Wiki FKKT - User contributions [en]

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T22:08:10Z

Srna Anastasovska: /* Delovanje molekulskega pretvornika */

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang.''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporteskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so bili bogati z uracilom. Po pomnoževanju so uporabili USER encim, s katerim so odstranili uracile in izpostavili enoverižni del sDNA, kjer se nahajata zapisa za TBS in T7 promotor[1].

==Potek reakcije TASER==
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za transkripcijo s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverižnega promotorja, da lahko trankripcija poteče. In vitro poskus je pokazal, da transkripcija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za transkripcijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T21:52:21Z

Srna Anastasovska: /* Izboljšanje sDNA */

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang.''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporteskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so bili bogati z uracilom. Po pomnoževanju so uporabili USER encim, s katerim so odstranili uracile in izpostavili enoverižni del sDNA, kjer se nahajata zapisa za TBS in T7 promotor[1].

==Potek reakcije TASER==
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za transkripcijo s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverižnega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T18:41:53Z

Srna Anastasovska:

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang.''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporteskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so bili bogati z uracilom. Po pomnoževanju so uporabili USER encim, s katerim so odstranili uracile in izpostavili enoverižni del sDNA, kjer se nahajata zapisa za TBS in T7 promotor[1].

==Potek reakcije TASER==
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverižnega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T18:40:43Z

Srna Anastasovska:

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang.''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporteskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so bili bogati z uracilom. Po pomnoževanju so uporabili USER encim, s katerim so odstranili uracile in izpostavili enoverižni del sDNA, kjer se nahajata zapisa za TBS in T7 promotor[1].
Potek reakcije TASER
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverižnega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T01:59:23Z

Srna Anastasovska: /* Delovanje molekulskega pretvornika */

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang.''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].
Potek reakcije TASER
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverižnega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T01:58:51Z

Srna Anastasovska:

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang.''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].
Potek reakcije TASER
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverinega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T01:58:34Z

Srna Anastasovska:

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang .''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].
Potek reakcije TASER
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverinega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T01:58:12Z

Srna Anastasovska:

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ''ang .'' loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].
Potek reakcije TASER
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverinega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T01:37:55Z

Srna Anastasovska: /* Viri */

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ang. loop-mediated isothermal amplification), RPA (ang. recombinase polymerase amplificatons), HBA (ang. hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (ang. Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].
Potek reakcije TASER
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL E. coli tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL E. coli DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverinega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu kmplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom E.coli S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metod TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz E.coli S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T01:36:05Z

Srna Anastasovska:

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ang. loop-mediated isothermal amplification), RPA (ang. recombinase polymerase amplificatons), HBA (ang. hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (ang. Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].
Potek reakcije TASER
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL E. coli tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL E. coli DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverinega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu kmplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom E.coli S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metod TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz E.coli S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).
[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92
[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.
[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.
[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091
[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781
[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532

Seminarji SB 2023/24

2024-05-27T01:35:13Z

Srna Anastasovska:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vse_v_enem-IQ_preklopna_stikala_z_veliko_vsestranskostjo_za_natančno_nastavitev_izražanja_transgenov_v_sesalskih_celicah_in_tkivih Vse v enem-IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v sesalskih celicah in tkivih] (Ena Kartal)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Podenote_E3_ligaznega_kompleksa_kot_degroni_za_učinkovito_degradacijo_citosolnih,_jedrnih_in_membranskih_proteinov Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov] (David Valte)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_robustnega_sistema_genetskega_biozadrževanja_kvasovk_s_stikalom_za_stabilnost_proteinov Razvoj robustnega sistema genetskega biozadrževanja kvasovk s stikalom za stabilnost proteinov] (Mark Loborec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_doksiciklinom_inducibilnega_genskega_stikala_za_bakterijsko_posredovano_terapijo Reprogramiranje z doksiciklinom inducibilnega genskega stikala za bakterijsko posredovano terapijo] (Špela Sotlar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_flexible_,_modular_and_versatile_part_assembly_toolkit_for_gene_cluster_engineering_in_Streptomyces A flexible, modular and versatile part assembly toolkit for gene cluster engineering in Streptomyces] (Damjan Pop Stefanija)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metoda_TASER_za_detekijo_nukleinskih_kislin TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter] (Srna Anastasovska)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FluoroLoop#Problematika_PFAS FluoroLoop] (Eva Vene)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OASYS OASYS - Diagnostični pripomoček za klinično depresijo] (Ajda Dedič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OTTER OTTER - Optimizirana tehnika za načrtovanje in karakterizacijo RNA-stikal] (Luka Hafner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Li+on_Switch Li+on Switch] (Hana Glavnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DRIP DRIP] (Klara Ažbe)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/B.HOME B.HOME] (Luša Karner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Methanivore Methanivore] (Anja Moškrič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/cELPro cELPro] (Jan Trebušak)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AureoBos AureoBos] (Tina Javeršek)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-05-27T01:34:25Z

Srna Anastasovska:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vse_v_enem-IQ_preklopna_stikala_z_veliko_vsestranskostjo_za_natančno_nastavitev_izražanja_transgenov_v_sesalskih_celicah_in_tkivih Vse v enem-IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v sesalskih celicah in tkivih] (Ena Kartal)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Podenote_E3_ligaznega_kompleksa_kot_degroni_za_učinkovito_degradacijo_citosolnih,_jedrnih_in_membranskih_proteinov Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov] (David Valte)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_robustnega_sistema_genetskega_biozadrževanja_kvasovk_s_stikalom_za_stabilnost_proteinov Razvoj robustnega sistema genetskega biozadrževanja kvasovk s stikalom za stabilnost proteinov] (Mark Loborec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_doksiciklinom_inducibilnega_genskega_stikala_za_bakterijsko_posredovano_terapijo Reprogramiranje z doksiciklinom inducibilnega genskega stikala za bakterijsko posredovano terapijo] (Špela Sotlar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_flexible_,_modular_and_versatile_part_assembly_toolkit_for_gene_cluster_engineering_in_Streptomyces A flexible, modular and versatile part assembly toolkit for gene cluster engineering in Streptomyces] (Damjan Pop Stefanija)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metoda_TASER_za_detekijo_nukleinskih_kislin] (Srna Anastasovska)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FluoroLoop#Problematika_PFAS FluoroLoop] (Eva Vene)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OASYS OASYS - Diagnostični pripomoček za klinično depresijo] (Ajda Dedič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OTTER OTTER - Optimizirana tehnika za načrtovanje in karakterizacijo RNA-stikal] (Luka Hafner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Li+on_Switch Li+on Switch] (Hana Glavnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DRIP DRIP] (Klara Ažbe)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/B.HOME B.HOME] (Luša Karner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Methanivore Methanivore] (Anja Moškrič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/cELPro cELPro] (Jan Trebušak)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AureoBos AureoBos] (Tina Javeršek)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

2024-05-27T01:32:24Z

Srna Anastasovska: TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ang. loop-mediated isothermal amplification), RPA (ang. recombinase polymerase amplificatons), HBA (ang. hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določne pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (ang. Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

==Postopek metode TASER==
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

==Priprava sDNA==
Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].
Potek reakcije TASER
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL E. coli tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL E. coli DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

==Detekcija signala==

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

==Izboljšanje sDNA==

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

==Delovanje molekulskega pretvornika==

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverinega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu kmplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom E.coli S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metod TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz E.coli S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

==Prednosti in uporaba metode TASER==

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

==Zaključek==
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

==Viri==
[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).
[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92
[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.
[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.
[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091
[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781
[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532

Talk:Seminarji SB 2023/24

2024-05-27T00:09:43Z

Srna Anastasovska: Blanked the page

Talk:Seminarji SB 2023/24

2024-05-27T00:09:01Z

Srna Anastasovska: TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ang. loop-mediated isothermal amplification), RPA (ang. recombinase polymerase amplificatons), HBA (ang. hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določne pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (ang. Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

Postopek metode TASER
Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

Priprava sDNA
Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].
Potek reakcije TASER
V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL E. coli tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL E. coli DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

Detekcija signala

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

Izboljšanje sDNA

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za sintezo proteinov s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

Delovanje molekulskega pretvornika

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverinega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu kmplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom E.coli S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metod TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz E.coli S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7].
Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

Prednosti in uporaba metode TASER

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

Zaključek
Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).
[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92
[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.
[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.
[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091
[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781
[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532

Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)

2021-05-17T22:57:30Z

Srna Anastasovska: /* Nsp1 pri β-koronavirusih */

==Uvod==

Koronavirusi imajo eden od največjih enoverižnih RNA genoma, pri RNA virusih. Gen 1, ki je najbolj na 5’ koncu zaseda dve tretjini genoma in je izgrajen iz dva bralna okvira - ORF 1a in ORF 1b, ki se po okužbi translatirata v prekurzorne poliproteine, ki se nadalje procesirajo v proteinaze in nestrukturne proteine. Večina nestrukturnih proteinov je pomembna pri replikaciji in transkripciji virusa. V tem seminarju opisujemo nestrukturni protein 1 – nsp1

==Nsp1 pri α-koronavirusih==

Z raziskavo motifov in domen nsp1 pri α-koronavirusih, je odkrit β-sodček, ki ga obdaja α-vijačnica skupaj s številnimi aminokislinskimi ostanki, ki tvorijo hidrofobno jedro β-sodčka, kar nam opisuje strukturo proteina. Iz strukture ni odkrita ohranjena struktura, ki bi razložila funkcijo α-CoV-nsp1. Analizom celic okuženih z α-koronavirusih je ugotovljeno izražanje virusa v nukleusu in citoplazmi ledvičnih celic pri človeku. V sesalskih celicah, nsp1 inhibira: ekspesijo reporter genov katere tudi kontrolirajo konstitutivni promotorji in inducirajoči promotorji genov imunskega odziva, ekspresijo od SV40 – promotor – odvisnega reporter gena, kar podpira replikacijo virusa, inhibira tudi sintezo proteinov gostitelja, pri tem ne vplivajoči na stabilnost gostiteljske mRNA in v in-vitro sistemih inhibira translacijo različnih reporter genov. Mehanizmi inhibicije ekspresije reporter genov, inhibicje sinteze proteinov in translacije mRNA gostitelja od strane α-CoV-nsp1 niso še pojasnjeni. Nekaj je namigov da je več tipov α-CoV-nsp1 proteinov povezano z ribozomalnim proteinom S6, ki je lociran na vezavnem mestu za mRNA 40s podenote ribosoma in predstavlja centralno komponento translacijskega stroja celice.

==Nsp1 pri β-koronavirusih==

Pri β-koronavirusih poznamo 4 roda – A, B, C, D , kjer so značilni virusi – pri A: mišji hepatitis virus (MHV) in goveji koronavirus (BCoV) in v rodu B: SARS-CoV.
Nsp1 se pri MHV in BCoV virusih sprošča s procesiranjem ORF1a na N-koncu z papain podobno proteinazo in je lokaliziran izključno v citoplazmi okuženih celic. Raziskave, ki so se ukvarjale z biološkimi funkcijami nsp1 so ugotovile da se pri okužbi z MHV-jem v sesalskih celicah, nsp1 izraža tako da inhibira proliferacijo celic in zaustavlja celični cikel v G0/G1 fazi. Podobno kot pri α-koronavirusih, nsp1 inhibira ekspresijo reporter genov, pod kontrolom različnih promotorjev. Dodatno, z delecijo regije na C-koncu nsp1 se odkloni sposobnost inhibicije ekspresije reporter genov, kar ukazuje na pomembnost tiste regije. V dodatnih raziskavah so odkrili da nsp1 sodeluje pri bolj efikasni replikaciji virusa MHV tako da nasprotuje sistemu interferonov (IFN), kar so ugotovili tako, da so oslabljen virus MHV, katerem so genu v kodirajoči regiji odklonili 99 nukleotidov in inokulirali v miših s pomanjkanjem IFN receptorja. Nivoji replikacije oslabljenega virusa so bili približni kot bi bili pri okužbi z divjim tipom MHV-ja. V tej raziskavi je tudi odkrito da so mišji, okuženi z oslabljenim virusom bili bolj zaščiteni pred divjim sevom enakega virusa, kar je ukazovalo na mogoč potencial za razvijanje cepiva. Mehanizmi inhibicije ekspresije genov gostitelja z MHV nsp1 in tudi njegove interakcije z sistemom interferonov niso še odkriti.

