https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Suzana+Semi%C4%8D 2026-04-08T11:00:37Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Tumorigenost_iPSC&diff=8196 2013-06-03T10:05:21Z

<p>Suzana Semič: New page: Urška Navodnik: Ali sta pluripotentnost in tumorigenost združena?, Molekularna osnova tumorigenosti in zarodnih matičnih celic Ana Remžgar: Ali bodo negenetske metode za pridobivanje ...</p> <hr /> <div>Urška Navodnik: Ali sta pluripotentnost in tumorigenost združena?, Molekularna osnova tumorigenosti in zarodnih matičnih celic<br /> <br /> Ana Remžgar: Ali bodo negenetske metode za pridobivanje IPSC zmanjšale verjetnost tumorjev?, Pristopi, ki bi naredili terapije z izvornimi celicami bolj varne</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8192 2013-05-30T22:40:55Z

<p>Suzana Semič: /* Osnove za nadaljne študije */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> <br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> <br /> V letu 2010, so Liu ''et al.'' poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> <br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Narejen je bil poskus pridobivanja iPS iz keratinocitov, kjer je bil odsoten c-Myc. Na gojišču so nastale iPS celice, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. <br /> <br /> Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice ''in vitro'' in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> <br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> <br /> ==Osnove za nadaljnje študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> <br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu ''et al.'' Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. ''Science'', 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi ''et al.'' Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. ''Cell'', 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García ''et al.'' Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J''ournal of Molecular and Cellular Cardiology'', 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan ''et al.'' SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. ''Journal of Genetics and Genomics'', 2010, letn.37, št.4, str. 241–248<br /> <br /> • Alejandra M. Vitale ''et al.'' Induced pluripotent stem cells: A new technology to study human diseases. ''The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology'', 2011, letn.43, št.6, str. 843–846<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8191 2013-05-30T22:05:58Z

<p>Suzana Semič: /* Viri */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> <br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> <br /> V letu 2010, so Liu ''et al.'' poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> <br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Narejen je bil poskus pridobivanja iPS iz keratinocitov, kjer je bil odsoten c-Myc. Na gojišču so nastale iPS celice, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. <br /> <br /> Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice ''in vitro'' in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> <br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> <br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu ''et al.'' Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. ''Science'', 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi ''et al.'' Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. ''Cell'', 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García ''et al.'' Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J''ournal of Molecular and Cellular Cardiology'', 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan ''et al.'' SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. ''Journal of Genetics and Genomics'', 2010, letn.37, št.4, str. 241–248<br /> <br /> • Alejandra M. Vitale ''et al.'' Induced pluripotent stem cells: A new technology to study human diseases. ''The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology'', 2011, letn.43, št.6, str. 843–846<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8151 2013-05-27T22:05:59Z

<p>Suzana Semič: /* Viri */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> - Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> - Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili celice, v katere so prenesli Yamanaka faktoje, so po 10 dneh zaznali alkalno fosfatazo, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonosti.<br /> <br /> Celice se iz gojišča odvzeli po 14, 20 in 36 dneh ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celic s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bifulfidne metilacije je v pridobljenih celičnih linijah je v 3 celičnih linijah: IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1 pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, ki je zelo podobna demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se močno razlikuje od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene celične linije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2.primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti dox in VPA in 7 dneh le v prisotnosti dox razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 5 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4).<br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije 2, 10, 12, 13, 18, 11, 14, 17, 20 in 21 so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (ob testiranju z imunofluorescenco, so zaradi proteina GFP s katerim so testirali izražanje Oct4, linije fluorescirale močno zeleno).<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic ter na podlagi podobnosti izbrali 7 celičnih linij, od katerih so 4 razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ 9, 11, 14, 17 in 21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa.<br /> štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> Te raziskave lahko potekajo in vitro, ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> Pogosto se uporablja in vivo metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Stadtfeld M. et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.Genes Dev., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. Journal of Cell Physiology, 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. Journal of animal science and biotechnology, 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature, 2009, številka 461, str. 86-90<br /> *Boland M.J. in sod. Adut mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, številka 461, str. 91-94<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_celic&diff=8146 2013-05-27T21:55:01Z

<p>Suzana Semič: /* Skupine */</p> <hr /> <div>Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.<br /> <br /> V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.<br /> <br /> <br /> <br /> Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.<br /> <br /> Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.<br /> <br /> Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion'). <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled<br /> # Epigenetsko reprogramiranje - pregled<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369<br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767<br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html<br /> # Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html<br /> # Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/<br /> # Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/<br /> <br /> <br /> == Skupine ==<br /> <br /> <br /> Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme): <br /> <br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijske_zna%C4%8Dilnosti_izvornih_celic Biokemijske značilnosti izvornih celic](Urška Rode)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Epigenetsko_reprogramiranje_celic Epigenetsko reprogramiranje] (Karmen Belšak, Maša Mohar)<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Erik Janežič, Tomaž Rozmarič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inducirane_pluripotentne_celice_iz_mišjih_fibroblastov Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov ](Ana Kunšek, Nastja Pirman)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izboljšane_mišje_inducirane_pluripotentne_celice Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice] /za 3 študente/ (Julija Mazej, Bojana Lazović, Maja Kostanjevec) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_iPSC_za_zdravljenje_anemije_srpastih_celic_pri_miših Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših] (Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prve_človeške_inducirane_pluripotentne_celice Prve človeške inducirane pluripotentne celice](Dejan Marjanovič, Suzana Semič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezvirusni_na%C4%8Din_priprave_iPSC Brezvirusni način priprave iPSC](Griša Prinčič, Erik Mršnik, Jakob Gašper Lavrenčič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema Reprogramiranje z dvema faktorjema](Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_s_transpozicijo Reprogramiranje s transpozicijo] (Barbara Dušak, Sara Lorbek) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kloniranje_miši_iz_iPSC Kloniranje miši iz iPSC](Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tumorigenost_iPSC Tumorigenost iPSC](Urška Navodnik, Ana Remžgar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_miRNA Reprogramiranje z miRNA] (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pregled_in_prihodnost_postopkov_za_pripravo_iPSC Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC] / (Aleksander Benčič, Jernej Pušnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombiniranje_tehnologije_induciranih_pluripotentnih_mati%C4%8Dnih_celic_in_genskih_modifikacij_pri_zdravljenju_mi%C5%A1i%C4%8Dne_distrofije] (Urška Rauter)<br /> <br /> <br /> Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]] <br /> <br /> Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8103 2013-05-27T20:53:28Z

<p>Suzana Semič: /* Drugi izvori hiPS celic */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> <br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> <br /> V letu 2010, so Liu ''et al.'' poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> <br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Narejen je bil poskus pridobivanja iPS iz keratinocitov, kjer je bil odsoten c-Myc. Na gojišču so nastale iPS celice, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. <br /> <br /> Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice ''in vitro'' in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> <br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> <br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8102 2013-05-27T20:53:13Z

<p>Suzana Semič: /* Diferenciacija človeških iPS celic */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> <br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> <br /> V letu 2010, so Liu et al. poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> <br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Narejen je bil poskus pridobivanja iPS iz keratinocitov, kjer je bil odsoten c-Myc. Na gojišču so nastale iPS celice, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. <br /> <br /> Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice ''in vitro'' in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> <br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> <br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8101 2013-05-27T20:52:53Z

<p>Suzana Semič: /* Diferenciacija človeških iPS celic */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> <br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> <br /> V letu 2010, so Liu et al. poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> <br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Narejen je bil poskus pridobivanja iPS iz keratinocitov, kjer je bil odsoten c-Myc. Na gojišču so nastale iPS celice, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. <br /> <br /> Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice in vitro in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> <br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> <br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8100 2013-05-27T20:51:57Z

<p>Suzana Semič: /* Drugi izvori hiPS celic */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> <br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> <br /> V letu 2010, so Liu et al. poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> <br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Narejen je bil poskus pridobivanja iPS iz keratinocitov, kjer je bil odsoten c-Myc. Na gojišču so nastale iPS celice, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. <br /> <br /> Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice in vitro in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8098 2013-05-27T20:45:52Z

<p>Suzana Semič: </p> <hr /> <div>Dejan Marjanovič: Uvod, Pregled postopka za pripravo hIPS celic, Osnove za nadaljne študije<br /> <br /> Suzana Semič: Drugi izvori hiPS celic, Diferenciacija človeških iPS celic, Osnove za nadaljne študije</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8095 2013-05-27T20:43:05Z

<p>Suzana Semič: /* Viri */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> <br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> <br /> V letu 2010, so Liu et al. poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> <br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Po drugi strani tudi keratinociti predstavljajo visoko stopnjo Klf4 in cMyc. Pri poskusih kjer je bil odsoten cMyc so nastale iPS, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice in vitro in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8094 2013-05-27T20:41:21Z

<p>Suzana Semič: </p> <hr /> <div>Dejan Marjanovič: Uvod, Pregled postopka za pripravo hIPS celic<br /> <br /> Suzana Semič: Drugi izvori hiPS celic, Diferenciacija človeških iPS celic</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8093 2013-05-27T20:41:12Z

<p>Suzana Semič: New page: Dejan Marjanovič: Uvod, Pregled postopka za pripravo hIPS celic Suzana Semič: Drugi izvori hiPS celic, Diferenciacija človeških iPS celic</p> <hr /> <div>Dejan Marjanovič: Uvod, Pregled postopka za pripravo hIPS celic<br /> Suzana Semič: Drugi izvori hiPS celic, Diferenciacija človeških iPS celic</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8092 2013-05-27T20:38:47Z

<p>Suzana Semič: /* Drugi izvori hiPS celic */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> <br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> <br /> V letu 2010, so Liu et al. poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> <br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Po drugi strani tudi keratinociti predstavljajo visoko stopnjo Klf4 in cMyc. Pri poskusih kjer je bil odsoten cMyc so nastale iPS, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice in vitro in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8091 2013-05-27T20:38:35Z

<p>Suzana Semič: /* Pregled postopka za pripravo hIPS celic */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> <br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> V letu 2010, so Liu et al. poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Po drugi strani tudi keratinociti predstavljajo visoko stopnjo Klf4 in cMyc. Pri poskusih kjer je bil odsoten cMyc so nastale iPS, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice in vitro in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8090 2013-05-27T20:38:21Z

<p>Suzana Semič: /* Drugi izvori hiPS celic */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> V letu 2010, so Liu et al. poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Po drugi strani tudi keratinociti predstavljajo visoko stopnjo Klf4 in cMyc. Pri poskusih kjer je bil odsoten cMyc so nastale iPS, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> <br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice in vitro in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8089 2013-05-27T20:38:01Z

<p>Suzana Semič: /* Uvod */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> <br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> V letu 2010, so Liu et al. poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Po drugi strani tudi keratinociti predstavljajo visoko stopnjo Klf4 in cMyc. Pri poskusih kjer je bil odsoten cMyc so nastale iPS, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice in vitro in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8088 2013-05-27T20:34:56Z

<p>Suzana Semič: /* Uvod */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.<br /> <br /> ==Pregled postopka za pripravo hIPS celic==<br /> Za nastanek iPS celic iz odraslih človeških somatskih celic, je bilo potrebno opimizirati retrovirusno transdukcijo v človeških fibroblastih in prilagoditi pogoje gojenja. Optimizacija pogojev je omogočila nastanek iPS celic iz odraslih človeških fibroblastov (HDF) in ostalih somatskih celic. Prvo so vstavili GFP v odrasel HDF, s pomočjo amfotropičnega retrovirusa, ki je bil vzgojen v PLAT-A (Platinum Retroviral Packing Cells). Za kontrolo so vstavili GFP v mišje embrionalne fibroblaste (MEF) z ekotropičnim retrovirusom, vzgojenim v PLAT-E. V MEF je kar 80% celic izrazilo GFP, v HDF pa manj kot 20%. Da bi izboljšali učinkovitost transdukcije so v HDF vstavili mišji receptor za retroviruse, Slc7a1, z lentivirusom. Nato so vstavili retrovirus, kateri je vseboval človeške Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, v HDF-Slc7a1. <br /> Mehanizem po katerem štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) povzročijo pluripotentnost v somatskih celicah, še ni znan. Znana pa je funkcija Oct3/4 in Sox2, kot ključnih transkripcijskih faktorjev, vendar pa ne moreta vezati svoje tarčne gene v diferencirane celice zaradi drugih inhibitornih mehanizmov, vključno metilacije DNA in histonskih modifikacij. C-Myc in Klf4 naj bi spremenila strukturo kromatina, tako da bi se Sox2 in Oct3/4 lahko vezala na svoje tarče. Ugotovili so, da predvsem Klf4 interagira z p3000 histonsko acetiltransferazo in s tem regulira izražanje genov z moduliranjem acetilacije histonov. <br /> Šest dni po transdukciji so bile celice obdelane s tripsinizacijo in prenesene na mitomicin C. Naslednji dan so medij, kateri je vseboval 10% FBS, zamenjali z medijem za primarne ES celice, kateremu so dodali 4ng/ml osnovnega rastnega faktorja (bFGF). Štirinajst dni pozneje so se pojavile zrnate kolonije, katere pa morfološko niso bile podobne hES celicam. Okoli 25. dneva pa so opazili različne kolonije, ki so bile ravne in podobne hES celičnim kolonijam. V šestih neodvisnih eksperimentih so iz 5 krat 10^4 fibroblastov opazili 10 hES celičnih kolonij in 100 zrnatih kolonij. Po tridesetih dneh od začetka eksperimenta so vzeli hES celične kolonije in jih mehansko razčlenili na manjše enote, brez encimske razgradnje. Občasno so opazili nekatere hES celične kolonije med zrnatimi celicami, a jih je bilo težko izolirati, zaradi visoke gostote zrnatih celic. Nato so hES celice razširili na SNL hranilno gojišče s primarnim medijem ES celic, kateri je vseboval bFGF. Oblikovale so se ravne in tesno pakirane kolonije. Vsaka preiskovana celica je bila po morfologiji podobna hES celicam, torej je vsebovala veliko jedro in bolj skopo citoplazmo. Kot pri hES, so tudi tukaj opazili občasno spontano diferenciacijo v centru kolonije.<br /> Ker je eksperiment potrdil podobnost med ES celicami v morfologiji in drugih opisanih vidikih, so izbrane celice poimenovali, po transdukciji HDF, kot prve človeške inducirane pluripotentne celice.<br /> <br /> ==Drugi izvori hiPS celic==<br /> Kasnejše raziskave pa so pokazale, da iPS celice ne izhajajo samo iz fibroblastov, ampak jih lahko pridobijo tudi iz drugih somatskih celic.<br /> V letu 2010, so Liu et al. poročali o prvih človeških endodermalnih IPS celicah pridobljenih iz primarnih hepatocitov (hHiPS). V nasprotju iPS celic iz fibroblastov, so se iPS celice pridobljene iz hepatocitov pojavile na koloniji že 6-9 dni po transfekciji, kar pomeni, da je reprogramiranje hitrejše. Drugi vir iPS celic, ki jih je mogoče enostavno reprogramirati, so človeški keratinociti. Izkazalo se je, da so 100-krat bolj učinkoviti in 2-krat hitrejši kot iPS celice iz človeških fibroblastov. Keratinocite je mogoče dobiti tako iz kože, kot tudi iz las, zaradi česar so najbolj praktičen vir celic za proizvodnjo bolnikovih specifičnih iPS celic. Prav tako so celice iz krvi zelo dostopne za hitro proizvodnjo iPS celic. Vse te iPS celice so nastale iz zdravih darovalcev, obstaja pa tudi poročilo Carette et al. iz leta 2010, ki kaže, da lahko s standardnimi metodami reprogramiramo iPS celice iz človeških rakavih celic, ki nosijo onkogeno mutacijo. Te iPS celice izražajo pluripotentne markerje na podobnih ravneh kot ES celice, izražajo onkogene in imajo zaradi kromosomske nestabilnosti nenormalen kariotip.<br /> Vse omenjene celične linije so bile ustvarjene z istimi štirimi dejavniki, ki so jih uporabili Takahashi et al. (2007), vendar je možno, da povzročijo pluripotenco na somatskih celicah le nekateri izmed njih. Ugotovljeno je bilo, da je matične celice, ki izražajo endogeno Sox2, c-Myc in Klf4, mogoče reprogramirati z uporabo le enega od dejavnikov. Ta sistem zagotavlja prednost preprečevanja transfekciji onkogenih c-Myc in Klf4, ki ju lahko pripisujemo k tumorigenezi. Po drugi strani tudi keratinociti predstavljajo visoko stopnjo Klf4 in cMyc. Pri poskusih kjer je bil odsoten cMyc so nastale iPS, vendar je bilo število kolonij precej manjše, medtem ko v odsotnosti Klf4, kolonij ni bilo opaziti. Te študije podpirajo idejo, da reprogramiranje ni odvisno samo od štirih dejavnikov, ampak tudi od izvora celice.<br /> ==Diferenciacija človeških iPS celic==<br /> Človeške inducirane pluripotetentne celice se diferencirajo v različne tipe celic -nevrone, hepatocite, pankreatične beta celice in tudi kardiomiocite, kar kaže na to, da imajo lahko iPS celice znatno napredovanje pri srčno regenerativnih zdravljenjih. <br /> Vendar pa te celice delujejo tumorogeno. Če želimo to preprečiti, pridobimo celice in vitro in jih nato vbrizgamo v srce. V tem primeru ni nastanka tumorja, vendar so potrebne še dolgoročne študije za potrditev le-tega. IPS celice so pokazale tudi sposobnost diferenciacije v endotelijske celice in celice gladkih mišic, ki prispevajo k srčnemu popravljanju z oblikovanjem novih krvnih žil.<br /> IPS celice, ki izkoriščajo aktivin A in kostne morfogenetske proteine BMP4 so inkubirali na ploščah fetalnega govejega seruma in po 20 dneh inkubacije se je z analizo RT-PCR dokazalo, da te celice izražajo kardiomiocitne markerje, kot so TnTC, Mef2C. Nasprotno pa se je izražanje UPB3/4, Sox2 in Nanog izrazito zmanjšalo. Kardiomiociti se diferencirajo tudi brez govejega seruma ali pa v kulturi z END-2.<br /> ==Osnove za nadaljne študije==<br /> Čeprav je moč pridobiti pluripotente celice brez uničenja zarodkov in je vsaj teoretično enostavno dobiti pluripotente celice z genomom pacienta, je do klinične uporabe IPS celic še dolga pot. Prvi velik problem je uporaba retrovirusnih vektorjev, ki povročijo naključno vgradnjo konstruktov DNA, ki nosijo zapis za dejavnike, v genom in s tem povzročijo trajno spremembo dednega zapisa celic. Posledica takšne trajne in naključne vgradnje v genom je potencialno rakotvorno ali moteno delovanje določenih genov. Sporna je bila tudi uporaba dejavnika c-Myc, ki je znan onkogen. Z odkrivanjem novih nevirusnih in neintegracijskih metod indukcije iPS celic ter z uporabo različnih somatskih celičnih virov kot začetne stopnje v procesu diferenciacije so do danes že premagali številne začetne ovire. Največji napredek je bil dosežen ravno pri razvoju nevirusnih metod indukcije iPS celic. Med najbolj perspektivne metode, ki bi bile uporabne za klinične namene pridobivanja iPS celic, sodi indukcija s proteinskimi dejavniki ali z mikro RNA. Z uporabo nekaterih kemikalij se lahko zmanjša tudi število dejavnikov, potrebnih za indukcijo pluripotentnosti.<br /> ==Viri==<br /> • Junying Yu et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, 2007, letn.318, št. 5858, str.1917-1920<br /> <br /> • Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007, letn.131, št.5, str. 861-872<br /> <br /> • Olalla Iglesias-García et al. Induced pluripotent stem cells as a new strategy for cardiac regeneration and disease modeling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2013<br /> <br /> • Yoshinori Yoshida et al. iPS cells: A source of cardiac regeneration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2011, letn.50, št.2, str. 327–332<br /> <br /> • Chuanying Pan et al. SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Journal of Genetics and Genomics, 2010, letn.37, št.4, str. 241–248</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Prve_%C4%8Dlove%C5%A1ke_inducirane_pluripotentne_celice&diff=8087 2013-05-27T20:31:14Z

