Wiki FKKT - User contributions [en]

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-04T08:24:53Z

Spela Tomaz:

'''1. Uvod'''

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje gensko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

'''2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami'''

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2

Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2

Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1

Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega zaporedja lahko pripišemo njegovi podobnosti z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2
Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov ''psbAII'' in ''psbAIII'', ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z naravno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3

Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

'''3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg'''

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1

Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-dekarboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9

Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8

Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli ''in vitro'' povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11

Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko zmanjšali s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12

Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

'''4. Omejitve in izzivi'''

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah ''in vivo'', in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13

Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15

Povišana raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16

K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave ''in silico''. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko z metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

'''5. Zaključek'''

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

'''6. Literatura'''

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-03T22:16:44Z

Spela Tomaz:

'''1. Uvod'''

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje gensko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

'''2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami'''

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2

Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2

Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1

Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega zaporedja lahko pripišemo njegovi podobnosti z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2
Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov ''psbAII'' in ''psbAIII'', ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z naravno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3

Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

'''3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg'''

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1

Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9

Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8

Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli ''in vitro'' povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11

Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko zmanjšali s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12

Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

'''4. Omejitve in izzivi'''

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah ''in vivo'', in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13

Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15

Povišana raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16

K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave ''in silico''. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko z metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

'''5. Zaključek'''

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

'''6. Literatura'''

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-03T21:07:44Z

Spela Tomaz:

'''1. Uvod'''

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje gensko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

'''2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami'''

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2

Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2

Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1

Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega zaporedja lahko pripišemo njegovi podobnosti z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2
Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov ''psbAII'' in ''psbAIII'', ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z nativno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3

Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

'''3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg'''

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1

Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9

Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8

Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli ''in vitro'' povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11

Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko zmanjšali s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12

Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

'''4. Omejitve in izzivi'''

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah ''in vivo'', in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13

Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15

Povišana raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16

K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave ''in silico''. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko z metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

'''5. Zaključek'''

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

'''6. Literatura'''

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-03T21:07:17Z

Spela Tomaz:

'''1. Uvod'''

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje gensko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

'''2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami'''

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2

Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2

Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1

Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega zaporedja lahko pripišemo njegovi podobnosti z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2
Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov ''psbAII'' in ''psbAIII'', ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z nativno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3

Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

'''3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg'''

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1

Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9

Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8

Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli ''in vitro'' povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11

Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko zmanjšali s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12

Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

'''4. Omejitve in izzivi'''

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah in vivo, in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13

Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15

Povišana raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16

K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave ''in silico''. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko z metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

'''5. Zaključek'''

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

'''6. Literatura'''

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-03T21:01:54Z

Spela Tomaz:

'''1. Uvod'''

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje gensko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

'''2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami'''

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2

Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2

Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1

Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega zaporedja lahko pripišemo njegovi podobnosti z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2
Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov ''psbAII'' in ''psbAIII'', ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z nativno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3

Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

'''3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg'''

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1

Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9

Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8

Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli in vitro povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11

Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko zmanjšali s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12
Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

'''4. Omejitve in izzivi'''

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah in vivo, in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13
Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15
Povišana tudi raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16
K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave in silico. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

'''5. Zaključek'''

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

'''6. Literatura'''

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-03T20:58:51Z

Spela Tomaz:

'''1. Uvod'''

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje gensko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

'''2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami'''

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2

Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2

Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1

Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega zaporedja lahko pripišemo njegovi podobnosti z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2
Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov ''psbAII'' in ''psbAIII'', ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z nativno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3

Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

'''3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg'''

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1

Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9

Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8

Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli in vitro povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11

Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko zmanjšali s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12
Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

'''4. Omejitve in izzivi'''

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah in vivo, in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13
Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15
Povišana tudi raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16
K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave in silico. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

'''5. Zaključek'''

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

'''6. Literatura'''

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-03T20:51:25Z

Spela Tomaz:

'''1. Uvod'''

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje genetsko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

'''2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami'''

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2
Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2
Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1
Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega izmed zaporedij lahko pripišemo podobnosti zaporedja z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2
Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov psbAII in psbAIII, ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z nativno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3
Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

'''3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg'''

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1
Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9
Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8
Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli in vitro povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11
Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko odpravili s pripravo celic, ki bi biodje mogoče zmanjšati s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12
Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

'''4. Omejitve in izzivi'''

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah in vivo, in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13
Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15
Povišana tudi raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16
K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave in silico. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

'''5. Zaključek'''

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

'''6. Literatura'''

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-03T20:49:56Z

Spela Tomaz:

'''1. Uvod'''

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje genetsko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

'''2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami'''

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2
Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2

Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1

Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega izmed zaporedij lahko pripišemo podobnosti zaporedja z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2

Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov psbAII in psbAIII, ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z nativno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3

Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

'''3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg'''

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1

Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9

Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8

Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli in vitro povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11

Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko odpravili s pripravo celic, ki bi biodje mogoče zmanjšati s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12

Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

'''4. Omejitve in izzivi'''

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah in vivo, in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13

Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15

Povišana tudi raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16

K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave in silico. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

'''5. Zaključek'''

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

'''6. Literatura'''

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-03T20:47:20Z

Spela Tomaz:

'''1. Uvod'''

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje genetsko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

'''2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami'''

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2
Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2
Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1
Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega izmed zaporedij lahko pripišemo podobnosti zaporedja z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2
Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov psbAII in psbAIII, ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z nativno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3
Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

'''3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg'''

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1
Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9
Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8
Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli in vitro povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11
Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko odpravili s pripravo celic, ki bi biodje mogoče zmanjšati s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12
Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

'''4. Omejitve in izzivi'''

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah in vivo, in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13
Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15
Povišana tudi raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16
K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave in silico. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

'''5. Zaključek'''

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

'''6. Literatura'''

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Seminarji SB 2015/16

2016-01-03T20:44:42Z

Spela Tomaz:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3446811/ Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae] ([[Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah]]) (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation (Monika Praznik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] ([[Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije]])(Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki predogled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* Towards engineering biological systems in a broader context (Aleksander Benčič)
* Synthetic biology: Novel approaches for microbiology (Daša Janeš)
* Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4571725/ Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells] ([[Napredki v načrtovanju sintetičnih logičnih vrat v živih celicah]]) (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)
* Better together: engineering and application of microbial symbioses (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates (Mojca Banič)
* Synthetic biology of fungal natural products (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors (Benjamin Bajželj)
* How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application (Ana Grom & Ana Unkovič)
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)
* Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications (Maša Mirkovič)
* Synthetic biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)

Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

2016-01-03T19:44:12Z

Spela Tomaz: New page: 1. Uvod Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih k...

1. Uvod

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje genetsko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo ''Escherichia coli'' ali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''.1

2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.1 Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja PpsbA in PepcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.2
Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v ''E. coli'', se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah ''E. coli''. Aktivnost določenih močnih promotorjev (Plac, Ptet, λ PR) je v celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč Ptrc1O iz ''E. coli'' v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja PrbcL.3 Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.2
Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz ''E. coli''.1
Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega izmed zaporedij lahko pripišemo podobnosti zaporedja z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.2
Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov psbAII in psbAIII, ojačevalni zaporedji iz seva ''Synechococcus'' sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz ''E. coli'' 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.4

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta ''Chlamydomonas reinhardtii''.5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z nativno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z ''E. coli''. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).2,3
Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''.1 Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi ''Nannochloropsis'' sp.7

3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.1
Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.8 Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah ''Synechocystis'' sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.9
Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.1 V sevu ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.10 Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih ''Synechocystis'' sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942 in ''Synechococcus'' sp. PCC 7002.1,8
Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi ''C. reinhardti''. Razvoj vodika so uspeli in vitro povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H+ + 2e- -> H2.11
Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.8 Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko odpravili s pripravo celic, ki bi biodje mogoče zmanjšati s predhodno lizo celic. V celice ''Synechocystis'' sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni2+ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.1,12
Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.1

4. Omejitve in izzivi

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah in vivo, in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.1,13
Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.14 Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO2, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO2-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO3- v CO2, zaradi česar se razmerje CO2/O2 v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.1,15
Povišana tudi raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.1,16
K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave in silico. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.1

5. Zaključek

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

6. Literatura

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).