Mutacije kodirajočih regij MHV nsp1 identificira dve domeni nsp1, ki sta pomembni za replikacijo virusa. Delecije na N-koncu so bile smrtonosne za virus in so bile pomembne za replikacijo virusa. Mutacije na C-koncu, ki naj ne bi spremenile mesto za papainu podobno proteinazo, ki je pomembno pri sproščanju nsp1 iz ORF1a poliproteina, niso imele značilnega vpliva na replikacijo virusa. Vloga nsp1 pri replikaciji MHV virusa je nakazana v tem da je najden v kompleksih proteinov, ki nastajajo pri replikaciji virusa in v njegovi interakciji z nsp7, nsp 10, nsp 12 (RNA polimeraza) in nsp13 (helikaza), ki sta kritična proteina pri regulaciji sinteze virusne RNA, ki tudi izhajata iz ORF1a poliproteina. V okuženih celicah je nsp1 lokaliziran v celični membrani.
Pri BcoV se nsp1 veže na RNA in interagira s cis replikacijskimi elementi 5’-UTR regijo BcoV genoma, kar potencialno ukazuje na pomembno vlogo pri regulaciji translacije ali replikacije. V obeh BcoV in MHV je odkrita RNA-RNA interakcija med 5’UTR regijo in kodirajočo regijo nsp1 proteina, ampak z dodatno raziskavo se je ugotovilo da ni nujna pri replikaciji, ampak je značilna ker pospešuje proces replikacije pri SARS-CoV virusu.

==Inhibicija ekspresije genov v SARS-CoV-u==

V SARS-CoV-u, nsp1 protein je eden od najbolj tipičnih primerov tega proteina. Mehanizem inhibicije ekspresije genov je opisan v dveh korakih, kjer v prvi fazi protein napada proces translacije in vpliva na stabilnost celične mRNA. Nsp1 inhibira translacijo mRNA in inducira endonukleolitični razcep RNA na 5’-neprevedenoj regiji (5’-UTR). Rezultat je pospešena razgradnja mRNA s celično XRN-1 posredovano 5’-3’ eksonukleolitično potjo. SARS-Cov nsp1 se vezuje na 40S podenoto in tako inaktivira ribosom za translacijo in lahko pristopa do translacijskega stroja ribosoma. Mutaciji K164A in H165A v C-končni regiji onemogočita nsp1 v teh dejavnostih, kar ukazuje na povezanost tistih delov proteina z 40S podenoto. SARS-CoV nsp1 ne vsebuje endonukleazne aktivnosti in se predpostavlja da rekrutira dodatno endonukleazo kako bi inducirala cepitev mRNA. V in-vitro sistemih SARS-Cov nsp1 inducira cepitev RNA na 5’-UTR. Zanimivo je da SARS-Cov nsp1 nima kot tarčo specifično zaporedje nukleotidov za substrat. SARS-Cov nsp1 tudi blokira aktivacijo od-IFN-odvisnih genov, tako da inhibira od-IFN-odvisno signalno pot. Ugotovljene so mutacije R124S in K125E, ki značilno vplivajo na možnost SARS-Cov nsp1 pri inhibiranju signalnig poteh.

==Nsp1 inhibira translacijo pri virusu==
V eni in-vitro raziskavi SARS-CoV virusa je odkrito da nsp1 protein virusa vpliva tudi na translacijo virusne mRNA v okuženih celicah, tako da je upočasni. V iniciacijski fazi translacije virusne mRNA nsp1 blokira pretvorbo 40S podenote ribosoma v funkcionalni 80S kompleks. Nsp1, čeprav inducira endonukleolitično cepitev mRNA gostitelja, ne cepi virusno mRNA, zaradi ’zaščitnega’ zaporedja na 5’- koncu, ki je na splošno pogosta v virusih. Ker je inhibicija virusne translacije kontraintuitivno, ugotovilo se je da velja, ampak v nasprotju s tem nivoji replikacije virusa še vedno ostanejo na optimalnem nivoju. Količina nsp1 ni tako velika da bi inhibirala sintezo replikaza.

=Viri=

1. Narayanan, Krishna, et al. "Coronavirus nonstructural protein 1: Common and distinct functions in the regulation of host and viral gene expression." Virus research 202 (2015): 89-100.

2. Huang, Cheng, et al. "SARS coronavirus nsp1 protein induces template-dependent endonucleolytic cleavage of mRNAs: viral mRNAs are resistant to nsp1-induced RNA cleavage." PLoS Pathog 7.12 (2011): e1002433.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)

2021-05-17T22:08:07Z

Srna Anastasovska: /* Nsp1 pri β-koronavirusih */

==Uvod==

Koronavirusi imajo eden od največjih enoverižnih RNA genoma, pri RNA virusih. Gen 1, ki je najbolj na 5’ koncu zaseda dve tretjini genoma in je izgrajen iz dva bralna okvira - ORF 1a in ORF 1b, ki se po okužbi translatirata v prekurzorne poliproteine, ki se nadalje procesirajo v proteinaze in nestrukturne proteine. Večina nestrukturnih proteinov je pomembna pri replikaciji in transkripciji virusa. V tem seminarju opisujemo nestrukturni protein 1 – nsp1

==Nsp1 pri α-koronavirusih==

Z raziskavo motifov in domen nsp1 pri α-koronavirusih, je odkrit β-sodček, ki ga obdaja α-vijačnica skupaj s številnimi aminokislinskimi ostanki, ki tvorijo hidrofobno jedro β-sodčka, kar nam opisuje strukturo proteina. Iz strukture ni odkrita ohranjena struktura, ki bi razložila funkcijo α-CoV-nsp1. Analizom celic okuženih z α-koronavirusih je ugotovljeno izražanje virusa v nukleusu in citoplazmi ledvičnih celic pri človeku. V sesalskih celicah, nsp1 inhibira: ekspesijo reporter genov katere tudi kontrolirajo konstitutivni promotorji in inducirajoči promotorji genov imunskega odziva, ekspresijo od SV40 – promotor – odvisnega reporter gena, kar podpira replikacijo virusa, inhibira tudi sintezo proteinov gostitelja, pri tem ne vplivajoči na stabilnost gostiteljske mRNA in v in-vitro sistemih inhibira translacijo različnih reporter genov. Mehanizmi inhibicije ekspresije reporter genov, inhibicje sinteze proteinov in translacije mRNA gostitelja od strane α-CoV-nsp1 niso še pojasnjeni. Nekaj je namigov da je več tipov α-CoV-nsp1 proteinov povezano z ribozomalnim proteinom S6, ki je lociran na vezavnem mestu za mRNA 40s podenote ribosoma in predstavlja centralno komponento translacijskega stroja celice.

==Nsp1 pri β-koronavirusih==

Pri β-koronavirusih poznamo 4 roda – A, B, C, D , kjer so značilni virusi – pri A: mišji hepatitis virus (MHV) in goveji koronavirus (BCoV) in v rodu B: SARS-CoV.
Nsp1 se pri MHV in BCoV virusih sprošča s procesiranjem ORF1a na N-koncu z papain podobno proteinazo in je lokaliziran izključno v citoplazmi okuženih celic. Raziskave, ki so se ukvarjale z biološkimi funkcijami nsp1 so ugotovile da se pri okužbi z MHV-jem v sesalskih celicah, nsp1 izraža tako da inhibira proliferacijo celic in zaustavlja celični cikel v G0/G1 fazi. Podobno kot pri α-koronavirusih, nsp1 inhibira ekspresijo reporter genov, pod kontrolom različnih promotorjev. Dodatno, z delecijo regije na C-koncu nsp1 se odkloni sposobnost inhibicije ekspresije reporter genov, kar ukazuje na pomembnost tiste regije. V dodatnih raziskavah so odkrili da nsp1 sodeluje pri bolj efikasni replikaciji virusa MHV tako da nasprotuje sistemu interferonov (IFN), kar so ugotovili tako, da so oslabljen virus MHV, katerem so genu v kodirajoči regiji odklonili 99 nukleotidov in inokulirali v miših s pomanjkanjem IFN receptorja. Nivoji replikacije oslabljenega virusa so bili približni kot bi bili pri okužbi z divjim tipom MHV-ja. V tej raziskavi je tudi odkrito da so mišji, okuženi z oslabljenim virusom bili bolj zaščiteni pred divjim sevom enakega virusa, kar je ukazovalo na mogoč potencial za razvijanje cepiva. Mehanizmi inhibicije ekspresije genov gostitelja z MHV nsp1 in tudi njegove interakcije z sistemom interferonov niso še odkriti.

Mutacije kodirajočih regij MHV nsp1 identificira dve domeni nsp1, ki sta pomembni za replikacijo virusa. Delecije na N-koncu so bile smrtonosne za virus in so bile pomembne za replikacijo virusa. Mutacije na C-koncu, ki naj ne bi spremenile mesto za papainu podobno proteinazo, ki je pomembno pri sproščanju nsp1 iz ORF1a poliproteina, niso imele značilnega vpliva na replikacijo virusa. Vloga nsp1 pri replikaciji MHV virusa je nakazana v tem da je najden v kompleksih proteinov, ki nastajajo pri replikaciji virusa in v njegovi interakciji z nsp7, nsp 10, nsp 12 (RNA polimeraza) in nsp13 (helikaza), ki sta kritična proteina pri regulaciji sinteze virusne RNA, ki tudi izhajata iz ORF1a poliproteina. V okuženih celicah je nsp1 lokaliziran v celični membrani.
Pri BcoV se nsp1 vezuje na RNA in interagira s cis replikacijskimi elementi 5’-UTR regijo BcoV genoma, kar potencialno ukazuje na pomembno vlogo pri regulaciji translacije ali replikacije. V obeh BcoV in MHV je odkrita RNA-RNA interakcija med 5’UTR regijo in kodirajočo regijo nsp1 proteina, ampak z dodatno raziskavo se je ugotovilo da ni nujna pri replikaciji, ampak je značilna ker pospešuje proces replikacije pri SARS-CoV virusu.

==Inhibicija ekspresije genov v SARS-CoV-u==

V SARS-CoV-u, nsp1 protein je eden od najbolj tipičnih primerov tega proteina. Mehanizem inhibicije ekspresije genov je opisan v dveh korakih, kjer v prvi fazi protein napada proces translacije in vpliva na stabilnost celične mRNA. Nsp1 inhibira translacijo mRNA in inducira endonukleolitični razcep RNA na 5’-neprevedenoj regiji (5’-UTR). Rezultat je pospešena razgradnja mRNA s celično XRN-1 posredovano 5’-3’ eksonukleolitično potjo. SARS-Cov nsp1 se vezuje na 40S podenoto in tako inaktivira ribosom za translacijo in lahko pristopa do translacijskega stroja ribosoma. Mutaciji K164A in H165A v C-končni regiji onemogočita nsp1 v teh dejavnostih, kar ukazuje na povezanost tistih delov proteina z 40S podenoto. SARS-CoV nsp1 ne vsebuje endonukleazne aktivnosti in se predpostavlja da rekrutira dodatno endonukleazo kako bi inducirala cepitev mRNA. V in-vitro sistemih SARS-Cov nsp1 inducira cepitev RNA na 5’-UTR. Zanimivo je da SARS-Cov nsp1 nima kot tarčo specifično zaporedje nukleotidov za substrat. SARS-Cov nsp1 tudi blokira aktivacijo od-IFN-odvisnih genov, tako da inhibira od-IFN-odvisno signalno pot. Ugotovljene so mutacije R124S in K125E, ki značilno vplivajo na možnost SARS-Cov nsp1 pri inhibiranju signalnig poteh.

==Nsp1 inhibira translacijo pri virusu==
V eni in-vitro raziskavi SARS-CoV virusa je odkrito da nsp1 protein virusa vpliva tudi na translacijo virusne mRNA v okuženih celicah, tako da je upočasni. V iniciacijski fazi translacije virusne mRNA nsp1 blokira pretvorbo 40S podenote ribosoma v funkcionalni 80S kompleks. Nsp1, čeprav inducira endonukleolitično cepitev mRNA gostitelja, ne cepi virusno mRNA, zaradi ’zaščitnega’ zaporedja na 5’- koncu, ki je na splošno pogosta v virusih. Ker je inhibicija virusne translacije kontraintuitivno, ugotovilo se je da velja, ampak v nasprotju s tem nivoji replikacije virusa še vedno ostanejo na optimalnem nivoju. Količina nsp1 ni tako velika da bi inhibirala sintezo replikaza.

