in preoblikovalni faktor), ki jo zavira. V kvasovkah ACF premika nukleosome brez odstranjevanja histonov in izboljša NER, sploh na povezovalnih regijah med nukleosomi. NER faktorjem (XPC, XPA, RPA) je olajšan izrez 6-4PP lezij.
==Nekromatinski preoblikovalci==
Nekateri nekromatinski proteini lahko spreminjajo kromatin ali se vežejo na modificirane histone. GADD45 se preferenčno veže na hiperacetilirano DNA, ki so jo poškodovali UV žarki, in spremeni dostopnost nukleosomov. Sledi popravilo lezij, ki jih povzroča UV svetloba, z izrezom nukleotidov (NER). Nukleosom vezavni proteini HMGN (''high mobility group N'') se s posredovanjem CSB vežejo na rastoči popravljalni kompleks na poškodovani DNA in spremenijo kromatinske strukture s tarčenjem histonov H1 in H3. Manj HMGN1 v celici zmanjša frekvenco popravil.
==Vrnitev v originalni kromatinski status==
Po popravilu dvojnega zloma se kromatin prestrukturira v prvotno epigenetsko stanje. V tej stopnji sodelujejo histonske deacetilaze (HDAC), ki odstranijo acetilne markerje. Nekatere od njih so na zlomu prisotne že med popravilom mutacije .

Bolj kot deacetilaze so ključni od ATP neodvisni histonski šaperoni, kot so CAF1 (kromatinski povezovalni faktor 1), ki je sestavljen iz podenot p150, p60 in p48 ter močno ohranjen pri evkariontih. Njegova naloga je namestiti nukleosome na novo prepisani DNA med replikacijo ali na pravkar popravljeno DNA po NER. Znano je, da so med popravilom UV-povzročenih lezij (fotolezij) priključeni histoni H3 in H4. Analogno do sedaj še niso bili opaženi H2A/H2B histonski šaperoni v povezavi z NER, a bi bil možen kandidat šaperon FACT zaradi podobne vloge kot H3/H4 šaperon CAF1 med replikacijo in transkripcijo.
CAF1 se veže na DNA v odvisnosti od NER. Dodajanje histona H3.1 na popravljeno, do nedavnega zaradi UV poškodovano, mesto se zgodi šele po NER in s pomočjo CAF1. Slednji se pojavi na poškodovanem mestu šele po prihodu vseh endonukleaznih encimov in po zaključeni ligaciji. Rez na mestu 5' sproži sintezo novega segmenta DNA in hkrati privabi CAF1.

CAF1 poveča uspeh vračanja premeščenih nukleosomov s sodelovanjem s ASF1 – močno ohranjenim histonskim šaperonom, s katerim vmešča H3/H4 dimere in tetramere. ASF1-CAF1 sta aktivna med replikacijo in UV induciranih poškodbah DNA. Pri izbitju enega od genov cac1 (gen za CAF1) in asf1 je še vedno prisotna premeščevalna aktivnost, vendar s slabšim izkoristkom. CAF1 in ASF1 sta torej v osnovah samozadostna.
==Viri==
<p>
1. C. Dinant, A. B. Houtsmuller, and W. Vermeulen, “Chromatin structure and DNA damage repair.,” ''Epigenetics Chromatin'', vol. 1, no. 1, p. 9, 2008. <br/>
2. J. E. Krebs, B. Lewin, E. S. Goldstein, and S. T. Kilpatrick, Lewin’s Essential Genes. Jones and Bartlett Publishers, 2013. <br/>
3. Cook,P.J., Ju,B.G., Telese,F., Wang,X., Glass, C.K., and Rosenfeld,M.G. (2009). Tyrosine dephosphorylation of H2AX modulates apoptosis and survival decisions. ''Nature'' 458, 591-596. <br/>
4. N. C. M. House, M. R. Koch, and C. H. Freudenreich, “Chromatin modifications and DNA repair: Beyond double-strand breaks,” ''Front. Genet.'', 2014. <br/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Popravljanje mutacij in rekombinacijski procesi

2016-05-29T18:24:02Z

Smalensek:

V študijskem letu 2015/16 bodo seminarji obsegali dve med seboj povezani temi: Popravljanje okvar in mutacij ter mehanizme rekombinacije genetskega materiala. Tema je razdeljena na 18 poglavij, pri čemer zadnja poglavja zajemajo posebne primere in mehanizme popravljanja, ki niso vezani na DNA, pač pa na proces translacije pri poškodovani RNA, zadnji dve temi pa sta dodani kasneje in bosta predstavljeni v angleščini kot individualna seminarja. Kot izhodišče za pripravo si najprej preberite ustrezna poglavja v učbeniku, kjer so ta navedena na spodnjem seznamu. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se odmakniti od osnovne teme seminarja.

Vsako temo obdelajo praviloma dva ali trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje en dan pred predstavitvijo (do polnoči), torej najkasneje v nedeljo ali v torek za ponedeljkove oziroma sredine seminarje. Predstavitve seminarjev 1-4 bodo 23. maja, 5-8 25. maja, 9-12 30. maja, 13-16 1. junija 2016, 17-18 pa sta kratka seminarja in bosta na vrsti 6. junija. Za vsak seminar imate na voljo 14-18 minut časa, da ga predstavite, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki strani uporabite zavihek 'discussion').

Vsebina seminarjev je izpitna snov, razen seminarjev št. 4 ter 13-18.

Poglavja za seminarje so:

# Direktno popravljanje mutacij (Principles of Molecular Biology: 9.7)
# Popravljanje z izcepom baze (9.8)
# Popravljanje z izcepom nukleotida (9.9)
# Xeroderma pigmentosum
# Popravljanje neujemanja (9.10)
# SOS-popravljanje (9.11)
# Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic (10.1)
# Mitozna rekombinacija (10.2)
# Nehomologno povezovanje koncev (10.4)
# Mejozna rekombinacija (10.5)
# Razreševanje Hollidayevega križišča (Lewin's Essential Genes: 15.6)
# Popravljanje DNA v kontekstu kromatina (Lewin's Essential Genes: 16.9)
# Menjava spola pri kvasovki (Lewin's Essential Genes: 15.9)
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Lewin's Essential Genes: str. 400)
# Trans-translacija (translacija pri poškodovani mRNA)
# Od RNA neodvisna elongacija (Science 347, 75 (2015))
# Mehanizmi izjemne odpornosti proti radioaktivnemu sevanju pri prokariontih
# Kompleksne preureditve kromosomov

----

Vpišite se v oklepaj za naslovom seminarja:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Neposredno_popravljanje_mutacij Direktno popravljanje mutacij] (Matej Hvalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/POPRAVLJANJE_Z_IZCEPOM_BAZE_%28BER%29 Popravljanje z izcepom baze (BER)] (Urša Čerček, Urša Kopač, Ema Gašperšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_z_izcepom_nukleotida#Sklopitev_GG-NER_in_TC-NER Popravljanje z izcepom nukleotida] (Petra Hruševar, Gašper Žun, Uroš Zavrtanik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Xeroderma_pigmentosum Xeroderma pigmentosum] (Maja Zupanc, Elvira Boršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_neujemanja Popravljanje neujemanja] Popravljanje neujemanja (Kristjan Stibilj, Rok Miklavčič, Sara Tekavec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SOS-popravljanje SOS-popravljanje] (Tadej Satler, Gašper Virant)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_kolapsa_replikacijskih_vilic Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic] (Klara Lenart, Tilen Tršelič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mitozna_rekombinacija Mitozna rekombinacija] (Peter Pečan, Valentina Levak, Janja Krapež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nehomologno_povezovanje_koncev Nehomologno povezovanje koncev] (Klara Kuret, Blaž Lebar, Neža Koritnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mejozna_rekombinacija Mejozna rekombinacija] (Eva Rajh, Katja Čop)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razreševanje_Hollidayevega_križišča#Viri Razreševanje Hollidayevega križišča] (Nejc Kejžar, Lovro Kotnik)
# [[Popravljanje DNA v kontekstu kromatina|Popravljanje DNA v kontekstu kromatina]] (Špela Malenšek, Tjaša Lukšič)
# Menjava spola pri kvasovki
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Miha Koprivnikar Krajnc, Katja Brezovar)
# Trans-translacija (Lara Jerman, Aleksandra Uzar, Simon Aleksič)
# Od RNA neodvisna elongacija
# "Unraveling the mechanisms of extreme radioresistance in prokaryotes: Lessons from nature"(Fran Krstanović)
# "Mechanisms of origin, phenotypic effects and diagnostic implications of complex chromosome rearrangements" (Javier Fraguas)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

Popravljanje mutacij in rekombinacijski procesi

2016-05-29T18:23:48Z

Smalensek:

V študijskem letu 2015/16 bodo seminarji obsegali dve med seboj povezani temi: Popravljanje okvar in mutacij ter mehanizme rekombinacije genetskega materiala. Tema je razdeljena na 18 poglavij, pri čemer zadnja poglavja zajemajo posebne primere in mehanizme popravljanja, ki niso vezani na DNA, pač pa na proces translacije pri poškodovani RNA, zadnji dve temi pa sta dodani kasneje in bosta predstavljeni v angleščini kot individualna seminarja. Kot izhodišče za pripravo si najprej preberite ustrezna poglavja v učbeniku, kjer so ta navedena na spodnjem seznamu. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se odmakniti od osnovne teme seminarja.