Seminarji SB 2015/16

2016-01-03T19:13:14Z

Spela Tomaz:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3446811/ Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae] [[Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah]] (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation (Monika Praznik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] ([[Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije]])(Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki predogled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* Towards engineering biological systems in a broader context (Aleksander Benčič)
* Synthetic biology: Novel approaches for microbiology (Daša Janeš)
* Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4571725/ Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells] ([[Napredki v načrtovanju sintetičnih logičnih vrat v živih celicah]]) (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)
* Better together: engineering and application of microbial symbioses (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates (Mojca Banič)
* Synthetic biology of fungal natural products (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors (Benjamin Bajželj)
* How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application (Ana Grom & Ana Unkovič)
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)
* Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications (Maša Mirkovič)
* Synthetic biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)

Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov

2015-04-14T15:47:18Z

Spela Tomaz:

== Uvod ==

Uporaba celulozne biomase kot obnovljive surovine za mikrobno pridelavo biogoriv, etanola, organskih kislin in tudi encimov postaja vedno bolj aktualna. Pomembna sestavina celulozne biomase je ksiloza, ki jo nekateri organizmi s pretvorbo v ksilulozo-5-fosfat (X5P) lahko vključijo v pentoza-fosfatno pot (PPP) ter tako uporabijo v nadaljnih metabolnih procesih. Večina industrijsko pomembnih vrst mikroorganizmov ksiloze ne more učinkovito vključiti v metabolizem. Mnoge raziskave se zato usmerjajo v pripravo novih sevov, sposobnih pretvorbe ksiloze v biogoriva in uporabne kemijske spojine.
Avtorji članka so prvi opisali vnos metabolne poti za pretvorbo ksiloze v ekspresijski sistem, z namenom pridobivanja industrijsko pomembnih encimov. Kot modelni organizem so izbrali ''Pichio pastoris'', enega najpomembnejših prozivajalcev encimov, ki pa ksiloze ne more učinkovito uporabljati za izgradnjo lastne biomase.

== Namen ==

Priprava transgene ''P. pastoris'', ki bi ksilozo učinkovito vključevala v PPP ter jo tako izkoriščala za sintezo proteinov.

== Potek dela in rezultati ==

V raziskavi so naprej preverili, ali lahko ''P. pastoris'' (sev GS115) ksilozo uporablja kot edini vir ogljika. Celice so gojili na kompleksnem gojišču brez vira ogljika in enakem gojišču z dodano ksilozo. V prisotnosti ksiloze je bil čas celične rasti sicer daljši, vendar je bila rast počasna (podvojevalni čas ≈ 92 h). Pregled genoma GS115 je pokazal prisotnost domnevnih genov za NADPH-odvisno ksiloza reduktazo (XR) in NAD+-odvisno ksilitol dehidrogenazo (XDH), ki pri nekaterih vrstah kvasovk pretvarjata ksilozo v ksilulozo (oksidoreduktazna pot). Ksilulozo v X5P pretvarja ksilulokinaza (XK). Kljub prisotnosti genov, oksidoreduktazna pot pri ''P. pastoris'' očitno ni dobro razvita.

V celice GS115 zato vnesli gen za ksilozo izomerazo (XI) iz gliv rodu ''Orpinomyces''. XI pretvarja ksilozo v ksilulozo direktno, se tako izogne stranskim produktom in bolje ohranja ravnovesje kofaktorjev. Dodatno so vnesli tudi gen za XK, da bi povečali njegovo izražanje.

Pripravili so rekombinantna vektorja pGAPZ-XI-His, z vnešenim genom XI, in pGAPZ-XK, z vnešenim genom XK. Gena sta bila v obeh vektorjih pod kontrolo močnega konstitutivnega promotorja GAPDH iz ''P. pastoris''. Celice GS115 so transformirali z vsakim plazmidom posebej ali z obema hkrati. Dobljene seve GS-XI, GS-XK in GS-XI-XK so gojili v stresalnih posodah ter opazovali celično rast in porabo ksiloze v gojišču med fermentacijo. Kljub temu, da so celice uspešno izražale oba gena, se celična rast in poraba ksiloze glede na GS115 nista bistveno povečali.

Celice so zato na vnešeno metabolno pot poskusili prilagoditi z laboratorijsko evolucijo. Z metodo zaporednega serijskega gojenja so po 50-ih generacijah pridobili evolvirane seve: GS115SB50, GS-XISB50, GS-XI-XKSB50 in GS-XKSB50. Pri sevih GS115SB50, GS-XISB50 in GS-XKSB50 so opazili povečano hitrost celične rasti glede na sev GS115, pri podobni porabi ksiloze v gojišču (49-odstotno povečanje za GS115SB50, 80-odstotno za GS-XISB50 in 92-odstotno za GS-XKSB50). Z metodo qPCR v realnem času so pri teh sevih potrdili tudi povišano raven transkripcije genov XI in XK. Obratno so pri sevu GS-XI-XKSB50 opazili povišano porabo ksiloze, pri približno enaki hitrosti celične rasti. S qPCR v realnem času so ugotovili povišano izražanje gena XDH, zato je možno, da je evolucija seva potekala v smeri razvoja oksidoreduktazne poti.

Sposobnost izkoriščanja ksiloze za sintezo encimov so preverili z vnosom gena za β-manazo v celice GS115 in GS-XISB50. S transformacijo s plazmidom pGAPKH-Sman so dobili seva GS-3Sman in GS-XI-3Sman. Celice so gojili na gojiščih z dodano glukozo ali ksilozo ter primerjali končno biomaso celic in količino pridobljene β-manaze. Pri gojenju na glukoznem gojišču med sevoma ni bilo velikih razlik, medtem ko se je končna biomasa celic GS-XI-3Sman glede na celice GS-3Sman na ksiloznem gojišču povečala za 126 %, količina pridobljene β-manaze pa za 57,5 %.

== Zaključek ==

V raziskavi so z vnosom gena za XI, povišanjem izražanja XK in evolucijskim inženirstvom uspešno pripravili transgeni sev ''P. pastoris'', ki ksilozo učinkovito vključuje v metabolizem in jo izrablja za sintezo proteinov. Rezultati predstavljajo velik napredek v razvoju sistemov za izkoriščanje celulozne biomase za pridelavo industrijskih encimov.

Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov

2015-04-14T05:33:05Z

Spela Tomaz:

== Uvod ==

Uporaba celulozne biomase kot obnovljive surovine za mikrobno pridelavo biogoriv, etanola, organskih kislin in tudi encimov postaja vedno bolj aktualna. Pomembna sestavina celulozne biomase je ksiloza, ki jo nekateri organizmi s pretvorbo v ksilulozo-5-fosfat (X5P) lahko vključijo v pentoza-fosfatno pot (PPP) ter tako uporabijo v nadaljnih metabolnih procesih. Večina industrijsko pomembnih vrst mikroorganizmov ksiloze ne more učinkovito vključiti v metabolizem. Mnoge raziskave se zato usmerjajo v pripravo novih sevov, sposobnih pretvorbe ksiloze v biogoriva in uporabne kemijske spojine.
Avtorji članka so prvi opisali vnos metabolne poti za pretvorbo ksiloze v ekspresijski sistem, z namenom pridobivanja industrijsko pomembnih encimov. Kot modelni organizem so izbrali ''Pichio pastoris'', enega najpomembnejših prozivajalcev encimov, ki pa ksiloze ne more učinkovito uporabljati za izgradnjo lastne biomase.

== Namen ==

Priprava transgene ''P. pastoris'', ki bi ksilozo učinkovito vključevala v PPP ter jo tako izkoriščala za sintezo proteinov.