<p>Suzana Semič: New page: ==Uvod== Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolac...</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Ob številnih možnostih, ki jih ponujajo embrionalne matične celice (ES), se pojavlja nekaj ključnih problemov. Pridobivanje ES celic je etično sporno, saj se v procesu izolacije notranje celične mase iz blastule uniči zarodek. V primeru uporabe tujih ES celic, kot vira celic za uporabo v regenerativni medicini, bi bile te celice izpostavljene tudi imunski zavrnitvi vsadka (Yamanaka, 2009). Za rešitev tega problema ocenjujejo in preizkušajo dve možni rešitvi. Prva je etično sporna, terapevtsko kloniranje, druga novejša metoda, s katero se je mogoče izogniti uničevanju zarodkov in veliko obljublja, pa so inducirane pluripotentne matične celice (iPSC).<br /> Inducirane pluripotente matične celice sta odkrila Takahashi in Yamanaka leta 2006. Odkritje je pomenilo pomembno prelomnico pri pridobivanju potencialno uporabnih pluripotentnih celic brez uničevanja zarodkov. Prav tako je bilo odmevno na področju jedrnega reprogramiranja, saj so dokazali, da je možno z retroviralnim vnosom in ektopičnim izražanjem štirih dejavnikov- Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc, diferencirane mišje fibroblaste vrniti v pluripotentno stanje. <br /> Enaki štirje faktorji pa so sodelovali pri nastanku IPS celic iz odraslih človeških fibroblastov. hiPS celice so bile podobne hES celicam v morfologiji, proliferaciji, izražanju genov in telomerazni aktivnosti. Sama uporaba ES celic se sooča z etičnimi problemi, ki zavirajo njihovo uporabo. Poleg tega pa je težko ustvariti specifične ES celice za človeka ali bolezen, a prav njihova specifičnost je pogoj za učinkovito izrabo.</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_celic&diff=8065 2013-05-27T18:31:27Z

<p>Suzana Semič: /* Skupine */</p> <hr /> <div>Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.<br /> <br /> V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.<br /> <br /> <br /> <br /> Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.<br /> <br /> Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.<br /> <br /> Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion'). <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled<br /> # Epigenetsko reprogramiranje - pregled<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369<br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767<br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html<br /> # Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html<br /> # Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/<br /> # Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/<br /> <br /> <br /> == Skupine ==<br /> <br /> <br /> Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme): <br /> <br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijske_zna%C4%8Dilnosti_izvornih_celic Biokemijske značilnosti izvornih celic](Urška Rode)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Epigenetsko_reprogramiranje_celic Epigenetsko reprogramiranje] (Karmen Belšak, Maša Mohar)<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Erik Janežič, Tomaž Rozmarič)<br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Ana Kunšek, Nastja Pirman)<br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/ (Julija Mazej, Bojana Lazović, Maja Kostanjevec)<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prve_človeške_inducirane_pluripotentne_celice Prve človeške inducirane pluripotentne celice](Dejan Marjanovič, Suzana Semič)<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/(Griša Prinčič, Erik Mršnik, Jakob Gašper Lavrenčič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema Reprogramiranje z dvema faktorjema](Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_s_transpozicijo Reprogramiranje s transpozicijo] (Barbara Dušak, Sara Lorbek) <br /> # Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)<br /> # Tumorigenost iPSC (Urška Navodnik, Ana Remžgar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_miRNA Reprogramiranje z miRNA] (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pregled_in_prihodnost_postopkov_za_pripravo_iPSC Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC] / (Aleksander Benčič, Jernej Pušnik)<br /> # Kombiniranje tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic in genskih modifikacij pri zdravljenju mišične distrofije (Urška Rauter)<br /> <br /> <br /> Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]] <br /> <br /> Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_celic&diff=7934 2013-03-20T15:19:02Z

<p>Suzana Semič: /* Skupine */</p> <hr /> <div>Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.<br /> <br /> V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.<br /> <br /> <br /> <br /> Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min.<br /> <br /> Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.<br /> <br /> Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion'). <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled<br /> # Epigenetsko reprogramiranje - pregled<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369<br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767<br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html<br /> # Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html<br /> # Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/<br /> # Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/<br /> <br /> <br /> == Skupine ==<br /> <br /> <br /> Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme): <br /> <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic<br /> # Epigenetsko reprogramiranje<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami <br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) <br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela, Zala, Ajda)<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Dejan Marjanovič, Suzana Semič)<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema <br /> # Reprogramiranje s transpozicijo <br /> # Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)<br /> # Tumorigenost iPSC (Urška Navodnik, Ana Remžgar)<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Urška Rauter)<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/<br /> <br /> <br /> Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]] <br /> <br /> Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_celic&diff=7933 2013-03-20T15:18:48Z

<p>Suzana Semič: /* Skupine */</p> <hr /> <div>Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.<br /> <br /> V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.<br /> <br /> <br /> <br /> Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min.<br /> <br /> Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.<br /> <br /> Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion'). <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled<br /> # Epigenetsko reprogramiranje - pregled<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369<br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767<br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html<br /> # Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html<br /> # Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/<br /> # Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/<br /> <br /> <br /> == Skupine ==<br /> <br /> <br /> Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme): <br /> <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic<br /> # Epigenetsko reprogramiranje<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami <br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) <br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela, Zala, Ajda)<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Dejan Marjanović, Suzana Semič)<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema <br /> # Reprogramiranje s transpozicijo <br /> # Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)<br /> # Tumorigenost iPSC (Urška Navodnik, Ana Remžgar)<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Urška Rauter)<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/<br /> <br /> <br /> Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]] <br /> <br /> Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_celic&diff=7932 2013-03-20T15:18:35Z

<p>Suzana Semič: /* Skupine */</p> <hr /> <div>Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.<br /> <br /> V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.<br /> <br /> <br /> <br /> Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min.<br /> <br /> Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.<br /> <br /> Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion'). <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled<br /> # Epigenetsko reprogramiranje - pregled<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369<br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767<br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html<br /> # Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html<br /> # Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/<br /> # Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/<br /> <br /> <br /> == Skupine ==<br /> <br /> <br /> Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme): <br /> <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic<br /> # Epigenetsko reprogramiranje<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami <br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) <br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela, Zala, Ajda)<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice /(Dejan Marjanović, Suzana Semič)<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema <br /> # Reprogramiranje s transpozicijo <br /> # Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)<br /> # Tumorigenost iPSC (Urška Navodnik, Ana Remžgar)<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Urška Rauter)<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/<br /> <br /> <br /> Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]] <br /> <br /> Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Povzetki_seminarjev_2012&diff=7480 2012-12-21T22:54:16Z