Vsako temo obdelajo praviloma dva ali trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje en dan pred predstavitvijo (do polnoči), torej najkasneje v nedeljo ali v torek za ponedeljkove oziroma sredine seminarje. Predstavitve seminarjev 1-4 bodo 23. maja, 5-8 25. maja, 9-12 30. maja, 13-16 1. junija 2016, 17-18 pa sta kratka seminarja in bosta na vrsti 6. junija. Za vsak seminar imate na voljo 14-18 minut časa, da ga predstavite, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki strani uporabite zavihek 'discussion').

Vsebina seminarjev je izpitna snov, razen seminarjev št. 4 ter 13-18.

Poglavja za seminarje so:

# Direktno popravljanje mutacij (Principles of Molecular Biology: 9.7)
# Popravljanje z izcepom baze (9.8)
# Popravljanje z izcepom nukleotida (9.9)
# Xeroderma pigmentosum
# Popravljanje neujemanja (9.10)
# SOS-popravljanje (9.11)
# Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic (10.1)
# Mitozna rekombinacija (10.2)
# Nehomologno povezovanje koncev (10.4)
# Mejozna rekombinacija (10.5)
# Razreševanje Hollidayevega križišča (Lewin's Essential Genes: 15.6)
# Popravljanje DNA v kontekstu kromatina (Lewin's Essential Genes: 16.9)
# Menjava spola pri kvasovki (Lewin's Essential Genes: 15.9)
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Lewin's Essential Genes: str. 400)
# Trans-translacija (translacija pri poškodovani mRNA)
# Od RNA neodvisna elongacija (Science 347, 75 (2015))
# Mehanizmi izjemne odpornosti proti radioaktivnemu sevanju pri prokariontih
# Kompleksne preureditve kromosomov

----

Vpišite se v oklepaj za naslovom seminarja:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Neposredno_popravljanje_mutacij Direktno popravljanje mutacij] (Matej Hvalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/POPRAVLJANJE_Z_IZCEPOM_BAZE_%28BER%29 Popravljanje z izcepom baze (BER)] (Urša Čerček, Urša Kopač, Ema Gašperšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_z_izcepom_nukleotida#Sklopitev_GG-NER_in_TC-NER Popravljanje z izcepom nukleotida] (Petra Hruševar, Gašper Žun, Uroš Zavrtanik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Xeroderma_pigmentosum Xeroderma pigmentosum] (Maja Zupanc, Elvira Boršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_neujemanja Popravljanje neujemanja] Popravljanje neujemanja (Kristjan Stibilj, Rok Miklavčič, Sara Tekavec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SOS-popravljanje SOS-popravljanje] (Tadej Satler, Gašper Virant)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_kolapsa_replikacijskih_vilic Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic] (Klara Lenart, Tilen Tršelič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mitozna_rekombinacija Mitozna rekombinacija] (Peter Pečan, Valentina Levak, Janja Krapež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nehomologno_povezovanje_koncev Nehomologno povezovanje koncev] (Klara Kuret, Blaž Lebar, Neža Koritnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mejozna_rekombinacija Mejozna rekombinacija] (Eva Rajh, Katja Čop)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razreševanje_Hollidayevega_križišča#Viri Razreševanje Hollidayevega križišča] (Nejc Kejžar, Lovro Kotnik)
# [[Popravljanje DNA v kontekstu kromatina|Popravljanje DNA v kontekstu kromatina]](Špela Malenšek, Tjaša Lukšič)
# Menjava spola pri kvasovki
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Miha Koprivnikar Krajnc, Katja Brezovar)
# Trans-translacija (Lara Jerman, Aleksandra Uzar, Simon Aleksič)
# Od RNA neodvisna elongacija
# "Unraveling the mechanisms of extreme radioresistance in prokaryotes: Lessons from nature"(Fran Krstanović)
# "Mechanisms of origin, phenotypic effects and diagnostic implications of complex chromosome rearrangements" (Javier Fraguas)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

Talk:Popravljanje DNA v kontekstu kromatina

2016-05-29T18:19:31Z

Smalensek: New page: ===Delitev dela=== 1. Celični cikel, NER in DSB <br/> :1.1. Celični cikel : '''Špela Malenšek''' <br/> :1.2. NER in DSB : '''Tjaša Lukšič''' <br/> 2. Kovalentne modifikacije histo...

===Delitev dela===
1. Celični cikel, NER in DSB <br/>
:1.1. Celični cikel : '''Špela Malenšek''' <br/>
:1.2. NER in DSB : '''Tjaša Lukšič''' <br/>

2. Kovalentne modifikacije histonov : '''Špela Malenšek''' <br/>
:2.1. Fosforilacija <br/>
::2.1.1. Fosforilacija serina 139 <br/>
::2.1.2. (De)fosforilacija tirozina 142 <br/>
::2.1.3. Preučevanje fosforilacije ob DSB v kvasovkah <br/>
:2.2. Acetilacija <br/>
:2.3. Metilacija <br/>
:2.4. Ubikvitinacija <br/>

3. Od ATP odvisno preoblikovanje kromatina : '''Tjaša Lukšič''' <br/>
:3.1. Družina SWI/SNF (switching defective/sucrose fermenting) <br/>
:3.2. Družina ISWI (imitation SWI) <br/>
4. Nekromatinski preoblikovalci : '''Tjaša Lukšič''' <br/>
5. Vrnitev v originalni kromatinski status : '''Tjaša Lukšič''' <br/>

Popravljanje DNA v kontekstu kromatina

2016-05-29T18:12:45Z

Smalensek:

Popravljanje DNA v kontekstu kromatina

2016-05-29T18:12:12Z

Smalensek: New page: Ob poškodbi dednega materiala se celica odzove s t.i. '''DDR''' ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2596136/figure/F2/|''DNA damage response'']), ki poleg direktnega popravila n...

Ob poškodbi dednega materiala se celica odzove s t.i. '''DDR''' ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2596136/figure/F2/|''DNA damage response'']), ki poleg direktnega popravila napake vključuje tudi upočasnitev celičnega cikla, kar celici zagotovi več časa za popravljanje. Slednje je neizogibno povezano s konformacijo DNA, saj je ta večino časa v celici tesno zvita v strukturo, imenovano kromatin, kar vzpostavljajo proteini histoni. Prav kromatinsko stanje, ki tako kot na replikacijo ali transkripcijo vpliva tudi na DDR, je tisto, ki določa in omogoča dostop ključnim popravljalnim proteinom. Ključno za razumevanje popravljanja DNA v kontekstu kromatina je poznavanje celičnega cikla in popravljalnih mehanizmov.
==Celični cikel, NER in DSB==
===Celični cikel===
Celični cikel sestavljajo štiri faze: faza G1, S, G2 in M. V času faze G1 celica raste in ko doseže prvo kontrolno točko, ob prehodu v fazo S, mora biti podvojena določena minimalna količina RNA, proteinov, lipidov ter ogljikovih hidratov, DNA pa ne sme biti poškodovana. V primeru, da je DNA poškodovana, celica preide v fazo G0, kjer pride do popravljanja ali morebitne apoptoze. V fazi S in G2 pride do replikacije DNA in na kontrolni točki med G2 in M mora biti vsa DNA podvojena, nepoškodovana, ključno pa je tudi spodbudno zunajcelično okolje. Celični cikel uravnavajo proteini ciklini in od ciklinov odvisne kinaze, katerih delovanje je močno povezano s kromatinskim statusom DNA.
===NER in DSB===
Eden izmed najbolj znanih tipov popravila DNA pri sesalcih, odvisen od preoblikovanja kromatina, je popravljanje z izrezom nukleotidov (NER - ''nucleotide excision repair''). Mehanizem NER popravi posledice večine enojnih prelomov DNA, ki jih zazna zaostajanje RNA polimeraze II oziroma vezava kompleksa UV-DBB (''UV-damaged DNA binding protein'') oz. kompleksa XPC (''xeroderma pigmentosum group C''). Napačen nukleotid se izreže s pomočjo NER faktorjev, helikaz (XPB, XPD), proteinov SSB (XPA, RPA) in endonukleaz (XPF-ERCC1, XPG). Vrzel se zapolni s sintezo pravilne DNA glede na neokvarjeno matrično komplementarno verigo. Ta korak je izveden s pomočjo replikacijskega kompleksa in DNA ligaze.