== Potek dela in rezultati ==

V raziskavi so naprej preverili, ali lahko ''P. pastoris'' (sev GS115) ksilozo uporablja kot edini vir ogljika. Celice so gojili na kompleksnem gojišču brez vira ogljika in enakem gojišču z dodano ksilozo. V prisotnosti ksiloze je bil čas celične rasti sicer daljši, vendar je bila rast počasna (podvojevalni čas ≈ 92 h). Pregled genoma GS115 je pokazal prisotnost domnevnih genov za NADPH-odvisno ksiloza reduktazo (XR) in NAD+-odvisno ksilitol dehidrogenazo (XDH), ki pri nekaterih vrstah kvasovk pretvarjata ksilozo v ksilulozo (oksidoreduktazna pot). Ksilulozo v X5P pretvarja ksilulokinaza (XK). Kljub prisotnosti genov, oksidoreduktazna pot pri ''P. pastoris'' očitno ni dobro razvita.
V celice GS115 zato vnesli gen za ksilozo izomerazo (XI) iz gliv rodu ''Orpinomyces''. XI pretvarja ksilozo v ksilulozo direktno, se tako izogne stranskim produktom in bolje ohranja ravnovesje kofaktorjev. Dodatno so vnesli tudi gen za XK, da bi povečali njegovo izražanje.
Pripravili so rekombinantna vektorja pGAPZ-XI-His, z vnešenim genom XI, in pGAPZ-XK, z vnešenim genom XK. Gena sta bila v obeh vektorjih pod kontrolo močnega konstitutivnega promotorja GAPDH iz ''P. pastoris''. Celice GS115 so transformirali z vsakim plazmidom posebej ali z obema hkrati. Dobljene seve GS-XI, GS-XK in GS-XI-XK so gojili v stresalnih posodah ter opazovali celično rast in porabo ksiloze v gojišču med fermentacijo. Kljub temu, da so celice uspešno izražale oba gena, se celična rast in poraba ksiloze glede na GS115 nista bistveno povečali.
Celice so zato na vnešeno metabolno pot poskusili prilagoditi z laboratorijsko evolucijo. Z metodo zaporednega serijskega gojenja so po 50-ih generacijah pridobili evolvirane seve: GS115SB50, GS-XISB50, GS-XI-XKSB50 in GS-XKSB50. Pri sevih GS115SB50, GS-XISB50 in GS-XKSB50 so opazili povečano hitrost celične rasti glede na sev GS115, pri podobni porabi ksiloze v gojišču (49-odstotno povečanje za GS115SB50, 80-odstotno za GS-XISB50 in 92-odstotno za GS-XKSB50). Z metodo qPCR v realnem času so pri teh sevih potrdili tudi povišano raven transkripcije genov XI in XK. Obratno so pri sevu GS-XI-XKSB50 opazili povišano porabo ksiloze, pri približno enaki hitrosti celične rasti. S qPCR v realnem času so ugotovili povišano izražanje gena XDH, zato je možno, da je evolucija seva potekala v smeri razvoja oksidoreduktazne poti.
Sposobnost izkoriščanja ksiloze za sintezo encimov so preverili z vnosom gena za β-manazo v celice GS115 in GS-XISB50. S transformacijo s plazmidom pGAPKH-Sman so dobili seva GS-3Sman in GS-XI-3Sman. Celice so gojili na gojiščih z dodano glukozo ali ksilozo ter primerjali končno biomaso celic in količino pridobljene β-manaze. Pri gojenju na glukoznem gojišču med sevoma ni bilo velikih razlik, medtem ko se je končna biomasa celic GS-XI-3Sman glede na celice GS-3Sman na ksiloznem gojišču povečala za 126 %, količina pridobljene β-manaze pa za 57,5 %.

== Zaključek ==

V raziskavi so z vnosom gena za XI, povišanjem izražanja XK in evolucijskim inženirstvom uspešno pripravili transgeni sev ''P. pastoris'', ki ksilozo učinkovito vključuje v metabolizem in jo izrablja za sintezo proteinov. Rezultati predstavljajo velik napredek v razvoju sistemov za izkoriščanje celulozne biomase za pridelavo industrijskih encimov.

MBT seminarji 2015

2015-04-13T10:01:59Z

Spela Tomaz:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from Metschnikowia fructicola and overexpressed in Pichia pastoris to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov

2015-04-13T09:55:08Z

Spela Tomaz:

== Uvod ==

== Namen ==

== Potek dela in rezultati ==

== Zaključek ==

Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov

2015-04-13T09:53:37Z

Spela Tomaz: New page: '''Uvod''' '''Namen''' '''Potek dela in rezultati''' '''Zaključek'''

'''Uvod'''

'''Namen'''

'''Potek dela in rezultati'''

'''Zaključek'''

User:Spela Tomaz

2015-04-13T09:50:15Z

Spela Tomaz: Removing all content from page

User:Spela Tomaz

2015-04-13T09:46:29Z

Spela Tomaz:

== Priprava ''Pichie pastoris'', ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov ==

'''Uvod'''

'''Namen'''

'''Potek dela in rezultati'''

'''Zaključek'''

User:Spela Tomaz

2015-04-13T09:45:24Z

Spela Tomaz:

== '''Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov''' ==

'''Uvod'''

'''Namen'''

'''Potek dela in rezultati'''

'''Zaključek'''

User:Spela Tomaz

2015-04-13T09:44:27Z

Spela Tomaz: New page: == Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov == '''Uvod''' '''Namen''' '''Potek dela in rezultati''' '''Zaključek'''

== Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov ==

'''Uvod'''

'''Namen'''

'''Potek dela in rezultati'''

'''Zaključek'''

MBT seminarji 2015

2015-04-13T09:35:22Z

Spela Tomaz:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava ''Pichie pastoris'', ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from Metschnikowia fructicola and overexpressed in Pichia pastoris to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

MBT seminarji 2015

2015-03-11T15:49:59Z

Spela Tomaz:

MBT seminarji 2015

2015-03-09T15:41:59Z

Spela Tomaz:

MBT seminarji 2015

2015-03-09T15:40:16Z

Spela Tomaz:

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:50:12Z

Spela Tomaz: /* 7 VIRI */

==1 Uvod==
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

==2 Homologna rekombinacija==
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

==3 Rezultati homologne rekombinacije==
V izvornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

==4 Diferenciacija iPS v HP celice==
Homologni rekombinaciji je sledila ''in vitro'' diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Točen vpliv OP9 stromalnih celic na diferenciacijo ni raziskan, predvideva pa se, da gre za izločanje določenih snovi, ki nanjo ugodno vplivajo. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno ''in vitro'' diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

==5 Rezultati==
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so'' in vitro'' pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale znakov tvorjenja tumorjev, čeprav ste ti lahko kasneje še razvijejo.

==6 Zaključek==
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

==7 Viri==
• Hanna J. in sod. Treatment of Sickle Cell Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from Autologous Skin. Science, 2007, letn. 318, str. 1920-1923.

• Townes M. Tim. Gene Replacement Therapy for Sickle Cell Disease and Other Blood Disorders. Blood, 2008, str. 193-197.

• Wu L. in sod. Correction of sickle cell disease by homologous recombination in embryonic stem cells. Blood, 2006, letn. 108, str. 1183-1188

• Kyba M. in sod. HoxB4 Confers Definitive Lymphoid-Myeloid Engraftment Potential on Embryonic Stem Cell and Yolk Sac Hematopoietic Progenitors. Cell, 2002, letn. 109, str. 29–37.

• Metcalf D. Hematopoietic cytokines. Blood, 2008, letn. 111, str. 485-491

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:47:14Z

Spela Tomaz: /* 4 Diferenciacija iPS v HP celice */

==1 Uvod==
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

==2 Homologna rekombinacija==
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

==3 Rezultati homologne rekombinacije==
V izvornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

==4 Diferenciacija iPS v HP celice==
Homologni rekombinaciji je sledila ''in vitro'' diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Točen vpliv OP9 stromalnih celic na diferenciacijo ni raziskan, predvideva pa se, da gre za izločanje določenih snovi, ki nanjo ugodno vplivajo. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno ''in vitro'' diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

==5 Rezultati==
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so'' in vitro'' pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale znakov tvorjenja tumorjev, čeprav ste ti lahko kasneje še razvijejo.

==6 Zaključek==
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

==7 VIRI==
• Hanna J. in sod. Treatment of Sickle Cell Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from Autologous Skin. Science, 2007, letn. 318, str. 1920-1923.

• Townes M. Tim. Gene Replacement Therapy for Sickle Cell Disease and Other Blood Disorders. Blood, 2008, str. 193-197.

