Wiki FKKT - User contributions [en]

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-14T23:22:47Z

Tadej Satler: /* Metabolni inžiniring */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »''multiplex genome editing by natural transformation''«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijskem plazmidu.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem ''de novo'' sestavljanje plazmida s čimer se izognemo uporabi destinacijskih vektorjev, ki jih potrebujemo pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na mesto ORI in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij različne seve ''E. coli''. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature <ref name="prvi" />. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisa za proteazo Lon. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost za metabolni inžiniring. V celice so uvedli novo sintezno pot ter pospešili sintezo s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi" />.

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-14T23:15:50Z

Tadej Satler: /* VibriExpress */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »''multiplex genome editing by natural transformation''«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijskem plazmidu.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem ''de novo'' sestavljanje plazmida s čimer se izognemo uporabi destinacijskih vektorjev, ki jih potrebujemo pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na mesto ORI in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij različne seve ''E. coli''. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature <ref name="prvi" />. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisa za proteazo Lon. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi" />.

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-14T23:12:41Z

Tadej Satler: /* Priprava sevov */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »''multiplex genome editing by natural transformation''«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijskem plazmidu.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem ''de novo'' sestavljanje plazmida s čimer se izognemo uporabi destinacijskih vektorjev, ki jih potrebujemo pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na mesto ORI in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij različne seve ''E. coli''. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature <ref name="prvi" />. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi" />.

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-14T23:08:12Z

Tadej Satler: /* Zbirka Marburg */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »''multiplex genome editing by natural transformation''«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijskem plazmidu.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem ''de novo'' sestavljanje plazmida s čimer se izognemo uporabi destinacijskih vektorjev, ki jih potrebujemo pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na mesto ORI in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature <ref name="prvi" />. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi" />.

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:35:12Z

Tadej Satler: /* Vibrio natriegens */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »''multiplex genome editing by natural transformation''«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature <ref name="prvi" />. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi" />.

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:34:45Z

Tadej Satler: /* VibriClone */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature <ref name="prvi" />. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi" />.

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:34:10Z

Tadej Satler: /* Viri */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi" />.

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:33:58Z

Tadej Satler: /* Metabolni inžiniring */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi" />.

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:33:26Z

Tadej Satler: /* Priprava sevov */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:32:31Z

Tadej Satler: /* Priprava sevov */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti">, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:31:38Z

Tadej Satler: /* Vibrio natriegens */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum''.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:31:01Z

Tadej Satler: /* Urejanje genoma – FLP/FRP */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' <ref name="prvi" />.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:29:26Z

Tadej Satler: /* Zbirka Marburg */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' <ref name="prvi" />.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:28:33Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' <ref name="prvi" />.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:27:17Z

Tadej Satler: /* Vibrio natriegens */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' <ref name="prvi" />.

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:26:45Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji <ref name="prvi" />. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:26:24Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi" /> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji <ref name="prvi" />. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:24:49Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji <ref name="prvi" />. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref>Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref>iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:22:17Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref>iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji <ref>iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut <ref>Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah <ref>iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:16:34Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref>iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg
</ref>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:15:12Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref>iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg
<ref/>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T22:14:19Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref>iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg
<ref/>.

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:53:50Z

Tadej Satler: /* Zbirka Marburg */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

Seminarji SB 2018/19

2019-01-13T21:53:04Z

Tadej Satler:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_in%C5%BEeniring_intergenskih_regij_v_operonih_uravnava_izra%C5%BEanje_ve%C4%8D_genov Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov] (Urška Kašnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stohasti%C4%8Dna_oja%C4%8Ditev_in_signalizacija_v_substratnih_ciklih_s_%C5%A1umom_induciranih_bistabilnosti_z_oscilacijami Stohastična ojačitev in signalizacija v substratnih ciklih s šumom induciranih bistabilnosti z oscilacijami] (Uroš Zavrtanik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/VIBRIGENS:_pospe%C5%A1evanje_procesov_sintezne_biologije_z_Vibrio_natriegens VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z ''Vibrio natriegens''] (Tadej Satler)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Špela Koren 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Blaž Lebar

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:50:36Z

Tadej Satler: /* Zaključek */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.

Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu ''V. Natriegens''. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:49:49Z

Tadej Satler: /* Zaključek */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.

Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:47:45Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.

Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Zaključek''' ==

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo ''Vibrio Natriegens'', kot novo šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli''. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro ''de novo'' sestavljanje plazmidov.

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:35:19Z

Tadej Satler: /* Metabolni inžiniring */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.

Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:35:07Z

Tadej Satler: /* VibriInteract */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.

Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:34:55Z

Tadej Satler: /* VibriClone */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.

Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:34:18Z

Tadej Satler: /* Urejanje genoma – FLP/FRP */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.

Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:33:58Z

Tadej Satler: /* Zbirka Marburg */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.

Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:33:04Z

Tadej Satler: /* Vibrio natriegens */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].

Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].

Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.
Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.
Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:32:40Z

Tadej Satler: /* Vibrio natriegens */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].
Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].
Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.
Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.
Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:20:29Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije ''Vibrio natriegens'' za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. ''V. natriegens'' ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne ''E. coli'' ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri ''E. coli'' je 17 minut [3], medtem ko se populacija ''V. natriegens'' podvoji v samo 7 minutah [1].
Možnih razlogov za tako hitro rast je več. ''V. natriegens'' ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z ''E. coli'', kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo ''V. natriegens''. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi ''E. coli'' in ''C. glutamicum'' [1].
Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].
Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji.
Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.
Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence ''V. natriegens'', ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v ''V. natriegens'' je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve ''E. coli'' za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:09:12Z

Tadej Satler: /* Viri */

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije Vibrio natriegens za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. V. natriegens ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne E. coli ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri E. coli je 17 minut [3], medtem ko se populacija V. natriegens podvoji v samo 7 minutah [1].
Možnih razlogov za tako hitro rast je več. V. natriegens ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z E. coli, kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo V. natriegens. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi E. coli in C. glutamicum [1].
Za V. natriegens je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri V. natriegens Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].
Leta 2017 so raziskovalci za V. natriegens predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri V. natriegens uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v V. natriegens ter tudi kateri drugi bakteriji.
Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.
Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence V. natriegens, ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v V. natriegens je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve E. coli za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve V. natriegens, ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih E. coli sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po E. coli, so za ustrezen klonirni sev V. natriegens potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri V. natriegens sta Dns, ki je homologna EndA iz E. coli, in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev V. natrigens modelirala po sevu E. coli BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom V. natriegens ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev V. natrigens - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo V. natriegens celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so E. coli, kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z E. coli sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov V. natriegens, je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:08:47Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije Vibrio natriegens za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. V. natriegens ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne E. coli ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri E. coli je 17 minut [3], medtem ko se populacija V. natriegens podvoji v samo 7 minutah [1].
Možnih razlogov za tako hitro rast je več. V. natriegens ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z E. coli, kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo V. natriegens. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi E. coli in C. glutamicum [1].
Za V. natriegens je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri V. natriegens Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].
Leta 2017 so raziskovalci za V. natriegens predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri V. natriegens uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v V. natriegens ter tudi kateri drugi bakteriji.
Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.
Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence V. natriegens, ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v V. natriegens je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve E. coli za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve V. natriegens, ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih E. coli sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po E. coli, so za ustrezen klonirni sev V. natriegens potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri V. natriegens sta Dns, ki je homologna EndA iz E. coli, in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev V. natrigens modelirala po sevu E. coli BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom V. natriegens ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev V. natrigens - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo V. natriegens celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so E. coli, kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z E. coli sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov V. natriegens, je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg
[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens
[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.
[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017
[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.
[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:07:59Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije Vibrio natriegens za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. V. natriegens ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne E. coli ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri E. coli je 17 minut [3], medtem ko se populacija V. natriegens podvoji v samo 7 minutah [1].
Možnih razlogov za tako hitro rast je več. V. natriegens ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z E. coli, kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo V. natriegens. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi E. coli in C. glutamicum [1].
Za V. natriegens je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri V. natriegens Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].
Leta 2017 so raziskovalci za V. natriegens predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== '''Projekt''' ==

== '''Zbirka Marburg''' ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri V. natriegens uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v V. natriegens ter tudi kateri drugi bakteriji.
Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.
Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Zaradi naravne kompetence V. natriegens, ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v V. natriegens je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== '''Priprava sevov''' ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve E. coli za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve V. natriegens, ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih E. coli sevov.