Prav tako je dostopnost kromatina pomembna pri popravljanju dvojnih prelomov DNA (''DSB - double strand breaks''), kjer sta poškodovani obe verigi. Popravljanje DSB poteka preko nehomolognega povezovanja koncev (takojšnja povezava prelomljenih koncev DNA) ali pa s homologno rekombinacijo, ki lahko poteče izključno med S in G2 fazami celičnega cikla .
==Kovalentne modifikacije histonov==
Najprej mora priti do zaznave in določitve poškodbe, pri čemer pomaga tudi kromatinski status DNA. Direktna vezava popravljalnih proteinov je namreč pogosto onemogočena, saj so lahko poškodovane regije skrite in zakopane globoko v nukleosomskem jedru. Kovalentne modifikacije, ki omogočijo dostop popravljalnim proteinom, tako vzpostavljajo dinamično ravnotežje, ključno za stabilnost genoma.
===Fosforilacija===

----

====Fosforilacija serina 139====
Ob dvojnem prelomu DNA, poteče [http://www.mdpi.com/ijms/ijms-14-04596/article_deploy/html/images/ijms-14-04596f3-1024.png| fosforilacija] serina 139 na histonu H2AX. Reakcija je hitra, zgodi se blizu poškodovane regije in katalizirajo jo fosfoinositid-3-kinazi podobna kinaza (PIKK) ATM ter DNA-protein kinaze. Fosforiliran histon, γ-H2AX, je potreben za formacijo IRIF (''ionizig radiation induced foci''). Gre za kromosomsko mikrookolje, ki spodbuja vezavo popravljalnih proteinov, kot so NBS1 in Brca1 ter proteinov kontrolnih točk celičnega cikla, MDC1 in 53BP1. Koncentriranje slednjih tako spodbuja popravljanje, zmanjšuje možnosti mutacij in hkrati služi kot ojačevalec signalov kontrolnih točk celičnega cikla.
====(De)fosforilacija tirozina 142====
V običajnih situacijah je fosforiliran tudi tirozin 142 histona H2AX. Defosforilacijo sprožijo rentgenski žarki s poškodbo DNA, čemur sledi fosforilacija serina 139 ter vezava popravljalnih faktorjev. V primeru, da ne pride do defosforilacije tirozina, se na H2AX veže protein kinaza JNK1, kar sproži apoptozo. (De)fosforilacija tirozina je torej signal celici, da ob poškodbi presodi ali je zmožna popravila ali pa se usmeri v apoptozo.
====Preučevanje fosforilacije ob DSB v kvasovkah====
Vpliv fosforilacije ob nastanku DSB je bil preučevan tudi na kvasovkah, ki vsebujejo galaktozno-inducibilno HO endonukleazo. Ta sproži dvojni prelom na mestu MAT (''active mating type locus''), ko celice rastejo v prisotnosti galaktoze. Sledi mu fosforilacija histona H2AX (značilni motiv slednjega se pojavi na C terminalnem repu, t.i. motiv SQEL/Y) na serinu 129, ki jo katalizirajo kinaze Mec1/Tel1 (homologi sesalskim ATR/ATM kinazam). Nastali γ-H2AX ostane prisoten skozi celoten mehanizem popravljanja poškodbe .
===Acetilacija===

----

Acetilacija histonov lahko poteče zaradi sevanja UV žarkov in s tem vzpostavi odprto, aktivnejšo kromatinsko strukturo, ki je dostopnejša in omogoča vezavo popravljalnih proteinov. Acetilirana je kombinacija lizinskih ostankov na N terminalnih repkih histonov H3 in H4, kar nevtralizira sicer pozitivni naboj in s tem zrahlja interakcijo med histoni in DNA. Ključna katalizatorja sta histonski acetiltransferazi p300 in Gcn5.
===Metilacija===

----

Metilacije potečejo na lizinskih in argininskih ostankih, katalizirajo jih histonske metiltransferaze. Histoni so lahko mono-, di- ali trimetilirani, specifično zaporedje metiliranih aminokislinskih ostankov pa naj bi določalo transkripcijsko aktivnost in s tem dostopnost kromatina tako transkripcijskim kot tudi popravljalnim proteinom. Direktne povezave med metilacijami in popravljalnimi mehanizmi sicer niso znane, sta pa bili v primeru poškodb zaradi UV žarkov najdeni metilaciji H3K79me in H4K20me.
===Ubikvitinacija===

----

Vezava ubikvitina, majhnega peptida, ni nujno znak za proteasomsko razgradnjo proteina, ampak je lahko posledica sevanja UV žarkov ali DSB. Ubikvitinacija tako lahko povzroči sproščeno interakcijo med histoni in DNA, kar omogoči vezavo popravljalnih proteinov. Ob poškodbi zaradi UV žarkov pri kvasovkah poteče ubikvitinacija na lizinu 123, na histonu H2B. Katalizira jo kompleks Rad6/Bre1 E2/E3.

Pri sesalcih pride zaradi UV žarkov do ubikvitinacije histona H2A, ki pa naj bi bila bolj posledica NER kot pa povod, saj so nekateri eksperimenti pokazali, da v vseh celicah ni prišlo do modifikacije tega histona ob izpostavitvi UV sevanju. Prav tako se ob prisotnosti kompleksov UV-DDB in CUL4A začasno ubikvitinirata histona H3 in H4, kar ustvari kromatinsko okolje, ki omogoči NER.

Histona H2A in H2AX naj bi bila ubikvitinirana tudi ob dvojnih prelomih, kar katalizirata encima Ubc13 (encim E2) in RNF8 (''E3-ligase RING finger-containing enzyme RNF8''). Ubikvitinacija naj bi potekla zaradi fosforilacije histona H2AX in posledične aktivacije proteina MDC1, kamor se veže RNF8. Kljub temu, da direktno kavzalno sosledje med ubikvitinacijo in popravljalnimi mehanizmi ni dokazano, je eksperimentalno delo pokazalo, da v primeru deubikvitinacije pride do zaostanka poteka faze S in aktivacije kontrolnih točk celičnega cikla.
==Od ATP odvisno preoblikovanje kromatina==
Energija hidrolize ATP se porablja pri zamenjavi ali odstranitvi histonov ter pri premikanju nukleosomov vzdolž DNA. Kromatin-preoblikovalni kompleksi s hidrolizo ATP vplivajo na dostopnost DNA za transkripcijo, translacijo in popravljanje DNA. Kompleksi vsebujejo encime iz štirih različnih družin z motorno ATPazno (''SNF2-like'') podenoto: družina SWI/SNF, družina ISWI, družina NuRD/Mi-2/CHD (''nucleosome remodeling and deacatylation / chromodomain, helicase binding'') in družina INO80 (''inositol requiring 80''). Prvi dve družini sta opaženo stimulirali NER.
===Družina SWI/SNF (''switching defective/sucrose fermenting'')===
Encimi te družine v ''in vitro'' pogojih spreminjajo dostopnost nukleosomov ob poškodbah zaradi UV žarkov. Eden od teh DNA popravljalnih proteinov je protein Cockaynovega sindroma skupine B (CSB), ki in vitro spreminja razporeditev nukleosomov v odvisnosti od ATP. Poleg tega privabi p300/CBP in HMGN1 ter interagira s histoni in DNA. Kvasni homolog CSB je Rad26.
===Družina ISWI (''imitation SWI'')===
Običajno je ta družina vključena v regulacijo transkripcije. Večina transkripcijo stimulira, z izjemo ACF (od ATP odvisni kromatin-povezovalni in preoblikovalni faktor), ki jo zavira. V kvasovkah ACF premika nukleosome brez odstranjevanja histonov in izboljša NER, sploh na povezovalnih regijah med nukleosomi. NER faktorjem (XPC, XPA, RPA) je olajšan izrez 6-4PP lezij.
==Nekromatinski preoblikovalci==
Nekateri nekromatinski proteini lahko spreminjajo kromatin ali se vežejo na modificirane histone. GADD45 se preferenčno veže na hiperacetilirano DNA, ki so jo poškodovali UV žarki, in spremeni dostopnost nukleosomov. Sledi popravilo lezij, ki jih povzroča UV svetloba, z izrezom nukleotidov (NER). Nukleosom vezavni proteini HMGN (''high mobility group N'') se s posredovanjem CSB vežejo na rastoči popravljalni kompleks na poškodovani DNA in spremenijo kromatinske strukture s tarčenjem histonov H1 in H3. Manj HMGN1 v celici zmanjša frekvenco popravil.
==Vrnitev v originalni kromatinski status==
Po popravilu dvojnega zloma se kromatin prestrukturira v prvotno epigenetsko stanje. V tej stopnji sodelujejo histonske deacetilaze (HDAC), ki odstranijo acetilne markerje. Nekatere od njih so na zlomu prisotne že med popravilom mutacije .

Bolj kot deacetilaze so ključni od ATP neodvisni histonski šaperoni, kot so CAF1 (kromatinski povezovalni faktor 1), ki je sestavljen iz podenot p150, p60 in p48 ter močno ohranjen pri evkariontih. Njegova naloga je namestiti nukleosome na novo prepisani DNA med replikacijo ali na pravkar popravljeno DNA po NER. Znano je, da so med popravilom UV-povzročenih lezij (fotolezij) priključeni histoni H3 in H4. Analogno do sedaj še niso bili opaženi H2A/H2B histonski šaperoni v povezavi z NER, a bi bil možen kandidat šaperon FACT zaradi podobne vloge kot H3/H4 šaperon CAF1 med replikacijo in transkripcijo.
CAF1 se veže na DNA v odvisnosti od NER. Dodajanje histona H3.1 na popravljeno, do nedavnega zaradi UV poškodovano, mesto se zgodi šele po NER in s pomočjo CAF1. Slednji se pojavi na poškodovanem mestu šele po prihodu vseh endonukleaznih encimov in po zaključeni ligaciji. Rez na mestu 5' sproži sintezo novega segmenta DNA in hkrati privabi CAF1.