• Wu L. in sod. Correction of sickle cell disease by homologous recombination in embryonic stem cells. Blood, 2006, letn. 108, str. 1183-1188

• Kyba M. in sod. HoxB4 Confers Definitive Lymphoid-Myeloid Engraftment Potential on Embryonic Stem Cell and Yolk Sac Hematopoietic Progenitors. Cell, 2002, letn. 109, str. 29–37.

• Metcalf D. Hematopoietic cytokines. Blood, 2008, letn. 111, str. 485-491

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:42:26Z

Spela Tomaz: /* 5 Rezultati */

==1 Uvod==
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

==2 Homologna rekombinacija==
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

==3 Rezultati homologne rekombinacije==
V izvornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

==4 Diferenciacija iPS v HP celice==
Homologni rekombinaciji je sledila ''in vitro'' diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno ''in vitro'' diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

==5 Rezultati==
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so'' in vitro'' pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale znakov tvorjenja tumorjev, čeprav ste ti lahko kasneje še razvijejo.

==6 Zaključek==
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:39:36Z

Spela Tomaz: /* 4 Diferenciacija iPS v HP celice */

==1 Uvod==
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

==2 Homologna rekombinacija==
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

==3 Rezultati homologne rekombinacije==
V izvornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

==4 Diferenciacija iPS v HP celice==
Homologni rekombinaciji je sledila ''in vitro'' diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno ''in vitro'' diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

==5 Rezultati==
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.

==6 Zaključek==
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Talk:Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:37:57Z

Spela Tomaz:

Ajda Rojc - Uvod, Homologna rekombinacija, Rezultati

Zala Gluhić - Rezultati homologne rekombinacije

Špela Tomaž - Diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorje (HP)

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:33:20Z

Spela Tomaz: /* 3 Potek poskusa */

==1 Uvod==
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

==2 Homologna rekombinacija==
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

==3 Potek poskusa==
V izvornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

==4 Diferenciacija iPS v HP celice==
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

==5 Rezultati==
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.

==6 Zaključek==
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Talk:Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:32:48Z

Spela Tomaz:

Špela Tomaž - Diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorje

Talk:Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:31:39Z

Spela Tomaz: New page: Špela Tomaž - Diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorje

Špela Tomaž - Diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorje

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:27:33Z

Spela Tomaz: /* 5 ZAKLJUČEK */

===1 Uvod===
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

===2 Homologna rekombinacija===
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

===3 Potek poskusa===
V izVornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

===4 Diferenciacija iPS v HP celice===
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

===5 Zaključek===
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

2013-05-27T21:25:39Z

Spela Tomaz: /* 4 DIFERENCIACIJA iPS V HEMATOPOETIČNE PREKURZORSKE CELICE */

===1 UVOD===
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine.
Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

===2 HOMOLOGNA REKOMBINACIJA===
Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije.
Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli.
Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

===3 POTEK POSKUSA===
V izVornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more.
Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši.
Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

===4 DIFERENCIACIJA iPS V HEMATOPOETIČNE PREKURZORSKE CELICE===
Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije.
Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice.
Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1.
Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

===5 ZAKLJUČEK===
Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic.
Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega, saj so z GFP označene celice ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela.
Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale tvorjenja tumorjev, čeprav ste te lahko kasneje še razvijejo.
Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice.
Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.

Reprogramiranje celic

2013-03-25T08:29:22Z

Spela Tomaz: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# Biokemijske značilnosti izvornih celic
# Epigenetsko reprogramiranje (Karmen Belšak, Maša Mohar)
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Dejan Marjanovič, Suzana Semič)
# Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Samo Zakotnik)
# Reprogramiranje s transpozicijo (Barbara Dušak, Sara Lorbek)
# Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# Tumorigenost iPSC (Urška Navodnik, Ana Remžgar)
# Reprogramiranje z miRNA (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Urška Rauter)
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.

BIO2 Povzetki seminarjev 2012

2012-11-30T11:17:36Z

Spela Tomaz: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2012 stran]

===Griša Prinčič: Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice ===

S pomočjo EM je bilo mogoče podrobneje prepoznati in opisati tip III sekrecijski sistem in njegove komponente. Identificirali so vsaj pet različnih strukturnih komponent, njihovo proteinsko sestavo in delovanje.Več kot 20 različnih proteinov (YopD, YopB, YscF, YscP, YscR, YscS, YscT, YscU, YscV...) je potrebnih za učinkovito funkcioniranje T3SS-a, od katerih jih veliko kaže sekvenčno podobnost pri različnih vrstah. T3SS je sestavljen iz: igelnega dela , ki sestoji iz sekvenčno različnega proteina in tvori zvonasto ali filamentozno strukturo, zunajmembranskega kompleksa, znotrajmembranskega kompleksa in regulatornih komponent.

Efektorji, ki jih bakterija »dostavi« v celico modulirajo različne signalne poti. Blokirajo lahko MAPK in MAPKK (ospF, YopJ), kar zavre imunski odziv celice in prepreči vnetne procese. Pospešijo ali upočasnijo ubiquitinacijo (Cif in CHBP), za kar koristnost in učinkovitost še ni znana. Blokirajo majhne GTP-aze (IbpA), kar povzroči spremembe v aktinskem citoskeletu in moten membranski transport. Nekatere bakterije se v gostiteljski celisi razmnožujejo s pomočjo vakuol. SifA in SseJ sta bakterijska proteina, ki omogočata učinkovito tvorjenje tovrstnih struktur. Nekateri efektorji motijo tudi sintezo maščobnih kislin, nekateri poškodujejo pomembne celične strukture kot je na primer golgijev aparat. Vsi bakterijski efektorji delujejo na principu kovalentne modifikacije, torej trajno spremenijo strukturo in s tem inaktivirajo proteine – preprečijo kaskadno verigo.

===Erik Janežič: Hippo signalna pot in matične celice ===

Hippo signalna pot je ena glavnih regulatornih sistemov, ki preprečujejo tumorogenezo, nadzorujejo rast organov in sodelujejo pri diferneciaciji in vzdrževanju stalne gostote zarodnih celic. Hippo, drugače imenovana tudi Salvador/warts/hippo (SWH), je dobila takšno ime, ker mutacije v mehanizmu peljejo do preraščanja tkiva, kar lahko s tujko imenujemo »Hippopotamus «like phenotype. Prvič je bila opazovana v vinski mušici Drosophilia in večina ključnih raziskav je potekala prav na tem modelnem organizmu. Znanje pridobljeno z opazovanjem mehanizma mušic pa lahko direktno prenesemo tudi na lastnosti Hippo signalizacije sesalcev. Študije so namreč pokazale, da imajo vse ključne komponente pri mušici direktne ortologe v sesalcih in drugih organizmih. Smiselen se zdi sklep, da je bila Hippo signalna pot v veliki meri takšna kakor jo poznamo danes, prisotna že v prvih večceličnih organizmih,kar je tudi logično saj je pravilna diferenciacija in usmerjanje celic ključnega pomena za nastanke funkcionalnih celičnih enot (organov).
V preteklem desetletju s številne raziskave s Hippo področja zagotovile dobro poznavanje osrednje kinazne kaskade, katere funkcija je inaktivacija oziroma aktivacija YAP/TAZ transkripcijskih kofaktorjev proteinov družine TEA. Pri Hippo signalizaciji poleg osrednje kaskade sodelujejo tudi številni membranski in citoskeletni proteini, ki imajo veliko funkcij tudi pri kontaktni inhibiciji. Ogromno eksperimentalnih dokazov kaže neposredno povezanost nepravilnega delovanja Hippo signalizacije in nastankom raka, kar je verjetno razlog za intenzivne raziskave na tem področju v današnjem času.