<p>Suzana Semič: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 */</p> <hr /> <div>== Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 ==<br /> Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2012 stran]<br /> <br /> ===Griša Prinčič: Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice ===<br /> <br /> S pomočjo EM je bilo mogoče podrobneje prepoznati in opisati tip III sekrecijski sistem in njegove komponente. Identificirali so vsaj pet različnih strukturnih komponent, njihovo proteinsko sestavo in delovanje.Več kot 20 različnih proteinov (YopD, YopB, YscF, YscP, YscR, YscS, YscT, YscU, YscV...) je potrebnih za učinkovito funkcioniranje T3SS-a, od katerih jih veliko kaže sekvenčno podobnost pri različnih vrstah. T3SS je sestavljen iz: igelnega dela , ki sestoji iz sekvenčno različnega proteina in tvori zvonasto ali filamentozno strukturo, zunajmembranskega kompleksa, znotrajmembranskega kompleksa in regulatornih komponent.<br /> <br /> Efektorji, ki jih bakterija »dostavi« v celico modulirajo različne signalne poti. Blokirajo lahko MAPK in MAPKK (ospF, YopJ), kar zavre imunski odziv celice in prepreči vnetne procese. Pospešijo ali upočasnijo ubiquitinacijo (Cif in CHBP), za kar koristnost in učinkovitost še ni znana. Blokirajo majhne GTP-aze (IbpA), kar povzroči spremembe v aktinskem citoskeletu in moten membranski transport. Nekatere bakterije se v gostiteljski celisi razmnožujejo s pomočjo vakuol. SifA in SseJ sta bakterijska proteina, ki omogočata učinkovito tvorjenje tovrstnih struktur. Nekateri efektorji motijo tudi sintezo maščobnih kislin, nekateri poškodujejo pomembne celične strukture kot je na primer golgijev aparat. Vsi bakterijski efektorji delujejo na principu kovalentne modifikacije, torej trajno spremenijo strukturo in s tem inaktivirajo proteine – preprečijo kaskadno verigo.<br /> <br /> ===Erik Janežič: Hippo signalna pot in matične celice ===<br /> <br /> <br /> Hippo signalna pot je ena glavnih regulatornih sistemov, ki preprečujejo tumorogenezo, nadzorujejo rast organov in sodelujejo pri diferneciaciji in vzdrževanju stalne gostote zarodnih celic. Hippo, drugače imenovana tudi Salvador/warts/hippo (SWH), je dobila takšno ime, ker mutacije v mehanizmu peljejo do preraščanja tkiva, kar lahko s tujko imenujemo »Hippopotamus «like phenotype. Prvič je bila opazovana v vinski mušici Drosophilia in večina ključnih raziskav je potekala prav na tem modelnem organizmu. Znanje pridobljeno z opazovanjem mehanizma mušic pa lahko direktno prenesemo tudi na lastnosti Hippo signalizacije sesalcev. Študije so namreč pokazale, da imajo vse ključne komponente pri mušici direktne ortologe v sesalcih in drugih organizmih. Smiselen se zdi sklep, da je bila Hippo signalna pot v veliki meri takšna kakor jo poznamo danes, prisotna že v prvih večceličnih organizmih,kar je tudi logično saj je pravilna diferenciacija in usmerjanje celic ključnega pomena za nastanke funkcionalnih celičnih enot (organov). <br /> V preteklem desetletju s številne raziskave s Hippo področja zagotovile dobro poznavanje osrednje kinazne kaskade, katere funkcija je inaktivacija oziroma aktivacija YAP/TAZ transkripcijskih kofaktorjev proteinov družine TEA. Pri Hippo signalizaciji poleg osrednje kaskade sodelujejo tudi številni membranski in citoskeletni proteini, ki imajo veliko funkcij tudi pri kontaktni inhibiciji. Ogromno eksperimentalnih dokazov kaže neposredno povezanost nepravilnega delovanja Hippo signalizacije in nastankom raka, kar je verjetno razlog za intenzivne raziskave na tem področju v današnjem času.<br /> <br /> <br /> ===Dejan Marjanovič: Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov===<br /> <br /> <br /> Vimentina, glavni predstavnik intermediarnih filamentov (IF) , je izražen v normalnih mezenhimskih celicah, in je znano, da ohrani celovitost celic in zagotavlja odpornost proti stresu. Povečano koncentracijo vimentina, so poročali v različnih rakavih epitelih, vključno raka prostate, tumorjev prebavil, tumorjev centralnega živčnega sistema, raka dojke, pljučnega raka in druge vrste raka. Prekomerno izražanje vimentina v raku je povezano tudi z večjo rastjo tumorja, vendar je vloga vimentina v napredovanju raka še vedno nejasna.<br /> Na podlagi njegovega prekomernega izražanja v rakavih obolenjih in njegovo vlogo pri posredovanju v različnih tumorgenih dogodkih, vimentin služi kot privlačen cilj za zdravljenje raka. Poleg tega naj bi raziskave, usmerjene k pojasnjevanju vloge vimentina v različnih signalnih poteh, odpirale številne nove pristope za razvoj obetavnih zdravil za zdravljenje.<br /> <br /> Ker pa je moje širše področje signalizacija,se bom bolj podrobno usmeril za signalizacijske poti, razjasnitev številnih mehanizmov in vmesnih sodelujočih proteinov, encimov itd. Vimentin je znan po tem, da interagira z velikim številom proteinov in sodeluje v različnih celičnih funkcijah. Poleg tega vimentin sodeluje tudi v številnih drugih procesih, ki vključujejo oblikovanje kompleksov z več signalnimi molekulami in drugimi proteini. <br /> <br /> Iz te študije je razvidno, da vimentin ne deluje le kot ogrodni protein, temveč tudi posreduje pri večih poteh sporočanja in v celičnih procesih. Prav tako bi bilo zanimivo izvedeti, druge funkcije vimentina v jedru in morebitne vloge pri posredovanju v procesih celičnega cikla. Poleg tega bi lahko zunajcelični vimentin sodeloval pri posredovanje pri več signalnih procesih z vezavo na specifične receptorje, ki jih je treba še raziskati.<br /> <br /> <br /> ===Estera Merljak: Vpliv PKM2 na rakave celice===<br /> <br /> <br /> Piruvat kinaza M2 (PKM2) ima zelo pomembno vlogo pri rakavih celicah. je ena izmed oblik piruvat kinaze, ki katalizira pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat, pri čemer se fosfatna skupina iz PEP prenese na ADP ter s tem dobimo ATP. PKM2 je v izražena v celicah, ki se hitro delijo, kot so zarodne in rakave celice. Izražanje omogoča veliko transkripcijskih faktrojev, posebno pomembni pa so transkripcijski faktorji iz družine heterogenih jedernih ribonukleoproteinov (hnRNPs), ki dajejo prednost sintezi PKM2 z neposrednim vplivanjem na mRNA. <br /> Vpliv PKM2 na celičen metabolizem je zelo pomembna, saj lahko v celici prehaja med neaktivno dimerno obliko in aktivno tetramerno obliko, kar privede do različnih produktov. Aktivnost PKM2 je regulirana s strani mnogih snovi, med drugim intermediatov glikolize, ki lahko povečajo ali zmanjšajo aktivnost piruvat kinaze M2. Prav tako na aktivnost vplivajo razne post-translacijske spremembe aminokislin v samem proteinu, ki so rezultat kompleksnih reakcij v celici. S takimi procesi celica regulira sintezo energije in sintezo drugih prekurzorjev za množitev celic. <br /> Poznavanje teh procesov ima velik medicinski pomen, saj lahko pripelje do oznajdbe specifičnih zdravil za zdravljenje raka, ki bi napadale in uničile le rakave celice, zdravih pa ne.<br /> <br /> <br /> ===Maja Kostanjevec: Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah===<br /> <br /> <br /> Glukoza je pomemben vir energije, ki ureja marsikatero metabolno pot. Njena vloga se razlikuje od celice do celice glede na to, kakšne naloge opravlja. Posledično so se v evoluciji razvili različni mehanizmi njenega zaznavanja in prenosa signalov. <br /> <br /> Preučevanje zaznavnih mehanizmov glukoze je zapleteno, saj ima poleg hranilne vloge tudi signalno, ki pa jo včasih težko ločimo od ostalih procesov, v katerih sodeluje. Trenutno so najbolj raziskani mehanizmi v kvasovkah, saj gre za najenostavnejše evkarionte. V njih so odkrili štiri različne signalne poti: glavno represivno pot, cAMP pot ter inducirani poti, ki sta odvisni od senzorjev Snf3 in Rgt2 oz. od fosforilacije.<br /> <br /> Veliko bolj zahtevna je regulacija glukoze v rastlinah. V njih skrbi za izražanje različnih genov, ki urejajo procese fotosinteze, metabolizma, rasti… V modelni rastlini Arabidopisis thaliana so bili raziskani trije različni mehanizmi zaznavanja. Prvi je odvisen od heksokinaze in represira fotosintetske gene, drugi je od heksokinaze neodvisen in vsebuje še neznan receptor ter tretji, ki temelji na procesu glikolize in njenih vmesnih produktov.<br /> <br /> Zaznavanje glukoze pri sesalcih ima posebne lastnosti, ki se razlikujejo tako od tistih v kvasovkah kot v rastlinah. Ti mehanizmi so najbolje preučeni v beta celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke, ki skrbijo za izločanje inzulina. Znano je, da je pri tem potreben obsežen metabolizem glukoze, kot glavni mediator pa nastopa ATP.<br /> <br /> ===Julija Mazej: Metabolizem glukoze v živčnih celicah===<br /> <br /> Glukoza je preferenčno gorivo za možganske celice. Čeprav možgani predstavljajo le 2% celotne telesne mase, za svoje delovanje porabijo kar 25% zaužite glukoze. Možganske celice lahko kot energijski substrat uporabijo tudi: laktat, piruvat, glutamin in glutamat. Kakršnakoli ovira pri energijski oskrbi, je zelo rizična in se lahko konča z nezavestjo ali celo komo v manj kot 10 sekundah. V izogib takšnemu izidu so nekatere celice sposobne nadomestiti primanjkljaj energije oz. ATP z intenzivnejšo glikolizo. To velja za nevroglijalne celice, ki z glikolizo proizvajajo laktat. Vendar pa povišana glikoliza nima enakega vpliva na vse živčne celice. Nevroni zaradi povišane glikolize manj glukoze oksidirajo po pentoza-fosfatni poti, ki tam sicer poteka v normalnih razmerah. Ta metabolična pot je za nevrone zelo pomembna, ker se pri pretvorbi glukoza-6-fosfata v ribozo-5-fosfat regenerira NADPH. To je pomemben antioksidant, ki regenerira reduciran glutation in tako varuje nevrone pred poškodbami, zaradi reaktivnih kisikovih spojin. Glikolizo v nevro celicah stimulirajo hipoksični pogoji, nevrotoksične snovi, mutacije v respiratorni verigi.. Anomalije v metabolizmu glukoze so prisotne v mnogih nevrodegenerativnih boleznih, npr. Alzheimerjevi, Parkinsonovi, Huntingtonovi bolezni. Tu se kaže aplikativen pomen raziskav povezanih z metabolizmom glukoze v možganih. Velik problem pri razumevanju metabolizma v živčnih celicah predstavljajo nepojasnjene interakcije med glija celicami in nevroni .<br /> <br /> ===Jernej Pušnik: Uravnavanje metabolizma z acetilacijo proteinov===<br /> <br /> V svoji seminarski nalogi bom predstavil pomen posttranslacijske modifikacije-acetilacije pri uravnavanju celotnega celičnega metabolizma. Kot že verjetno vsi veste, je večina reakcij, ki so del neke metabolne poti, kataliziranih z encimi. Ti pa so v osnovi proteinske makromolekule, sestavljene iz dvajsetih različnih aminokislin. Ena izmed teh aminokislin je lizin in vsebuje dve amino skupini. S prvo se povezuje v peptidno vez, druga, ki se nahaja na koncu ogljikovodikove verige pa je tarča acetilacije. Ko se acetilna skupina enkrat veže na lizinski ostanek, to povzroči določene spremembe v strukturi proteinske molekule, s tem pa se tudi spremeni encimska aktivnost. Na ta način so regulirani skoraj vsi encimi metabolizma. V seminarju sem opisal kako pride do same acetilacije in deacetilacije, da je pri tem potrebna prisotnost določenih encimov, kako se spremeni delovanje encimov delujočih v glikolizi, glukoneogenezi, citratnem ciklu, oksidaciji maščobnih kislin, oksidaciji aminokislin in ciklu sečnine. Ker je acetilacija tako razširjena modifikacija pri nadzorovanju metabolizma, imajo raziskave na tem področju velik potencial za odkritje novih terapevtskih pristopov k zdravljenju bolezni srca in ožilja, diabetesa, debelosti, itd.<br /> <br /> ===Rok Razpotnik: Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija===<br /> <br /> V dani seminarski nalogi bom predstavil osnovne lastnosti rakavih celic, tipe celic, ki se nahajajo v tumorskem mikrookolju, ter podrobneje predstavil nekatere osnovne lastnosti metabolizma rakastih celic ter njene regulacije. Mutacije onkogenov in tumor supresorskih genov povzročijo spremembe v signalizacijskih poteh, katere povzročijo spremembe metabolizma rakastega tkiva. Metabolizem deluje v prid celični rasti, intenzivni celični delitvi, zaviranju apoptoze itd. Sam metabolizem rakastih celicah temelji na treh osnovnih temeljih: povečani produkciji energije, zadostni biosintezi potrebnih makromolekul in vzdrževanju redoks stanja. Da izpolnjujejo vse tri pogoje se rakaste celice poslužujejo mnogih regulacij metabolizma, z različnimi strateškimi potmi, npr. proteoliza skeletnih mišic, lipoliza maščobnega tkiva, intratumorna simbioza med laktat-proizvajajočimi in laktat-porabnimi celicami, upočasnevanje glikolize in usmerjanje intermediatov v pentoza fosfatno pot itd. Ker pa je mikrookolje, ki obkroža rakasto tkivo zelo dinamično, je za rakaste celice značilna metabolična fleksibilnost. Raziskave in razumevanje metabolične fleksibilnosti bi doprinesle k novim možnim strategijam zdravljenja. Učinek na reguliran metabolizem rakastega tkiva, bi imel ogromen vpliv na viabilnost rakastega tkiva, saj je metabolizem sklopljen s številnimi lastnostmi rakastih celic.<br /> <br /> ===Ajda Rojc: Metabolizem skeletnih mišic===<br /> <br /> Mišice so največji porabnik energije v telesu, saj nam omogočajo vrsto različnih dejavnosti pri katerih se porablja energija. V našem telesu potekata dva različna sistema metabolizma – anaerobni in aerobni. Pri anaerobnem metabolizmu imata pomembno vlogo kreatin fosfat in glikogen. Zaloge ATP je v mišicah zelo malo, zato takoj nastopi cepitev visokoenergetskih vezi v kreatin fosfatu. Po porabi te energije se v glikolizi razgradi glikogen, ki se pri pomanjkanju kisika v mišicah namesto v piruvat, pretvori v laktat in to povzroča bolečine v mišicah. Druga vrsta metabolizma pa deluje kadar je kisika dovolj in to je aerobni metabolizem. Poleg glukoze se pri tej vrsti presnove razgrajujejo tudi maščobne kisline, ki se v β-oksidaciji reducirajo do vodika in acetil-CoA, ta pa vstopi v Krebsov cikel, kjer se proizvede energija ATP. Večja razpoložljivost maščobnih kislin vpliva na nalaganje znotrajmišičnega prostega Pi in AMP med vadbo. Pi in AMP sta odgovorna za regulacijo encima glikogen fosforilaze, ki cepi glikogen. Torej, če se njune koncentracije znižajo pride do manjšega števila cepitev glikogena na glukozo. Pri znatnem povišanju dostopnosti maščobnih kislin je glikogen fosforilaza inhibirana. To je le eden od načinov regulacije substratov v mišičnem metabolizmu. Domnevajo, da je oksidacija maščob regulirana s podobnimi faktorji (npr. adrenalin, Ca2+, ADP, AMP, Pi; AMPK, pH, acetil-CoA) kot razgradnja ogljikovih hidratov, vendar je glede tega, kako te faktorji vplivajo na regulacijo maščobnih kislin in oksidacijo maščob ter kaj je njihova vloga še veliko nejasnosti.<br /> <br /> ===Janez Meden: NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo===<br /> <br /> Celično dihanje je sestavljeno iz glikolize, citratnega ciklusa in verige za prenos elektronov. Večina energije nastane, v obliki ATP pri zadnji stopnji celičnega dihanja, torej pri prenosu elektronov skozi komplekse I, II, III, IV in nastanku ATP-ja v kompleksu V – ATP-sintazi. Zadnja stopnja pa je mogoča le v prisotnosti O2.<br /> Pa vendar življenje obstaja tudi v hipoksičnem okolju. Posebna oblika energijskega metabolizma, ki je značilno za nekatere bakterije, notranje zajedavce in školjke ter celo rakave celice je fumaratsko dihanje. Ta način metabolizma omogoča nekoliko boljši izkoristek energije. Pri njem sodelujeta le dva kompleksa I in II. Kompleks II je povezan s citratnim ciklusom – TCA in verigo za prenos elektronov. Prenašalec med kompleksoma je kvinon z nizkim redoks potencialom, kot je npr. rodokvinon pri A. suum, ali pa menakvinon, znan kot vitamin K.<br /> Z razumevanjem mehanizma fumaratskega dihanja bi lahko razvili zdravila, ki bi inhibirala ali celo onemogočila delovanje tega mehanizma. Primerna tarča novih zdravil bi lahko bila Fp podenota kompleksa II ali pa bi zdravilo lahko delovalo tudi kot kompetitivni inhibitor kvinona.<br /> <br /> ===Ana Kunšek: Večfunkcionalnost akonitaze===<br /> <br /> Akonitaza je protein, ki katalizira drugo stopnjo Krebsovega cikla, torej pretvorbo citrata v izocitrat. Vendar je tudi eden izmed &quot;moonlighting&quot; proteinov, torej proteinov, ki imajo poleg glavne tudi druge funkcije. Prav zato, ker ima toliko funkcij je njena vloga v celici še toliko bolj pomembna, nepravilno delovanje pa lahko pripelje tudi do pojava diabetesa in miopatije. <br /> <br /> Akonitaza poleg kataliziranja omenjene pretvorbe citrata v izocitrat pomaga tudi pri uravnavanju koncentracije železa v celici, stabilizaciji oz. destabilizaciji mitohondrijske DNA ter pri odgovoru na oksidativni stres. Pri uravnavanju koncentracije železa se veže na mRNA in s tem zaustavi sintezo feritina (proteina, ki veže železo) ter s tem pomaga pri uravnavanju homeostaze. Mitohondrijsko DNA destabilizira, kar ji pomaga za lažje podvojevanje, pri oksidativnem stresu pa je ključni faktor pri uravnavanju pravilnega pH-ja v celici, brez katerega encimi ne morejo pravilni delovati.<br /> <br /> Že samo s temi funkcijami smo ugotovili, da je akonitaza zelo pomembna v našem življenju, vendar verjetno še vedno ne poznamo vseh njenih funkcij, saj je odkrivanje &quot;moonlighting&quot; proteinov in njihovih ostalih funkcij zelo težko in zahteva veliko eksperimentalnega dela. Vendar bi lahko z vedenjem vseh funkcij proteinov iznašli tudi takšna zdravila, ki stranskih učinkov ne bi imela, saj bi zablokirala ali pospešila sintezo le tistega proteina, za katerega je to potrebno in ne bi s tem vplivala tudi na ostale funkcije proteina v organizmu.<br /> <br /> ===Tomaž Rozmarič: Warburg in Crabtree efekt===<br /> <br /> Znanstveniki so ugotovili, da rakave celice, kljub prisotnosti kisika, ne izvajajo aerobnih procesov. Namesto tega so se usmerile v glikolizo. Temu se reče Warburg efekt. Kaj so rakave celice s tem pridobile, še ni čisto raziskano. Obstajajo pa hipoteze, da so zaradi tega veliko bolj invazivne, se sposobne deliti pri nizkih koncentracijah kisika in se izogniti apoptozi. Warburgov efekt je reguliran na večih stopnjah metabolne poti, s prekomerno izraženimi in prekomerno aktivnimi encimi, ki vzpodbujajo glikolizo ter inhibicijo proteinov, ki spodbujajo aerobni metabolizem.<br /> Zraven Warburgovega efekta poznamo še Crabtree efekt. Ta mehanizem rakavi celici omogoča preklop na aerobni metabolizem pri pomanjkanju glukoze in obratno pri velikih koncentracijah. Brez poznavanja obeh mehanizmov in prekinitvi obeh hkrati je uspešnost zdravljenja raka zelo majhna. <br /> Znanstveniki so našli vrsto kvasovke, ki ima skoraj identični metabolizem, kot ga ima rakava in je Crabtree pozitivna. Pri nizkih koncentracijah glukoze izvaja anaerobni metabolizem, v prisotnosti visoke koncentracije pa aerobni. Zaradi navedenih lastnosti je idealna za študijo rakavih celic.<br /> Ko bodo znanstveniki natančno proučili Warburg in Crabtree efekt, se bodo lahko razvila tarčna zdravila, katera bi bistveno izboljšala kakovost našega življenja.<br /> <br /> <br /> ===Erik Mršnik: Adrenolevkodistrofija===<br /> <br /> X-vezana adrenolevkodistrofija je precej redka bolezen, ki pa ima zelo hude posledice. Te v večini primerov vodijo v zgodnjo smrt. Z razumevanjem biokemijskega in genetskega ozadja te bolezni so v zadnjih letih naredili velik korak naprej v odkrivanju in preprečevanju te bolezni. <br /> V osnovi gre za napako (mutacije so v večini primerov dedne - 90 %) na genu ABCD1, kar se odraža na ALDP (adrenolevkodistrofični protein), ki je peroksisomalni transportni protein. Če ne deluje, je otežena oziroma onemogočena β-oksidacija VLCFAs (dolgih maščobnih kislin), ki se nabirajo v tkivih in povzročajo velike težave v delovanju možganov in živčevja ter nadledvične žleze. Bolezen se odraža v različnih fenotipih, ki prizadenejo predvsem moške (otroke in moške srednjih let), ženske so navadno le prenašalke, lahko pa se tudi pri njih izrazijo blažji simptomi. Če se bolezen odkrije že v zgodnji fazi, je možnost pomoči večja. Predvsem uspešna je presaditev krvotvronih matičnih celic. Velikokrat pregledajo že dojenčke (t.i. newborn screening), za katere vejo (zaradi dednosti), da so podvrženi tej bolezni, kar bistveno pripomore k pravilnemu pristopu pri izbiri terapije.<br /> <br /> ===Katja Leben: Tia-maščobne kisline===<br /> <br /> Tia-maščobne kisline so umetno sintetizirane nasičene maščobne kisline, ki se od ostalih razlikujejo po vsebnosti heterogenega žveplovega atoma. Zaradi posebnega metabolizma – žveplov atom preprečuje za maščobe običajno β-oksidacijo – in zadostnih podobnosti z naravnimi maščobnimi kislinami so nekatere tia-maščobne kisline široko farmakološko uporabne, saj imajo veliko različnih aplikativnih vplivov na bio sisteme.<br /> <br /> Katabolizem tia-maščobnih kislin do β-oksidacije poteka običajno, ko pa se žveplov atom približa aktivnemu mestu se proces ustavi. Pri 4-tiamaščobnih kislinah pride do inhibicije drugega encima v obratu β-oksidacije, kar negativno vpliva na metabolizem maščobnih kislin, med tem, ko 3-tia-maščobne kisline sploh ne morejo vstopiti v β-oksidacijo in se razgradijo po ω-oksidativni poti. Vse sode nasičene tia-maščobne kisline se po nekaj obratih β pretvorijo v 4-tia-maščobne kisline, zato tudi reagirajo enako, vse lihe nasičene tia-maščobne kisline pa se z β-oksidacijo lahko pretvorijo v 3-tia-maščobne kisline in nato reagirajo enako.<br /> Zaradi posebnega metabolizma so tia-maščobne kisline uporabili tudi za proučevanje delovanja in regulacijie različnih celičnih procesov povezanih z metabolizmom lipidov. Njihov vpliv je močno odvisen od lege žveplovega atoma v ogljikovem skeletu. Tako 4-tia-maščobne kisline zavirajo oksidacijo maščobnih kislin, 3-tia-maščobne kisline pa jo pospešujejo, kar je zaželjeno pri regulaciji bolezenskih stanj, ko je v celici povečana količina maščobnih kislin.