CAF1 poveča uspeh vračanja premeščenih nukleosomov s sodelovanjem s ASF1 – močno ohranjenim histonskim šaperonom, s katerim vmešča H3/H4 dimere in tetramere. ASF1-CAF1 sta aktivna med replikacijo in UV induciranih poškodbah DNA. Pri izbitju enega od genov cac1 (gen za CAF1) in asf1 je še vedno prisotna premeščevalna aktivnost, vendar s slabšim izkoristkom. CAF1 in ASF1 sta torej v osnovah samozadostna.
==Viri==
<p>
1. C. Dinant, A. B. Houtsmuller, and W. Vermeulen, “Chromatin structure and DNA damage repair.,” ''Epigenetics Chromatin'', vol. 1, no. 1, p. 9, 2008. <br/>
2. 5. J. E. Krebs, B. Lewin, E. S. Goldstein, and S. T. Kilpatrick, Lewin’s Essential Genes. Jones and Bartlett Publishers, 2013. <br/>
3. 4. Cook,P.J., Ju,B.G., Telese,F., Wang,X., Glass, C.K., and Rosenfeld,M.G. (2009). Tyrosine dephosphorylation of H2AX modulates apoptosis and survival decisions. ''Nature'' 458, 591-596. <br/>
4. N. C. M. House, M. R. Koch, and C. H. Freudenreich, “Chromatin modifications and DNA repair: Beyond double-strand breaks,” ''Front. Genet.'', 2014. <br/>

Popravljanje mutacij in rekombinacijski procesi

2016-04-04T09:24:27Z

Smalensek:

BIO2 Seminar 2015

2015-11-24T17:50:21Z

Smalensek: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Rok_Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni]||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tina_Simunovic: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom]||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Maja_Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na metabolizem]||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tilen_Trselic: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic]||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Lara_Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti]||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Eva_Rajh: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na modifikacije DNK in histonov ter vpliv na staranje]||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Sara_Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev]||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Fran_Krstanovic: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity]||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Elvira_Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih]||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Janja_Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kisln na povišan krvni tlak v pljučnih arterijah]||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Miha_Koprivnikar_Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze]||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Špela_Malenšek: Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1]||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||Mutacije TMEM70 vplivajo na obstoj ATP sintaze||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||Uravnavanje koncentracije ROS v mitohondriju z glutationilacijo||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||Vloga sfingolipidov pri fagocitozi ''Candide albicans''||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||Nucleoside antibiotics||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||Vloga metabolizma serina in glicina pri raku||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||12/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je:<br>'''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje:<br>
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od <font color=red>2700 do 3000 besed </font>, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. <font color=red>Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. </font>
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==<font color=green>Imena datotek</font>==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* <font color=green>312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%</font>

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana <font color=green>zeleno</font>.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.<br>
'''Citiranje knjig:'''<br>
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.<br>
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.<br>

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.<br>
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.<br>
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:'''<br>
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.<br>
<font color=green>Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.</font>

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:<br>
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.<br>
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis:<br>
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)<br>

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:'''<br>
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov<br>
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life<br>
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2015

2015-11-24T17:48:25Z

Smalensek: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2015 stran]

=== Kristjan Stibilj: PI3K kaskada in njihova vloga pri rakavih obolenjih ===
Dandanes je zdravljenje rakavih obolenj poglavitna točka v razvoju farmacevtskih zdravil. Velike multinacionalke vlagajo ogromno denarja v razvoj zdravila, ki bi ozdravil tumorje oz. omilil njihovo delovanje. Za nastanek rakavih obolenj so v veliki meri krivi receptorji tirozin kinaze (RTK) in njihova PI3K/AKT/mTOR signalna pot. Ta namreč nadzoruje celično proliferacijo, metabolizem, premikanje in preživetje. Mutacije ključnih proteinov v PI3K kaskadi vodijo do nenadzorovane rasti in delitve celic, kar privede do nastanka tumorjev. Glavni princip zdravljenja oz. iskanje zdravila za rakava obolenja je torej poiskati takšno molekulo, ki bi uspešno inhibirala mutiran protein in s tem ustavila njegovo hiperaktivacjo. Znanstveniki so v zadnjih letih odkrili precej inhibitorjev, ki so bolj ali majn specifični in so sedaj v preiskavah kot morebitno zdravilo. Za inhibiranje PI3K molekule sta se v predkličninih študijah pokazala kot uspešna pictilisib in buparlisib, ki se vežeta na ATP-vezavno mesto. Na enak način deluje tudi večina AKT inhibitorjev, kamor spada tudi dobro raziskan Inhibitor VIII. mTOR, zadnja molekula v PI3K kaskadi, pa ima prav tako kar nekaj sintetičnih inhibitorjev, ki so analogni naravni molekuli rapamcin. Vsi našteti inhibitorji pa žal še niso zdravila za raka, saj so interakcije z ostalimi encimi v celici še vedno nepoznane.

=== Klara Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv ===
Patogene bakterije uporabljajo efektorje za zatiranje imunskega odziva gostitelja. Tarča mnogih efektorskih proteinov je celični ubikvitinacijski sistem (UBS), ki je pomemben regulator imunskega odgovora. Ubikvitinska signalizacija poteka preko treh encimskih kompleksov, ki na proteinske substrate vežejo molekule ubikvitina. Dolžina in oblika ubikvitinske verige narekujeta, kakšen bo biološki odgovor celice na ubikvitinacijo oz. kaj se bo s substratom zgodilo. Ker prokarionti nimajo lastnega ubikvitinacijskega sistema, so morali razviti drugačne mehanizme, ki jim omogočajo interakcijo z evkariontskimi proteini, kateri nastopajo pri ubikvitinaciji. Efektorji lahko gostiteljski UBS izkoriščajo tako, da strukturno ali funkcijsko posnemajo evkariontske komponente UBS, ali pa so homologi evkariontskih proteinov. Lahko tudi pospešujejo ali inhibirajo delovanje 26S proteasoma. Efektorski proteini torej izkoriščajo evkariontske strategije za nadzor in manipulacijo gostiteljevih celičnih procesov, v smeri, ki patogenu omogoča čim boljšo možnost razvoja in množitve. Efektorji AvrPtoB, HopM1 ter VirF so nastali z različnim evolucijskim razvojem, zato se tudi mehanizmi njihovega delovanja na UBS razlikujejo. Patogeni efektorji lahko preko ubikvitinacije pomembnih signalnih proteinov v imunskih kaskadah povzročijo nezmožnost celice, da aktivira PAMP ter ETI imunost. Razgradnja gostiteljevih proteinov vodi lahko do motenj v izražanju genov, motenj v vezikularnem transportu in številnih drugih nepravilnosti v celičnih procesih, ki pripeljejo do večje dovzetnosti celice za okužbo.

=== Tjaša Lukšič: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini ===
Alternativno izrezovanje GPCR-jev je pogost pojav, še posebej pri sekretinski in nekaterih sorodnih družinah. Receptorji sekretinske družine se pojavljajo v zanimivih izooblikah, ki odstirajo nove poglede na regulacijo celične signalizacije. V sedmi transmembranski vijačnici sekretinskih GPCR-jev je dobro ohranjen ekson 12 oz. zaporedje 14 aminokislin, ki je tarča izrezovalno-povezovalnega kompleksa pri nekaterih receptorjih. Delecija eksona 12 nima izrazitega vpliva na vezavo primarnih sporočevalcev, ima pa zato toliko večje posledice pri prenosu signalov. Povezovanje z G-proteini je onemogočeno, ker skrajšana TMD7 ne omogoča normalne konformacijske spremembe. Le-ta se v običajnih izooblikah zgodi zaradi premika TMD6 in TMD7 proti statični TMD3, kar razkrije intracelularno vezavno domeno za navzdolnje efektorje. Poleg omenjene funkcije lažnega receptorja, se oslabi tudi membranska ekspresija kratkih-TMD7 receptorjev, saj je izbrisan transportni motiv v eksonu 12 in zmanjšana hidrofobnost C konca. Najbolj fascinantna posledica je zagotovo dominantno negativna regulacija membranske ekspresije ostalih izooblik. Za transport GPCR-jev iz kontrolnega sistema endoplazmatskega retikuluma je potrebna oligomerizacija. Hetero-oligomeri določenih kombinacij s kratkim-TMD7 receptorjem ne uspejo zapustiti ER, število delujočih receptorjev v membrani se zmanjšuje in celica je slabše odzivna na njihove primarne sporočevalce. Med tem pa nekateri receptorji nimajo težav pri transportu skupaj s skrajšanimi izooblikami. Številna bolezenska stanja so povezana s patološkimi izooblikami ali z neuspešnim transportom proteinov iz ER, za kar obstaja potencialna rešitev v farmakoloških šaperonih.

=== Rok Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni ===
Celice so se skozi čas prilagodile na življenje v okolju, polnem potencialno škodljivih patogenov. Razvilo se je mnogo mehanizmov celičnega odgovora, ki so prilagojeni tako, da lahko ustrezen odgovor na patogene pripravijo v različnih situacijah. En takih mehanizmov predstavlja tudi signalna kaskada preko TNFR1, receptorja za citokin TNFα. TNFα sprostijo celice imunskega sistema, ko zaznajo prisotnost patogena. Osnovni celični odgovor pri stimulaciji TNFR1 je kaskada, ki preko zaporedja ubikvitinacij sodelujočih proteinov, privede do translokacije transkripcijskega faktorja NF-κB v jedro. NF-κB tam sproži prepisovanje genov za vnetne citokine, ki ob kasnejšem sproščanju v okolico celice povzročijo vnetni odziv sosednjih celic ter s tem omejitev okužbe. Nekateri patogeni pa so na ta odziv prilagojeni tako, da inhibirajo ključne proteine v začetni kaskadi in s tem zmanjšajo vnetje, vendar pa imajo na to prilagoditev odgovor tudi gostiteljske celice. Pri taki inhibiciji pride do prenosa signala po drugi poti, ki privede do apoptoze napadene celice, kar ubije tudi patogene v njej, in tako omeji okužbo. Patogeni lahko inhibirajo tudi samo apoptozo, zaradi česar obstaja tudi zasilni celični mehanizem odgovora nanje. V primeru inhibicije apoptoze se kaskada konča z aktivacijo psevdokinaze MLKL, ki je glavni efektor za mehanizem programirane nekroze z imenom nekroptoza. Pri nekroptozi pride kot pri nekrozi do celične lize, pri čemer se v okolico sprostijo DAMP-i, ki sprožijo vnetni odziv okoliškega tkiva.