=Viri=

1. Narayanan, Krishna, et al. "Coronavirus nonstructural protein 1: Common and distinct functions in the regulation of host and viral gene expression." Virus research 202 (2015): 89-100.

2. Huang, Cheng, et al. "SARS coronavirus nsp1 protein induces template-dependent endonucleolytic cleavage of mRNAs: viral mRNAs are resistant to nsp1-induced RNA cleavage." PLoS Pathog 7.12 (2011): e1002433.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)

2021-05-17T18:42:49Z

Srna Anastasovska: /* Nsp1 pri β-koronavirusih */

==Uvod==

Koronavirusi imajo eden od največjih enoverižnih RNA genoma, pri RNA virusih. Gen 1, ki je najbolj na 5’ koncu zaseda dve tretjini genoma in je izgrajen iz dva bralna okvira - ORF 1a in ORF 1b, ki se po okužbi translatirata v prekurzorne poliproteine, ki se nadalje procesirajo v proteinaze in nestrukturne proteine. Večina nestrukturnih proteinov je pomembna pri replikaciji in transkripciji virusa. V tem seminarju opisujemo nestrukturni protein 1 – nsp1

==Nsp1 pri α-koronavirusih==

Z raziskavo motifov in domen nsp1 pri α-koronavirusih, je odkrit β-sodček, ki ga obdaja α-vijačnica skupaj s številnimi aminokislinskimi ostanki, ki tvorijo hidrofobno jedro β-sodčka, kar nam opisuje strukturo proteina. Iz strukture ni odkrita ohranjena struktura, ki bi razložila funkcijo α-CoV-nsp1. Analizom celic okuženih z α-koronavirusih je ugotovljeno izražanje virusa v nukleusu in citoplazmi ledvičnih celic pri človeku. V sesalskih celicah, nsp1 inhibira: ekspesijo reporter genov katere tudi kontrolirajo konstitutivni promotorji in inducirajoči promotorji genov imunskega odziva, ekspresijo od SV40 – promotor – odvisnega reporter gena, kar podpira replikacijo virusa, inhibira tudi sintezo proteinov gostitelja, pri tem ne vplivajoči na stabilnost gostiteljske mRNA in v in-vitro sistemih inhibira translacijo različnih reporter genov. Mehanizmi inhibicije ekspresije reporter genov, inhibicje sinteze proteinov in translacije mRNA gostitelja od strane α-CoV-nsp1 niso še pojasnjeni. Nekaj je namigov da je več tipov α-CoV-nsp1 proteinov povezano z ribozomalnim proteinom S6, ki je lociran na vezavnem mestu za mRNA 40s podenote ribosoma in predstavlja centralno komponento translacijskega stroja celice.

==Nsp1 pri β-koronavirusih==

Pri β-koronavirusih poznamo 4 roda – A, B, C, D , kjer so značilni virusi – pri A: mišji hepatitis virus (MHV) in goveji koronavirus (BCoV) in v rodu B: SARS-CoV.
Nsp1 se pri MHV in BCoV virusih sprošča s procesiranjem ORF1a na N-koncu z papain podobno proteinazo in je lokaliziran izključno v citoplazmi okuženih celic. Raziskave, ki so se ukvarjale z biološkimi funkcijami nsp1 so ugotovile da se pri okužbi z MHV-jem v sesalskih celicah, nsp1 izraža tako da inhibira proliferacijo celic in zaustavlja celični cikel v G0/G1 fazi. Podobno kot pri α-koronavirusih, nsp1 inhibira ekspresijo reporter genov, pod kontrolom različnih promotorjev. Dodatno, z delecijo regije na C-koncu nsp1 se odkloni sposobnost inhibicije ekspresije reporter genov, kar ukazuje na pomembnost tiste regije. V dodatnih raziskavah so odkrili da nsp1 sodeluje pri bolj efikasni replikaciji virusa MHV tako da nasprotuje sistemu interferonov (IFN), kar so ugotovili tako, da so oslabljen virus MHV, katerem so genu v kodirajoči regiji odklonili 99 nukleotidov in inokulirali v miših s pomanjkanjem IFN receptorja. Nivoji replikacije oslabljenega virusa so bili približni kot bi bili pri okužbi z divjim tipom MHV-ja. V tej raziskavi je tudi odkrito da so mišji, okuženi z oslabljenim virusom bili bolj zaščiteni na divji sev enakega virusa, kar je ukazovalo na mogoč potencial za razvijanje cepiva. Mehanizmi inhibicije ekspresije genov gostitelja z MHV nsp1 in tudi njegove interakcije z sistemom interferonov niso še odkriti.

Mutacije kodirajočih regij MHV nsp1 identificira dve domeni nsp1, ki sta pomembni za replikacijo virusa. Delecije na N-koncu so bile smrtonosne za virus in so bile pomembne za replikacijo virusa. Mutacije na C-koncu, ki naj ne bi spremenile mesto za papainu podobno proteinazo, ki je pomembno pri sproščanju nsp1 iz ORF1a poliproteina, niso imele značilnega vpliva na replikacijo virusa. Vloga nsp1 pri replikaciji MHV virusa je nakazana v tem da je najden v kompleksih proteinov, ki nastajajo pri replikaciji virusa in v njegovi interakciji z nsp7, nsp 10, nsp 12 (RNA polimeraza) in nsp13 (helikaza), ki sta kritična proteina pri regulaciji sinteze virusne RNA, ki tudi izhajata iz ORF1a poliproteina. V okuženih celicah je nsp1 lokaliziran v celični membrani.
Pri BcoV se nsp1 vezuje na RNA in interagira s cis replikacijskimi elementi 5’-UTR regijo BcoV genoma, kar potencialno ukazuje na pomembno vlogo pri regulaciji translacije ali replikacije. V obeh BcoV in MHV je odkrita RNA-RNA interakcija med 5’UTR regijo in kodirajočo regijo nsp1 proteina, ampak z dodatno raziskavo se je ugotovilo da ni nujna pri replikaciji, ampak je značilna ker pospešuje proces replikacije pri SARS-CoV virusu.

==Inhibicija ekspresije genov v SARS-CoV-u==

V SARS-CoV-u, nsp1 protein je eden od najbolj tipičnih primerov tega proteina. Mehanizem inhibicije ekspresije genov je opisan v dveh korakih, kjer v prvi fazi protein napada proces translacije in vpliva na stabilnost celične mRNA. Nsp1 inhibira translacijo mRNA in inducira endonukleolitični razcep RNA na 5’-neprevedenoj regiji (5’-UTR). Rezultat je pospešena razgradnja mRNA s celično XRN-1 posredovano 5’-3’ eksonukleolitično potjo. SARS-Cov nsp1 se vezuje na 40S podenoto in tako inaktivira ribosom za translacijo in lahko pristopa do translacijskega stroja ribosoma. Mutaciji K164A in H165A v C-končni regiji onemogočita nsp1 v teh dejavnostih, kar ukazuje na povezanost tistih delov proteina z 40S podenoto. SARS-CoV nsp1 ne vsebuje endonukleazne aktivnosti in se predpostavlja da rekrutira dodatno endonukleazo kako bi inducirala cepitev mRNA. V in-vitro sistemih SARS-Cov nsp1 inducira cepitev RNA na 5’-UTR. Zanimivo je da SARS-Cov nsp1 nima kot tarčo specifično zaporedje nukleotidov za substrat. SARS-Cov nsp1 tudi blokira aktivacijo od-IFN-odvisnih genov, tako da inhibira od-IFN-odvisno signalno pot. Ugotovljene so mutacije R124S in K125E, ki značilno vplivajo na možnost SARS-Cov nsp1 pri inhibiranju signalnig poteh.

==Nsp1 inhibira translacijo pri virusu==
V eni in-vitro raziskavi SARS-CoV virusa je odkrito da nsp1 protein virusa vpliva tudi na translacijo virusne mRNA v okuženih celicah, tako da je upočasni. V iniciacijski fazi translacije virusne mRNA nsp1 blokira pretvorbo 40S podenote ribosoma v funkcionalni 80S kompleks. Nsp1, čeprav inducira endonukleolitično cepitev mRNA gostitelja, ne cepi virusno mRNA, zaradi ’zaščitnega’ zaporedja na 5’- koncu, ki je na splošno pogosta v virusih. Ker je inhibicija virusne translacije kontraintuitivno, ugotovilo se je da velja, ampak v nasprotju s tem nivoji replikacije virusa še vedno ostanejo na optimalnem nivoju. Količina nsp1 ni tako velika da bi inhibirala sintezo replikaza.

=Viri=

1. Narayanan, Krishna, et al. "Coronavirus nonstructural protein 1: Common and distinct functions in the regulation of host and viral gene expression." Virus research 202 (2015): 89-100.

2. Huang, Cheng, et al. "SARS coronavirus nsp1 protein induces template-dependent endonucleolytic cleavage of mRNAs: viral mRNAs are resistant to nsp1-induced RNA cleavage." PLoS Pathog 7.12 (2011): e1002433.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)

2021-05-17T18:33:10Z

Srna Anastasovska: /* Nsp1 pri β-koronavirusih */

==Uvod==

Koronavirusi imajo eden od največjih enoverižnih RNA genoma, pri RNA virusih. Gen 1, ki je najbolj na 5’ koncu zaseda dve tretjini genoma in je izgrajen iz dva bralna okvira - ORF 1a in ORF 1b, ki se po okužbi translatirata v prekurzorne poliproteine, ki se nadalje procesirajo v proteinaze in nestrukturne proteine. Večina nestrukturnih proteinov je pomembna pri replikaciji in transkripciji virusa. V tem seminarju opisujemo nestrukturni protein 1 – nsp1

==Nsp1 pri α-koronavirusih==

Z raziskavo motifov in domen nsp1 pri α-koronavirusih, je odkrit β-sodček, ki ga obdaja α-vijačnica skupaj s številnimi aminokislinskimi ostanki, ki tvorijo hidrofobno jedro β-sodčka, kar nam opisuje strukturo proteina. Iz strukture ni odkrita ohranjena struktura, ki bi razložila funkcijo α-CoV-nsp1. Analizom celic okuženih z α-koronavirusih je ugotovljeno izražanje virusa v nukleusu in citoplazmi ledvičnih celic pri človeku. V sesalskih celicah, nsp1 inhibira: ekspesijo reporter genov katere tudi kontrolirajo konstitutivni promotorji in inducirajoči promotorji genov imunskega odziva, ekspresijo od SV40 – promotor – odvisnega reporter gena, kar podpira replikacijo virusa, inhibira tudi sintezo proteinov gostitelja, pri tem ne vplivajoči na stabilnost gostiteljske mRNA in v in-vitro sistemih inhibira translacijo različnih reporter genov. Mehanizmi inhibicije ekspresije reporter genov, inhibicje sinteze proteinov in translacije mRNA gostitelja od strane α-CoV-nsp1 niso še pojasnjeni. Nekaj je namigov da je več tipov α-CoV-nsp1 proteinov povezano z ribozomalnim proteinom S6, ki je lociran na vezavnem mestu za mRNA 40s podenote ribosoma in predstavlja centralno komponento translacijskega stroja celice.

==Nsp1 pri β-koronavirusih==

Pri β-koronavirusih poznamo 4 roda – A, B, C, D , kjer so značilni virusi – pri A: mišji hepatitis virus (MHV) in goveji koronavirus (BCoV) in v rodu B: SARS-CoV.
Nsp1 se pri MHV in BCoV virusih sprošča s procesiranjem ORF1a na N-koncu z papain podobno proteinazo in je lokaliziran izključno v citoplazmi okuženih celic. Raziskave, ki so se ukvarjale z biološkimi funkcijami nsp1 so ugotovile da se pri okužbi z MHV-jem v sesalskih celicah, nsp1 izraža tako da inhibira proliferacijo celic in zaustavlja celični cikel v G0/G1 fazi. Podobno kot pri α-koronavirusih, nsp1 inhibira ekspresijo reporter genov, pod kontrolom različnih promotorjev. Dodatno, z delecijo regije na C-koncu nsp1 se odkloni sposobnost inhibicije ekspresije reporter genov, kar ukazuje na pomembnost tiste regije. V dodatnih raziskavah so odkrili da nsp1 sodeluje pri bolj efikasnoj replikaciji virusa MHV tako da nasprotuje sistemu interferonov (IFN), kar so ugotovili tako da so oslabljen virus MHV, katerem so genu v kodirajoči regiji odklonili 99 nukleotidov in inokulirali v miše z pomanjkanjem IFN receptorja. Nivoji replikacije oslabljenega virusa so bili približni kot bi bili pri okužbi z divjim tipom MHV-ja. V tej raziskavi je tudi odkrito da so mišji okuženi z oslabljenim virusom bili bolj zaščiteni na divji sev enakega virusa, kar je ukazovalo na mogoč potencial za razvijanje cepiva. Mehanizmi inhibicije ekspresije genov gostitelja z MHV nsp1 in tudi njegove interakcije z sistemom interferonov niso še odkriti.