<br /> <br /> Biološki odzivi na tia-maščobne kisline obsegajo vpliv na transkripcijski faktor PPARα (peroksisom proliferator aktiviran receptor), mitohondrijsko proliferacijo, antiadipoznost, antioksidativne lastnosti, zmanjšanje proliferacije hitro delečih se celic in celično diferenciacijo. Zadnje raziskave kažejo, da tia-maščobne kisline niso škodljive za naš organizem tudi ob dolgotrajnem uživanju in bi se torej lahko uporabljale kot zdravila.<br /> <br /> ===Ana Cirnski: Peroksisomalna razgradnja maščobnih kislin===<br /> <br /> Maščobne kisline se razgrajujejo do enostavnejših snovi v procesu, imenovanem β-oksidacija. Ta poteka v mitohondriju, pa tudi v peroksisomu. Peroksisomalna in mitohondrijska β-oksidacija se poleg kraja, kjer poteka razgradnja, razlikujeta še v encimih, ki reakcije katalizirajo in v substratih, ki se oksidirajo.<br /> <br /> Rastline razgrajujejo tudi take maščobne kisline, ki jih živali in ljudje ne moremo. Za razliko od nas, lahko maščobne kisline popolnoma razgradijo (saj so peroksisomi edino mesto razgradnje), mi pa v peroksisomih razgrajujemo le zelo dolge maščobne kisline do ustreznih intermediatov, ki se dokončno razgradijo v mitohondriju.<br /> <br /> Oksidacija nenasičenih maščobnih kislin v višje razvitih rastlinah je pomembna za proizvodnjo mnogih spojin, med njimi so bioaktivne molekule, imenovane oksilipini. Mednje spadajo tudi jasmonska kislina in njeni derivati, ki so pomembne signalne molekule in sodelujejo pri obrambi, komunikaciji, signalizaciji in odgovoru na različne biotske in abiotske stresorje. Povzročajo tudi staranje rastline in odpadanje listov.<br /> <br /> Jasmonska kislina se sintetizira v oktadekanojski poti iz α-linolenske kisline (18:3). Pretvorba se začne v kloroplastu, kjer se pretvori v 12-okso-fitodienojsko kislino (OPDA). Ta potuje v peroksisom, kjer nastane oksofitoenojska kislina (OPC:8), ki vstopi v β-oksidacijo in se oksidira v jasmonsko kislino.<br /> <br /> Danes se jasmonska kislina in njeni derivati že uporabljajo v aplikativni znanosti.<br /> <br /> ===Zala Gluhić : Hiperamoniemija===<br /> <br /> Hiperamoniemija je povišana koncentracija v krvi raztopljenega amoniaka. Lahko je posledica motene presnove v ciklu sečnine (na primer zaradi nepravilnega delovanja katerega izmed encimov) – ali pa gre za pridobljeno motnjo zaradi jetrnih bolezni (npr. jetrna odpoved). <br /> Amoniak je še posebno škodljiv za možgane. V krvi raztopljen amoniak prestopa možgansko-žilno pregrado in kadar je njegova koncentracija previsoka, lahko pride do nepopravljive škode pri razvoju centralnega živčnega sistema ali do možganskega edema. Ker v možganih ni vseh za cikel sečnine potrebnih encimov, imajo glavo nalogo pri odstranjevanju odvečnega amoniaka astrociti, vrsta nevroglijskih celic. Koncentracije uravnavajo s pomočjo sinteze glutamina. V primeru hiperamoniemije pride v njih do številnih morfoloških sprememb in sprememb v izražanju različnih proteinov (npr. spremembe v aktivnosti prenašalcev EAAT1 in 2, izražanju GFAP proteinov itd.). Prekomerno sintezo glutamina je mogoče uravnavati z MSO (metionin sulfoksimidom).<br /> <br /> ===Bojana Lazović : Novi farmakološki šaperoni za zdravljenje fenilketonurije===<br /> <br /> Fenilketonurija (PKU) je redka avtosomno recesivna genska bolezen do katere pride, če je okvarjen jetrni encim fenilalanin-4-hidroksilaza (PAH), ki je odgovoren za pretvorbo fenilalanina v tirozin. Ker tako ne more prihajati do razgradnje fenilalanina, se le ta akumulira v telesu in spremeni v fenilpiruvat. To ima toksičen učinek na telo, posebej možgane, saj se pri teh bolnikih lahko razvije težka umska zaostalost. Bolniki se lahko temu izognejo tako, da se že od rojstva držijo stroge diete, po kateri se lahko prehranjujejo le z nebeljakovinsko hrano (sadje in zelenjava). Ostale esencialne aminokisline dobijo v obliki praška, ki vsebuje vse AK razen fenilalanina. Toda raziskave kažejo, da taka dieta pogosto vodi v podhranjenost in psihološke težave bolnikov. Pred nekaj leti je na tržišče prišlo zdravilo Kuvan oz. sintetični naravni kofaktor encima PAH, katerega pomanjkanje je lahko razlog bolezni. Njegova draga sinteza in pri določenih genotipih PKU, slaba učinkovitost, pa je znanstvenike spodbudila k iskanju novih sintetičnih kofaktorjev encima PAH, ki hkrati delujejo kot farmakološki šaperoni. V raziskavi, ki jo opisujem so odkrili dva nova farmakološka šaperona primerna za zdravljenje PKU.<br /> <br /> ===Matic Kovačič : Sirtuin 3 ob dieti spodbuja cikel sečnine in oksidacijo maščobnih kislin ===<br /> Pri dieti ali stradanju pridobimo s hrano veliko manj ali nič energije, zato mora telo dobiti iz svojih zalo, kar naredi z metabolizmom aminokislin in maščobnih kislin. Pri oksidaciji aminokislin dobimo amoniak, ki se mora zaradi svoje toksičnosti v ciklu sečnine pretvoriti v sečnino. V seminarski nalogi bom predstavil vpliv proteina Sirtuin 3 (Sirt3) na povečano delovanje cikla sečnine in metabolizma maščobnih kislin. Sirt3 je encim deacetilaza, ki se nahaja v mitohondriju in s svojim delovanjem vpliva na veliko mitohondrijskih encimov. Mutacije ali odsotnost tega proteina ima za organizem smrtne posledice, zaradi nepravilnega delovanja cikla sečnine in tudi drugih procesov. Povedal bom še nekaj o napaki cikla sečnine, ki jo povzroči pomanjkanje encima ornitin transkarbamoilaze in kakšne posledice ima lahko to na organizem.<br /> <br /> ===Špela Tomaž: Inhibicija fotosinteze===<br /> Čeprav je svetloba bistvena za reakcije fotosinteze, ima nanje tudi uničujoče učinke. Predvsem sta inhibiciji fotosinteze izpostavljena fotosistema II in I, pri katerih lahko intenzivne osvetlitve povzročijo strukturne in funkcijske okvare. Ena izmed aktualnih hipotez o mehanizmu fotoinhibicije fotosistema II (PSII) predvideva dvostopenjski sistem. V prvem koraku je udeležen kompleks, ki v fotosintezi cepi vodo (OEC) – z absorpcijo svetlobe nizkih valovnih dolžin pride do njegovih poškodb, ki omogočijo drugi korak inhibicije. V tem delu se inhibira reakcijski center fotosistema, na kar vpliva svetloba daljših valovnih dolžin. Posledično se tvorijo škodljive reaktivne kisikove spojine (ROS). Proces svetlobnega delovanja sproži popravljalne mehanizme poškodovanih struktur. Fotoinhibicija PSII je pogosta, saj so fototrofi čez dan razmeroma konstantno osvetljeni. Popravljalni cikel PSII je tako pogosto aktiviran in skrbi za to, da ne pride do ustavitve fotosinteze. ROS zavirajo obnovitev aparatov in so na nek način glavni krivci okvar zaradi fotoinhibicije. Sodelujejo tudi v inhibiciji fotosistema I (PSI), ki pa je dosti redkejša in je pogojena s posebnimi razmerami. Njegova regeneracija ni najbolj učinkovita, zato je njegova okvara toliko bolj usodna. Seveda pa so fototrofi razvili mnoge mehanizme različnih oblik, ki fotosisteme ščitijo. Fotoinhibicija je regulirana tudi z mnogimi zunanjimi in notranjimi vplivi na organizem.<br /> <br /> ===Monika Biasizzo: Mitohondrijski razklopni proteini===<br /> Oksidativna fosforilacija je sklopljen proces prenosa protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano (ob prenosu elektronov po dihalni verigi) in sintezo ATP. Mitohondrijski razklopni protein pa ta proces razklopijo s prenosom protonov nazaj v mitohondrijski matriks in s tem znižajo protonski gradient. Poznamo več različnih razklopnih proteinov (UCP), ki so si med seboj bolj ali manj podobni. Prvi odkriti je bil UCP1 – termogenin, ki ima pomembno vlogo v termogenezi in s tem pri vzdrževanju stalne telesne temperature pri sesalcih. UCP2 in UCP3 sta 60-70% homologna UCP1, vendar v celici ne opravljata funkcije termogeneze.<br /> <br /> Mehanizem prenosa protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano s pomočjo UCP še ni pojasnjen, vendar obstajajo trije predlagani modeli: flip-flop model, model s kofaktorjem in kompetetivni model.<br /> <br /> UCP2 ima pomembno vlogo pri zmanjševanju nastanka reaktivnih kisikovih spojin (ROS). Nastanek ROS je eksponentno odvisen od protonskega gradienta. UCP2 z blago razklopitvijo nekoliko zmanjša protonski gradient, tako da sinteza ATP še vedno nemoteno poteka in s tem tudi zmanjša nastanek ROS. UCP3 je pristonem predvsem v skeletnih mišicah, kjer ima prav tako kot UCP2 pomembno vlogo pri zmanjševanju nastanka ROS, še posebej med športno aktivnostjo.<br /> <br /> Regulacija UCP poteka na več različnih nivojih. Aktivnost UCP je regulirana z manjšimi molekulami, kot no di- in trinukleotidi (npr. GDP), ki inhibirajo UCP in maščobnimi kislinami, ki UCP aktivirajo. Regulacija pa poteka tudi na nivoju razgradnje, za katero predvidevajo, da poteka s citosolnim proteosomom, vendar mehanizem še ni pojasnjen.<br /> <br /> ===Nastja Pirman: Mitohondrij, center celične apoptoze===<br /> Mitohondrij je organel vrvohodec, ki izvaja tako življenske kot smrtne funkcije. Njegova najpomembnejša lastnost je membranska prepustnost, ki odloča, ali se bodo procesi pričeli izvajati v korist ali škodo celice. Na mitohondrijevo odločitev vplivajo inter- in intracelularni faktorji in kot njihova podmnožica tudi stresi.<br /> Ko stres preseže mejo, se sproži eden od treh tipov programirane smrti: apoptoza, avtofagija (ki ne vodi nujno do smrti) in nekroza. Osredotočimo se na človeško apoptozo, kjer družina Bcl-2 proteinov z značilnim BH zaporedjem prejema z apoptozo povezane signale. Deli se na antiapoptotske in proapoptoske proteine, ki z medsebojno kombinacijo in z multimerizacijo posredujejo sporočilo mitohondrijskim ionskim kanalom.<br /> Če signal narekuje apoptozo, se bosta z apoptozo povezana kanala MAC in mPTP široko odprla, spustila Cyt c v citosol in depolarizirala membrano. Koncentracija kalcija sodeluje s procesom. V tem kjučnem koraku se porušita membranski potencial in metabolizem.<br /> Kaspaze-9 v kompleksu z Apaf1 in izpuščenim Cyt c (apoptosom) tačas v citosolu začnejo s kaskadno proteolitsko aktivacijo citosolnih proteinov. <br /> Apoptotski mehanizem ni popoln. Napake povzročijo raka ali bolezenska stanja, ki jih ne bomo mogli zavreti z učinkovinami, dokler ne poznamo vseh povezav med deli mehanizma.<br /> <br /> ===Barbara Dušak: Sinteza bakterijske celične stene ===<br /> Bakterijske celična stena je sestavljene iz peptidoglkianskih verig, ki se med seboj povezujejo s kratkimi peptidi. Peptidoglikan je veriga N-acetilglukozamina in N-acetilmuramične kisline, povezanih z β(1,4)-glikozidno vezjo, N-acetilmuraminska kislina pa ima vezan še peptid. <br /> <br /> Sinteza stene je kompleksen proces, ki poteka v treh delih. Najprej se v citosolu sintetizirajo osnovne komponente stene, reakcije katalizirajoi encimi družine Mur. Nato pride do vezave komponent na undekaprenil fosfat in transporta preko membrane, na koncu pa še do sinteze peptidoglikana in vgradnje v že obstoječo celično stene. Verige nastajajo v procesu transglikozilacije, peptidne povezave pa v procesu transpeptidacije. Ta dva procesa katalizirajo encimi družine PBP (penicillin binding proteins), ki se delijo v več razredov glede na katiltično aktivnost in velikost. <br /> Za vgradnjo nove verige v celično steno, se morajo nekatere vezi tudi razcepiti, za kar so potrebne še dodatne hidrolaze, rast celične stene pa poleg vseh teh encimov uravnava tudi citoskelet, ki določa obliko celice. Obstaja tudi več teorij, kako naj bi vgradnja potekala, temlejiijo pa na tem, da se trdnost stene med samim procesom ne sme zmanjšati.<br /> <br /> ===Matej Vrhovnik: Biosinteza škroba, saharoza kot substrat za sintezo zelo razvejanih komponent škroba ===<br /> Škrob je rastlinski rezervni polisaharid, za živa bitja pa eden izmed glavnih virov ogljikovih hidratov v hrani, hkrati pa je zelo lahko razgradljiv. Nahaja se v kloroplastih, kjer se skladišči le za kratek čas, da poteši energijske potrebe rastline, ko fotosinteza ne poteka, ali v amiloplastih za daljše obdobje. Zgrajen je iz glukoz, ki se povezujejo z α(1-4)glikozidno vezjov amilozo in iz amilopketina α(1-6) vezi med razvejitvami. Nastane iz odvečnih energijsko bogatih molekul, ki se ustvarijo pri fotosintezi. Na ta način rastlina shrani energijo oziroma energijsko bogate molekule za prihodnje generacije. Škrob sintetizira škrobosintaza, ki lahko nalaga glukoze na nereducirajoči konec verige, lahko pa tudi na reducirajoči, polisahardi pa nastaja tako, da se na dekstrin, oziroma verigo glukoz pripenjajo nove ADP-glukoze. Sinteza je uravnavana z ADP-glukoza pirofosforilazo. Od vsake vrste rastlin posebi je odvisno kakšen škrob nastaja v njej, zelo se razlikujejo v razmerju amiloza:amilopektin, % razvejanosti in dolžini stranskih verig. V raziskavi so odkrili, da je vir glukoze za škrob lahko tudi saharoza. Ta kot substrat vpliva na obliko molekul škroba: molekule amilopektina so veliko bolj razvejane, pri razpadu škroba ob prisotnosti encima α-amilaze pa ostajajo zelo dolgi skupki α-omejeni dekstrini, ki se ne morejo razgraditi. <br /> Molekule škroba se ob prisotnosti pravih encimov in proteinov začnejo zvijat v dvojne helikse, ti pa so sestavljeni skupaj v urejene enote, ki sestavljajo škrobno zrno.<br /> <br /> ===Jakob Gašper Lavrenčič: Sinteza rastlinske celične stene===<br /> Rastlinaska celična stena je najpogostejši biomaterial na svetu, gradijo jo predvsem polisaharidi, izmed katerih prevladuje predvsem celuloza. Sinteza strukturnih polisaharidov poteka z vezavo sladkornih enot na nastajajočo verigo z α(1-4) glikozidno vezjo, s pomočjo večjih encimskih kompleksov. V zadnjih letih je prišlo do večjih prebojev v razumevanju delovanja teh encimov in načina odlaganja nastajajočih polisaharidov na celično plazmalemo. <br /> Celuloza je linearni polisaharid, ki predstavlja osnovno ogrodje rastlinskih celičnih sten. Celulozne verige so med seboj povezane z hemicelulozo in pektinom, kar povečuje trdnost in odpornost celične stene. Celulozne verige se med seboj povezujejo v mikrofibrile, s tem povečajo svojo trdnost. Sinteza celuloze poteka z pomočjo membranskega encimskega kompleksa znanega kot rozetni terminalni kompleks (RTC), ki se nahaja na celični plazmalemi. Čeprav je bil odkrit v 70-ih letih prejšnjega stoletja so do večjih prebojev v razumevanju njegove strukture in delovanja prišli komaj v zadnjem desetletju. Kljub temu ostajaj še veliko neznanega o poteku sinteze celuloze in njenemu vgrajevanju v celično steno.<br /> Za razliko od celuloze so pektini in hemiceluloze zelo razvejane molekule, katerih sinteza poteka v Golgijevem aparatu. Njihova naloga je, da zamrežijo celulozne mikrofibrile med seboj in z drugimi komponentami celične stene, kot so lignini. Njihova sinteza še ni povsem znana, zato je predmet različnih raziskav.<br /> <br /> ===Mirjana Malnar: Vloga PPAR in leptina v metabolizmu lipidov===<br /> Metabolizem lipidov je lahko reguliran na ravni izražanja genov. Pri tem so pomembni receptorji, aktivirani s proliferatorjem peroksisomov (PPAR). To so od liganda odvisni transkripcijski faktorji, ki glede na vnos hrane/energije regulirajo izražanje genov, ki kodirajo encime odgovorne za metabolizem vnesenih energetskih molekul. Primeri so PPARα, ki stimulira katabolizem lipidov in PPAR, ki stimulira sintezo lipidov ter adipogenezo. Glede na količino nastalega maščobnega tkiva, to izloča hormone, torej deluje kot endokrini organ. Ti hormoni se imenujejo adipokini. Primer je leptin, ki vpliva na center za apetit v hipotalamusu. S tem regulira vnos hrane v organizem. Pomemben je tudi pri preprečevanju debelosti, ker zmanjša učinkovitost signala inzulina na maščobno tkivo in na ta način prepreči lipogenezo po obroku. Leptin posredno pospeši oksidacijo maščobnih kislin in nastanek ketonskih telesc, zavre pa lipogenezo, sintezo TG in holesterola. Poleg tega leptin stimulira delovanje PPARα in PPAR, ti pa povečajo sintezo vezavnih proteinov maščobnih kislin (FABP). Ti proteini prenašajo maščobne kisline do raznih organelov, odvisno od namena – v mitohondrije, kjer se oksidirajo, do ER, kjer poteka reesterifikacija, do lipidnih kapljic, ki služijo shranjevanju. <br /> Če pride do okvare v mehanizmu delovanja PPAR ali leptina so lahko posledice različne bolezni. Primeri takih bolezni so metabolni sindrom, dislipidemija, inzulinska rezistenca, debelost, diabetes. PPAR so vse bolj aktualne tarče za zdravljenje teh bolezni.<br /> <br /> <br /> ===Samo Zakotnik:Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin in njihova vloga===<br /> V svojem seminarju bom govoril o sintezi n vlogi PUFA - polyunsaturated fatty acid. Gre za biološko zelo pomembno skupino maščobnih kislin. PUFA so ključne za pravilno delovanje celičnih membran, so pomembni prekurzorji za signalne molekule, kot so fosfotidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2), jasmonska kislina in steroidni hormoni. Za človeka sta α-linolenska kislina in linolna kislina esencialni kislini, saj ju ne more sintetizirati sam. Glavni vir PUFA so morski sadeži, ki pa zaradi onesnaževanja in prekomernega izlova izginjajo. Posledično številne raziskovalne skupine iščejo alternativni vir sinteze PUFA. Kot primeren kandidat so se izkazale kvasovke Saccharomyces cerevisiae, na primeru katerih bom predstavil verigo za sintezo PUFA. Na modelu rastline Arabidopsis thaliana pa bom prikazal vlogo PUFA v rastlini in posledice, kaj se zgodi, če prekinemo sintezo PUFA na različnih točkah. PUFA pa so pomembne tudi za embrionalni razvoj in za razvoj centralnega živčevja, zato jih dodajajo prehrani namenjeni dojenčkom (mleko v prahu).<br /> <br /> <br /> ===Ellen Malovrh: Hem, železo in staranje===<br /> Hem je kompleksna organska molekula, sestavljena iz protoporfirinskega obroča (heterocikličen sistem iz 4 pirolovih obročev) in koordinacijsko vezanega železovega iona. Biosinteza hema poteka v mitohondrijih in citosolu celic, v osmih encimsko kataliziranih reakcijah. Zadnjo reakcijo katalizira metaloencim ferokelataza, ki v protoporfirinski obroč vgradi Fe2+ ion. <br /> <br /> Kot proteinska prostetična skupina hem sodeluje pri številnih procesih, npr. pri prenašanju kisika in CO2, redoks reakcijah v elektronski prenašalni verigi in regulaciji celičnega metabolizma. Novo področje raziskav pa nakazuje, da je pomanjkanje hema tesno povezano tudi s procesom staranja in nevrodegenerativnimi boleznimi. Inhibicija sinteze hema v celicah povzroči zmanjšano prisotnost kompleksa IV v elektronski prenašalni verigi in posledično motnje v delovanju mitohondrijev, oksidativen stres, motnje v homeostazi železa in propadanje celic. Vse to so tudi karakteristične lastnosti staranja in Alzheimerjeve bolezni. Prihodnje raziskave na tem področju, ki bi utemeljile potek reakcij in metabolnih poti, v katerih sodelujeta hem in železo, bi morda lahko omogočile razvoj novih načinov zdravljenja pomanjkanja železa in starostnih bolezni.<br /> <br /> <br /> ===Suzana Semič: Lesch-Nyhanov sindrom===<br /> Lesch-Nyhanov sindrom ali s kratico LNS je redka dedna motnja presnove purina, ki se deduje X-vezano recesivno in se pojavlja pri enem od 380.000 osebkov moškega spola. Bolezen sta prvič prepoznala in klinično dokazala študent medicine Michael Lesch in mentor, pediater Bill Nyhan. Svoje ugotovitve sta objavila v letu 1964. <br /> Bolezen se pojavi zaradi napake v presnovi purinskih baz v reciklažni poti, povzroča pa jo pomanjkanje encima hipoksantin-gvanin-fosforibozil transferaza(GPRT). Zaradi pomanjkanja tega encima se purinski bazi gvanin in hipoksantin pretvarjata v sečno kislino, kar pa privede do hiperurikemije (zvečana koncentracija sečne kisline v krvi), uričnega artitisa, ledvičnih kamnov in odpovedi ledvic. Vse te motnje pa spremljajo še nevrološki problemi, tj. mentalna zaostalost, abnormalni gibi telesa in nagnjenost k samopoškodbam. Vzroki za kopičenje sečne kisline so dobro znani in jih je mogoče zdraviti z zdravili, kot je alopurinol. Razlogi za nevrološke motnje pa so bolj zapleteni. Študije le teh so pokazale, da gre pri LNS za zmanjšano raven dopamina v bazalnih ganglijih, vendar bo potrebno še kar nekaj raziskav o tem, kako vpliva GPRT na dopaminski sistem in zakaj se pojavijo motnje, kot so težnja k samopoškodovanju in mentalna zaostalost.<br /> <br /> <br /> ===Sara Lorbek: Glutaminska odvisnost rakavih celic===<br /> Glutamin je pogojno esencialna aminokislina, ki je za obstoj rakavih celic ključnega pomena. Ima pomembno vlogo v sintezi nukleotidov, neesencialnih aminokislin in sodeluje pri vstopu esencialnih aminokislin v celico. Poleg tega je od prisotnosti glutamina odvisna sinteza glutationa- pomembnega antioksidanta. V rakavi celici je glutamin pomemben vir energije in prekurzorjev za biosintezo celici lastnih molekul, brez katerih se ne bi mogla deliti, bi oslabela in prej ali slej propadla. Mitohondrijski encim, glutaminaza, je v rakavih celicah eden izmed najpomembnejših, zato je tudi njegova aktivnost v primerjavi z zdravimi celicami povečana. Glutaminaza katalizira reakcijo pretvorbe glutamina v glutamat. To je prva stopnja, ki je potrebna za vse nadaljne reakcije pridobivanja energije in nastanka intermediatov, ki so uporabni v različnih biokemijskih sintezah. Rakava celica mora metabolizem prilagoditi svojim potrebam po energiji in sintezi proteinov, nukleotidov,... skratka vseh biomolekul, ki jih potrebuje za preživetje in pospešeno delitev. Na prilagoditev metabolnih poti glutamina pomembno vplivajo: HIF-1, mTORC in onkogen c-Myc. Zanje je značilno, da so v rakavih celicah prisotni v višji koncentraciji oz. v aktivnejši obliki kot v zdravih celicah, njihovo delovanje sem podrobneje opisala v seminarski nalogi. Odkar so raziskovalci bolje spoznali vpliv glutamina na rast in razvoj rakavih celic, so zasnovali tudi nekaj učinkovitih terapij. Le-te temeljijo na različnih metabolnih poteh glutamina in so se izkazale za precej učinkovite v boju proti raku, kar še dodatno potrjuje nenadomestljivost glutamina v tumorskih celicah. Pomembnejše molekule, ki zavirajo rast in proliferacijo s svojim vplivom na presnovo glutamina, in njihove tarče, sem prav tako vključila v svojo seminarsko nalogo, ki vas bo prepričala, da je glutamin na mnogih področjih ena izmed najpomembnejših molekul za rakavo celico.</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Povzetki_seminarjev_2012&diff=7478 2012-12-21T20:01:35Z