=== Ema Gašperšič: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen ===
Protein kinaze C (PKC) so družina encimov, ki sodelujejo v številnih signalnih poteh v celici. S fosforilacijo serina ali treonina nekega drugega proteina regulira njegovo aktivnost. Vplivajo na proliferacijo in diferenciacijo celice, apoptozo, oblikovanje sinaps, učenje ter shranjevanje spominov, nevrološke motnje in mnogo drugih procesov v celici. Za aktivacijo PKC sta ključni povečani koncentraciji diacilglicerola (DAG) in kalcijevih ionov Ca2+, ki z vezavo na PKC povzročita prehod iz neaktivne v aktivno obliko. Aktivacija PKC vpliva na spodbujanje oziroma inhibiranje razvoja raznih bolezni, kot so rak, ishemična možganska kap ali Alzheimerjeva bolezen in druge nevrodegenerativne bolezni. Problem je v tem, da je pri zdravljenju raka potrebno rast celic čim prej zaustaviti, med tem ko morajo pri nevrodegenerativnih boleznih nevroni ostajati živi. Poleg tega je zanimivo, da naj bi nekateri aktivatorji protein kinaz C rast rakavih celic spodbujali, drugi pa zavirali. Običajen mehanizem delovanja PKC je težko opisati, saj obstaja več oblik PKC izoencimov, ki so po različnih tkivih različno razporejeni, v celici imajo različne funkcije, poleg tega pa obstaja več signalnih poti, ki vodijo do aktivacije PKC. Vse to so razlogi za oteženo delo raziskovalcev, ki želijo odkriti načine zdravljenja prej omenjenih boleznih, zato torej to področje zahteva še precej raziskav, ki bi posledično lahko olajšale njihovo zdravljenje.

=== Tadej Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic ===
Melanom je najnevarnejša oblika kožnega raka in znanstveniki že desetletja borijo izboljšali rezultate zdravljenja. Vzpodbuditi želijo proti-tumorski odziv imunskega sistema, vendar so zaradi kontrolnih točk neuspešni. Kontrolne točke so ključne za ohranjanje imunske homeostaze, saj bi brez njih bili žrtev številnim avtoimunskim boleznim in poškodbam tkiva ob prevelikem odzivu sistema na patogene vnetje. Med imunske kontrolne točke spada tudi receptor PD-1. Je monomer sestavljen iz imunoglobulinske in citoplazemske domene. Zanj sta značilna tudi dva liganda (PD-L1 in PD-L2), ki sta potrebna za njegovo aktivacijo. Najdemo ga predvsem pri limfocitih T in nekaterih melanomskih celicah. Izražanje PD-1 je raziskano predvsem pri limfocitih T, kjer ob interakciji z ligandoma inhibira delovanje in funkcije limfocitov ter povzroča njihovo apoptozo. To doseže s pomočjo zaviranja številnih ključnih procesov znotraj celice, ki so potrebni za njeno normalno delovanje. Pri melanomskih celicah je pa delovanje PD-1 še dokaj neraziskano. Do zdaj njegova prisotnost ni bila znana, vendar so nedavne raziskave pokazale njegovo izražanje na nekaterih celicah limfocitov. Obnašanje PD-1 melanomskih celic je drugačno kot pa pri limfocitih, saj njegovo izražanje spodbuja rast tumorja. S pomočjo boljšega poznavanja delovanja PD-1 v limfocitih T in melanomskih celicah, bo lažje razviti učinkovitejše metode boja proti raku.

=== Tilen Tršelič: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic ===
Piruvat kinaza (PK) je pomemben glikolitski encim, ki se pojavlja v štirih različnih oblikah. Oblika M2 je posebno zanimiva, saj poleg svoje glikolitske funkcije opravlja še mnoge druge, nemetabolične funkcije. Poleg tega je PKM2 prevladujoča oblika encima v rakavih celicah. Razlog za povečano izražanje le-tega verjeno izhaja iz dejstva, da lahko PKM2 zavzema aktivno tetramerno obliko ali skoraj neaktivno dimerno obliko. Možnost menjavanja svojih oblik celicam, bodisi zdravim ali rakavim, omogoča prilagajanje delovanja njihovim potrebam. Če celici primanjkuje energije, lahko encim zavzema pretežno aktivno tetramerno obliko in tako spodbuja proizvodnjo ATP. Če celica potrebuje nove makromolekule za proliferacijo, tu encim lahko zavzame pretežno neaktivno dimerno obliko in spodbuja kopičenje intermediatov glikolize. Te so ključni za sintezo novih snovi, saj služijo kot njihovi prekurzorji.
Aktivnost encima PKM2 se regulira na več načinov. Vlogo regulatorjev po navadi opravljajo post-translacijske modifikacije encima, lahko pa tudi nekatere druge spremembe v celičnem okolju.
PKM2 v svoji manj aktivni dimerni obliki prav tako lahko regulira druge procese. Predvsem pospešuje celično rast in razvoj prek reakcij z pomembnimi transkripcijskimi faktorji v jedru. Izkazalo se je, da delovanje encima PKM2 močno koristi rakavim celicam.
Ker je encim PKM2 zelo pomemben za razvoj takšnih celic, predstavlja dobro potencialno tarčo za zdravljenje. Raziskave potrjujejo, da bi bilo slednje možno, ne ponujajo pa konkretnega odgovora na vprašanje, kako bi takšno zdravljenje potekalo.

=== Tina Šimunović: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom ===
Pod imenom rak razumemo bolezen, za katero je značilna nenadzorovana rast in celična delitev. Rakave celice imajo tako večjo potrebo po biosintezi pomembnih makromolekul, ki jo zadostijo s prilagoditvijo in spremembo svojih metaboličnih poti. Ena izmed prilagoditev je lahko sprememba pentoza-fosfatne poti (PPP). To je ena izmed metaboličnih poti glukoze, katere glavna produkta sta riboza-5-fosfat in NADPH. Prva se naprej uporablja pri sintezi nukleinskih kislin, NADPH pa je pomemben za sintezo makromolekul in za detoksikacijo. Regulacija PPP poteka preko njenih metabolnih encimov. V rakavih celicah je predvsem izražena povišana aktivnost glukoza-6-fosfat dehidrogenaze in s tem aktivnost PPP. Pri tem encimu sta, poleg mnogih drugih, najpomembnejša regulatorja NADPH in tumorski supresor p53. Aktivnost PPP lahko poveča tudi acetilacija 6-fosfoglukonat dehidrogenaze ali pa povečano izražanje transketolaze. Na pospešeno proliferacijo rakavih celic vplivajo tudi inaktivirani tumorski supresorji in aktivirani onkoproteini, npr. p53, TIGAR, ATM, Ras, mTORC1 in Nrf2. Največji pomen PPP pri rakavih celicah, je v zaščiti pred celično smrtjo, saj se s povečano aktivnostjo PPP pospeši tvorba njenih produktov, ki so ključni pri preživetju celice. Z inhibicijo te poti, bi lahko tudi inhibirali rast tumorjev. PPP je tako postala potenciala tarča za zdravljenje raka, vendar je za to potrebnih še veliko raziskav in boljše razumevanje metabolizma rakavih celic.

=== Maja Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na regulacijo metabolizma ===
Ena najbolj fascinantnih lastnosti metabolizma je njegova regulacija. Za homeostazo metabolizma hranil in energije v telesu je nujna specializirana regulacija centralnega živčnega sistema, Langerhansovih otočkov trebušne slinavke in glavnih metabolnih tkiv (maščobno tkivo, skeletne mišice in jetra). Dolge nekodirajoče molekule RNA (lncRNA) so RNA molekule dolge več kot 200 nukleotidov, ki ne kodirajo proteinov. Njihov spekter delovanja je izredno širok, na metabolizem vplivajo prek regulacije procesov adipogeneze in hepatičnega metabolizma, nadzora funkcionalnosti Langerhansovih otočkastih celic, regulacije razvoja skeletnih mišic, in energijske homeostaze. Do sedaj je bilo odkritih že več kot 60000 dolgih nekodirajočih RNA molekul in repetuar njihovih funkcij se z vsako novo raziskavo širi. Vloga lncRNA je še pred desetimi leti bila neznanka, od takrat pa nam je že postalo jasno, da so pomembni regulatorji izražanja DNA, diferenciacije in razvoja celic, razvoja tkiva in tumorogeneze. V resnici pa vemo zelo malo, oziroma smo šele na začetku razumevanja lncRNA. Ker se zaradi tega z vsakim novim odkritjem pojavlja še več vprašanj (o podrobnih principih delovanja lncRNA in njihovega sodelovanja z drugimi molekulami, o še nepoznanih funkcijah, vpletenosti v bolezni in možnosti razvoja novih tehnik zdravljenja…), so raziskave na tem področju zelo aktualne.