===Dejan Marjanovič: Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov===

Vimentina, glavni predstavnik intermediarnih filamentov (IF) , je izražen v normalnih mezenhimskih celicah, in je znano, da ohrani celovitost celic in zagotavlja odpornost proti stresu. Povečano koncentracijo vimentina, so poročali v različnih rakavih epitelih, vključno raka prostate, tumorjev prebavil, tumorjev centralnega živčnega sistema, raka dojke, pljučnega raka in druge vrste raka. Prekomerno izražanje vimentina v raku je povezano tudi z večjo rastjo tumorja, vendar je vloga vimentina v napredovanju raka še vedno nejasna.
Na podlagi njegovega prekomernega izražanja v rakavih obolenjih in njegovo vlogo pri posredovanju v različnih tumorgenih dogodkih, vimentin služi kot privlačen cilj za zdravljenje raka. Poleg tega naj bi raziskave, usmerjene k pojasnjevanju vloge vimentina v različnih signalnih poteh, odpirale številne nove pristope za razvoj obetavnih zdravil za zdravljenje.

Ker pa je moje širše področje signalizacija,se bom bolj podrobno usmeril za signalizacijske poti, razjasnitev številnih mehanizmov in vmesnih sodelujočih proteinov, encimov itd. Vimentin je znan po tem, da interagira z velikim številom proteinov in sodeluje v različnih celičnih funkcijah. Poleg tega vimentin sodeluje tudi v številnih drugih procesih, ki vključujejo oblikovanje kompleksov z več signalnimi molekulami in drugimi proteini.

Iz te študije je razvidno, da vimentin ne deluje le kot ogrodni protein, temveč tudi posreduje pri večih poteh sporočanja in v celičnih procesih. Prav tako bi bilo zanimivo izvedeti, druge funkcije vimentina v jedru in morebitne vloge pri posredovanju v procesih celičnega cikla. Poleg tega bi lahko zunajcelični vimentin sodeloval pri posredovanje pri več signalnih procesih z vezavo na specifične receptorje, ki jih je treba še raziskati.

===Estera Merljak: Vpliv PKM2 na rakave celice===

Piruvat kinaza M2 (PKM2) ima zelo pomembno vlogo pri rakavih celicah. je ena izmed oblik piruvat kinaze, ki katalizira pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat, pri čemer se fosfatna skupina iz PEP prenese na ADP ter s tem dobimo ATP. PKM2 je v izražena v celicah, ki se hitro delijo, kot so zarodne in rakave celice. Izražanje omogoča veliko transkripcijskih faktrojev, posebno pomembni pa so transkripcijski faktorji iz družine heterogenih jedernih ribonukleoproteinov (hnRNPs), ki dajejo prednost sintezi PKM2 z neposrednim vplivanjem na mRNA.
Vpliv PKM2 na celičen metabolizem je zelo pomembna, saj lahko v celici prehaja med neaktivno dimerno obliko in aktivno tetramerno obliko, kar privede do različnih produktov. Aktivnost PKM2 je regulirana s strani mnogih snovi, med drugim intermediatov glikolize, ki lahko povečajo ali zmanjšajo aktivnost piruvat kinaze M2. Prav tako na aktivnost vplivajo razne post-translacijske spremembe aminokislin v samem proteinu, ki so rezultat kompleksnih reakcij v celici. S takimi procesi celica regulira sintezo energije in sintezo drugih prekurzorjev za množitev celic.
Poznavanje teh procesov ima velik medicinski pomen, saj lahko pripelje do oznajdbe specifičnih zdravil za zdravljenje raka, ki bi napadale in uničile le rakave celice, zdravih pa ne.

===Maja Kostanjevec: Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah===

Glukoza je pomemben vir energije, ki ureja marsikatero metabolno pot. Njena vloga se razlikuje od celice do celice glede na to, kakšne naloge opravlja. Posledično so se v evoluciji razvili različni mehanizmi njenega zaznavanja in prenosa signalov.

Preučevanje zaznavnih mehanizmov glukoze je zapleteno, saj ima poleg hranilne vloge tudi signalno, ki pa jo včasih težko ločimo od ostalih procesov, v katerih sodeluje. Trenutno so najbolj raziskani mehanizmi v kvasovkah, saj gre za najenostavnejše evkarionte. V njih so odkrili štiri različne signalne poti: glavno represivno pot, cAMP pot ter inducirani poti, ki sta odvisni od senzorjev Snf3 in Rgt2 oz. od fosforilacije.

Veliko bolj zahtevna je regulacija glukoze v rastlinah. V njih skrbi za izražanje različnih genov, ki urejajo procese fotosinteze, metabolizma, rasti… V modelni rastlini Arabidopisis thaliana so bili raziskani trije različni mehanizmi zaznavanja. Prvi je odvisen od heksokinaze in represira fotosintetske gene, drugi je od heksokinaze neodvisen in vsebuje še neznan receptor ter tretji, ki temelji na procesu glikolize in njenih vmesnih produktov.

Zaznavanje glukoze pri sesalcih ima posebne lastnosti, ki se razlikujejo tako od tistih v kvasovkah kot v rastlinah. Ti mehanizmi so najbolje preučeni v beta celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke, ki skrbijo za izločanje inzulina. Znano je, da je pri tem potreben obsežen metabolizem glukoze, kot glavni mediator pa nastopa ATP.

===Julija Mazej: Metabolizem glukoze v živčnih celicah===

Glukoza je preferenčno gorivo za možganske celice. Čeprav možgani predstavljajo le 2% celotne telesne mase, za svoje delovanje porabijo kar 25% zaužite glukoze. Možganske celice lahko kot energijski substrat uporabijo tudi: laktat, piruvat, glutamin in glutamat. Kakršnakoli ovira pri energijski oskrbi, je zelo rizična in se lahko konča z nezavestjo ali celo komo v manj kot 10 sekundah. V izogib takšnemu izidu so nekatere celice sposobne nadomestiti primanjkljaj energije oz. ATP z intenzivnejšo glikolizo. To velja za nevroglijalne celice, ki z glikolizo proizvajajo laktat. Vendar pa povišana glikoliza nima enakega vpliva na vse živčne celice. Nevroni zaradi povišane glikolize manj glukoze oksidirajo po pentoza-fosfatni poti, ki tam sicer poteka v normalnih razmerah. Ta metabolična pot je za nevrone zelo pomembna, ker se pri pretvorbi glukoza-6-fosfata v ribozo-5-fosfat regenerira NADPH. To je pomemben antioksidant, ki regenerira reduciran glutation in tako varuje nevrone pred poškodbami, zaradi reaktivnih kisikovih spojin. Glikolizo v nevro celicah stimulirajo hipoksični pogoji, nevrotoksične snovi, mutacije v respiratorni verigi.. Anomalije v metabolizmu glukoze so prisotne v mnogih nevrodegenerativnih boleznih, npr. Alzheimerjevi, Parkinsonovi, Huntingtonovi bolezni. Tu se kaže aplikativen pomen raziskav povezanih z metabolizmom glukoze v možganih. Velik problem pri razumevanju metabolizma v živčnih celicah predstavljajo nepojasnjene interakcije med glija celicami in nevroni .

===Jernej Pušnik: Uravnavanje metabolizma z acetilacijo proteinov===

V svoji seminarski nalogi bom predstavil pomen posttranslacijske modifikacije-acetilacije pri uravnavanju celotnega celičnega metabolizma. Kot že verjetno vsi veste, je večina reakcij, ki so del neke metabolne poti, kataliziranih z encimi. Ti pa so v osnovi proteinske makromolekule, sestavljene iz dvajsetih različnih aminokislin. Ena izmed teh aminokislin je lizin in vsebuje dve amino skupini. S prvo se povezuje v peptidno vez, druga, ki se nahaja na koncu ogljikovodikove verige pa je tarča acetilacije. Ko se acetilna skupina enkrat veže na lizinski ostanek, to povzroči določene spremembe v strukturi proteinske molekule, s tem pa se tudi spremeni encimska aktivnost. Na ta način so regulirani skoraj vsi encimi metabolizma. V seminarju sem opisal kako pride do same acetilacije in deacetilacije, da je pri tem potrebna prisotnost določenih encimov, kako se spremeni delovanje encimov delujočih v glikolizi, glukoneogenezi, citratnem ciklu, oksidaciji maščobnih kislin, oksidaciji aminokislin in ciklu sečnine. Ker je acetilacija tako razširjena modifikacija pri nadzorovanju metabolizma, imajo raziskave na tem področju velik potencial za odkritje novih terapevtskih pristopov k zdravljenju bolezni srca in ožilja, diabetesa, debelosti, itd.