<p>Suzana Semič: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 */</p> <hr /> <div>== Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 ==<br /> Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2012 stran]<br /> <br /> ===Griša Prinčič: Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice ===<br /> <br /> S pomočjo EM je bilo mogoče podrobneje prepoznati in opisati tip III sekrecijski sistem in njegove komponente. Identificirali so vsaj pet različnih strukturnih komponent, njihovo proteinsko sestavo in delovanje.Več kot 20 različnih proteinov (YopD, YopB, YscF, YscP, YscR, YscS, YscT, YscU, YscV...) je potrebnih za učinkovito funkcioniranje T3SS-a, od katerih jih veliko kaže sekvenčno podobnost pri različnih vrstah. T3SS je sestavljen iz: igelnega dela , ki sestoji iz sekvenčno različnega proteina in tvori zvonasto ali filamentozno strukturo, zunajmembranskega kompleksa, znotrajmembranskega kompleksa in regulatornih komponent.<br /> <br /> Efektorji, ki jih bakterija »dostavi« v celico modulirajo različne signalne poti. Blokirajo lahko MAPK in MAPKK (ospF, YopJ), kar zavre imunski odziv celice in prepreči vnetne procese. Pospešijo ali upočasnijo ubiquitinacijo (Cif in CHBP), za kar koristnost in učinkovitost še ni znana. Blokirajo majhne GTP-aze (IbpA), kar povzroči spremembe v aktinskem citoskeletu in moten membranski transport. Nekatere bakterije se v gostiteljski celisi razmnožujejo s pomočjo vakuol. SifA in SseJ sta bakterijska proteina, ki omogočata učinkovito tvorjenje tovrstnih struktur. Nekateri efektorji motijo tudi sintezo maščobnih kislin, nekateri poškodujejo pomembne celične strukture kot je na primer golgijev aparat. Vsi bakterijski efektorji delujejo na principu kovalentne modifikacije, torej trajno spremenijo strukturo in s tem inaktivirajo proteine – preprečijo kaskadno verigo.<br /> <br /> ===Erik Janežič: Hippo signalna pot in matične celice ===<br /> <br /> <br /> Hippo signalna pot je ena glavnih regulatornih sistemov, ki preprečujejo tumorogenezo, nadzorujejo rast organov in sodelujejo pri diferneciaciji in vzdrževanju stalne gostote zarodnih celic. Hippo, drugače imenovana tudi Salvador/warts/hippo (SWH), je dobila takšno ime, ker mutacije v mehanizmu peljejo do preraščanja tkiva, kar lahko s tujko imenujemo »Hippopotamus «like phenotype. Prvič je bila opazovana v vinski mušici Drosophilia in večina ključnih raziskav je potekala prav na tem modelnem organizmu. Znanje pridobljeno z opazovanjem mehanizma mušic pa lahko direktno prenesemo tudi na lastnosti Hippo signalizacije sesalcev. Študije so namreč pokazale, da imajo vse ključne komponente pri mušici direktne ortologe v sesalcih in drugih organizmih. Smiselen se zdi sklep, da je bila Hippo signalna pot v veliki meri takšna kakor jo poznamo danes, prisotna že v prvih večceličnih organizmih,kar je tudi logično saj je pravilna diferenciacija in usmerjanje celic ključnega pomena za nastanke funkcionalnih celičnih enot (organov). <br /> V preteklem desetletju s številne raziskave s Hippo področja zagotovile dobro poznavanje osrednje kinazne kaskade, katere funkcija je inaktivacija oziroma aktivacija YAP/TAZ transkripcijskih kofaktorjev proteinov družine TEA. Pri Hippo signalizaciji poleg osrednje kaskade sodelujejo tudi številni membranski in citoskeletni proteini, ki imajo veliko funkcij tudi pri kontaktni inhibiciji. Ogromno eksperimentalnih dokazov kaže neposredno povezanost nepravilnega delovanja Hippo signalizacije in nastankom raka, kar je verjetno razlog za intenzivne raziskave na tem področju v današnjem času.<br /> <br /> <br /> ===Dejan Marjanovič: Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov===<br /> <br /> <br /> Vimentina, glavni predstavnik intermediarnih filamentov (IF) , je izražen v normalnih mezenhimskih celicah, in je znano, da ohrani celovitost celic in zagotavlja odpornost proti stresu. Povečano koncentracijo vimentina, so poročali v različnih rakavih epitelih, vključno raka prostate, tumorjev prebavil, tumorjev centralnega živčnega sistema, raka dojke, pljučnega raka in druge vrste raka. Prekomerno izražanje vimentina v raku je povezano tudi z večjo rastjo tumorja, vendar je vloga vimentina v napredovanju raka še vedno nejasna.<br /> Na podlagi njegovega prekomernega izražanja v rakavih obolenjih in njegovo vlogo pri posredovanju v različnih tumorgenih dogodkih, vimentin služi kot privlačen cilj za zdravljenje raka. Poleg tega naj bi raziskave, usmerjene k pojasnjevanju vloge vimentina v različnih signalnih poteh, odpirale številne nove pristope za razvoj obetavnih zdravil za zdravljenje.<br /> <br /> Ker pa je moje širše področje signalizacija,se bom bolj podrobno usmeril za signalizacijske poti, razjasnitev številnih mehanizmov in vmesnih sodelujočih proteinov, encimov itd. Vimentin je znan po tem, da interagira z velikim številom proteinov in sodeluje v različnih celičnih funkcijah. Poleg tega vimentin sodeluje tudi v številnih drugih procesih, ki vključujejo oblikovanje kompleksov z več signalnimi molekulami in drugimi proteini. <br /> <br /> Iz te študije je razvidno, da vimentin ne deluje le kot ogrodni protein, temveč tudi posreduje pri večih poteh sporočanja in v celičnih procesih. Prav tako bi bilo zanimivo izvedeti, druge funkcije vimentina v jedru in morebitne vloge pri posredovanju v procesih celičnega cikla. Poleg tega bi lahko zunajcelični vimentin sodeloval pri posredovanje pri več signalnih procesih z vezavo na specifične receptorje, ki jih je treba še raziskati.<br /> <br /> <br /> ===Estera Merljak: Vpliv PKM2 na rakave celice===<br /> <br /> <br /> Piruvat kinaza M2 (PKM2) ima zelo pomembno vlogo pri rakavih celicah. je ena izmed oblik piruvat kinaze, ki katalizira pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat, pri čemer se fosfatna skupina iz PEP prenese na ADP ter s tem dobimo ATP. PKM2 je v izražena v celicah, ki se hitro delijo, kot so zarodne in rakave celice. Izražanje omogoča veliko transkripcijskih faktrojev, posebno pomembni pa so transkripcijski faktorji iz družine heterogenih jedernih ribonukleoproteinov (hnRNPs), ki dajejo prednost sintezi PKM2 z neposrednim vplivanjem na mRNA. <br /> Vpliv PKM2 na celičen metabolizem je zelo pomembna, saj lahko v celici prehaja med neaktivno dimerno obliko in aktivno tetramerno obliko, kar privede do različnih produktov. Aktivnost PKM2 je regulirana s strani mnogih snovi, med drugim intermediatov glikolize, ki lahko povečajo ali zmanjšajo aktivnost piruvat kinaze M2. Prav tako na aktivnost vplivajo razne post-translacijske spremembe aminokislin v samem proteinu, ki so rezultat kompleksnih reakcij v celici. S takimi procesi celica regulira sintezo energije in sintezo drugih prekurzorjev za množitev celic. <br /> Poznavanje teh procesov ima velik medicinski pomen, saj lahko pripelje do oznajdbe specifičnih zdravil za zdravljenje raka, ki bi napadale in uničile le rakave celice, zdravih pa ne.<br /> <br /> <br /> ===Maja Kostanjevec: Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah===<br /> <br /> <br /> Glukoza je pomemben vir energije, ki ureja marsikatero metabolno pot. Njena vloga se razlikuje od celice do celice glede na to, kakšne naloge opravlja. Posledično so se v evoluciji razvili različni mehanizmi njenega zaznavanja in prenosa signalov. <br /> <br /> Preučevanje zaznavnih mehanizmov glukoze je zapleteno, saj ima poleg hranilne vloge tudi signalno, ki pa jo včasih težko ločimo od ostalih procesov, v katerih sodeluje. Trenutno so najbolj raziskani mehanizmi v kvasovkah, saj gre za najenostavnejše evkarionte. V njih so odkrili štiri različne signalne poti: glavno represivno pot, cAMP pot ter inducirani poti, ki sta odvisni od senzorjev Snf3 in Rgt2 oz. od fosforilacije.<br /> <br /> Veliko bolj zahtevna je regulacija glukoze v rastlinah. V njih skrbi za izražanje različnih genov, ki urejajo procese fotosinteze, metabolizma, rasti… V modelni rastlini Arabidopisis thaliana so bili raziskani trije različni mehanizmi zaznavanja. Prvi je odvisen od heksokinaze in represira fotosintetske gene, drugi je od heksokinaze neodvisen in vsebuje še neznan receptor ter tretji, ki temelji na procesu glikolize in njenih vmesnih produktov.<br /> <br /> Zaznavanje glukoze pri sesalcih ima posebne lastnosti, ki se razlikujejo tako od tistih v kvasovkah kot v rastlinah. Ti mehanizmi so najbolje preučeni v beta celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke, ki skrbijo za izločanje inzulina. Znano je, da je pri tem potreben obsežen metabolizem glukoze, kot glavni mediator pa nastopa ATP.<br /> <br /> ===Julija Mazej: Metabolizem glukoze v živčnih celicah===<br /> <br /> Glukoza je preferenčno gorivo za možganske celice. Čeprav možgani predstavljajo le 2% celotne telesne mase, za svoje delovanje porabijo kar 25% zaužite glukoze. Možganske celice lahko kot energijski substrat uporabijo tudi: laktat, piruvat, glutamin in glutamat. Kakršnakoli ovira pri energijski oskrbi, je zelo rizična in se lahko konča z nezavestjo ali celo komo v manj kot 10 sekundah. V izogib takšnemu izidu so nekatere celice sposobne nadomestiti primanjkljaj energije oz. ATP z intenzivnejšo glikolizo. To velja za nevroglijalne celice, ki z glikolizo proizvajajo laktat. Vendar pa povišana glikoliza nima enakega vpliva na vse živčne celice. Nevroni zaradi povišane glikolize manj glukoze oksidirajo po pentoza-fosfatni poti, ki tam sicer poteka v normalnih razmerah. Ta metabolična pot je za nevrone zelo pomembna, ker se pri pretvorbi glukoza-6-fosfata v ribozo-5-fosfat regenerira NADPH. To je pomemben antioksidant, ki regenerira reduciran glutation in tako varuje nevrone pred poškodbami, zaradi reaktivnih kisikovih spojin. Glikolizo v nevro celicah stimulirajo hipoksični pogoji, nevrotoksične snovi, mutacije v respiratorni verigi.. Anomalije v metabolizmu glukoze so prisotne v mnogih nevrodegenerativnih boleznih, npr. Alzheimerjevi, Parkinsonovi, Huntingtonovi bolezni. Tu se kaže aplikativen pomen raziskav povezanih z metabolizmom glukoze v možganih. Velik problem pri razumevanju metabolizma v živčnih celicah predstavljajo nepojasnjene interakcije med glija celicami in nevroni .<br /> <br /> ===Jernej Pušnik: Uravnavanje metabolizma z acetilacijo proteinov===<br /> <br /> V svoji seminarski nalogi bom predstavil pomen posttranslacijske modifikacije-acetilacije pri uravnavanju celotnega celičnega metabolizma. Kot že verjetno vsi veste, je večina reakcij, ki so del neke metabolne poti, kataliziranih z encimi. Ti pa so v osnovi proteinske makromolekule, sestavljene iz dvajsetih različnih aminokislin. Ena izmed teh aminokislin je lizin in vsebuje dve amino skupini. S prvo se povezuje v peptidno vez, druga, ki se nahaja na koncu ogljikovodikove verige pa je tarča acetilacije. Ko se acetilna skupina enkrat veže na lizinski ostanek, to povzroči določene spremembe v strukturi proteinske molekule, s tem pa se tudi spremeni encimska aktivnost. Na ta način so regulirani skoraj vsi encimi metabolizma. V seminarju sem opisal kako pride do same acetilacije in deacetilacije, da je pri tem potrebna prisotnost določenih encimov, kako se spremeni delovanje encimov delujočih v glikolizi, glukoneogenezi, citratnem ciklu, oksidaciji maščobnih kislin, oksidaciji aminokislin in ciklu sečnine. Ker je acetilacija tako razširjena modifikacija pri nadzorovanju metabolizma, imajo raziskave na tem področju velik potencial za odkritje novih terapevtskih pristopov k zdravljenju bolezni srca in ožilja, diabetesa, debelosti, itd.<br /> <br /> ===Rok Razpotnik: Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija===<br /> <br /> V dani seminarski nalogi bom predstavil osnovne lastnosti rakavih celic, tipe celic, ki se nahajajo v tumorskem mikrookolju, ter podrobneje predstavil nekatere osnovne lastnosti metabolizma rakastih celic ter njene regulacije. Mutacije onkogenov in tumor supresorskih genov povzročijo spremembe v signalizacijskih poteh, katere povzročijo spremembe metabolizma rakastega tkiva. Metabolizem deluje v prid celični rasti, intenzivni celični delitvi, zaviranju apoptoze itd. Sam metabolizem rakastih celicah temelji na treh osnovnih temeljih: povečani produkciji energije, zadostni biosintezi potrebnih makromolekul in vzdrževanju redoks stanja. Da izpolnjujejo vse tri pogoje se rakaste celice poslužujejo mnogih regulacij metabolizma, z različnimi strateškimi potmi, npr. proteoliza skeletnih mišic, lipoliza maščobnega tkiva, intratumorna simbioza med laktat-proizvajajočimi in laktat-porabnimi celicami, upočasnevanje glikolize in usmerjanje intermediatov v pentoza fosfatno pot itd. Ker pa je mikrookolje, ki obkroža rakasto tkivo zelo dinamično, je za rakaste celice značilna metabolična fleksibilnost. Raziskave in razumevanje metabolične fleksibilnosti bi doprinesle k novim možnim strategijam zdravljenja. Učinek na reguliran metabolizem rakastega tkiva, bi imel ogromen vpliv na viabilnost rakastega tkiva, saj je metabolizem sklopljen s številnimi lastnostmi rakastih celic.<br /> <br /> ===Ajda Rojc: Metabolizem skeletnih mišic===<br /> <br /> Mišice so največji porabnik energije v telesu, saj nam omogočajo vrsto različnih dejavnosti pri katerih se porablja energija. V našem telesu potekata dva različna sistema metabolizma – anaerobni in aerobni. Pri anaerobnem metabolizmu imata pomembno vlogo kreatin fosfat in glikogen. Zaloge ATP je v mišicah zelo malo, zato takoj nastopi cepitev visokoenergetskih vezi v kreatin fosfatu. Po porabi te energije se v glikolizi razgradi glikogen, ki se pri pomanjkanju kisika v mišicah namesto v piruvat, pretvori v laktat in to povzroča bolečine v mišicah. Druga vrsta metabolizma pa deluje kadar je kisika dovolj in to je aerobni metabolizem. Poleg glukoze se pri tej vrsti presnove razgrajujejo tudi maščobne kisline, ki se v β-oksidaciji reducirajo do vodika in acetil-CoA, ta pa vstopi v Krebsov cikel, kjer se proizvede energija ATP. Večja razpoložljivost maščobnih kislin vpliva na nalaganje znotrajmišičnega prostega Pi in AMP med vadbo. Pi in AMP sta odgovorna za regulacijo encima glikogen fosforilaze, ki cepi glikogen. Torej, če se njune koncentracije znižajo pride do manjšega števila cepitev glikogena na glukozo. Pri znatnem povišanju dostopnosti maščobnih kislin je glikogen fosforilaza inhibirana. To je le eden od načinov regulacije substratov v mišičnem metabolizmu. Domnevajo, da je oksidacija maščob regulirana s podobnimi faktorji (npr. adrenalin, Ca2+, ADP, AMP, Pi; AMPK, pH, acetil-CoA) kot razgradnja ogljikovih hidratov, vendar je glede tega, kako te faktorji vplivajo na regulacijo maščobnih kislin in oksidacijo maščob ter kaj je njihova vloga še veliko nejasnosti.<br /> <br /> ===Janez Meden: NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo===<br /> <br /> Celično dihanje je sestavljeno iz glikolize, citratnega ciklusa in verige za prenos elektronov. Večina energije nastane, v obliki ATP pri zadnji stopnji celičnega dihanja, torej pri prenosu elektronov skozi komplekse I, II, III, IV in nastanku ATP-ja v kompleksu V – ATP-sintazi. Zadnja stopnja pa je mogoča le v prisotnosti O2.<br /> Pa vendar življenje obstaja tudi v hipoksičnem okolju. Posebna oblika energijskega metabolizma, ki je značilno za nekatere bakterije, notranje zajedavce in školjke ter celo rakave celice je fumaratsko dihanje. Ta način metabolizma omogoča nekoliko boljši izkoristek energije. Pri njem sodelujeta le dva kompleksa I in II. Kompleks II je povezan s citratnim ciklusom – TCA in verigo za prenos elektronov. Prenašalec med kompleksoma je kvinon z nizkim redoks potencialom, kot je npr. rodokvinon pri A. suum, ali pa menakvinon, znan kot vitamin K.<br /> Z razumevanjem mehanizma fumaratskega dihanja bi lahko razvili zdravila, ki bi inhibirala ali celo onemogočila delovanje tega mehanizma. Primerna tarča novih zdravil bi lahko bila Fp podenota kompleksa II ali pa bi zdravilo lahko delovalo tudi kot kompetitivni inhibitor kvinona.<br /> <br /> ===Ana Kunšek: Večfunkcionalnost akonitaze===<br /> <br /> Akonitaza je protein, ki katalizira drugo stopnjo Krebsovega cikla, torej pretvorbo citrata v izocitrat. Vendar je tudi eden izmed &quot;moonlighting&quot; proteinov, torej proteinov, ki imajo poleg glavne tudi druge funkcije. Prav zato, ker ima toliko funkcij je njena vloga v celici še toliko bolj pomembna, nepravilno delovanje pa lahko pripelje tudi do pojava diabetesa in miopatije. <br /> <br /> Akonitaza poleg kataliziranja omenjene pretvorbe citrata v izocitrat pomaga tudi pri uravnavanju koncentracije železa v celici, stabilizaciji oz. destabilizaciji mitohondrijske DNA ter pri odgovoru na oksidativni stres. Pri uravnavanju koncentracije železa se veže na mRNA in s tem zaustavi sintezo feritina (proteina, ki veže železo) ter s tem pomaga pri uravnavanju homeostaze. Mitohondrijsko DNA destabilizira, kar ji pomaga za lažje podvojevanje, pri oksidativnem stresu pa je ključni faktor pri uravnavanju pravilnega pH-ja v celici, brez katerega encimi ne morejo pravilni delovati.<br /> <br /> Že samo s temi funkcijami smo ugotovili, da je akonitaza zelo pomembna v našem življenju, vendar verjetno še vedno ne poznamo vseh njenih funkcij, saj je odkrivanje &quot;moonlighting&quot; proteinov in njihovih ostalih funkcij zelo težko in zahteva veliko eksperimentalnega dela. Vendar bi lahko z vedenjem vseh funkcij proteinov iznašli tudi takšna zdravila, ki stranskih učinkov ne bi imela, saj bi zablokirala ali pospešila sintezo le tistega proteina, za katerega je to potrebno in ne bi s tem vplivala tudi na ostale funkcije proteina v organizmu.<br /> <br /> ===Tomaž Rozmarič: Warburg in Crabtree efekt===<br /> <br /> Znanstveniki so ugotovili, da rakave celice, kljub prisotnosti kisika, ne izvajajo aerobnih procesov. Namesto tega so se usmerile v glikolizo. Temu se reče Warburg efekt. Kaj so rakave celice s tem pridobile, še ni čisto raziskano. Obstajajo pa hipoteze, da so zaradi tega veliko bolj invazivne, se sposobne deliti pri nizkih koncentracijah kisika in se izogniti apoptozi. Warburgov efekt je reguliran na večih stopnjah metabolne poti, s prekomerno izraženimi in prekomerno aktivnimi encimi, ki vzpodbujajo glikolizo ter inhibicijo proteinov, ki spodbujajo aerobni metabolizem.<br /> Zraven Warburgovega efekta poznamo še Crabtree efekt. Ta mehanizem rakavi celici omogoča preklop na aerobni metabolizem pri pomanjkanju glukoze in obratno pri velikih koncentracijah. Brez poznavanja obeh mehanizmov in prekinitvi obeh hkrati je uspešnost zdravljenja raka zelo majhna. <br /> Znanstveniki so našli vrsto kvasovke, ki ima skoraj identični metabolizem, kot ga ima rakava in je Crabtree pozitivna. Pri nizkih koncentracijah glukoze izvaja anaerobni metabolizem, v prisotnosti visoke koncentracije pa aerobni. Zaradi navedenih lastnosti je idealna za študijo rakavih celic.<br /> Ko bodo znanstveniki natančno proučili Warburg in Crabtree efekt, se bodo lahko razvila tarčna zdravila, katera bi bistveno izboljšala kakovost našega življenja.<br /> <br /> <br /> ===Erik Mršnik: Adrenolevkodistrofija===<br /> <br /> X-vezana adrenolevkodistrofija je precej redka bolezen, ki pa ima zelo hude posledice. Te v večini primerov vodijo v zgodnjo smrt. Z razumevanjem biokemijskega in genetskega ozadja te bolezni so v zadnjih letih naredili velik korak naprej v odkrivanju in preprečevanju te bolezni. <br /> V osnovi gre za napako (mutacije so v večini primerov dedne - 90 %) na genu ABCD1, kar se odraža na ALDP (adrenolevkodistrofični protein), ki je peroksisomalni transportni protein. Če ne deluje, je otežena oziroma onemogočena β-oksidacija VLCFAs (dolgih maščobnih kislin), ki se nabirajo v tkivih in povzročajo velike težave v delovanju možganov in živčevja ter nadledvične žleze. Bolezen se odraža v različnih fenotipih, ki prizadenejo predvsem moške (otroke in moške srednjih let), ženske so navadno le prenašalke, lahko pa se tudi pri njih izrazijo blažji simptomi. Če se bolezen odkrije že v zgodnji fazi, je možnost pomoči večja. Predvsem uspešna je presaditev krvotvronih matičnih celic. Velikokrat pregledajo že dojenčke (t.i. newborn screening), za katere vejo (zaradi dednosti), da so podvrženi tej bolezni, kar bistveno pripomore k pravilnemu pristopu pri izbiri terapije.<br /> <br /> ===Katja Leben: Tia-maščobne kisline===<br /> <br /> Tia-maščobne kisline so umetno sintetizirane nasičene maščobne kisline, ki se od ostalih razlikujejo po vsebnosti heterogenega žveplovega atoma. Zaradi posebnega metabolizma – žveplov atom preprečuje za maščobe običajno β-oksidacijo – in zadostnih podobnosti z naravnimi maščobnimi kislinami so nekatere tia-maščobne kisline široko farmakološko uporabne, saj imajo veliko različnih aplikativnih vplivov na bio sisteme.