Mutacije kodirajočih regij MHV nsp1 identificira dve domeni nsp1, ki sta pomembni za replikacijo virusa. Delecije na N-koncu so bile smrtonosne za virus in so bile pomembne za replikacijo virusa. Mutacije na C-koncu, ki naj ne bi spremenile mesto za papain podobno proteinazo, ki je pomembno pri sproščanju nsp1 iz ORF1a poliproteina, niso imele značilnega vpliva na replikacijo virusa. Vloga nsp1 pri replikaciji MHV virusa je nakazana v tem da je najden v kompleksih proteinov, ki nastajajo pri replikaciji virusa in v njegovi interakciji z nsp7, nsp 10, nsp 12 (RNA polimeraza) in nsp13 (helikaza), ki sta kritična proteina pri regulaciji sinteze virusne RNA, ki tudi izhajata iz ORF1a poliproteina. V okuženih celicah je nsp1 lokaliziran v celični membrani.
Pri BcoV se nsp1 vezuje na RNA in interagira z cis replikacijskimi elementi 5’-UTR regijo BcoV genoma, kar potencialno ukazuje na pomembno vlogo pri regulaciji translacije ali replikacije. V obeh BcoV in MHV je odkrita RNA-RNA interakcija med 5’UTR regijo in kodirajočo regijo nsp1 proteina, ampak z dodatno raziskavo se je ugotovilo da ni nujna pri replikaciji, ampak je značilna ker pospešuje proces replikacije pri SARS-CoV virusu.

==Inhibicija ekspresije genov v SARS-CoV-u==

V SARS-CoV-u, nsp1 protein je eden od najbolj tipičnih primerov tega proteina. Mehanizem inhibicije ekspresije genov je opisan v dveh korakih, kjer v prvi fazi protein napada proces translacije in vpliva na stabilnost celične mRNA. Nsp1 inhibira translacijo mRNA in inducira endonukleolitični razcep RNA na 5’-neprevedenoj regiji (5’-UTR). Rezultat je pospešena razgradnja mRNA s celično XRN-1 posredovano 5’-3’ eksonukleolitično potjo. SARS-Cov nsp1 se vezuje na 40S podenoto in tako inaktivira ribosom za translacijo in lahko pristopa do translacijskega stroja ribosoma. Mutaciji K164A in H165A v C-končni regiji onemogočita nsp1 v teh dejavnostih, kar ukazuje na povezanost tistih delov proteina z 40S podenoto. SARS-CoV nsp1 ne vsebuje endonukleazne aktivnosti in se predpostavlja da rekrutira dodatno endonukleazo kako bi inducirala cepitev mRNA. V in-vitro sistemih SARS-Cov nsp1 inducira cepitev RNA na 5’-UTR. Zanimivo je da SARS-Cov nsp1 nima kot tarčo specifično zaporedje nukleotidov za substrat. SARS-Cov nsp1 tudi blokira aktivacijo od-IFN-odvisnih genov, tako da inhibira od-IFN-odvisno signalno pot. Ugotovljene so mutacije R124S in K125E, ki značilno vplivajo na možnost SARS-Cov nsp1 pri inhibiranju signalnig poteh.

==Nsp1 inhibira translacijo pri virusu==
V eni in-vitro raziskavi SARS-CoV virusa je odkrito da nsp1 protein virusa vpliva tudi na translacijo virusne mRNA v okuženih celicah, tako da je upočasni. V iniciacijski fazi translacije virusne mRNA nsp1 blokira pretvorbo 40S podenote ribosoma v funkcionalni 80S kompleks. Nsp1, čeprav inducira endonukleolitično cepitev mRNA gostitelja, ne cepi virusno mRNA, zaradi ’zaščitnega’ zaporedja na 5’- koncu, ki je na splošno pogosta v virusih. Ker je inhibicija virusne translacije kontraintuitivno, ugotovilo se je da velja, ampak v nasprotju s tem nivoji replikacije virusa še vedno ostanejo na optimalnem nivoju. Količina nsp1 ni tako velika da bi inhibirala sintezo replikaza.

=Viri=

1. Narayanan, Krishna, et al. "Coronavirus nonstructural protein 1: Common and distinct functions in the regulation of host and viral gene expression." Virus research 202 (2015): 89-100.

2. Huang, Cheng, et al. "SARS coronavirus nsp1 protein induces template-dependent endonucleolytic cleavage of mRNAs: viral mRNAs are resistant to nsp1-induced RNA cleavage." PLoS Pathog 7.12 (2011): e1002433.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T10:20:35Z

Srna Anastasovska:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/)
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (Neža Leskovar, Iva Matić, Anja Moškrič)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (Timotej Sotosek, Erik Putar, Eva Vene)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (Evgen Kozole, David Verdel, Petra Sintič)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik, Aljaž Simonič, Luka Hafner)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (Aleksandra Rauter, Nika Banovšek)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak, Rebeka Jerina)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc, Vid Dobrovoljc, Rahela Repina)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T09:44:55Z

Srna Anastasovska:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, kar je glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema. Za seminarje sem določil 15 ožjih področij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/) (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/) (Neža Leskovar)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/) (Timotej Sotosek, Erik Putar, Eva Vene)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)(Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka StankoviĆ)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/) (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/) (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/) (Tinkara Božič, Nika Bedrač, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/) (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/) (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/) (Rebeka Jerina, Ela Bizjak, Veronika Bračič)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/) (Vid Dobrovoljc, Manca Pirc)

BIO2 Seminar 2020

2021-01-06T16:58:53Z

Srna Anastasovska: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na biosintezo lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Luka_Hafner_-_GABA_in_njeni_receptorji_v_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganih GABA in njeni receptorji v človeških možganih]|||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23|||Vpliv estrogena in estrogenskih receptorjev na skeletne mišice ||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||Grelin in njegove funkcije v organizmu||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||Galanin, spexin in kisspeptin||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||Učinki uporabe kreatina v športu in medicini||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Evgen Kozole||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Evgen_Kozole_-_Sirtuini_in_njihova_vloga_v_organizmu Sirtuini in njihova vloga v organizmu]||||||||||
|-
| Eva Kanalec||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Eva_Kanalec_-_Oksitocin_in_njegova_vloga_v_telesu Oksitocin in njegova vloga v telesu]||||||||||
|-
| Špela Kladnik||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#.C5.A0pela_Kladnik_-_Leptin_in_njegova_potencialna_vloga_biomarkerja_za_debelost Leptin in njegova potencialna vloga biomarkerja]||||||||||
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2020

2020-12-30T16:40:02Z

Srna Anastasovska: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 =

==Jan Bregar - Protein retinoblastoma==

Protein retinoblastoma (pRb) je eden ključnih proteinov, ki regulirajo celični cikel in njegova inaktivacija lahko povzroči različna bolezenska stanja. Ta protein regulira ključni prehod iz G1 v S fazo celičnega cikla s pomočjo interakcij z družino E2F, ki je vrsta transkripcijskih faktorjev celičnega cikla. Retinoblastoma protein (pRb) nadzoruje tudi izstop celice iz celičnega cikla. Njeno aktivnost regulira več mehanizmov, ki zaznavajo znotraj- in zunajcelične signale, ki blokirajo ali dovoljujejo fosforilacijo. pRb fosforilirajo od ciklina odvisne kinaze (Cdk-ji) in s tem protein Rb bodisi inaktivirajo ali pa rahlo spremenijo njegove lastnosti, protein pa vseeno ohrani svojo funkcijo. Odkrili so tudi, da pRb regulira apoptozo s pomočjo enakih interakcij s transkripcijskimi faktorji E2F. To, da je pRb vpleten pri apoptozi, popolno dopolnjuje pRb kot pomemben določevalec usode celice. Med trajanjem celičenga cikla je pRb inaktiviran, kar povzroči, da je celica bolj občutljiva na apoptotske stimuluse. Regulacijo apoptoze lahko onesposobijo nekateri virusi, ki s svojimi onkoproteini povzročijo napake v delovanju proteina Rb, kar lahko predstavlja tveganje za organizem. pRb – E2F kompleksi imajo pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije genov, ki so vključeni v diferenciaciji in razvoju.

==Ajda Beltram - Struktura in dinamika signalnih komplekov GPCR==

Receptorji sklopljeni z G-proteinom (GPCR) so transmembranski proteini, ki kot odgovor na ligande regulirajo veliko signalnih poti preko heterotrimernih G-proteinov ali pa preko fosforilacije receptorja s kinazo GRK in arestinov. Vendar ti proteini ne obstajajo le v aktivirani ali neaktivirani obliki, pač pa imajo veliko konformacijskih stanj, ki vsaka sproži svojo signalno pot. Mene je zanimala podrobna razlaga konformacijskih sprememb, ki se zgodijo med prenosom signala. Za aktivacijo G-proteinov je potrebna zamenjava GDP z GTP, kjer igra ključno vlogo razcep domen podenote α G-proteina in destabilizacija vezavnega mesta za nukleotid na Ras-domeni podenote α, kar so posledice konformacijskih sprememb, ki jih povzroči vezava na receptor. Različni ligandi, ki se vežejo na receptorje, pa lahko vplivajo tudi na afiniteto G-proteina do GDP. Kompleksi receptor-G-protein, ki nastanejo z vezavo popolnih agonistov, imajo manjšo afiniteto do GDP, kot tisti, ki so nastali z vezavo delnih agonistov. Pri arestinih pa so prav tako prišli do novega spoznanja. Aktivacija arestinov je večinoma prikazana kot proces iz dveh delov in sicer vezave na fosforiliran C-rep receptorja in nato vezave na jedro receptorja, vendar pa so odkrili, da lahko obe vezavi posebej aktivirata arestin. To nakazuje na to, da verjetno obstaja veliko različnih kompleksov arestina in receptorja, ki regulirajo vsak svojo signalno pot.

==Anja Moškrič - Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmitorjev==

Signalizacija živčnih celic med drugim poteka s prenosom nevrotransmitorjev preko sinaps. Pri kemični sinapsi gre za pretvarjanje električnih impulzov v eksocitotsko sprostitev nevrotransmitorja (npr. glutamat, GABA, epinefrin, norepinefrin). Pri pretvarjanju signala imajo ključno vlogo napetostno uravnavani kalcijevi ionski kanalčki (Cav), v presinaptičnem predelu. Ti, kot odgovor na depolarizacijo nevrona, usmerjajo kalcijeve ione v notranjost celice in posledično sprožijo fuzijo mešička (z nevrotransmitorjem) s presinaptično membrano. Zgrajeni so iz več podenot, od teh je glavna α1, ki tvori poro za pretok ionov. Podenoti α2δ in β pa regulirata lastnosti. Kanalčke glede na obliko glavne podenote klasificiramo v 3 večje skupine: Cav1, Cav2 in Cav3. V večini sinaps so prisotni kanalčki iz družine Cav2. Da eksocitoza lahko poteče hitro in učinkovito, morajo biti Cav locirani znotraj aktivne regije presinaptične membrane, v bližini mesta eksocitoze. Slednjo kalcijevi kanalčki regulirajo preko različnih proteinov. Pomembnejši predstavnik je družina proteinov RIM (z rab3 vezavne molekule). Ti se na kanalček vežejo z RIM vezavnimi proteini (RBP). Z njimi asociira tudi protein munc13, ki je v membrani vezikla in nevrona vezani s proteini SNARE. Ti so mediatorji pri fuziji membran. Delovanje kanalčka inaktivirajo procesi, kot sta od napetosti odvisni mehanizem in od kalcija odvisen mehanizem, ki je povezan s kalmodulinom.