===Rok Razpotnik: Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija===

V dani seminarski nalogi bom predstavil osnovne lastnosti rakavih celic, tipe celic, ki se nahajajo v tumorskem mikrookolju, ter podrobneje predstavil nekatere osnovne lastnosti metabolizma rakastih celic ter njene regulacije. Mutacije onkogenov in tumor supresorskih genov povzročijo spremembe v signalizacijskih poteh, katere povzročijo spremembe metabolizma rakastega tkiva. Metabolizem deluje v prid celični rasti, intenzivni celični delitvi, zaviranju apoptoze itd. Sam metabolizem rakastih celicah temelji na treh osnovnih temeljih: povečani produkciji energije, zadostni biosintezi potrebnih makromolekul in vzdrževanju redoks stanja. Da izpolnjujejo vse tri pogoje se rakaste celice poslužujejo mnogih regulacij metabolizma, z različnimi strateškimi potmi, npr. proteoliza skeletnih mišic, lipoliza maščobnega tkiva, intratumorna simbioza med laktat-proizvajajočimi in laktat-porabnimi celicami, upočasnevanje glikolize in usmerjanje intermediatov v pentoza fosfatno pot itd. Ker pa je mikrookolje, ki obkroža rakasto tkivo zelo dinamično, je za rakaste celice značilna metabolična fleksibilnost. Raziskave in razumevanje metabolične fleksibilnosti bi doprinesle k novim možnim strategijam zdravljenja. Učinek na reguliran metabolizem rakastega tkiva, bi imel ogromen vpliv na viabilnost rakastega tkiva, saj je metabolizem sklopljen s številnimi lastnostmi rakastih celic.

===Ajda Rojc: Metabolizem skeletnih mišic===

Mišice so največji porabnik energije v telesu, saj nam omogočajo vrsto različnih dejavnosti pri katerih se porablja energija. V našem telesu potekata dva različna sistema metabolizma – anaerobni in aerobni. Pri anaerobnem metabolizmu imata pomembno vlogo kreatin fosfat in glikogen. Zaloge ATP je v mišicah zelo malo, zato takoj nastopi cepitev visokoenergetskih vezi v kreatin fosfatu. Po porabi te energije se v glikolizi razgradi glikogen, ki se pri pomanjkanju kisika v mišicah namesto v piruvat, pretvori v laktat in to povzroča bolečine v mišicah. Druga vrsta metabolizma pa deluje kadar je kisika dovolj in to je aerobni metabolizem. Poleg glukoze se pri tej vrsti presnove razgrajujejo tudi maščobne kisline, ki se v β-oksidaciji reducirajo do vodika in acetil-CoA, ta pa vstopi v Krebsov cikel, kjer se proizvede energija ATP. Večja razpoložljivost maščobnih kislin vpliva na nalaganje znotrajmišičnega prostega Pi in AMP med vadbo. Pi in AMP sta odgovorna za regulacijo encima glikogen fosforilaze, ki cepi glikogen. Torej, če se njune koncentracije znižajo pride do manjšega števila cepitev glikogena na glukozo. Pri znatnem povišanju dostopnosti maščobnih kislin je glikogen fosforilaza inhibirana. To je le eden od načinov regulacije substratov v mišičnem metabolizmu. Domnevajo, da je oksidacija maščob regulirana s podobnimi faktorji (npr. adrenalin, Ca2+, ADP, AMP, Pi; AMPK, pH, acetil-CoA) kot razgradnja ogljikovih hidratov, vendar je glede tega, kako te faktorji vplivajo na regulacijo maščobnih kislin in oksidacijo maščob ter kaj je njihova vloga še veliko nejasnosti.

===Janez Meden: NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo===

Celično dihanje je sestavljeno iz glikolize, citratnega ciklusa in verige za prenos elektronov. Večina energije nastane, v obliki ATP pri zadnji stopnji celičnega dihanja, torej pri prenosu elektronov skozi komplekse I, II, III, IV in nastanku ATP-ja v kompleksu V – ATP-sintazi. Zadnja stopnja pa je mogoča le v prisotnosti O2.
Pa vendar življenje obstaja tudi v hipoksičnem okolju. Posebna oblika energijskega metabolizma, ki je značilno za nekatere bakterije, notranje zajedavce in školjke ter celo rakave celice je fumaratsko dihanje. Ta način metabolizma omogoča nekoliko boljši izkoristek energije. Pri njem sodelujeta le dva kompleksa I in II. Kompleks II je povezan s citratnim ciklusom – TCA in verigo za prenos elektronov. Prenašalec med kompleksoma je kvinon z nizkim redoks potencialom, kot je npr. rodokvinon pri A. suum, ali pa menakvinon, znan kot vitamin K.
Z razumevanjem mehanizma fumaratskega dihanja bi lahko razvili zdravila, ki bi inhibirala ali celo onemogočila delovanje tega mehanizma. Primerna tarča novih zdravil bi lahko bila Fp podenota kompleksa II ali pa bi zdravilo lahko delovalo tudi kot kompetitivni inhibitor kvinona.

===Ana Kunšek: Večfunkcionalnost akonitaze===

Akonitaza je protein, ki katalizira drugo stopnjo Krebsovega cikla, torej pretvorbo citrata v izocitrat. Vendar je tudi eden izmed "moonlighting" proteinov, torej proteinov, ki imajo poleg glavne tudi druge funkcije. Prav zato, ker ima toliko funkcij je njena vloga v celici še toliko bolj pomembna, nepravilno delovanje pa lahko pripelje tudi do pojava diabetesa in miopatije.

Akonitaza poleg kataliziranja omenjene pretvorbe citrata v izocitrat pomaga tudi pri uravnavanju koncentracije železa v celici, stabilizaciji oz. destabilizaciji mitohondrijske DNA ter pri odgovoru na oksidativni stres. Pri uravnavanju koncentracije železa se veže na mRNA in s tem zaustavi sintezo feritina (proteina, ki veže železo) ter s tem pomaga pri uravnavanju homeostaze. Mitohondrijsko DNA destabilizira, kar ji pomaga za lažje podvojevanje, pri oksidativnem stresu pa je ključni faktor pri uravnavanju pravilnega pH-ja v celici, brez katerega encimi ne morejo pravilni delovati.

Že samo s temi funkcijami smo ugotovili, da je akonitaza zelo pomembna v našem življenju, vendar verjetno še vedno ne poznamo vseh njenih funkcij, saj je odkrivanje "moonlighting" proteinov in njihovih ostalih funkcij zelo težko in zahteva veliko eksperimentalnega dela. Vendar bi lahko z vedenjem vseh funkcij proteinov iznašli tudi takšna zdravila, ki stranskih učinkov ne bi imela, saj bi zablokirala ali pospešila sintezo le tistega proteina, za katerega je to potrebno in ne bi s tem vplivala tudi na ostale funkcije proteina v organizmu.

===Tomaž Rozmarič: Warburg in Crabtree efekt===

Znanstveniki so ugotovili, da rakave celice, kljub prisotnosti kisika, ne izvajajo aerobnih procesov. Namesto tega so se usmerile v glikolizo. Temu se reče Warburg efekt. Kaj so rakave celice s tem pridobile, še ni čisto raziskano. Obstajajo pa hipoteze, da so zaradi tega veliko bolj invazivne, se sposobne deliti pri nizkih koncentracijah kisika in se izogniti apoptozi. Warburgov efekt je reguliran na večih stopnjah metabolne poti, s prekomerno izraženimi in prekomerno aktivnimi encimi, ki vzpodbujajo glikolizo ter inhibicijo proteinov, ki spodbujajo aerobni metabolizem.
Zraven Warburgovega efekta poznamo še Crabtree efekt. Ta mehanizem rakavi celici omogoča preklop na aerobni metabolizem pri pomanjkanju glukoze in obratno pri velikih koncentracijah. Brez poznavanja obeh mehanizmov in prekinitvi obeh hkrati je uspešnost zdravljenja raka zelo majhna.
Znanstveniki so našli vrsto kvasovke, ki ima skoraj identični metabolizem, kot ga ima rakava in je Crabtree pozitivna. Pri nizkih koncentracijah glukoze izvaja anaerobni metabolizem, v prisotnosti visoke koncentracije pa aerobni. Zaradi navedenih lastnosti je idealna za študijo rakavih celic.
Ko bodo znanstveniki natančno proučili Warburg in Crabtree efekt, se bodo lahko razvila tarčna zdravila, katera bi bistveno izboljšala kakovost našega življenja.