=== Lara Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti ===
V dvajsetih letih prejšnjega stoletja je Otto Warburg s svojimi sodelavci meril porabo kisika in sintezo laktata v rakastem tkivu. Pri tem je prišel do zelo pomembnega opažanja, ki ostaja zelo aktualno – da celice rakastega tkiva tudi ob normoksičnih pogojih vztrajajo pri močno povečani glikolizi. Danes vemo, da se Warburgov učinek v rakastih tkivi pojavlja skoraj univerzalno. Večina Warburgovih opažanj in meritev je bila kvantitativno pravilna. Njegova razlaga vzroka pojava pa se je izkazala za napačno, saj povečano stopnjo glikolize zasledimo v mnogih rakastih tkivih brez določljivih mitohondrijskih mutacij ali motenj oksidativno-fosforilacijske metabolne poti. V takih tkivih sinteza ATP v mitohondrijih poteka nemoteno in enako učinkovito kot pri normalnih tkivih z enako koncentracijo kisika. Raziskave zadnjih let kažejo na to, da je povečana glikoliza strateška poteza rakastih celic, ki zadovoljuje predvsem njihove potrebe po sintezi biomase. V skoraj stoletju od Warburgovega prvotnega odkritja je postalo jasno, da metabolična stikala omogočajo celici, da se prilagaja svojim bioenergetskim in biosintetskim potrebam. Zmožnost hitrega prilagajanje potrebam je še posebej pomembna pri imunskih celicah, ki morajo ob imunskem odzivu hitro preiti iz mirujočega stanja. Zato ni presenetljivo, da so si rakaste in imunske celice glede zagotavljanja metabolnih tokov in bionenergetike za rast in širjenje v marsičem podobne.

=== Sara Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev ===
Encimi izocitrat dehidrogenaza (IDH), sukcinat dehidrogenaza (SDH) in fumarat hidrataza (FH) sodelujejo v Krebsovem ciklu. Prvi omogoča pretvorbo izocitrata v α-ketoglutarat (α-KG), drugi pretvorbo sukcinata v fumarat, tretji pa pretvorbo fumarata v malat. Za gene, ki kodirajo te encime, so značilne mutacije, ki vodijo v nastanek in rast tumorjev. Mutacije so lahko onkogen-aktivirajoče (mutacija IDH) ali tumor-supresor deaktivirajoče (mutacije SDH in FH). Mutacija IDH tako v encimu vzpodbudi novo funkcijo, in sicer pretvorbo α-ketoglutarata ob prisotnosti NADPH v onkometabolit 2-hidroksiglutarat (2-HG). Pri drugih dveh mutacijah pa gre za to, da je aktivnost encima zmanjšana oz. je sploh ni, kar ima za posledico kopičenje sukcinata ali fumarata. To ugodno vpliva na rast tumorja, saj lahko te tri omenjene molekule na različne načine inducirajo izražanje genov, pomembnih za celično rast in preživetje. Vse tri na primer stabilizirajo hipoksični inducibilni faktor (HIF), ki nato sproži transkripcijo in angiogenezo (rast krvnih žil). Z zmanjšano koncentracijo dveh antioksidantov NADPH in α-ketoglutarata se poveča tudi tveganje za nove mutacije, povzročene s strani reaktivnih kisikovih zvrsti. Poleg tega lahko α-KG sam deluje kot mutagen ali pa tudi inhibira metilacijo DNA in histonov, zaradi česar je izražanje onkogenov povečano. Kljub temu, da je ta metabolična pot pri tumorjih precej kompleksna, nam bodo nove metode detekcije tumorjev kmalu omogočile tudi boljše razumevanje samih mutacij in mehanizma nastanka tumorjev, ki tiči v ozadju.

=== Fran Krstanović: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity ===
Our energy metabolism is working constantly to cover energy need of our body. ATP represents the first line of action. With cellular ATP concentration low, our body needs other sources of energy as fuel. Fats carbs and proteins play that part. To get energy from fats they need to be oxidase. The process of fat oxidation is situated in the mitochondria. Fats need a special transporter to get into the cell, l-carnitine.
Apart from fat transportation l-carnitine has many other roles; enhancing exercise endurance capacity is believed to be one of them. Mice fed with L-carnitine showed great promise to confirm this theory. Glycogen concentrations were higher, all important parameters for fatty acid intake and mitochondria biogenesis were higher and do additional AMPK was activated. The most important parameter was higher endurance capacity was reached. The problem lies in implicating the theory on humans; consuming concentrations are unknown (high can lead to problems, low won’t have affect). Further experiments will surely be held as carnitine provides great attention from sports industries as a supplement for fat burning or maybe for greater athletes’ fatigue.

=== Janja Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kislin na povišan krvni tlak v plučnih arterijah ===
Povišan krvni tlak v pljučnih arterijah (PAH) je huda bolezen, ki posledično zelo vpliva tudi na srce, predvsem na desni prekat, ki se zaradi prevelike obremenjenosti poveča. To lahko privede tudi do odpovedi srca. Zakaj pride do nepravilnega delovanja desnega prekata, je še neznano, prav tako kako do tega pride. Zadnje raziskave sklepajo, da je z nedelovanje povezan tudi metabolizem maščobnih kislin in glukoze. Problem predstavlja kopičenje maščobnih kislin znotraj mišičnih celic srca. Za transport maščobnih kislin z dolgimi verigami poskrbi protein CD36 skupaj s FATP (v miocitih FATP6). Kopičenje maščobnih kislin v celici je povezano tudi s favoriziranjem oksidacije glukoze. Preklop med ß-oksidacijo maščobnih kislin in oksidacijo glukoze poteka v Randlovem ciklu, kjer intermediati ene oksidacije inhibirajo drugo. Ključni pri inhibiciji ß-oksidacije je malonil-CoA, ki inhibira CAP encim na mitohondrjski membrani in je ključni prenašalec maščobnih kislin v mitohondrij, kjer se nadalje oksidirajo. Trenutne raziskave želijo izboljšati delovanje desnega prekata prav preko oksidacije maščobnih kislin. Šele razumevanje zapletenih mehanizmov metabolizma bo omogočilo nadaljnji razvoj potencialnih zdravil za zdravljenje PAH in posledično tudi izboljšalo delovanje desnega prekata.

=== Elvira Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih ===
V fetusu kardiomiociti pridobivajo energijo z oksidacijo glukoze in laktata zaradi pomanjkanja kisika. Ko se rodimo pa postanejo maščobne kisline preferenčni substrat pridobivanja ATP-ja. Do sprememb glavnega substrata pride zaradi večjih telesnih obremenitev, bolezni in okoliščin zunaj celice. Pri tem imajo osrednjo vlogo razni transkripcijski faktorji, npr. receptor, aktiviran s peroksisomskim proliferatorjem α (PPARα), in transkripcijski koaktivatorji, npr. PPARγ koaktivator 1α (PGC1α). Dokazali so, da lahko nedelovanje vsaj 22 encimov in transporterjev udeleženih pri metabolizmu maščobnih kislin povzroči razne bolezni, ki zmanjšajo delovanje srca. Vsaka od teh pa lahko povzroči srčno popuščanje. Do tega pride, ko srce ni več zmožno črpati krvi iz pljuč po telesu. Najpogostejša vzroka sta zvišan krvni tlak in ishemija. Slednjo povzroči hipoksija, zaradi česar se ustavi tok elektronov v dihalni verigi. V anaerobnih pogojih je tako glikoliza edini vir energije in proizvede le 5 % celotnega ATP-ja, ki ga imajo kardiomiociti v normalnih pogojih. Produkti glikolize porušijo homeostazo in za ohranjanje le-te celice porabijo veliko energije, ki bi se sicer porabila pri kontrakciji. Raven kisika se obnovi pri reperfuziji, ki pa naredi še več škode kot ishemija. Zaradi srčnega popuščanja umre vsako leto več tisoč ljudi, saj še ne poznamo zdravila, ki bi to bolezen preprečilo. Ker še ne razumemo vseh mehanizmov, poteka na tem področju veliko raziskav.

=== Miha Koprivnikar Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze ===
Pomanjkanje karbamoil fosfat sintetaze (CPS1) je ena izmed motenj cikla sečnine, torej poslabša zmožnost proizvodnje sečnine, ki ima pomembno vlogo pri regulaciji pH. CPS1 katalizira nastanek vstopne spojine cikla sečnine, karbamoil fosfat, in jo regulirajo Mg2+, Ca2+, NAG, ter tudi druge snovi posredno, preko NAG sintetaze. Mutacij, ki povzročajo spremembo strukture CPS1 je kar nekaj in povzročajo spremembe v aktivnosti encima različnih jakosti (od milih sprememb do popolne inaktivacije). To je razlog, da nekateri oboleli velikokrat sploh ne dočakajo otroštva, medtem ko pri ostalih bolezen pride na dan kasneje v življenju ob nekem stresu za organizem. Simptomi pomanjkanja CPS1 so predvsem nevropatološke narave in vključujejo poslabšanje kognitivnih sposobnosti, epizode delirija, utrujenost in druge simptome. Pri pacientih s hujšimi motnjami lahko bolezen tudi po zdravljenju pusti trajne posledice, saj pride do poškodb možganov v procesu razvoja. Razlog za nevrotoksičnost je osmotska aktivnost glutamina, ki se v velikih količinah nabira v astrocitah možganov. To povzroča hipertonično okolje v celicah in otekanje možganov. Brez ukrepov to privede do kome in smrti. Zdravljenje akutnih primerov motnje se začne z uporabo lovilcev amonijaka in dializo krvi, nadaljnji ukrepi pa so za enkrat omejeni na dieto z malo proteinov in citrulin. Za prihodnost je obetavno zdravljenje s stimulacijo encima z aktivatorjem oziroma njegovim analogom ali pa kar s stimulacijo sintetaze aktivatorja.