<br /> <br /> Katabolizem tia-maščobnih kislin do β-oksidacije poteka običajno, ko pa se žveplov atom približa aktivnemu mestu se proces ustavi. Pri 4-tiamaščobnih kislinah pride do inhibicije drugega encima v obratu β-oksidacije, kar negativno vpliva na metabolizem maščobnih kislin, med tem, ko 3-tia-maščobne kisline sploh ne morejo vstopiti v β-oksidacijo in se razgradijo po ω-oksidativni poti. Vse sode nasičene tia-maščobne kisline se po nekaj obratih β pretvorijo v 4-tia-maščobne kisline, zato tudi reagirajo enako, vse lihe nasičene tia-maščobne kisline pa se z β-oksidacijo lahko pretvorijo v 3-tia-maščobne kisline in nato reagirajo enako.<br /> Zaradi posebnega metabolizma so tia-maščobne kisline uporabili tudi za proučevanje delovanja in regulacijie različnih celičnih procesov povezanih z metabolizmom lipidov. Njihov vpliv je močno odvisen od lege žveplovega atoma v ogljikovem skeletu. Tako 4-tia-maščobne kisline zavirajo oksidacijo maščobnih kislin, 3-tia-maščobne kisline pa jo pospešujejo, kar je zaželjeno pri regulaciji bolezenskih stanj, ko je v celici povečana količina maščobnih kislin.<br /> <br /> Biološki odzivi na tia-maščobne kisline obsegajo vpliv na transkripcijski faktor PPARα (peroksisom proliferator aktiviran receptor), mitohondrijsko proliferacijo, antiadipoznost, antioksidativne lastnosti, zmanjšanje proliferacije hitro delečih se celic in celično diferenciacijo. Zadnje raziskave kažejo, da tia-maščobne kisline niso škodljive za naš organizem tudi ob dolgotrajnem uživanju in bi se torej lahko uporabljale kot zdravila.<br /> <br /> ===Ana Cirnski: Peroksisomalna razgradnja maščobnih kislin===<br /> <br /> Maščobne kisline se razgrajujejo do enostavnejših snovi v procesu, imenovanem β-oksidacija. Ta poteka v mitohondriju, pa tudi v peroksisomu. Peroksisomalna in mitohondrijska β-oksidacija se poleg kraja, kjer poteka razgradnja, razlikujeta še v encimih, ki reakcije katalizirajo in v substratih, ki se oksidirajo.<br /> <br /> Rastline razgrajujejo tudi take maščobne kisline, ki jih živali in ljudje ne moremo. Za razliko od nas, lahko maščobne kisline popolnoma razgradijo (saj so peroksisomi edino mesto razgradnje), mi pa v peroksisomih razgrajujemo le zelo dolge maščobne kisline do ustreznih intermediatov, ki se dokončno razgradijo v mitohondriju.<br /> <br /> Oksidacija nenasičenih maščobnih kislin v višje razvitih rastlinah je pomembna za proizvodnjo mnogih spojin, med njimi so bioaktivne molekule, imenovane oksilipini. Mednje spadajo tudi jasmonska kislina in njeni derivati, ki so pomembne signalne molekule in sodelujejo pri obrambi, komunikaciji, signalizaciji in odgovoru na različne biotske in abiotske stresorje. Povzročajo tudi staranje rastline in odpadanje listov.<br /> <br /> Jasmonska kislina se sintetizira v oktadekanojski poti iz α-linolenske kisline (18:3). Pretvorba se začne v kloroplastu, kjer se pretvori v 12-okso-fitodienojsko kislino (OPDA). Ta potuje v peroksisom, kjer nastane oksofitoenojska kislina (OPC:8), ki vstopi v β-oksidacijo in se oksidira v jasmonsko kislino.<br /> <br /> Danes se jasmonska kislina in njeni derivati že uporabljajo v aplikativni znanosti.<br /> <br /> ===Zala Gluhić : Hiperamoniemija===<br /> <br /> Hiperamoniemija je povišana koncentracija v krvi raztopljenega amoniaka. Lahko je posledica motene presnove v ciklu sečnine (na primer zaradi nepravilnega delovanja katerega izmed encimov) – ali pa gre za pridobljeno motnjo zaradi jetrnih bolezni (npr. jetrna odpoved). <br /> Amoniak je še posebno škodljiv za možgane. V krvi raztopljen amoniak prestopa možgansko-žilno pregrado in kadar je njegova koncentracija previsoka, lahko pride do nepopravljive škode pri razvoju centralnega živčnega sistema ali do možganskega edema. Ker v možganih ni vseh za cikel sečnine potrebnih encimov, imajo glavo nalogo pri odstranjevanju odvečnega amoniaka astrociti, vrsta nevroglijskih celic. Koncentracije uravnavajo s pomočjo sinteze glutamina. V primeru hiperamoniemije pride v njih do številnih morfoloških sprememb in sprememb v izražanju različnih proteinov (npr. spremembe v aktivnosti prenašalcev EAAT1 in 2, izražanju GFAP proteinov itd.). Prekomerno sintezo glutamina je mogoče uravnavati z MSO (metionin sulfoksimidom).<br /> <br /> ===Bojana Lazović : Novi farmakološki šaperoni za zdravljenje fenilketonurije===<br /> <br /> Fenilketonurija (PKU) je redka avtosomno recesivna genska bolezen do katere pride, če je okvarjen jetrni encim fenilalanin-4-hidroksilaza (PAH), ki je odgovoren za pretvorbo fenilalanina v tirozin. Ker tako ne more prihajati do razgradnje fenilalanina, se le ta akumulira v telesu in spremeni v fenilpiruvat. To ima toksičen učinek na telo, posebej možgane, saj se pri teh bolnikih lahko razvije težka umska zaostalost. Bolniki se lahko temu izognejo tako, da se že od rojstva držijo stroge diete, po kateri se lahko prehranjujejo le z nebeljakovinsko hrano (sadje in zelenjava). Ostale esencialne aminokisline dobijo v obliki praška, ki vsebuje vse AK razen fenilalanina. Toda raziskave kažejo, da taka dieta pogosto vodi v podhranjenost in psihološke težave bolnikov. Pred nekaj leti je na tržišče prišlo zdravilo Kuvan oz. sintetični naravni kofaktor encima PAH, katerega pomanjkanje je lahko razlog bolezni. Njegova draga sinteza in pri določenih genotipih PKU, slaba učinkovitost, pa je znanstvenike spodbudila k iskanju novih sintetičnih kofaktorjev encima PAH, ki hkrati delujejo kot farmakološki šaperoni. V raziskavi, ki jo opisujem so odkrili dva nova farmakološka šaperona primerna za zdravljenje PKU.<br /> <br /> ===Matic Kovačič : Sirtuin 3 ob dieti spodbuja cikel sečnine in oksidacijo maščobnih kislin ===<br /> Pri dieti ali stradanju pridobimo s hrano veliko manj ali nič energije, zato mora telo dobiti iz svojih zalo, kar naredi z metabolizmom aminokislin in maščobnih kislin. Pri oksidaciji aminokislin dobimo amoniak, ki se mora zaradi svoje toksičnosti v ciklu sečnine pretvoriti v sečnino. V seminarski nalogi bom predstavil vpliv proteina Sirtuin 3 (Sirt3) na povečano delovanje cikla sečnine in metabolizma maščobnih kislin. Sirt3 je encim deacetilaza, ki se nahaja v mitohondriju in s svojim delovanjem vpliva na veliko mitohondrijskih encimov. Mutacije ali odsotnost tega proteina ima za organizem smrtne posledice, zaradi nepravilnega delovanja cikla sečnine in tudi drugih procesov. Povedal bom še nekaj o napaki cikla sečnine, ki jo povzroči pomanjkanje encima ornitin transkarbamoilaze in kakšne posledice ima lahko to na organizem.<br /> <br /> ===Špela Tomaž: Inhibicija fotosinteze===<br /> Čeprav je svetloba bistvena za reakcije fotosinteze, ima nanje tudi uničujoče učinke. Predvsem sta inhibiciji fotosinteze izpostavljena fotosistema II in I, pri katerih lahko intenzivne osvetlitve povzročijo strukturne in funkcijske okvare. Ena izmed aktualnih hipotez o mehanizmu fotoinhibicije fotosistema II (PSII) predvideva dvostopenjski sistem. V prvem koraku je udeležen kompleks, ki v fotosintezi cepi vodo (OEC) – z absorpcijo svetlobe nizkih valovnih dolžin pride do njegovih poškodb, ki omogočijo drugi korak inhibicije. V tem delu se inhibira reakcijski center fotosistema, na kar vpliva svetloba daljših valovnih dolžin. Posledično se tvorijo škodljive reaktivne kisikove spojine (ROS). Proces svetlobnega delovanja sproži popravljalne mehanizme poškodovanih struktur. Fotoinhibicija PSII je pogosta, saj so fototrofi čez dan razmeroma konstantno osvetljeni. Popravljalni cikel PSII je tako pogosto aktiviran in skrbi za to, da ne pride do ustavitve fotosinteze. ROS zavirajo obnovitev aparatov in so na nek način glavni krivci okvar zaradi fotoinhibicije. Sodelujejo tudi v inhibiciji fotosistema I (PSI), ki pa je dosti redkejša in je pogojena s posebnimi razmerami. Njegova regeneracija ni najbolj učinkovita, zato je njegova okvara toliko bolj usodna. Seveda pa so fototrofi razvili mnoge mehanizme različnih oblik, ki fotosisteme ščitijo. Fotoinhibicija je regulirana tudi z mnogimi zunanjimi in notranjimi vplivi na organizem.<br /> <br /> ===Monika Biasizzo: Mitohondrijski razklopni proteini===<br /> Oksidativna fosforilacija je sklopljen proces prenosa protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano (ob prenosu elektronov po dihalni verigi) in sintezo ATP. Mitohondrijski razklopni protein pa ta proces razklopijo s prenosom protonov nazaj v mitohondrijski matriks in s tem znižajo protonski gradient. Poznamo več različnih razklopnih proteinov (UCP), ki so si med seboj bolj ali manj podobni. Prvi odkriti je bil UCP1 – termogenin, ki ima pomembno vlogo v termogenezi in s tem pri vzdrževanju stalne telesne temperature pri sesalcih. UCP2 in UCP3 sta 60-70% homologna UCP1, vendar v celici ne opravljata funkcije termogeneze.<br /> <br /> Mehanizem prenosa protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano s pomočjo UCP še ni pojasnjen, vendar obstajajo trije predlagani modeli: flip-flop model, model s kofaktorjem in kompetetivni model.<br /> <br /> UCP2 ima pomembno vlogo pri zmanjševanju nastanka reaktivnih kisikovih spojin (ROS). Nastanek ROS je eksponentno odvisen od protonskega gradienta. UCP2 z blago razklopitvijo nekoliko zmanjša protonski gradient, tako da sinteza ATP še vedno nemoteno poteka in s tem tudi zmanjša nastanek ROS. UCP3 je pristonem predvsem v skeletnih mišicah, kjer ima prav tako kot UCP2 pomembno vlogo pri zmanjševanju nastanka ROS, še posebej med športno aktivnostjo.<br /> <br /> Regulacija UCP poteka na več različnih nivojih. Aktivnost UCP je regulirana z manjšimi molekulami, kot no di- in trinukleotidi (npr. GDP), ki inhibirajo UCP in maščobnimi kislinami, ki UCP aktivirajo. Regulacija pa poteka tudi na nivoju razgradnje, za katero predvidevajo, da poteka s citosolnim proteosomom, vendar mehanizem še ni pojasnjen.<br /> <br /> ===Nastja Pirman: Mitohondrij, center celične apoptoze===<br /> Mitohondrij je organel vrvohodec, ki izvaja tako življenske kot smrtne funkcije. Njegova najpomembnejša lastnost je membranska prepustnost, ki odloča, ali se bodo procesi pričeli izvajati v korist ali škodo celice. Na mitohondrijevo odločitev vplivajo inter- in intracelularni faktorji in kot njihova podmnožica tudi stresi.<br /> Ko stres preseže mejo, se sproži eden od treh tipov programirane smrti: apoptoza, avtofagija (ki ne vodi nujno do smrti) in nekroza. Osredotočimo se na človeško apoptozo, kjer družina Bcl-2 proteinov z značilnim BH zaporedjem prejema z apoptozo povezane signale. Deli se na antiapoptotske in proapoptoske proteine, ki z medsebojno kombinacijo in z multimerizacijo posredujejo sporočilo mitohondrijskim ionskim kanalom.<br /> Če signal narekuje apoptozo, se bosta z apoptozo povezana kanala MAC in mPTP široko odprla, spustila Cyt c v citosol in depolarizirala membrano. Koncentracija kalcija sodeluje s procesom. V tem kjučnem koraku se porušita membranski potencial in metabolizem.<br /> Kaspaze-9 v kompleksu z Apaf1 in izpuščenim Cyt c (apoptosom) tačas v citosolu začnejo s kaskadno proteolitsko aktivacijo citosolnih proteinov. <br /> Apoptotski mehanizem ni popoln. Napake povzročijo raka ali bolezenska stanja, ki jih ne bomo mogli zavreti z učinkovinami, dokler ne poznamo vseh povezav med deli mehanizma.<br /> <br /> ===Barbara Dušak: Sinteza bakterijske celične stene ===<br /> Bakterijske celična stena je sestavljene iz peptidoglkianskih verig, ki se med seboj povezujejo s kratkimi peptidi. Peptidoglikan je veriga N-acetilglukozamina in N-acetilmuramične kisline, povezanih z β(1,4)-glikozidno vezjo, N-acetilmuraminska kislina pa ima vezan še peptid. <br /> <br /> Sinteza stene je kompleksen proces, ki poteka v treh delih. Najprej se v citosolu sintetizirajo osnovne komponente stene, reakcije katalizirajoi encimi družine Mur. Nato pride do vezave komponent na undekaprenil fosfat in transporta preko membrane, na koncu pa še do sinteze peptidoglikana in vgradnje v že obstoječo celično stene. Verige nastajajo v procesu transglikozilacije, peptidne povezave pa v procesu transpeptidacije. Ta dva procesa katalizirajo encimi družine PBP (penicillin binding proteins), ki se delijo v več razredov glede na katiltično aktivnost in velikost. <br /> Za vgradnjo nove verige v celično steno, se morajo nekatere vezi tudi razcepiti, za kar so potrebne še dodatne hidrolaze, rast celične stene pa poleg vseh teh encimov uravnava tudi citoskelet, ki določa obliko celice. Obstaja tudi več teorij, kako naj bi vgradnja potekala, temlejiijo pa na tem, da se trdnost stene med samim procesom ne sme zmanjšati.<br /> <br /> ===Matej Vrhovnik: Biosinteza škroba, saharoza kot substrat za sintezo zelo razvejanih komponent škroba ===<br /> Škrob je rastlinski rezervni polisaharid, za živa bitja pa eden izmed glavnih virov ogljikovih hidratov v hrani, hkrati pa je zelo lahko razgradljiv. Nahaja se v kloroplastih, kjer se skladišči le za kratek čas, da poteši energijske potrebe rastline, ko fotosinteza ne poteka, ali v amiloplastih za daljše obdobje. Zgrajen je iz glukoz, ki se povezujejo z α(1-4)glikozidno vezjov amilozo in iz amilopketina α(1-6) vezi med razvejitvami. Nastane iz odvečnih energijsko bogatih molekul, ki se ustvarijo pri fotosintezi. Na ta način rastlina shrani energijo oziroma energijsko bogate molekule za prihodnje generacije. Škrob sintetizira škrobosintaza, ki lahko nalaga glukoze na nereducirajoči konec verige, lahko pa tudi na reducirajoči, polisahardi pa nastaja tako, da se na dekstrin, oziroma verigo glukoz pripenjajo nove ADP-glukoze. Sinteza je uravnavana z ADP-glukoza pirofosforilazo. Od vsake vrste rastlin posebi je odvisno kakšen škrob nastaja v njej, zelo se razlikujejo v razmerju amiloza:amilopektin, % razvejanosti in dolžini stranskih verig. V raziskavi so odkrili, da je vir glukoze za škrob lahko tudi saharoza. Ta kot substrat vpliva na obliko molekul škroba: molekule amilopektina so veliko bolj razvejane, pri razpadu škroba ob prisotnosti encima α-amilaze pa ostajajo zelo dolgi skupki α-omejeni dekstrini, ki se ne morejo razgraditi. <br /> Molekule škroba se ob prisotnosti pravih encimov in proteinov začnejo zvijat v dvojne helikse, ti pa so sestavljeni skupaj v urejene enote, ki sestavljajo škrobno zrno.<br /> <br /> ===Jakob Gašper Lavrenčič: Sinteza rastlinske celične stene===<br /> Rastlinaska celična stena je najpogostejši biomaterial na svetu, gradijo jo predvsem polisaharidi, izmed katerih prevladuje predvsem celuloza. Sinteza strukturnih polisaharidov poteka z vezavo sladkornih enot na nastajajočo verigo z α(1-4) glikozidno vezjo, s pomočjo večjih encimskih kompleksov. V zadnjih letih je prišlo do večjih prebojev v razumevanju delovanja teh encimov in načina odlaganja nastajajočih polisaharidov na celično plazmalemo. <br /> Celuloza je linearni polisaharid, ki predstavlja osnovno ogrodje rastlinskih celičnih sten. Celulozne verige so med seboj povezane z hemicelulozo in pektinom, kar povečuje trdnost in odpornost celične stene. Celulozne verige se med seboj povezujejo v mikrofibrile, s tem povečajo svojo trdnost. Sinteza celuloze poteka z pomočjo membranskega encimskega kompleksa znanega kot rozetni terminalni kompleks (RTC), ki se nahaja na celični plazmalemi. Čeprav je bil odkrit v 70-ih letih prejšnjega stoletja so do večjih prebojev v razumevanju njegove strukture in delovanja prišli komaj v zadnjem desetletju. Kljub temu ostajaj še veliko neznanega o poteku sinteze celuloze in njenemu vgrajevanju v celično steno.<br /> Za razliko od celuloze so pektini in hemiceluloze zelo razvejane molekule, katerih sinteza poteka v Golgijevem aparatu. Njihova naloga je, da zamrežijo celulozne mikrofibrile med seboj in z drugimi komponentami celične stene, kot so lignini. Njihova sinteza še ni povsem znana, zato je predmet različnih raziskav.<br /> <br /> ===Mirjana Malnar: Vloga PPAR in leptina v metabolizmu lipidov===<br /> Metabolizem lipidov je lahko reguliran na ravni izražanja genov. Pri tem so pomembni receptorji, aktivirani s proliferatorjem peroksisomov (PPAR). To so od liganda odvisni transkripcijski faktorji, ki glede na vnos hrane/energije regulirajo izražanje genov, ki kodirajo encime odgovorne za metabolizem vnesenih energetskih molekul. Primeri so PPARα, ki stimulira katabolizem lipidov in PPAR, ki stimulira sintezo lipidov ter adipogenezo. Glede na količino nastalega maščobnega tkiva, to izloča hormone, torej deluje kot endokrini organ. Ti hormoni se imenujejo adipokini. Primer je leptin, ki vpliva na center za apetit v hipotalamusu. S tem regulira vnos hrane v organizem. Pomemben je tudi pri preprečevanju debelosti, ker zmanjša učinkovitost signala inzulina na maščobno tkivo in na ta način prepreči lipogenezo po obroku. Leptin posredno pospeši oksidacijo maščobnih kislin in nastanek ketonskih telesc, zavre pa lipogenezo, sintezo TG in holesterola. Poleg tega leptin stimulira delovanje PPARα in PPAR, ti pa povečajo sintezo vezavnih proteinov maščobnih kislin (FABP). Ti proteini prenašajo maščobne kisline do raznih organelov, odvisno od namena – v mitohondrije, kjer se oksidirajo, do ER, kjer poteka reesterifikacija, do lipidnih kapljic, ki služijo shranjevanju. <br /> Če pride do okvare v mehanizmu delovanja PPAR ali leptina so lahko posledice različne bolezni. Primeri takih bolezni so metabolni sindrom, dislipidemija, inzulinska rezistenca, debelost, diabetes. PPAR so vse bolj aktualne tarče za zdravljenje teh bolezni.<br /> <br /> <br /> ===Samo Zakotnik:Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin in njihova vloga===<br /> V svojem seminarju bom govoril o sintezi n vlogi PUFA - polyunsaturated fatty acid. Gre za biološko zelo pomembno skupino maščobnih kislin. PUFA so ključne za pravilno delovanje celičnih membran, so pomembni prekurzorji za signalne molekule, kot so fosfotidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2), jasmonska kislina in steroidni hormoni. Za človeka sta α-linolenska kislina in linolna kislina esencialni kislini, saj ju ne more sintetizirati sam. Glavni vir PUFA so morski sadeži, ki pa zaradi onesnaževanja in prekomernega izlova izginjajo. Posledično številne raziskovalne skupine iščejo alternativni vir sinteze PUFA. Kot primeren kandidat so se izkazale kvasovke Saccharomyces cerevisiae, na primeru katerih bom predstavil verigo za sintezo PUFA. Na modelu rastline Arabidopsis thaliana pa bom prikazal vlogo PUFA v rastlini in posledice, kaj se zgodi, če prekinemo sintezo PUFA na različnih točkah. PUFA pa so pomembne tudi za embrionalni razvoj in za razvoj centralnega živčevja, zato jih dodajajo prehrani namenjeni dojenčkom (mleko v prahu).<br /> <br /> <br /> ===Ellen Malovrh: Hem, železo in staranje===<br /> Hem je kompleksna organska molekula, sestavljena iz protoporfirinskega obroča (heterocikličen sistem iz 4 pirolovih obročev) in koordinacijsko vezanega železovega iona. Biosinteza hema poteka v mitohondrijih in citosolu celic, v osmih encimsko kataliziranih reakcijah. Zadnjo reakcijo katalizira metaloencim ferokelataza, ki v protoporfirinski obroč vgradi Fe2+ ion. <br /> <br /> Kot proteinska prostetična skupina hem sodeluje pri številnih procesih, npr. pri prenašanju kisika in CO2, redoks reakcijah v elektronski prenašalni verigi in regulaciji celičnega metabolizma. Novo področje raziskav pa nakazuje, da je pomanjkanje hema tesno povezano tudi s procesom staranja in nevrodegenerativnimi boleznimi. Inhibicija sinteze hema v celicah povzroči zmanjšano prisotnost kompleksa IV v elektronski prenašalni verigi in posledično motnje v delovanju mitohondrijev, oksidativen stres, motnje v homeostazi železa in propadanje celic. Vse to so tudi karakteristične lastnosti staranja in Alzheimerjeve bolezni. Prihodnje raziskave na tem področju, ki bi utemeljile potek reakcij in metabolnih poti, v katerih sodelujeta hem in železo, bi morda lahko omogočile razvoj novih načinov zdravljenja pomanjkanja železa in starostnih bolezni.<br /> <br /> <br /> ===Suzana Semič: Lesch-Nyhanov sindrom===<br /> Lesch-Nyhanov sindrom ali s kratico LNS je redka dedna motnja presnove purina, ki se deduje X-vezano recesivno in se pojavlja pri enem od 380.000 osebkov moškega spola. Bolezen sta prvič prepoznala in klinično dokazala študent medicine Michael Lesch in mentor, pediater Bill Nyhan. Svoje ugotovitve sta objavila v letu 1964. <br /> Bolezen se pojavi zaradi napake v presnovi purinskih baz v reciklažni poti, povzroča pa jo pomanjkanje encima hipoksantin-gvanin-fosforibozil (GPRT). Zaradi pomanjkanja tega encima se purinski bazi gvanin in hipoksantin pretvarjata v sečno kislino, kar pa privede do hiperurikemije (zvečana koncentracija sečne kisline v krvi), uričnega artitisa, ledvičnih kamnov in odpovedi ledvic. Vse te motnje pa spremljajo še nevrološki problemi, tj. mentalna zaostalost, abnormalni gibi telesa in nagnjenost k samopoškodbam. Vzroki za kopičenje sečne kisline so dobro znani in jih je mogoče zdraviti z zdravili, kot je alopurinol. Razlogi za nevrološke motnje pa so bolj zapleteni. Študije le teh so pokazale, da gre pri LNS za zmanjšano raven dopamina v bazalnih ganglijih, vendar bo potrebno še kar nekaj raziskav o tem, kako vpliva GPRT na dopaminski sistem in zakaj se pojavijo motnje, kot so težnja k samopoškodovanju in mentalna zaostalost.</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2012&diff=7475 2012-12-20T19:17:06Z