==Gregor Strniša - Načini aktivacije GPCR==

GPCR, oziroma z G proteinom sklopljeni receptorji, so transmembranski proteini, ki s svojim delovanjem vplivajo na dogajanje v celici. Zaradi vezave liganda na njihovo zunajcelično stran se jim spremeni konformacija in omogoči prenos signala preko različnih signalnih molekul. Signal se preko različnih G proteinov in β-arrestinov prenaša do drugih proteinov v celici. Kmalu po odkritju GPCR se je izkazalo, da vsi ne delujejo po istem principu. Nove raziskovalne metode so omogočile napredek na področju vizualizacije molekul in njihovega sledenja v celici. Tako so znanstveniki prišli do odkritja petih novih metod aktivacije GPCR, ki lažje razložijo delovanje receptorjev. Med seboj so si različne, a se lahko pogosto prekrivajo in dopolnjujejo. GPCR omogočijo več možnosti odgovora na določen ligand in njegovo koncentracijo. Načini aktivacije, predstavljeni v moji seminarski nalogi, so pristranska aktivacija, znotrajcelična aktivacija, dimerizacijska aktivacija, transaktivacija in dvofazna aktivacija. Posamezen receptor navadno deluje na več načinov. Ob posameznem načinu so podani primeri receptorjev in njihovega delovanja. Z razumevanjem načinov njihove aktivacije se odprejo nove možnosti razvoja zdravil, ki bi delovale preko GPCR, ali vplivale na njihove signalne poti.

==Nikola Janakievski - Selective Androgen Receptor Modulators==

Selective Androgen Receptors Modulators or better known as SARMs, were discovered 30 years ago, as a potential replacement to steroid therapy. SARMs are a type of Selective Receptor Modulators (SRM), compounds which can act both as agonists and antagonists in androgen receptors (ARs) (as a non-steroid replacement), according to the tissue they are in. The main idea behind SARMs, is improving the hormone therapies we have currently, which use synthetic steroids. An ideal SARM could have all the benefits of steroid hormones, without the side effects. The potential benefits and safety of SARMs is yet to be determined, there are numerous ongoing studies for various applications. It is important to have a summary of all these potential application and past examples of studies. In this seminar, we aim to do just that, by comparing all past studies and future potential applications related to SARMs. We conclude that, SARMs are a viable alternative, possibly an improvement to synthetic steroids, although much more research and clinical trials are required for SARMs to become truly applicable.

==Vid Dobrovoljc - Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti==

Preučevanje součinkovanja med signalnimi potmi v celici je zelo zanimivo področje, vendar dokaj težko za raziskovanje. S seminarjem sem poizkusil predstaviti sovplivanje inzulinske(RTK) in β-adrenergične (GCPR) poti v srcu. . Inzulin na β-adrenergične (βAR) poti vpliva s fosforilacijo receptorja z različnimi kinazami, na primer protein kinazo A (PKA) G-protein kinazo (GRK2) in celo sam inzulinskim receptorjem (INSR), kar vodi do desenzitacije in včasih tudi internalizacije receptorja z vezavo β-arestina. Drug način vplivanja je z delovanjem na nižje člene v signalni poti, na primer na koncentracijo cAMP s fosfodiesterazami (PDE). Inzulin lahko tudi s pomočjo fosforilacije uporabi β-adrenergično pot za krepitev svojega signala. Zelo pomembna točka obeh signalnih poti je GRK2, ki po naravi deluje inhibirajoče na obe signalni poti, po zadnjih rezultatih pa jo poleg tega inzulin uporablja za še dodatno inhibicijo GPCR poti. Vplivanje βAR poti na inzulinsko pot je manj jasno, vendar kaže, da lahko βAR na sprejem glukoze v odvisnosti od situacije vpliva tako pozitivno kot negativno, dokaj pomembno vlogo pri tem pa ima PKB. Domnevam, da bo v prihodnosti vedno več raziskav na temo povezav med signalnimi potmi, saj bodo razvite nove opazovalne tehnike, poleg tega pa je razumevanje povezav koristno tako pri razvoju novih tehnik zdravljenja, kot pri samem študiju razvoja celične signalizacije

==Rebeka Jerina - Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev==

Veliko ljudi po svetu pije kavo, čaj ali kokakolo. Vsem naštetim pijačam je skupen kofein, najpogosteje zaužit psihostimulant na svetu. Kofein povzroča veliko učinkov, med katerimi je najbolj znan vpliv na budnost. Zanima me ali vemo kako in zakaj jo povzroči. Kofein je antagonist adenozinskih receptorjev (ARs). Ima podobno strukturo kot adenozin, zato lahko zaseda njegova vezavna mesta. Adenozinski receptorji so izraženi v mnogih tkivih, veliko pa jih najdemo v centralnem živčnem sistemu (CNS). Raziskala sem, da kofein večinoma vpliva na adenozinska receptorja podtipa A1 in A2A. Te dva podtipa adenozinskih receptorjev (ARs) vplivata na regulacijo mnogih fizioloških funkcij kot so spanje, kognicija, motivacija in čustva. Kofein tako z antagonizmom adenozinskih receptorjev (ARs) prepreči signalno kaskado, ki bi spodbudila zaspanost in posledično ohranja budnost. Adenozinski receptorji (ARs) spadajo pod receptorje povezane z G-proteini. Zgradba A1AR in A2AAR se nekoliko razlikuje, zato je tudi mehanizem delovanja teh dveh podtipov nekoliko drugačen. Signalizacija adenozinskih receptorjev (ARs) lahko poteka po več različnih signalnih poteh. Kofein bi zaradi pozitivnih okrepitvenih učinkov, pojava različnih duševnih motenj in pojava negativnih simptomov po prenehanju uživanja lahko prištevali med droge. Raziskave so pokazale, da se z antagonizmom adenozinskih receptorjev da uspešno zdraviti tudi številne bolezni. Glede na učinke in uporabo kofeina bi lahko rekli, da velja za hranilo, zdravilo ali drogo.

==Zala Perko - Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice==

Fotoreceptorji v membrani celic očesne mrežnice so značilni predstavniki z G-proteinom sklopljenih receptorjev. Njihova naloga je absorpcija svetlobe določene valovne dolžine in prenos signala preko G-proteina na citoplazemsko stran, kjer poteče veriga encimsko kataliziranih reakcij. Aktiviran fotoreceptor mora v procesu regeneracije ponovno zavzeti neaktivno konformacijo in vezati naravni ligand 11-cis-retinal. Barvni fotoreceptorji jodopsini zahtevajo učinkovit regeneracijski mehanizem, ker morajo stalno procesirati veliko količino svetlobnih signalov. Aktivna konformacija jodopsina razpade veliko hitreje v primerjavi z rodopsinom in tudi sam potek regeneracije je pri jodopsinih hitrejši. Vzrok za to bi lahko bila različna usoda desenzibiliziranih receptorjev. Nedavno so odkrili možnost, da pri regeneraciji jodopsinov pride do preusmeritve signalne poti. Namesto, da se receptor deaktivira preko internalizacije z arestinom, ostane v membrani in veže ligand glede na prehodno konformacijsko stanje v katerem se nahaja. Na različen potek regeneracije jodopsinov bi lahko vplivala tudi vezava druge molekule retinala v alosterično mesto, ki je posledica konformacijskih sprememb. Povezava med interakcijo retinala in njegovih analogov z določenim konformacijskim intermediatom ima pomembno vlogo tudi s terapevtskega vidika, saj GPCR-ji v splošnem predstavljajo terapevtske tarče za zdravljenje mnogih obolenj. Uporaba analogov 11-cis-retinala, kot sta 9CR in 6mr, ki se vežeta v aktivno ali eno od alosteričnih mest, bi lahko predstavljala učinkovit pristop pri zdravljenju prirojenih mutacij v fotoreceptorjih.

==Eva Vene - Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1==

Družina TRP kanalčkov pri živalih združuje devet manjših skupin kationskih prenašalcev, ki odločilno vplivajo na pravilno delovanje organizma. Eden od tovrstnih kanalčkov je tudi TRPV1 z angleškim imenom »transient receptor potential vanilloid 1«. Tega najdemo v mnogih organih in organskih sistemih, natančneje pa se v tem seminarju osredotočamo na njegovo vlogo v perifernem živčevju. TRPV1 vsebuje okoli polovica vseh somatskih in visceralnih senzoričnih nevronov, zato je pomemben mediator pri nocicepciji oziroma zaznavanju možno nevarnih stimulov ter njihovim prevodom v akcijskih potencial. Njegovo delovanje, poleg nekaterih drugih dražljajev, lahko vzbudi organska molekula, imenovana kapsaicin. Slednjega najdemo v sadežih rastlin rodu Capsicum in ga pojmujemo kot eno odločilnih molekul za pekoč okus teh plodov. Ob vezavi kapsaicina na TRPV1 v celico vdrejo kationi, ki spodbudijo različne celične procese, ključne za oblikovanje in prenos živčnega signala do možganov ter pojav vnetja. Posebej zanimive so dvolične posledice vezave kapsaicina, ki sicer vodijo do bolečine, draženja in vnetja, a omogočijo tudi refrakcijsko dobo kanalčka, ki predstavlja čas, ko slednjega ne moremo aktivirati ter desenzitacijo in degradacijo živčnih vlaken, kar povezujemo z analgetičnim učinkom te molekule. Ob redni daljši izpostavitvi kapsaicinu, ki ga lahko administriramo transdermalno ali injiciramo, se tako uspešno uporablja pri lajšanju kroničnih bolečin.

==Erik Putar - AMPK: senzor glukoze ter celičnega energijskega stanja ==

Celica uporablja z AMP aktivirano protein kinazo (AMPK) kot senzor celičnega energijskega stanja in glukoze. Njen glavni aktivator je AMP, ki promovira fosforilacijo Thr172 na AMPK, inhibira defosforilacijo fosforiliranega Thr172 ter alosterično aktivira AMPK. Aktivacija AMPK poteče že ob majhem energijskem deficitu in sproži regulatorni odgovor, ki preusmeri celični metabolizem iz anabolizma v katabolizem. Fosforilacija Thr172 poteče preko kinaze LKB1, medtem ko sta glikogen sintaza in acetil koencim A karboksilaza (ACC) dve tarči izmed mnogih kinazne aktivnosti AMPK. AMPK je heterotrimer sestavljen iz podenot α, β in γ. V α podenoti je prisotno kinazno aktivno mesto ter Thr172, medtem ko so na γ podenoti prisotna vezavna mesta za adenin nukleotide. β podenota je miristilirana na svojem N koncu, kar je ključnega pomena za delovanje glukoznega senzorja. Ta mehanizem poteka na lizosomih in sicer s tvorbo velikega kompleksa, ki vsebuje aldolazo, v-ATPazo, Ragulator, AXIN, LKB1 ter AMPK. Aldolaza je sicer tista, ki čuti prisotnost glukoze in to preko fruktoze 1,6-bisfosfata (FBP): odsotnost FBP v njenem aktivnem mestu aktivira AMPK neodvisno od razmerja koncentracijah adenin nukleotidov in tako preusmeri celico iz glikolitične v alternativne oksidativne poti.

==Timotej Sotošek - Regulacija mišičnega glikogena: granule in njeni proteini ==

Glikogen je primarna oblika shranjevanja glukoze, ki je hitra in dostopna oblika energije. Kljub njegovi pomembnosti pa procesi regulacije glikogena še vedno niso popolnoma jasni. Metabolizem glikogena je zelo reguliran, hkrati pa dinamičen. Kako se bo metabolizem glikogena usmeril, je odvisno od mnogih dejavnikov. Zaloge glikogena v skeletnih mišicah so razdeljena na tri območja: podsarkomerno, intermiofibrilarno in intramiofibrilarno. Vsako od teh območij ima drugačno funkcijo v celici in temu primerno vsaka zase regulira sintezo in razgradnjo glikogenskih granul. Vsaka granula glikogena pa je sposobna tudi samostojnega izvajanja regulacije, pri kateri sodelujejo različni proteini. Eden pomembnejših je protein fosfataza 1 (PP1), ki nadzoruje aktivnost ključnih encimov, kot so glikogen sintaza (GS) in glikogen fosforilaza (GP), pri tem pa mu pomaga glikogen tarčni protein (PTG), ki deluje kot ogrodni protein med PP1 in drugimi proteini. Ta proces je reguliran preko kompleksa laforin-malin, ki prekine povezavo med PP1 in PTG. V seminarju so predstavljene naloge in lastnosti glikogena v treh oddelkih znotraj skeletnih mišic. Predstavljen bo vpliv, ki ga imajo našteti proteini na sintezo glikogena, podrobnejši opis naloge, zgradbe proteinov laforina in malina, kako kompleks laforin-malin inhibira glikogen sintezo ter kakšne so posledice nedelovanja tega proteinskega kompleksa.