=== Špela Malenšek: Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1 ===
Kompleks mTORC1 je ohranjena Ser/Thr kinaza, ki z združevanjem signalov regulira celično ravnovesje med anabolizmom in katabolizmom. Nadzoruje celično rast, sintezo proteinov ter ribosomov in blokira avtofagijo. Nepravilno delovanje mTORC1 je vzrok različnim vrstam raka, diabetesu tipa 2 in nevrodegenerativnim boleznim. Verjetno najpomembnejši, a hkrati najmanj razumljeni regulatorji mTORC1 so aminokisline, med katerimi izstopata leucin in glutamin. Koncentraciji slednjih v citosolu sta odvisni druga od druge, saj je t.i. terciarni aktivni transport leucina v celico sklopljen s prenosom glutamina iz celice. Eden izmed modelov regulacije mTORC1 predpostavlja, da so pri prenosu aminokislinskega signala do mTORC1 glavni trije multiproteinski kompleksi, ki vključujejo majhne RagGTPaze, Ragulator in v-ATPazo. Združitev slednjih poteka na lizosomih, kjer je mTORC1 posledično tudi aktiviran s proteinom Rheb. Aminokislinska signalna kaskada mTORC1 predstavlja tudi tipalo, s katerim celica zaznava prisotnost in koncentracijo aminokislin v lizosomskem lumnu, citoplazmi in v zunaj-celičnem prostoru. Delovanje v-ATPaze je namreč močno odvisno od koncentracije leucina v notranjosti lizosomov in predstavlja t.i. »notranjo« regulacijo mTORC1. Hkrati naj bi leucin neposredno vplival na spremembno konformacije RagGTPaz z vezavo na protein Sestrin2, vendar so je popoln mehanizem posledice vezave leucina še nepojasnjen. Glutamin naj bi na mTORC1 deloval drugače kot leucin (brez posredovanja RagGTPaz in Ragulatorja), hkrati pa naj bi regulacijsko vlogo aktivacije mTORC1 imel tudi eden izmed produktov dvojne deaminacije glumatina, α-ketoglutarat.

BIO2 Seminar 2015

2015-11-24T17:13:07Z

Smalensek: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Rok_Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni]||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tina_Simunovic: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom]||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Maja_Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na metabolizem]||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tilen_Trselic: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic]||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Lara_Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti]||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Eva_Rajh: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na modifikacije DNK in histonov ter vpliv na staranje]||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Sara_Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev]||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Fran_Krstanovic: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity]||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Elvira_Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih]||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Janja_Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kisln na povišan krvni tlak v pljučnih arterijah]||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Miha_Koprivnikar_Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze]||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18|| Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||Mutacije TMEM70 vplivajo na obstoj ATP sintaze||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||Uravnavanje koncentracije ROS v mitohondriju z glutationilacijo||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||Vloga sfingolipidov pri fagocitozi ''Candide albicans''||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||Nucleoside antibiotics||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||Vloga metabolizma serina in glicina pri raku||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||12/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je:<br>'''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje:<br>
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od <font color=red>2700 do 3000 besed </font>, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. <font color=red>Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. </font>
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==<font color=green>Imena datotek</font>==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* <font color=green>312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%</font>

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana <font color=green>zeleno</font>.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.<br>
'''Citiranje knjig:'''<br>
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.<br>
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.<br>

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.<br>
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.<br>
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:'''<br>
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.<br>
<font color=green>Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.</font>

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:<br>
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.<br>
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis:<br>
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)<br>

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:'''<br>
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov<br>
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life<br>
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2015

2015-10-28T21:06:25Z

Smalensek:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||Pentoza-fosfatna pot in rak||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||Kako lncRNA regulira metabolizem||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||PKM2 in njegova vloga pri razvoju tumorjev||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na posttranslacijske modifikacije in DNA metilacijo ||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18|| Aminokislinska regulacija mTORC1||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||14/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je:<br>'''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje:<br>
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od <font color=red>2700 do 3000 besed </font>, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. <font color=red>Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. </font>
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==<font color=green>Imena datotek</font>==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* <font color=green>312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%</font>

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/19bnx0Yh4RIuC2Kzkdaa8t8WqRTBgXYNTV_IWfjrO0W4/viewform?usp=send_form mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana <font color=green>zeleno</font>.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.<br>
'''Citiranje knjig:'''<br>
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.<br>
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.<br>

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.<br>
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.<br>
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:'''<br>
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.<br>
<font color=green>Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.</font>

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:<br>
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.<br>
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis:<br>
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)<br>

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:'''<br>
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov<br>
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life<br>
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2015 Povzetki seminarjev

2015-03-16T21:33:36Z

Smalensek: /* Špela Malenšek: Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši? */

[[TBK2015-seminar|Nazaj na osnovno stran]]

=== Uroš Zavrtanik: Mehanizem popravljanja DNA: NER (faktor XPC) ===

Od samega nastanka naprej se življenje spopada s fundamentalnim problemom kemijske nestabilnosti genetske informacije, shranjene v DNA. Molekula DNA je izpostavljena številnim fizikalnim ter kemijskim dejavnikom, ki lahko vplivajo na njeno strukturo in posredno ali neposredno tudi na samo informacijo. Ker pa predstavlja ohranjanje informacije eden izmed ključnih in pomembnejših aspektov življenja samega, so se tekom evolucije razvili številni mehanizmi popravljanja DNA. Eden izmed teh mehanizmov je popravljanje DNA z izrezom nukleotidov (ang. Nucleotide Excision Repair-NER). NER je popravljalni proces za odstranjevanje in popravo večjih strukturnih nepravilnosti v strukturi DNA, ki so v glavnem posledica radiacije (UV, gama) ter okolijskih dejavnikov (specifične molekule, ki lahko strukturno poškodujejo DNA). NER predstavlja pri človeku edini mehanizem za popravljanje poškodb povzročenih zaradi UV radiacije. Največji izziv NER je, kako najti vse poškodovane dele DNA v celotnem genomu. Na podlagi eksperimentalnih ugotovitev raziskovalci ugotavljajo, da bi lahko bil ''ključ do uspeha'' naključna vezava proteina XPC (začetni faktor NER) na nespecifično mesto v DNA ter nato vzdolžna difuzija XPC do poškodovanega (specifičnega) mesta, kjer XPC za trenutek obstane, kar je signal za sprožitev popravljalnega procesa. Odkritje bi lahko predstavljalo generalni koncept mehanizma še vedno malo raziskane interakcije protein-DNA.

=== Klara Lenart: Permanentno označevanje nevronskih povezav ===

Preučevanje nevronskih povezav je precej neraziskano področje. Za raziskave teh povezav uporabljajo proteine, najpogosteje skupino proteinov imenovano GCaMP, ki oddajajo fluorescenčno svetlobo kratek čas po zaznavi spremembe v koncentraciji kalcijevih ionov v celici. Skupina znanstvenikov z medicinskega inštituta Howard Hughes je razvila nov protein, imenovan CaMPARI(podoben je skupini GCaMP-jev), ki označuje aktivne nevrone glede na spremembo koncentracije Ca2+ v njih. Proteini, podobni CaMPARI-ju obstajajo že zadnjih 20 let, a posebnost novega proteina je permanentna fluorescenca, ki jo oddaja ob povečanju koncentracije kalcija v celici ter sočasnem obsevanju z vijolično svetlobo. Glavni del CaMPARI-ja je fluorescenten protein EosFP, ki spremeni barvo iz zelene v rdečo ob obsvetljevanju z vijolično svetlobo. Ko so EosFP spojili z kalmodulinom in peptidom M13, katera sta potrebna za vezavo kalcijevih ionov, je nastal CaMPARI. Ponuja možnost raziskav nevronskih povezav med kompleksnejšim vedenjem, na primer med učenjem. Prav tako je uporaben, ker lahko z reguliranim obsvetljevanjem vplivamo, kdaj bo potekala pretvorba iz zelene v rdečo in kdaj ne. Preizkusili so ga v štirih poskusih; na ličinkah in odraslih osebkih vinske mušice, na ličinkah cebrice in na odraslih miših. Vsi poskusi so potrdili že znana dejstva, kar dokazuje njegovo zanesljivost, ter ponuja mnogo možnosti za nadaljnje raziskave.

=== Blaž Lebar: Preučitev imunskega odziva komarja po piku ===

Malarija je bolezen, ki jo prenaša komar mrzličar ali Anopheles. Na leto se okuži na stotine milijonov ljudi, nekaj milijonov jih tudi umre. Povzročitelj te bolezni so različne vrste plazmodijev, ki se uspešno množijo v komarju, ki nato po piku okuži svojo žrtev. Vendar kako uspe tako inferiorno bitje kot je komar okužiti tako kompleksno bitje kot je človek, morda celo smrtno, sam komar pa normalno funkcionira navkljub patogenom v lastnem v organizmu?
Za komarjev imunski sistem so odgovorni LRIMi, bilo naj bi jih nekaj več kot 24, vendar delovanja večine še ne poznajo. Najpomembnejša za imunski sistem komarja naj bi bila člena sistema komplementa: LRIM1 in APL1C v hemolimfi, ki se z LRRji povežeta z TEP1cut in tako izvedeta uspešno lizo in melanizacijo patogenov, vendar sta se izkazala kot popolnoma neučinkovita pri eliminaciji P. berghei. V tej študiji pa so se osredotočili na LRIM9, protein v imunskem sistemu, ki naj bi imel najpomembnejšo vlogo pri borbi z plazmodiji. Najpogostejša tehnika je bila qRT-PCR, preverjali pa so namnožitev, reprodukcijo in melanizacijo P. berghei pri komarjih vrste A. gambiae ob prehranjevanju s krvjo miši, ter različne vplive na izražanje LRIM9 (prehranjevanje, bakterije, imunost…). Ugotovili so tudi povezavo izražanja LRIM9 in hormona »ecdysone«, ki se izloča iz jajčnikov samic.
Danih je bilo veliko odgovorov, ki pa so odprli nova vprašanja, katera bodo zahtevala še veliko raziskav.