<p>Suzana Semič: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>== Novice za študente ==<br /> [https://www.google.com/calendar/embed?src=94r835uhlqu6sornlvmnldb5d0%40group.calendar.google.com&amp;ctz=Europe/Belgrade &lt;font color=red&gt;Razpored izpitnih rokov in kolokvijev ter nekaterih kolokvijev iz vaj&lt;/font&gt;]<br /> <br /> = Biokemijski seminar =<br /> Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 9:00 do 12:00.<br /> <br /> Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime Priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Tema*'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Erik Kristian Janežič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892412000694 Hippo signalna pot in matične celice ]||Filip Mihalič||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Dejan Marjanovič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482707001450 Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov]||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Griša Prinčič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000411001149 Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice]||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||Ajda Rojc||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Maja Kostanjevec||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000401018059# Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah]||Sara Lorbek||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Julija Mazej||14||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002072 Metabolizem glukoze v živčnih celicah]||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||Ana Kunšek||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Estera Merljak||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800041200059X Vloga PKM2 v rakavih celicah]||Suzana Semič||Monika Biasizzo||Janez Meden||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Jernej Pušnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410001702 Uravnavanje metabolnih poti z acetilacijo proteinov]||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Rok Razpotnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304419X12000534 Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija]||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||Erik Mršnik||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Ajda Rojc||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001448271000282X Metabolizem skeletnih mišic]||Ana Grom||Matej Vrhovnik||Katja Leben||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Tomaž Rozmarič||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272810006869 Crabtree in Warburg efekt: izvor energije rakavih celic]||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||Matic Kovačič||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Ana Kunšek||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000406000843 Večfunkcionalnost akonitaze]||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Janez Meden||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304416511003059 NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo]||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Ana Cirnski||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163782701000224 Peroksisomalna razgradnja maščobnih kislin]||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||Nastja Pirman||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Erik Mršnik||17||[http://www.nature.com/nrneurol/journal/v3/n3/full/ncpneuro0421.html Adrenolevkodistrofija]||Julija Mazej||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Katja Leben||17||[http://journals.lww.com/co-lipidology/Abstract/2002/06000/Metabolic_effects_of_thia_fatty_acids.10.aspx Tio maščobne kisline]||Estera Merljak||Suzana Semič||Monika Biasizzo||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Matic Kovačič||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276511000037# Sirtuin 3 ob dieti spodbuja cikel sečnine in oksidacijo maščobnih kislin]||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Zala Gluhić||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165017307001439# Hiperamoniemija]||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Bojana Lazović||18||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22246293 Novi farmakološki šaperoni za zdravljenje fenilketonurije]||Ajda Rojc||Ana Grom||Matej Vrhovnik||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Nastja Pirman||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800040500335X Mitohondrij, center celične apoptoze]||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Špela Tomaž||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001085450700183X Inhibicija fotosinteze]||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Monika Biasizzo||19||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002138 Mitohondrijski razklopni proteini]||Janez Meden||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Jakob Gašper Lavrenčič||20||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369526606001506 Sinteza rastlinske celične stene]||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Barbara Dušak||20||[http://mmbr.asm.org/content/69/4/585.full Sinteza bakterijske celične stene]||Erik Mršnik||Julija Mazej||Ellen Malovrh||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Matej Vrhovnik||20||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0008621503003185 Biosinteza škroba; saharoza kot substrat za sintezo zelo razvejanih komponent škroba]||Katja Leben||Estera Merljak||Suzana Semič||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Filip Mihalič||21||Moj izbrani naslov||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Samo Zakotnik||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000402021680 Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin in njihova vloga]||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Mirjana Malnar||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000409001418 Vloga PPPAR in leptina v metabolizmu lipidov]||Bojana Lazović||Ajda Rojc||Ana Grom||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Sara Lorbek||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410000915 Glutaminska odvisnost rakavih celic]||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Ellen Malovrh||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568163704000121 Hem, železo in staranje]||Špela Tomaž||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Suzana Semič||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165017399000946 Lesch-Nyhanov sindrom]||Monika Biasizzo||Janez Meden||Griša Prinčič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Katarina Tolar||23||Moj izbrani naslov||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |-<br /> | Aleksander Benčič||23||Moj izbrani naslov||Barbara Dušak||Erik Mršnik||Julija Mazej||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |-<br /> | Ana Grom||23||Moj izbrani naslov||Matej Vrhovnik||Katja Leben||Estera Merljak||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti članek iz revije [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS], če tam ne najdete primerne teme, lahko izberete tudi pregledni članek iz kakšne druge revije, ki ima faktor vpliva nad 5. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! <br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2012|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt;Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli vsakemu od recenzentov in docentu (docentu ga pošljite po e-pošti).<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte avtorju in Gunčarju.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).<br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Suzana Semič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2012&diff=7474 2012-12-20T18:59:32Z