==Nika Tomsič - Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec ==

Acetil-CoA je eden glavnih metabolitov. Deluje kot mejna točka med glikolizo in Krebsovim ciklom. Poleg tega so pomembne tudi njegove naloge kot sekundarni obveščevalec. Nadzoruje ključne celične procese, vključno z energetsko presnovo, mitozo in avtofagijo, tako neposredno kot preko regulacije ekspresije genov. Acetil-CoA običajno nastane v mitohondrijskem matriksu iz piruvata ali kot posledica β-oksidacije dolge verige maščobnih kislin. Lahko pa nastane tudi v citosolu z oksidacijo aminokislin, etanola ali z delovanjem acetil-CoA sintetaze, ki združuje dve glavni komponenti: acetil in koencim A. Razmerje med koncentracijama v mitohondrijskem matriksu in v citosolu je vedno enako. Govorimo torej o nekem dinamičnem ravnotežju, ki ga omogočajo številni prenašalci. Mitohondrijska memebrana je sicer neprepustna za acetil-CoA, zato mora najprej zreagirati v drugo obliko, da lahko vstopa ali iztopa iz mitohondrija. V mitohondrij vstopa piruvat s pomočjo citrat – piruvatnih prenašalcev. Tu piruvat dehidrogenazni kompleks katalizira reakcijo v acetil-CoA. Ko pa je v mitohondriju preveč acetil-CoA, se lahko ta prenese v citosol ali jedro v obliki acetilkarnitina preko karnitinskega prenašalca. V citosolu se spet povrne v acetil-CoA in je lahko vir anabolizma maščobnih kislin ali aminokislin, v jedru pa je njegova funkcija acetiliranje histonov. To omogoči prepisovanje genskega materiala. Lahko pa tudi nadaljuje svojo pot v mitohondriju in vstopi v citratni cikel, kjer je prvi korak pretvorba v citrat preko citratnega sinteznega kompleksa.

==Aleksandra Rauter - Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih==

Makrofagi so nepogrešljive komponente imunskega sistema, ki izhajajo iz matičnih celic kostnega mozga in nastajajo v procesu hematopoeze. Glavne funkcije, ki jih opravljajo so fagocitoza, izločanje citokinov in sodelovanje pri humoralnem imunskem odzivu skupaj z limfociti. Njihovo aktivacijo povzroči prisotnost različnih citokinov, ki se vežejo na specifične TLR receptorje. Najpogostejši ligand klasične aktivacije je lipopolisaharid (LPS), strukturna komponenta celičnih sten bakterij. Zaznava vezanega liganda preko adapterskih proteinov, signalne kaskade, transkripcijskih faktorjev vodi do razvoja enega od dveh fenotipov makrofagov. M1 fenotip ima baktericidno in fagocitno delovanje, M2 pa sodeluje predvsem pri reparaciji tkiv. Točni mehanizmi, ki to povzročijo, še niso poznani. M1 makrofag ima reprogramiran Krebsov cikel, kar povzroči akumulacijo različnih intermediatov v mitohondriju. Ti se lahko prenesejo v citosol preko specifičnih transporterjev in sodelujejo pri različnih regulatornih mehanizmih. Sukcinat povzroči povečano izločanje vnetnih citokinov preko stabilizacije transkripcijskega faktorja HIF-1α, povečanja količine mROS, posttranslacijskih modifikacij proteinov in signalizacije preko z GPCR. Spremenjen Krebsov cikel povzroči akumulacijo citrata, ki je perkurzor itakonata. Ta preko transkripcijske regulacije in inhibicije določenih encimov regulira protivnetni in protimikrobni odziv. Fumarat in α-ketoglutarat sodelujeta pri epigenetski regulaciji celičnih procesov.

==Jakob Tomšič - Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju ==

Acetoacetat, β-hidroksibutirat in aceton, drugače imenovani tudi ketonska telesca, so produkti našega metabolizma, ki ob pomankanju hranil možgansko tkivo, srce in skeletne mišice oskrbujejo z energijo. Ketogeneze pa danes ne povezujemo le s stanjem pomankanja hranil, ampak jo lahko spodbudimo tudi s tako imenovano ketogeno dieto, ki ji pripisujejo mnoge pozitivne učinke. Vloga ketogene diete pri epilepsiji in drugih nevroloških boleznih je poznana že skoraj stoletje, vendar so bili mehanizmi za antiepileptično delovanje vedno uganka. Trenutno poznamo več funkcij ketonskih telesc, ki presegajo njihovo osnovno metabolno vlogo. Ketonska telesca imajo epigenetski vpliv in lahko spodbujajo izražanje antioksidativnih genov. Prav tako je viden vpliv na vezikularni transport glutamatata z VGLUT v nevronih in zaviranje prenosa signala z GABA nevrotransmiterji. Ketonska telesca izražajo nevrozaščitno in protivnetno vlogo z vplivom na imunski sistem, z vezavo na HCA2 receptor, ki spodbuja nastanek prostagladina D2, in inhibicijo NLRP3 inflamasoma. Nevrološke motnje, kot je epilepsija, imajo več vzrokov, med katerimi sta neizpodbitno prevelika vzburjenost nevronov ter vnetno stanje tkiva. Vedno več dokazov kaže na vlogo ketonskih telesc pri nadziranju in manjšanju števila epileptičnih napadov pri bolnikih. Kljub vsem dokazom in povezavam pa še vedno obstajajo dvomi, da so ravno ketonska telesca tista, ki imajo antiepileptične funkcijo.

==Laura Unuk - Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta ==

Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin (lcFAOD) so dedne avtosomske recesivne bolezni, ki onemogočajo metabolizem maščobnih kislin. Gre za mutacije genov, ki kodirajo encime oksidacije in karnitinskega transporta. Pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin (12-18 C-atomov) sodeluje več kot 15 encimov, vendar le motnja enega lahko pripelje do kliničnih simptomov, kot so šibkost mišic, odpoved jeter, odpoved srca, itd. Glavni encimi, ki katalizirajo karnitinski transport so OCTN2 (organski-kationski-transporter-novel-2), CPT1 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-1A), CPT2 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-2) in CACT (karnitin-acilkarnitin-translokaza); encimi, ki pa katalizirajo oksidacijo so VLCAD (zelo-dolgoverižna-acil-CoA-dehidrogenaza), MTP (mitohondrijski-trifunkcijski-protein), LCHAD (dolgoverižna-3-hidroksiacil-CoA-dehidrogenaza) in LCKAT (dolgoverižna-3-ketoacil-CoA-tiolaza). Karnitin je pomembna molekula za prenos dolgoverižnih maščobnih kislin skozi membrano mitohondrija, saj dolgoverižna maščobna kislina lahko vstopi v mitohondrij le v obliki acil-karnitin estra. Najpogostejša motnja pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin pa je motnja VLCAD encima, ki katalizira reakcije odcepa dveh ogljikovih atomov iz maščobne kisline na CoA. Nastali acil-CoA lahko nato vstopi v cikel citronske kisline, kjer nastane ATP. Ob nedelovanju VLCAD pride do pomanjkanja ATP v celici in posledično kliničnih simptomov. Zaznavanje napake enega od encimov je izvedena preko profila acilkarnitina v krvi, plazmi ali DBS. Z metodo NBS ('newborn screening') lahko kmalu po rojstvu že zaznajo motnjo in tako s hitrim zdravljenjem preprečijo neprijetno napredovanje bolezni. Poleg trenutnega zdravljenja so v razvoju različne terapije za zdravljenje motenj, ki pa imajo velik potencial.

==Stefanija Ivanova - Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc ==

Ketonska telesca predstavljajo alternativno energijo za možgane, srce in skeletne mišice pod določenimi pogoji, kot so stradanje, intenzivna vadba, nenadzorovan diabetes ali po zaužitju ketonskih dodatkov. Zanimanje za delovanje ketonskih telesc se je povečalo predvsem pri športnikih. Ker ima uživanje eksogenih ketonov dramatične učinke na metabolizem skeletnih mišic med vadbo, imajo lahko športniki od tega koristi. Pomembna premisleka sta, kako športniki tolerirajo vnos ketonskih estrov med vadbo in ali dodatek ogroža ali vpliva na vnos ogljikovih hidratov. Zaužitje ketonskih dodatkov lahko hitro poveča koncentracijo ketonskih telesc, v primerjavi s ketogeno prehrano ali stradanjem, ki potrebujeta vsaj nekaj dni. Dodatek eksogenih ketonov predstavlja vir energije in ima lahko učinke pri varčevanju zalog ogljikovih hidratov med treningom v času nizke razpoložljivosti ogljikovih hidratov. Varčevanje zalog endogenih ogljikovih hidratov bi teoretično povzročilo večjo zmogljivost med ključnimi deli, med katerim so ogljikovi hidrati prevladujoči substrat. Dokler niso metabolne interakcije dodatkov ketonskih estrov s skeletnimi mišicami med vadbo popolnoma razjasnjene, vse predlagane ergogene lastnosti ostanejo teoretične. Glavni razlog za utemeljevanje eksogenih dodatkov ketonov morajo biti ugotovitve, da se ketoliza med vadbo poveča in pomembno prispeva k oskrbi z energijo. Čeprav obstajajo predlogi, da so dodatki ketonskih telesc koristni za športnike, je trenutno premalo informacij o učinkih dodatkov na metabolizem ketonskih telesc med vadbo. Na številna vprašanja je še treba odgovoriti.

==Nika Perko - Encim karbamoil fosfat sintetaza 1 ==

Karbamoil fosfat sintetaza 1 (CPS1) je limitni encim cikla uree, ker katalizira njeno prvo tristopenjsko reakcijo. Nahaja se v matriksu mitohondrija v celicah jeter, ledvic in tankega črevesa. Sestavljen je iz šestih domen: interakcijske, glutaminazne, integracijske, alosterične in dveh katalitskih. Encim je lahko v neaktivni ali aktivni obliki. Alosterično ga aktivira N-acetil-L-glutamat. Encim se lahko pozitivno regulira s proteinom Sirtuin 5 in glukagonom, negativno pa z mikro RNA miR-19b in od ATP odvisno kinazo (AMPK). Napačno delovanje kateregakoli od petih encimov ali transporterjev cikla uree vodi v zelo redko bolezen – motnje cikla sečnine. Prav motnja v delovanju encima CPS1 povzročajo najhujšo obliko te bolezni. Izrazi se lahko tako v neonatalni dobi kot tudi kasneje, določi pa se jo preko encimske ali genske analize. Simptomi so lahko letargija, bruhanje, encefalopatija in koma. Mutacije tega in tudi preostalih encimov ciklusa povzročijo hiperamoniemijo, ki se jo zdravi s hemodializo in raznimi zdravili, kot so L-arginin hidroklorid, natrijev benzoat in natrijev fenilbutirat. Bolniki se morajo držati stroge diete, bogate z ogljikovimi hidrati in maščobami. Poleg omenjenih zdravil lahko uživajo tudi N-karbamil-L-glutamat, ki deluje kot šaperon, stabilizator in aktivator. Trenutno je edina trajna in učinkovita rešitev transplantacija jeter, v prihodnosti pa bo morda učinkovita tudi genska terapija.