===Erik Mršnik: Adrenolevkodistrofija===

X-vezana adrenolevkodistrofija je precej redka bolezen, ki pa ima zelo hude posledice. Te v večini primerov vodijo v zgodnjo smrt. Z razumevanjem biokemijskega in genetskega ozadja te bolezni so v zadnjih letih naredili velik korak naprej v odkrivanju in preprečevanju te bolezni.
V osnovi gre za napako (mutacije so v večini primerov dedne - 90 %) na genu ABCD1, kar se odraža na ALDP (adrenolevkodistrofični protein), ki je peroksisomalni transportni protein. Če ne deluje, je otežena oziroma onemogočena β-oksidacija VLCFAs (dolgih maščobnih kislin), ki se nabirajo v tkivih in povzročajo velike težave v delovanju možganov in živčevja ter nadledvične žleze. Bolezen se odraža v različnih fenotipih, ki prizadenejo predvsem moške (otroke in moške srednjih let), ženske so navadno le prenašalke, lahko pa se tudi pri njih izrazijo blažji simptomi. Če se bolezen odkrije že v zgodnji fazi, je možnost pomoči večja. Predvsem uspešna je presaditev krvotvronih matičnih celic. Velikokrat pregledajo že dojenčke (t.i. newborn screening), za katere vejo (zaradi dednosti), da so podvrženi tej bolezni, kar bistveno pripomore k pravilnemu pristopu pri izbiri terapije.

===Katja Leben: Tia-maščobne kisline===

Tia-maščobne kisline so umetno sintetizirane nasičene maščobne kisline, ki se od ostalih razlikujejo po vsebnosti heterogenega žveplovega atoma. Zaradi posebnega metabolizma – žveplov atom preprečuje za maščobe običajno β-oksidacijo – in zadostnih podobnosti z naravnimi maščobnimi kislinami so nekatere tia-maščobne kisline široko farmakološko uporabne, saj imajo veliko različnih aplikativnih vplivov na bio sisteme.

Katabolizem tia-maščobnih kislin do β-oksidacije poteka običajno, ko pa se žveplov atom približa aktivnemu mestu se proces ustavi. Pri 4-tiamaščobnih kislinah pride do inhibicije drugega encima v obratu β-oksidacije, kar negativno vpliva na metabolizem maščobnih kislin, med tem, ko 3-tia-maščobne kisline sploh ne morejo vstopiti v β-oksidacijo in se razgradijo po ω-oksidativni poti. Vse sode nasičene tia-maščobne kisline se po nekaj obratih β pretvorijo v 4-tia-maščobne kisline, zato tudi reagirajo enako, vse lihe nasičene tia-maščobne kisline pa se z β-oksidacijo lahko pretvorijo v 3-tia-maščobne kisline in nato reagirajo enako.
Zaradi posebnega metabolizma so tia-maščobne kisline uporabili tudi za proučevanje delovanja in regulacijie različnih celičnih procesov povezanih z metabolizmom lipidov. Njihov vpliv je močno odvisen od lege žveplovega atoma v ogljikovem skeletu. Tako 4-tia-maščobne kisline zavirajo oksidacijo maščobnih kislin, 3-tia-maščobne kisline pa jo pospešujejo, kar je zaželjeno pri regulaciji bolezenskih stanj, ko je v celici povečana količina maščobnih kislin.

Biološki odzivi na tia-maščobne kisline obsegajo vpliv na transkripcijski faktor PPARα (peroksisom proliferator aktiviran receptor), mitohondrijsko proliferacijo, antiadipoznost, antioksidativne lastnosti, zmanjšanje proliferacije hitro delečih se celic in celično diferenciacijo. Zadnje raziskave kažejo, da tia-maščobne kisline niso škodljive za naš organizem tudi ob dolgotrajnem uživanju in bi se torej lahko uporabljale kot zdravila.

===Ana Cirnski: Peroksisomalna razgradnja maščobnih kislin===

Maščobne kisline se razgrajujejo do enostavnejših snovi v procesu, imenovanem β-oksidacija. Ta poteka v mitohondriju, pa tudi v peroksisomu. Peroksisomalna in mitohondrijska β-oksidacija se poleg kraja, kjer poteka razgradnja, razlikujeta še v encimih, ki reakcije katalizirajo in v substratih, ki se oksidirajo.

Rastline razgrajujejo tudi take maščobne kisline, ki jih živali in ljudje ne moremo. Za razliko od nas, lahko maščobne kisline popolnoma razgradijo (saj so peroksisomi edino mesto razgradnje), mi pa v peroksisomih razgrajujemo le zelo dolge maščobne kisline do ustreznih intermediatov, ki se dokončno razgradijo v mitohondriju.

Oksidacija nenasičenih maščobnih kislin v višje razvitih rastlinah je pomembna za proizvodnjo mnogih spojin, med njimi so bioaktivne molekule, imenovane oksilipini. Mednje spadajo tudi jasmonska kislina in njeni derivati, ki so pomembne signalne molekule in sodelujejo pri obrambi, komunikaciji, signalizaciji in odgovoru na različne biotske in abiotske stresorje. Povzročajo tudi staranje rastline in odpadanje listov.

Jasmonska kislina se sintetizira v oktadekanojski poti iz α-linolenske kisline (18:3). Pretvorba se začne v kloroplastu, kjer se pretvori v 12-okso-fitodienojsko kislino (OPDA). Ta potuje v peroksisom, kjer nastane oksofitoenojska kislina (OPC:8), ki vstopi v β-oksidacijo in se oksidira v jasmonsko kislino.

Danes se jasmonska kislina in njeni derivati že uporabljajo v aplikativni znanosti.

===Zala Gluhić : Hiperamoniemija===

Hiperamoniemija je povišana koncentracija v krvi raztopljenega amoniaka. Lahko je posledica motene presnove v ciklu sečnine (na primer zaradi nepravilnega delovanja katerega izmed encimov) – ali pa gre za pridobljeno motnjo zaradi jetrnih bolezni (npr. jetrna odpoved).
Amoniak je še posebno škodljiv za možgane. V krvi raztopljen amoniak prestopa možgansko-žilno pregrado in kadar je njegova koncentracija previsoka, lahko pride do nepopravljive škode pri razvoju centralnega živčnega sistema ali do možganskega edema. Ker v možganih ni vseh za cikel sečnine potrebnih encimov, imajo glavo nalogo pri odstranjevanju odvečnega amoniaka astrociti, vrsta nevroglijskih celic. Koncentracije uravnavajo s pomočjo sinteze glutamina. V primeru hiperamoniemije pride v njih do številnih morfoloških sprememb in sprememb v izražanju različnih proteinov (npr. spremembe v aktivnosti prenašalcev EAAT1 in 2, izražanju GFAP proteinov itd.). Prekomerno sintezo glutamina je mogoče uravnavati z MSO (metionin sulfoksimidom).

===Bojana Lazović : Novi farmakološki šaperoni za zdravljenje fenilketonurije===

Fenilketonurija (PKU) je redka avtosomno recesivna genska bolezen do katere pride, če je okvarjen jetrni encim fenilalanin-4-hidroksilaza (PAH), ki je odgovoren za pretvorbo fenilalanina v tirozin. Ker tako ne more prihajati do razgradnje fenilalanina, se le ta akumulira v telesu in spremeni v fenilpiruvat. To ima toksičen učinek na telo, posebej možgane, saj se pri teh bolnikih lahko razvije težka umska zaostalost. Bolniki se lahko temu izognejo tako, da se že od rojstva držijo stroge diete, po kateri se lahko prehranjujejo le z nebeljakovinsko hrano (sadje in zelenjava). Ostale esencialne aminokisline dobijo v obliki praška, ki vsebuje vse AK razen fenilalanina. Toda raziskave kažejo, da taka dieta pogosto vodi v podhranjenost in psihološke težave bolnikov. Pred nekaj leti je na tržišče prišlo zdravilo Kuvan oz. sintetični naravni kofaktor encima PAH, katerega pomanjkanje je lahko razlog bolezni. Njegova draga sinteza in pri določenih genotipih PKU, slaba učinkovitost, pa je znanstvenike spodbudila k iskanju novih sintetičnih kofaktorjev encima PAH, ki hkrati delujejo kot farmakološki šaperoni. V raziskavi, ki jo opisujem so odkrili dva nova farmakološka šaperona primerna za zdravljenje PKU.