<p>Suzana Semič: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>== Novice za študente ==<br /> [https://www.google.com/calendar/embed?src=94r835uhlqu6sornlvmnldb5d0%40group.calendar.google.com&amp;ctz=Europe/Belgrade &lt;font color=red&gt;Razpored izpitnih rokov in kolokvijev ter nekaterih kolokvijev iz vaj&lt;/font&gt;]<br /> <br /> = Biokemijski seminar =<br /> Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 9:00 do 12:00.<br /> <br /> Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime Priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Tema*'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Erik Kristian Janežič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892412000694 Hippo signalna pot in matične celice ]||Filip Mihalič||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Dejan Marjanovič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482707001450 Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov]||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Griša Prinčič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000411001149 Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice]||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||Ajda Rojc||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Maja Kostanjevec||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000401018059# Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah]||Sara Lorbek||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Julija Mazej||14||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002072 Metabolizem glukoze v živčnih celicah]||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||Ana Kunšek||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Estera Merljak||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800041200059X Vloga PKM2 v rakavih celicah]||Suzana Semič||Monika Biasizzo||Janez Meden||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Jernej Pušnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410001702 Uravnavanje metabolnih poti z acetilacijo proteinov]||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Rok Razpotnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304419X12000534 Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija]||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||Erik Mršnik||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Ajda Rojc||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001448271000282X Metabolizem skeletnih mišic]||Ana Grom||Matej Vrhovnik||Katja Leben||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Tomaž Rozmarič||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272810006869 Crabtree in Warburg efekt: izvor energije rakavih celic]||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||Matic Kovačič||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Ana Kunšek||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000406000843 Večfunkcionalnost akonitaze]||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Janez Meden||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304416511003059 NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo]||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Ana Cirnski||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163782701000224 Peroksisomalna razgradnja maščobnih kislin]||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||Nastja Pirman||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Erik Mršnik||17||[http://www.nature.com/nrneurol/journal/v3/n3/full/ncpneuro0421.html Adrenolevkodistrofija]||Julija Mazej||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Katja Leben||17||[http://journals.lww.com/co-lipidology/Abstract/2002/06000/Metabolic_effects_of_thia_fatty_acids.10.aspx Tio maščobne kisline]||Estera Merljak||Suzana Semič||Monika Biasizzo||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Matic Kovačič||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276511000037# Sirtuin 3 ob dieti spodbuja cikel sečnine in oksidacijo maščobnih kislin]||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Zala Gluhić||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165017307001439# Hiperamoniemija]||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Bojana Lazović||18||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22246293 Novi farmakološki šaperoni za zdravljenje fenilketonurije]||Ajda Rojc||Ana Grom||Matej Vrhovnik||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Nastja Pirman||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800040500335X Mitohondrij, center celične apoptoze]||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Špela Tomaž||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001085450700183X Inhibicija fotosinteze]||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Monika Biasizzo||19||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002138 Mitohondrijski razklopni proteini]||Janez Meden||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Jakob Gašper Lavrenčič||20||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369526606001506 Sinteza rastlinske celične stene]||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Barbara Dušak||20||[http://mmbr.asm.org/content/69/4/585.full Sinteza bakterijske celične stene]||Erik Mršnik||Julija Mazej||Ellen Malovrh||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Matej Vrhovnik||20||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0008621503003185 Biosinteza škroba; saharoza kot substrat za sintezo zelo razvejanih komponent škroba]||Katja Leben||Estera Merljak||Suzana Semič||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Filip Mihalič||21||Moj izbrani naslov||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Samo Zakotnik||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000402021680 Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin in njihova vloga]||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Mirjana Malnar||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000409001418 Vloga PPPAR in leptina v metabolizmu lipidov]||Bojana Lazović||Ajda Rojc||Ana Grom||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Sara Lorbek||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410000915 Glutaminska odvisnost rakavih celic]||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Ellen Malovrh||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568163704000121 Hem, železo in staranje]||Špela Tomaž||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Suzana Semič||22||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0165017399000946 Lesch-Nyhanov sindrom]||Monika Biasizzo||Janez Meden||Griša Prinčič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Katarina Tolar||23||Moj izbrani naslov||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |-<br /> | Aleksander Benčič||23||Moj izbrani naslov||Barbara Dušak||Erik Mršnik||Julija Mazej||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |-<br /> | Ana Grom||23||Moj izbrani naslov||Matej Vrhovnik||Katja Leben||Estera Merljak||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti članek iz revije [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS], če tam ne najdete primerne teme, lahko izberete tudi pregledni članek iz kakšne druge revije, ki ima faktor vpliva nad 5. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! <br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2012|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt;Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli vsakemu od recenzentov in docentu (docentu ga pošljite po e-pošti).<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte avtorju in Gunčarju.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).<br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Suzana Semič