==Neža Leskovar - Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina ==

Urea je vodotopna polarna molekula, ki lahko počasi prehaja čez celične membrane z difuzijo, hiter in učinkovit transport pa ji omogočajo urea transporterji UT-A in UT-B. Ti sodelujejo pri izločanju odvečnega dušika iz telesa, koncentriranju urina in s tem pri regulaciji tekočinskega ravnovesja ter ponovni uporabi dušika vezanega v urei s pomočjo črevesnih bakterij. Transporterji so v osnovi sestavljeni iz dveh hidrofobnih transmembranskih domen in velike ekstracelularne povezovalne zanke, razen UT-A1, ki je rezultat podvojene osnovne strukture. So N-glikozilirani in imajo znotrajcelični aminski in karboksilni konec. UT-A transporterji se večinoma nahajajo v ledvicah. UT-A1 najdemo v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, v apikalnih delih celic, kjer omogoča prehod uree iz zbiralca v epitelne celice. UT-A3 se prav tako nahaja v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, le da v bazalnih delih celic in omogoča prehod uree nazaj v telesni obtok. UT-A2 se nahaja v Henlejevi zanki in skrbi za prehod uree iz ledvične sredice nazaj v Henlejevo zanko. UT-A4 je bil najden v ledvicah podgan, UT-A5 so našli v testisih miši in UT-A6 v človeškem črevesju. UT-B transporterji se nahajajo v ledvičnih kapilarah, najdemo jih tudi v različnih tkivih. Transport uree je dobro reguliran z vazopresinom, hiperosmolarnostjo, ubikvinacijo in drugimi načini.

==Ela Bizjak - Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni==

Mutacije mitohondrijske DNA so del mitohondriju lastnega dednega zapisa. Mitohondrijska DNA je krožna molekula, ki je stabilizirana z zvitjem v nukleoide. Najpogosteje mutacije nastanejo med replikacijo, saj je po predvidenih mehanizmih takrat DNA dolgo izpostavljena in enoverižna, prav tako pa je podvajanje pogosto. Poleg tega, da ima mitohondrijska polimeraza šibko eksonukleazno aktivnost, se v bližini dednega materiala nahaja tudi respiratorna veriga, ki proizvaja reaktivne kisikove radikale. Mutacije se širijo glede na njihovo vrsto. Delecije imajo pri podvajanju prednost, ker so manjše kot nemutirane molekule, zato v organelu hitro prevladujejo, dedni prenos delecij pa je zelo redek. Točkovne mutacije se širijo s sproščeno replikacijo, delitvami in fisijami mitohondrijev. Če so prisotne v spolnih celicah matere, jih podedujejo vsi njeni potomci. Heteroplazmija se lahko med tkivi osebka razlikuje. Te razlike so opazne v nepravilnostih na proteinskih superkompleksih, oblikah krist, sestavi mitohondrijske membrane, napetostnem potencialu in okvarah respiratorne verige. S sledenjem mutacijam ali različnim haploskupinam lahko sledimo tudi migracijam populacij. Nekatere dedne mutacije so odgovorne tudi za bolezenska stanja, če je nosilka mutacij mati. Najpogosteje prizadenejo živčevje, pojavijo pa se lahko ob rojstvu ali kasneje med 20. in 40. letom.

==Bor Krajnik - Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije ==

Kisikove reaktivne zvrsti ali krajše ROS so zelo reaktivne zvrsti, ki nastajajo pri redukciji molekularnega kisika, med seboj pa se pretvarjajo spontano ali s pomočjo encimov. V celici sta najpomembnejša predstavnika vodikov peroksid in superoksidni anion. Glaven vir ROS v celici so mitohondriji, kjer nastajajo kot produkt preobremenjenih elektronskih prenašalnih verig. Sprva se je njihova pristnost v organizmih smatrala za izključno škodljivo, ampak danes vemo, da imajo v človeškem organizmu več funkcij. V celici igrajo pomembno vlogo v določenih signalnih poteh, kar dosežejo z oksidacijo predvsem cisteinskih ostankov. Ob hipoksiji so ROS pomembne pri stabilizaciji ene od podenot hipoksija inducibilnih faktorjev (HIF), to so transkripcijski fakorji, ki regulirajo ekspresijo genov in so pomembni za angiogenezo in celično proliferacijo. Prav tako so pomemben člen signalne poti preko katere hormon angiotenzin II spodbuja delitev celic gladkih mišic v žilah. Regulirajo aktivacijo T-celic, kar privede do njihove proliferacije. ROS so vpletene tudi v proliferacijo rakastih celic, v katerih visoki nivoji ROS pomagajo pri angiogenezi, ki je potrebna zaradi hitre rasti tumorja kar vodi v hipoksijo. Zaradi tega so bile preizkušene kot potencialna tarča pri zdravljenju raka vendar so rezultati mešani.

==Maja Kobal - Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza==

Termogeneza je proces nastajanja toplote in je eden od mehanizmov termoregulacije. Glavni regulator adaptivne nedrgetajoče termogeneze je protein UCP1, imenovan tudi termogenin. To je razklopitveni (ang. uncoupling) protein, ki se nahaja v notranji mitohondrijski membrani rjavih in bež adipocitov (maščobne celice), kjer razklaplja protonski gradient, ki se ustvari med procesom dihalne verige. Gradient protonov preusmeri nazaj v matriks mitohondrija, namesto da bi ta šel preko ATP-sintaze. Tako torej ne nastane ATP, ampak sprosti se toplota, ki segreje celico in pomaga ohranjati stalno telesno temperaturo. Glavni regulatorji delovanja UCP1 so maščobne kisline in purinski nukleotidi; prvi delujejo kot aktivatorji, slednji pa kot inhibitorji. Novejše raziskave pa so pokazale mehanizme in termogene regulatorje v adipocitih, ki so neodvisni od UCP1. Ti mehanizmi so kroženje kalcijevih ionov preko mehanizma SERCA, kreatin-substratni cikel, kroženje lipidov, transport glicerol-3-fosfata in razklop preko N-acil aminokislin. Natančno poznavanje mehanizmov termogeneze bi ponudilo številne nove možnosti za zdravljenje debelosti in sladkorne bolezni tipa 2. Znanje o UCP1 neodvisnih mehanizmih termogeneze bi bilo zelo uporabno za zdravljenje predebelih in starejših ljudi, ki nimajo UCP1-pozitivnih adipocitov. Čeprav že več desetletij potekajo raziskave o termogenezi, je znanje na tem področju pomanjkljivo, tako da bodo potrebne še številne raziskave.

==Martin Stanonik - Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze==

Oksigena fotosinteza je pomemben mikrobiološki proces, ki je omogočil dvig atmosferske koncentracije kisika in posledični razvoj večceličnih organizmov. Pred tem procesom so že obstajali mehanizmi, ki so proizvajali energijo. Za to so potrebovali molekule bogate z elektroni, kot H2S. Vendar ti procesi niso proizvajali kisika, kot stranskega produkta. Zato je sprememba kompozicije atmosfere, ali GOE (Great Oxidation Event) povzročila smrt mnogih organizmov kake 2.5 milijarde let nazaj. Tisti, ki pa so preživeli, so pa razvili obrambne mehanizme proti radikalnimi molekulami (ROS), ki so nastale iz kisika, ali pa so se umaknili v globje predele takratnih oceanov, kjer so še zmeraj prevladovali pogoji pred GOE. Kljub temu znanju natančen pojav in razvoj teh procesov še ni poznan. Danes še obstajajo organizmi, ki izvajajo te procese, nekateri lahko celo oba, vendar je to odvisno od okolja. To, vključno z fosili in filogenetskimi raziskavami, bi nam lahko pomagalo razumeti kako se je razvilo življenje na Zemlji. Organizmi z oskigeno fotosintezo so pomemben vir kisika v okoljih. Oksigena fotosinteza vključuje mnoge dele, kot reaktivne centre (RCI in RCII) in fotosisteme PSI in PSII ter OEC, ki je sistem ,ki tvori stranski produkt kisik. Pojav teh mehanizmov tudi še ni natančno poznan zato bodo potrebne še številne raziskave.

==Tinkara Božič - Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline==
Saharoza je pomemben disaharid, ki vpliva na rast rastlin, njihov razvoj, reprodukcijo in obrambne odgovore. Višek trioza fosfata, ki nastane iz ogljika med aktivno fotosintezo, se v citoplazmi pretvori v saharozo. Z delovanjem saharoze je tesno povezana še trehaloza, oligosaharid iz dveh molekul glukoze, ki ima v celicah regulatorno vlogo. Saharoza je pomembna predvsem zaradi cepitve na heksozi glukozo in fruktozo, kar poteka na dva načina – lahko jo cepi saharozna sintaza ali jo hidrolizirajo invertaze. Slednje encime inhibirajo posebni proteini, imenovani invertazni inhibitorji. Saharozna pot se v rastlinah začne v fotosintetskih tkivih, nadaljuje z nalaganjem v floem, zaključi pa se z odlaganjem iz floema v ponore oz. nefotosintetska tkiva. Invertaze so treh vrst in jih klasificiramo glede na njihov pH ter mesto v celici – poznamo invertaze celične stene, vakuolne invertaze in citoplazemske invertaze. Nastopijo v celicah ponora, ko je potrebna cepitev saharoze na njeni sestavni molekuli. Invertaze celične stene pa sodelujejo še pri obrambnih odgovorih celice na napad patogenih organizmov, ko jo ti izkoriščajo za sladkorje. Če pa patogeni v navezo s celicami prinašajo hranila, ki jih gostitelji potrebujejo, to povezavo imenujemo mikoriza. Ta hranila so v glavnem fosfati, sladkor, ki ga od rastlin prejemajo patogeni organizmi, pa je glukoza.

==Mateja Milošević - CAM tip fotosinteze: Crassulacean Acid Metabolism==
CAM tip fotosinteze je evolucijska prilagoditev določenih vrst rastlin na ekstremne okoljske razmere, kot je pomanjkanje vode in zelo visoke temperature – tipičen primer takih rastlin so kaktusi v puščavi, ali kot prilagoditev ko rastlina ne more privoščiti si dovolj CO₂ čez dan. Takšen tip fotosinteze se od običajnega C3 tipa razlikuje po tem, da vsebuje dodaten encim t. j. fosfoenolpiruvat karboksilaza (PEPC). Ta skupaj z encimom RuBisCO pomaga asimilirati zunanji CO₂. Delovanje teh dveh encimov je časovno ločeno, in prav po tem se CAM fotosinteza razlikuje od še enega tipa fotosinteze – tipa C4. Asimilacija zunanjega CO₂ je ločena po fazah. Da se rastlina izogne prekomerni izgubi vode, čez dan svoje posebne listne pore - stome - zapre, uporablja pa v sebi shranjene energijsko bogate molekule. Ko pride do spremembe v okolici, npr. nastopi noč, rastlina svoje stome odpre in tako sprejme zunanji CO₂. Pomemben intermediat je malat2-, ki nastaja z obdelavo zunanjega CO₂ in se shranjuje v vakuoli v obliki malatne kisline. Ko se malat dekarboksilira, iz njega nastaneta piruvat in CO₂. Ta dva v nadaljnih metabolnih procesih doprineseta energijo in pomembne intermediate..

==Nika Banovšek - Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka==
Mleko je edina, in zato glavna prehrana novorojenčka, ki je v začetnih fazah svojega obstoja zelo ranljiv. V materinih mlečnih žlezah nastajajo primerne sestavine, ki so pomembne tako za periferni kot za centralni razvoj mladiča. Mlečni lipidi so glavna komponenta mleka. Nastajajo preko različnih substratov; med glavne štejemo maščobe kisline, glukozo in glicerol. V citosolu mlečnih epitelnih celic se iz slednjih tvorijo predvsem srednje dolge verige mašobnih kislin, ki igrajo pomembno vlogo v telesu novorojenčka, saj mu prinašajo tako hranilne vrednosti in energijo kakor tudi nekatere signalne molekule. Triacilgliceroli nastajajo v endoplazmatskem retikulumu, kjer se nato zapakirajo kot mehurčki in se iz mlečne epitelne celice izločajo v obliki mleka. Na sestavo mleka in regulacijo njegovih sestavin vplivajo številni dejavniki. Med ključne štejemo transkripcijske faktorje, kot sta, npr. SREBP-1 in PPARγ, in samo prehrano. Če imajo matere novorojenčkov genetske okvare ali slabe prehranske navade, se v celici zgodijo napačne regulacije v sintezi mlečnih lipidov ter pride do tvorbe in izločanja »toksičnega« mleka v alveolih mlečnih žlez. Takšno mleko lahko povzroči velike nepravilnosti v telesu novorojenčka, saj ta zaužije sebi škodljive snovi, ki vodijo do raznih notranjih vnetij. Zaužitje takšne vrste mleka se lahko odraža tudi v dolgoročnem razvoju otroka v obliki različnih bolezni.