===Matic Kovačič : Sirtuin 3 ob dieti spodbuja cikel sečnine in oksidacijo maščobnih kislin ===
Pri dieti ali stradanju pridobimo s hrano veliko manj ali nič energije, zato mora telo dobiti iz svojih zalo, kar naredi z metabolizmom aminokislin in maščobnih kislin. Pri oksidaciji aminokislin dobimo amoniak, ki se mora zaradi svoje toksičnosti v ciklu sečnine pretvoriti v sečnino. V seminarski nalogi bom predstavil vpliv proteina Sirtuin 3 (Sirt3) na povečano delovanje cikla sečnine in metabolizma maščobnih kislin. Sirt3 je encim deacetilaza, ki se nahaja v mitohondriju in s svojim delovanjem vpliva na veliko mitohondrijskih encimov. Mutacije ali odsotnost tega proteina ima za organizem smrtne posledice, zaradi nepravilnega delovanja cikla sečnine in tudi drugih procesov. Povedal bom še nekaj o napaki cikla sečnine, ki jo povzroči pomanjkanje encima ornitin transkarbamoilaze in kakšne posledice ima lahko to na organizem.

===Špela Tomaž: Inhibicija fotosinteze===
Čeprav je svetloba bistvena za reakcije fotosinteze, ima nanje tudi uničujoče učinke. Predvsem sta inhibiciji fotosinteze izpostavljena fotosistema II in I, pri katerih lahko intenzivne osvetlitve povzročijo strukturne in funkcijske okvare. Ena izmed aktualnih hipotez o mehanizmu fotoinhibicije fotosistema II (PSII) predvideva dvostopenjski sistem. V prvem koraku je udeležen kompleks, ki v fotosintezi cepi vodo (OEC) – z absorpcijo svetlobe nizkih valovnih dolžin pride do njegovih poškodb, ki omogočijo drugi korak inhibicije. V tem delu se inhibira reakcijski center fotosistema, na kar vpliva svetloba daljših valovnih dolžin. Posledično se tvorijo škodljive reaktivne kisikove spojine (ROS). Proces svetlobnega delovanja sproži popravljalne mehanizme poškodovanih struktur. Fotoinhibicija PSII je pogosta, saj so fototrofi čez dan razmeroma konstantno osvetljeni. Popravljalni cikel PSII je tako pogosto aktiviran in skrbi za to, da ne pride do ustavitve fotosinteze. ROS zavirajo obnovitev aparatov in so na nek način glavni krivci okvar zaradi fotoinhibicije. Sodelujejo tudi v inhibiciji fotosistema I (PSI), ki pa je dosti redkejša in je pogojena s posebnimi razmerami. Njegova regeneracija ni najbolj učinkovita, zato je njegova okvara toliko bolj usodna. Seveda pa so fototrofi razvili mnoge mehanizme različnih oblik, ki fotosisteme ščitijo. Fotoinhibicija je regulirana tudi z mnogimi zunanjimi in notranjimi vplivi na organizem.

BIO2 Seminar 2012

2012-11-09T05:43:19Z

Spela Tomaz: /* Seznam seminarjev */

== Novice za študente ==
[https://www.google.com/calendar/embed?src=94r835uhlqu6sornlvmnldb5d0%40group.calendar.google.com&ctz=Europe/Belgrade Razpored izpitnih rokov in kolokvijev ter nekaterih kolokvijev iz vaj]

= Biokemijski seminar =
Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 9:00 do 12:00.

Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema*'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Erik Kristian Janežič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892412000694 Hippo signalna pot in matične celice ]||Filip Mihalič||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012
|-
| Dejan Marjanovič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482707001450 Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov]||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012
|-
| Griša Prinčič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000411001149 Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice]||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||Ajda Rojc||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012
|-
| Maja Kostanjevec||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000401018059# Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah]||Sara Lorbek||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012
|-
| Julija Mazej||14||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002072 Metabolizem glukoze v živčnih celicah]||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||Ana Kunšek||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012
|-
| Estera Merljak||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800041200059X Vloga PKM2 v rakavih celicah]||Suzana Semič||Monika Biasizzo||Janez Meden||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012
|-
| Jernej Pušnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410001702 Uravnavanje metabolnih poti z acetilacijo proteinov]||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012
|-
| Rok Razpotnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304419X12000534 Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija]||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||Erik Mršnik||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012
|-
| Ajda Rojc||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001448271000282X Metabolizem skeletnih mišic]||Ana Grom||Matej Vrhovnik||Katja Leben||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012
|-
| Tomaž Rozmarič||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272810006869 Crabtree in Warburg efekt: izvor energije rakavih celic]||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||Matic Kovačič||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012
|-
| Ana Kunšek||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000406000843 Večfunkcionalnost akonitaze]||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012
|-
| Janez Meden||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304416511003059 NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo]||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012
|-
| Ana Cirnski||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0981942808002404 Oksilipini]||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||Nastja Pirman||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012
|-
| Erik Mršnik||17||[http://www.nature.com/nrneurol/journal/v3/n3/full/ncpneuro0421.html Adrenolevkodistrofija]||Julija Mazej||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012
|-
| Katja Leben||17||[http://journals.lww.com/co-lipidology/Abstract/2002/06000/Metabolic_effects_of_thia_fatty_acids.10.aspx Tio maščobne kisline]||Estera Merljak||Suzana Semič||Monika Biasizzo||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012
|-
| Matic Kovačič||18||Moj izbrani naslov||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012
|-
| Zala Gluhić||18||Moj izbrani naslov||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012
|-
| Bojana Lazović||18||Moj izbrani naslov||Ajda Rojc||Ana Grom||Matej Vrhovnik||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012
|-
| Nastja Pirman||19||Moj izbrani naslov||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012
|-
| Špela Tomaž||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001085450700183X Inhibicija fotosinteze]||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012
|-
| Monika Biasizzo||19||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002138 Mitohondrijski razklopni proteini]||Janez Meden||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012
|-
| Jakob Gašper Lavrenčič||20||Moj izbrani naslov||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012
|-
| Barbara Dušak||20||Moj izbrani naslov||Erik Mršnik||Julija Mazej||Ellen Malovrh||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012
|-
| Matej Vrhovnik||20||Moj izbrani naslov||Katja Leben||Estera Merljak||Suzana Semič||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012
|-
| Filip Mihalič||21||Moj izbrani naslov||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013
|-
| Samo Zakotnik||21||Moj izbrani naslov||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013
|-
| Mirjana Malnar||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000409001418 Adipokini - vpliv na metabolizem lipidov]||Bojana Lazović||Ajda Rojc||Ana Grom||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013
|-
| Sara Lorbek||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410000915 Glutaminska odvisnost rakavih celic]||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013
|-
| Ellen Malovrh||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000407002150 Biosinteza hema v plazmodiju]||Špela Tomaž||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013
|-
| Suzana Semič||22||Moj izbrani naslov||Monika Biasizzo||Janez Meden||Griša Prinčič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013
|-
| Katarina Tolar||23||Moj izbrani naslov||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013
|-
| Aleksander Benčič||23||Moj izbrani naslov||Barbara Dušak||Erik Mršnik||Julija Mazej||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013
|-
| Ana Grom||23||Moj izbrani naslov||Matej Vrhovnik||Katja Leben||Estera Merljak||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti članek iz revije [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS], če tam ne najdete primerne teme, lahko izberete tudi pregledni članek iz kakšne druge revije, ki ima faktor vpliva nad 5. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2012|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli vsakemu od recenzentov in docentu (docentu ga pošljite po e-pošti).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte avtorju in Gunčarju.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.