=== Špela Malenšek: Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši? ===

Človeški endogeni retrovirusi (ERV), genetsko podedovani ostanki preteklih virusnih infekcij, so klasično obravnavani kot človeku oziroma gostitelju neuporabni del genoma, tako imenovani "junk DNA". Njihovo delovanje je v običajnih somatskih celicah (fibroblasti, hepatocite, bele krvne celice …) nadzorovano z epigenetskim mehanizmom metilacije DNA, kjer se metilna skupina doda citozinu ali adeninu in tako prepreči izražanje virusnih delov genoma. V nevronskih izvornih celicah naj bi med drugim izražanje endogenih retrovirusnih elementov nadzoroval tudi protein TRIM28. Deluje namreč kot korepresor, ki z modifikacijo histonov zatre prepisovanje genetskega materiala. Raziskave na univerzah Lund in EPLF so pokazale, da se ob izbrisu TRIM28 v celicah nakopičita dve večji skupini ERV, ki pri miših vplivata na izražanje gena BC048671 in služita kot startni točki za IncRNA (dolga nekodirajoča RNA). Hkrati izbris proteina TRIM28 povzroči tako kompleksne vedenjske spremembe kot tudi abnormalne vedenjske fenotipe modelnih organizmov (miši), ki se izkažejo podobne nekaterim človeškim psihološkim motnjam. Klasični hipotezi o nefunkcionalnosti ERV se tako zoperstavlja nova ideja, ki trdi, da aktivnost ERV vpliva na izražanje genov v nevronskih izvornih celicah in na kompleksnost nevronske mreže v možganih. S tem se odpira popolnoma nova molekularna perspektiva na analizo kompleksnih vedenjskih vzorcev, možganskih motenj in samega delovanja nevronske mreže.

=== Nejc Kejžar: Novi 'pametni' inzulin ===

Z odkritjem biotehnoloških metod za umetno sintezo inzulina s pomočjo bakterije E. coli ali kvasovk je življenje s sladkorno boleznijo postalo mogoče, še vedno pa so prisotni zapleti, ki jih povzročata hipoglikemija in hiperglikemija. Današnje inzulinske terapije se osredotočajo na konstanto merjenje koncentracij glukoze v krvi in intravenozni vnos inzulina glede na izmerjeno koncentracijo, kar pa je kljub nujnosti (še posebej za paciente diabetesa tipa 1) zelo nadležno. Do težav lahko pride zaradi neupoštevanja terapije ali slabe glikemične kontrole, kar lahko v resnih stanjih hipoglikemije privede do kome ali smrti, hiperglikemija pa lahko vodi do kardiovaskularnih obolenj, težav s celjenjem ran ali celo do raka. Za učinkovitejše nadziranje krvne koncentracije glukoze in olajšano življenje pacientov je skupina znanstvenikov iz MIT razvila ‘pametni’ inzulin, ki ima nase pritrjen konjugat sestavljen iz alifatske verige 11 ogljikovih atomov in fenilborove kisline. Alifatska veriga povzroča podaljšano delovanje inzulina, fenilborova kislina pa služi kot ‘stikalo’, ki aktivira delovanje inzulina samo ob povečani koncentracije glukoze v krvi. Ta sintetični derivat je zmožen hitrejšega obnavljanja normalnih koncentracij krvne glukoze kot naravni in klinični inzulin, večkratnega zaporednega odziva na porast glukoze, prav tako pa ima nižji hipoglikemični indeks ob administraciji v času normalnih koncentracij glukoze, kar pomeni, da je tveganje za hipoglikemijo manjše. V najbolj zgovornem testu je bilo pokazano, da je učinkovitost pametnega inzulina primerljiva z delovanjem zdravega pankreasa.

TBK2015-seminar

2015-02-27T20:53:13Z

Smalensek: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prištejeh končnipisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Klara Lenart||naslov||povezava||10.03.||13.03.||16.03.||Maja Zupanc||Matej Hvalec||Urša Kopač
|-
| Uroš Zavrtanik||"Miselno" uravnavanje genske ekspresije||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/11/141111111317.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Eva Rajh||Lara Jerman||Neža Koritnik
|-
| Blaž Lebar||||||10.03.||13.03.||16.03.||Elvira Boršić||Kristjan Stibilj||Katja Čop
|-
| Gašper Žun||||||17.03.||20.03.||23.03.||Nejc Kejžar||Samo Smole||Klara Kuret
|-
| Rok Miklavčič||||||17.03.||20.03.||23.03.||Tilen Tršelič||Miha Koprivnikar Krajnc||Matej Hvalec
|-
| Simon Aleksič||||||17.03.||20.03.||23.03.||Klara Lenart||Maja Zupanc||Lara Jerman
|-
| Tjaša Lukšič||||||17.03.||20.03.||23.03.||Uroš Zavrtanik||Eva Rajh||Kristjan Stibilj
|-
| Špela Malenšek||Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši?||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150112093129.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Blaž Lebar||Elvira Boršić||Samo Smole
|-
| Ema Gašperšič||||||24.03.||27.03.||30.03.||Gašper Žun||Nejc Kejžar||Miha Koprivnikar Krajnc
|-
| Tilen Tršelič||||||24.03.||27.03.||30.03.||Miha Koprivnikar Krajnc||Klara Kuret||Samo Purič
|-
| Gašper Virant||||||24.03.||27.03.||30.03.||Simon Aleksič||Klara Lenart||Eva Rajh
|-
| Manca Zupan||||||07.04.||10.04.||13.04.||Tjaša Lukšič||Uroš Zavrtanik||Elvira Boršić
|-
| Urša Čerček||||||07.04.||10.04.||13.04.||Špela Malenšek||Blaž Lebar||Nejc Kejžar
|-
| Katja Brezovar||||||07.04.||10.04.||13.04.||Ema Gašperšič||Gašper Žun||Tilen Tršelič
|-
| Lovro Kotnik||||||07.04.||10.04.||13.04.||Petra Hruševar||Rok Miklavčič||Klara Lenart
|-
| Maruša Grošelj||||||14.04.||17.04.||20.04.||Gašper Virant||Simon Aleksič||Uroš Zavrtanik
|-
| Tadej Satler||||||14.04.||17.04.||20.04.||Manca Zupan||Tjaša Lukšič||Blaž Lebar
|-
| Aleksandra Uzar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Urša Čerček||Špela Malenšek||Gašper Žun
|-
| Niko Šetar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Katja Brezovar||Ema Gašperšič||Rok Miklavčič
|-
| Lija Srnovršnik||||||24.04.||30.04.||04.05.||Lovro Kotnik||Petra Hruševar||Simon Aleksič
|-
| Sara Tekavec||||||24.04.||30.04.||04.05.||Maruša Grošelj||Gašper Virant||Tjaša Lukšič
|-
| Jaka Kos||||||24.04.||30.04.||04.05.||Tadej Satler||Manca Zupan||Špela Malenšek
|-
| Samo Purič||Desifrirana enigma: virusne infekcije||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150204075224.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Aleksandra Uzar||Urša Čerček||Ema Gašperšič
|-
| Urša Kopač||||||05.05.||08.05.||11.05.||Niko Šetar||Katja Brezovar||Petra Hruševar
|-
| Neža Koritnik||||||05.05.||08.05.||11.05.||Lija Srnovršnik||Lovro Kotnik||Gašper Virant
|-
| Katja Čop||||||05.05.||08.05.||11.05.||Sara Tekavec||Maruša Grošelj||Manca Zupan
|-
| Klara Kuret||||||05.05.||08.05.||11.05.||Jaka Kos||Tadej Satler||Urša Čerček
|-
| Matej Hvalec||||||12.05.||15.05.||18.05.||Samo Purič||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar
|-
| Lara Jerman||||||12.05.||15.05.||18.05.||Urša Kopač||Niko Šetar||Lovro Kotnik
|-
| Kristjan Stibilj||||||12.05.||15.05.||18.05.||Neža Koritnik||Lija Srnovršnik||Maruša Grošelj
|-
| Samo Smole||||||12.05.||15.05.||18.05.||Katja Čop||Sara Tekavec||Tadej Satler
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Klara Kuret||Jaka Kos||Aleksandra Uzar
|-
| Maja Zupanc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Matej Hvalec||Samo Purič||Niko Šetar
|-
| Eva Rajh||||||19.05.||22.05.||25.05.||Lara Jerman||Urša Kopač||Lija Srnovršnik
|-
| Elvira Boršić||||||19.05.||22.05.||25.05.||Kristjan Stibilj||Neža Koritnik||Sara Tekavec
|-
| Nejc Kejžar||Novi 'pametni' inzulin||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150209161141.htm||26.05.||29.05.||01.06.||Samo Smole||Katja Čop||Jaka Kos
|-
| Petra Hruševar||||||26.05.||29.05.||01.06.||Rok Miklavčič||Tilen Tršelič||Maja Zupanc
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2014. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2015 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==<font color=green>Imena datotek</font>==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
* TBK_2015_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2015_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2015_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2015_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2015_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.<br>'''Citiranje knjig:'''<br>Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.<br>Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.<br>Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.<br>Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.<br>Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:'''<br>Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.<br>Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:<br>Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.<br>Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis:<br>C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)<br>V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:'''<br>Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov<br>strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life<br>Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.