==Luka Stanković - LIPIDNE KAPLJE: nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj==
Lipidne kaplje so bile prvič odkrite pred več kot 100 leti. Kljub temu, se jim do nedavnega ni posvečalo večje pozornosti in pripisovalo znatnejše vloge v delovanju organizma. Danes odkrivamo, da ne gre le za celično strukturo, ki shranjuje lipide, temveč gre za nadvse pomemben organel, ki ga najdemo v vseh evkariontskih celicah. Ne le, da so kaplje nadvse pomembne za metabolne procese, temveč imajo tudi pomembno vlogo pri zaščiti pred lipotoksičnostjo, poškodbi mitohondrijev, obnavljanju homeostaze, zadnje čase pa se odkriva tudi njihov pomen v signalnih poteh. Kljub številnim funkcijam, med katerimi je še veliko neraziskanega, se v seminarju posvečamo predvsem nastanku kapelj, njihovi strukturi in njihovem zorenju. Nastanek lipidne kaplje začnemo z nastankom maščobnih kislin iz acetil CoA. Le-te se v ER skupaj z glicerolom s pomočjo kompleksa encimov pretežno pretvorijo v di- in triacilgliceride. Naraščanje njihove koncentracije znotraj membrane ER povzroči nastanek in odcep kaplje iz membrane. V večini primerov gre za reguliran odcep v citosol. Celoten proces in kasnejšo zorenje uravnava cela kopica proteinov, katerih natančni mehanizmi ali pa celo vloge v nekaterih primerih še niso popolnoma jasni. Napake v delovanju slednjih pa lahko povzročajo hujše zdravstvene zaplete kot so debelost, inzulinska odpornost in posledično diabetis.

== Ana Pervanja - Vpliv cirkadianega cikla na biosintezo lipidov==
Cirkadiani ritem oz. cikel je mehanizem, ki na podlagi zunanjih dražljajev vpliva na delovanje organizma. Proces poteka na osnovi zaznave svetlobe v fotosenzitivnih ganglijskih celicah, ki pošljejo signal v hipotalamus, kjer se nahaja glavna »ura«. Ta nato uskladi ostale organe po telesu. Posledica tega je nihanje regulatornih molekul (oscilatorjev) v perifernih celicah, ki preko glavnih regulatornih encimov vplivajo na metabolizem. Na biosintezo lipidov vplivata dve od cirkadianega cikla odvisni molekuli: transkripcijski faktor SREPB, ki sodeluje pri sintezi maščobnih kislin in sterolov, in jedrni receptor PPARγ, ki vpliva na sintezo maščobnih kislin z zelo dolgimi verigami. V primeru motenj cirkadianega cikla, ki so lahko posledica nepravilnega delovanja regulatornih molekul ali neusklajenosti glavne in perifernih »ur«, pride do disregulacije metabolizma. To lahko vodi do razvoja debelosti, sladkorne bolezni tipa II, ateroskleroze, možganske in srčne kapi idr.

== Aljaž Simonič - Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra ==
Virusi so parazitski biološki delci, ki v svojih gostiteljih povzročajo bolezni. Večina do sedaj uporabljanih protivirusnih zdravil deluje na virusne proteine, vendar ta pristop ne omogoča zdravljenja več virusov z enim zdravilom in je občutljiv na mutacije virusa. Različne na gostitelja delujoče učinkovine bi lahko kljub hujšim stranskim učinkom delovale kot širokospektralna protivirusna zdravila. Med takšnimi spojinami so obetavni tudi inhibitorji biosinteze nukleotidov, sistema kompleksnih metabolnih poti, ki tvorijo nove purinske in pirimidinske nukleotide ali reciklirajo delno razgrajene. Inhibicija teh poti virusom odvzame molekule, ki jih za replikacijo neizogibno potrebujejo v količinah, ki močno presegajo potrebe ter zaloge zdravih celic in v okuženih celicah zato tudi spodbujajo njihove sintezne poti ali alternativno zavirajo njihovo razgradnjo, ter jih tako prizadanejo bolj kot zdrave celice. V klinični rabi kot protivirusno zdravilo je ribavirin, inhibitor sinteze gvanozina, ki deluje tudi kot mutagen. Za različne druge bolezni se uporabljajo tudi inhibitorji de novo sinteze pirimidinov, vendar zaradi učinkovite reciklaže in visoke koncentracije uridina v krvni plazmi sami po sebi niso uspešni proti virusnim okužbam. To bi lahko popravilo dodajanje inhibitorja reciklažne poti.

== Luka Hafner - GABA in njeni receptorji v človeških možganih ==
GABA ali 4-aminobutanojska kislina je neproteinogena aminokislina, ki je prisotna v večini organizmov . Sprva je bilo mišljeno, da je le sekundarni metabolit v rastlinah in mikroorganizmih. Komaj leta 1950 je bila odkrita tudi v centralnem živčnem sistemu sesalcev in 1967 je bila prepoznana kot nevrotransmiter. Pri sesalcih je prisotna skoraj v vseh tkivih in deluje kot signalna molekula z vrsto vlog. Nastaja v kratki metabolni poti "GABA shunt", in sicer preko glutamat dekarboksilaze, v manjši meri pa pri razgradnji putrescina. V centralnem živčnem sistemu deluje kot inhibitorni nevrotransmiter. Veže se na GABAA in GABAB receptorje. GABAA receptorji so kloridni kanalčki, ki imajo poleg GABA vezavnega mesta številna alosterična vezavna mesta. GABAB receptorji so GPCR receptorji, ki posredno odpirajo kalijeve kanalčke in inhibirajo kalcijeve kanalčke in adenilil ciklazo. Z aktivacijo receptorjev se nevron hiperpolarizira in tako se prepreči prenos signala. GABA ima zelo pomembno vlogo pri prenatalnem razvoju živčnega sistema, kjer vpliva na proliferacijo, migracijo in diferenciacijo živčnih celic. Ker ima GABA tako pomembno vlogo pri uravnavanju delovanja centralnega živčnega sistema, lahko nepravilnosti pri GABA signalizaciji privedejo do številnih nevroloških in psiholoških obolenj.

== Nika Bedrač - Vpliv estrogena in njegovih receptorjev na skeletne mišice ==
Estrogeni so steroidni hormoni, glavni predstavniki pa so 17β -estradiol, estron in estriol. Pri ženskah uravnavajo funkcijo reproduktivnega sistema, rast in razvoj spolnih organov, ohranitev sekundarnih spolnih znakov, imajo pa tudi vpliv na kostno gostoto, delovanje skeletnih mišic, delovanje možganov itd. So male lipofilne molekule, ki lahko direktno prehajajo membrano in se na citosolni strani vežejo na estrogenske receptorje. Od tam se lahko translocirajo v jedro in interagirajo z jedrno DNA, ob enem pa lahko tudi regulirajo transkripcijo in replikacijo mitohondrijske DNA. Glavna estrogenska receptorja sta ER-α in ER-β , razlika med njima je v tem, kateri gen ju kodira in v katerih organih sta prisotna.
Koncentracije estrogena pomembno vplivajo na telesno vzdržljivost in na izbiro substrata, ki ga celica med samo aktivnostjo oksidira. Raziskave so pokazale, da so pri glodavcih samice bile bolj telesno vzdržljive in so kot primarni substrat porabljale maščobne kisline – do podobnih ugotovitev so prišli tudi pri ljudeh. Koncentracija estrogena v telesu pri ženskah bistveno fluktuira in je odvisne od obdobja menstrualnega cikla.
S starostjo se koncentracija estrogena (predvsem pri ženskah) zmanjša, kar pa se lahko odraža v upadu mišične mase in kostne gostote. Za zdravljenje se uporabljajo hormonske nadomestne terapije.

== Srna Anastasovska - Grelin in njegove funkcije v organizmu ==
Grelin je hormon ki je bil odkrit kot endogeni ligand ki se veže na GHS receptor in s tem stimulira sekrecijo GH hormona. Sestavljen je iz 28 aminokislin, kjer je Ser 3 oktaniliran, kar je bistveno za biološko aktivnost hormona. Ta reakcija oktaniliranja katalizira ghrelin O-acil transferaza (GOAT) in je med prvimi peptidni hormoni ki ima takšno modifikacijo. V telesu so prisotni več oblik grelina: acilirane, deacilirane itd. Hormon je identificiran pri mnogih sesalcih in ima podobno funkcijo pri vseh. Grelin ima več funkcij v organizmu: stimulira sproščanje rastnega hormona (GH), signalizira možganom kadar potrebuje vnos hrane tako da aktivira celice v hipotalamusu in hipofizi, vključno z NPY nevroni ki stimulirajo apetit, regulira metabolizem glukoze, poboljša učenje in spomin, regulira metabolizem energije. Ko je želodec prazen, v zgornji regiji sintetizira grelin ki potem po kri ali vagusnem sistemu signalizira in aktivira regije v hipotalamusu (arkuatno jedro) ki nato stimulirajo apetit. Številne funkcije grelina in njegova sposobnost širjenja v številna tkiva omogočajo široko uporabo v medicini pri zdravljenju različnih bolezni ali stanj kot so anemija, bulimija, deficit rastnega hormona, odpoved srca, postoperativnega ileusa, in ima tudi pozitiven učinek na kardiovaskularnem sistemu. Odkritje grelina je omogočilo znanstvenikom vpogled v nove mehanizme regulacije in razumevanje hranjenja.

BIO2 Seminar 2020

2020-12-28T14:52:09Z

Srna Anastasovska: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na biosintezo lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Luka_Hafner_-_GABA_in_njeni_receptorji_v_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganih GABA in njeni receptorji v človeških možganih]|||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||Ghrelin in njegove funkcije v organizmu||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||Učinki uporabe kreatina v športu in medicini||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2020

2020-12-27T00:42:45Z

Srna Anastasovska: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na biosintezo lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Luka_Hafner_-_GABA_in_njeni_receptorji_v_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganih GABA in njeni receptorji v človeških možganih]|||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||The role of adipocyte hormones in regulatling fuel metabolism||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||Učinki uporabe kreatina v športu in medicini||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2020

2020-12-25T15:08:22Z

Srna Anastasovska: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na biosintezo lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Luka_Hafner_-_GABA_in_njeni_receptorji_v_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganih GABA in njeni receptorji v človeških možganih]|||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||Hormonal Regulation of Fuel Metabolism||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||Učinki uporabe kreatina v športu in medicini||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2019-seminar

2019-03-07T14:59:28Z

Srna Anastasovska: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević|| Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miši ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||Prevelika količina popravljene DNA lahko poškoduje tkiva||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190212141409.htm||05.03||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090930.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||Bakterijski genotoksin kolibaktin človeškega črevesa alkilira DNA.||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214153159.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||Kako nas okuži določena vrsta bakterij?||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190225075613.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213124350.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||New details of HIV life cycle||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181005111453.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||Naivni makrofagi||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181129142441.htm?fbclid=IwAR2x562KFLljGOmHD5T40KXBf6I2L72TpMpvVM0I3lNBckrVxXW3cXQG-vM||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||Sile znotraj aktivnih celic|| https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190212081535.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127092558.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak||Merjenje celične obremenjenosti s fluorescenčno molekulo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/08/180827110828.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||New pill can deliver insulin through the stomach||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207142206.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||RNA-vezavni protein Pum2 je tarča v boju proti staranju||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190110141826.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||Vpogled v mehanizem, ki nadzira poškodbe DNA||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190226112344.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2019 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2019-seminar

2019-02-27T21:07:48Z

Srna Anastasovska: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević|| Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miši ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||Kemikalija dodana potrošniškim produktom oslabi delovanje antibiotikov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190221172048.htm||05.03||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||Zmanjšanje posledic kemoterapije||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090930.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214153159.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190225075613.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||Iznajdba, ki bi lahko rešila problem pri zdravljenju virusa HIV.||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207173229.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||Great white shark genome decoded|| https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190218153238.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak||Merjenje celične obremenjenosti s fluorescenčno molekulo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/08/180827110828.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||New test to detect disease and infection||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110808.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||Vpogled v mehanizem, ki nadzira poškodbe DNA||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190226112344.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.