=== '''VibriClone''' ===

Pri zgledovanju po E. coli, so za ustrezen klonirni sev V. natriegens potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri V. natriegens sta Dns, ki je homologna EndA iz E. coli, in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== '''VibriExpress''' ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev V. natrigens modelirala po sevu E. coli BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom V. natriegens ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== '''VibriInteract''' ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev V. natrigens - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo V. natriegens celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so E. coli, kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z E. coli sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== '''Metabolni inžiniring''' ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov V. natriegens, je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''Viri''' ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg
[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens
[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.
[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017
[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.
[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:07:06Z

Tadej Satler:

== '''Uvod''' ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije Vibrio natriegens za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== '''''Vibrio natriegens''''' ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. V. natriegens ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne E. coli ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri E. coli je 17 minut [3], medtem ko se populacija V. natriegens podvoji v samo 7 minutah [1].
Možnih razlogov za tako hitro rast je več. V. natriegens ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z E. coli, kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo V. natriegens. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi E. coli in C. glutamicum [1].
Za V. natriegens je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri V. natriegens Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].
Leta 2017 so raziskovalci za V. natriegens predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== PROJEKT ==

== Zbirka Marburg ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri V. natriegens uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v V. natriegens ter tudi kateri drugi bakteriji.
Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.
Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== Urejanje genoma – FLP/FRP ==

Zaradi naravne kompetence V. natriegens, ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v V. natriegens je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== Priprava sevov ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve E. coli za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve V. natriegens, ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih E. coli sevov.

=== VibriClone ===

Pri zgledovanju po E. coli, so za ustrezen klonirni sev V. natriegens potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri V. natriegens sta Dns, ki je homologna EndA iz E. coli, in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== VibriExpress ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev V. natrigens modelirala po sevu E. coli BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom V. natriegens ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== VibriInteract ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev V. natrigens - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo V. natriegens celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so E. coli, kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z E. coli sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== Metabolni inžiniring ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov V. natriegens, je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== Viri ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg
[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens
[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.
[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017
[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.
[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:06:09Z

Tadej Satler:

== Uvod ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije Vibrio natriegens za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== Vibrio natriegens ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. V. natriegens ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne E. coli ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri E. coli je 17 minut [3], medtem ko se populacija V. natriegens podvoji v samo 7 minutah [1].
Možnih razlogov za tako hitro rast je več. V. natriegens ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z E. coli, kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo V. natriegens. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi E. coli in C. glutamicum [1].
Za V. natriegens je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri V. natriegens Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].
Leta 2017 so raziskovalci za V. natriegens predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== PROJEKT ==

== Zbirka Marburg ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri V. natriegens uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v V. natriegens ter tudi kateri drugi bakteriji.
Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.
Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== Urejanje genoma – FLP/FRP ==

Zaradi naravne kompetence V. natriegens, ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v V. natriegens je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== Sevi ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve E. coli za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve V. natriegens, ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih E. coli sevov.

=== VibriClone ===

Pri zgledovanju po E. coli, so za ustrezen klonirni sev V. natriegens potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri V. natriegens sta Dns, ki je homologna EndA iz E. coli, in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

=== VibriExpress ===

Študentska ekipa je ekspresijski sev V. natrigens modelirala po sevu E. coli BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom V. natriegens ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

=== VibriInteract ===

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev V. natrigens - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo V. natriegens celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so E. coli, kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z E. coli sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== Metabolni inžiniring ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov V. natriegens, je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== Viri ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg
[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens
[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.
[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017
[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.
[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

2019-01-13T21:02:33Z

Tadej Satler: New page: == UVOD == VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije Vibrio n...

== UVOD ==

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije Vibrio natriegens za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline [1].

== Vibrio natriegens ==

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti [2]. V. natriegens ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne E. coli ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji [1]. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri E. coli je 17 minut [3], medtem ko se populacija V. natriegens podvoji v samo 7 minutah [1].
Možnih razlogov za tako hitro rast je več. V. natriegens ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z E. coli, kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo V. natriegens. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi E. coli in C. glutamicum [1].
Za V. natriegens je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri V. natriegens Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) [1].
Leta 2017 so raziskovalci za V. natriegens predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) [4], ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih [1].

== PROJEKT ==

== Zbirka Marburg ==

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 [5] pokazali, da lahko pri V. natriegens uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v V. natriegens ter tudi kateri drugi bakteriji.
Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.
Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot [1].

== Urejanje genoma – FLP/FRP ==

Zaradi naravne kompetence V. natriegens, ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo [1].
Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v V. natriegens je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.
Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.
Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma [6] [1].

== Sevi ==

V laboratorijih uporabljamo različne seve E. coli za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve V. natriegens, ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih E. coli sevov.

== VibriClone ==

Pri zgledovanju po E. coli, so za ustrezen klonirni sev V. natriegens potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri V. natriegens sta Dns, ki je homologna EndA iz E. coli, in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.
Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.
Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

== VibriExpress ==

Študentska ekipa je ekspresijski sev V. natrigens modelirala po sevu E. coli BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom V. natriegens ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

== VibriInteract ==

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev V. natrigens - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo V. natriegens celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so E. coli, kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.
Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z E. coli sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

== Metabolni inžiniring ==

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov V. natriegens, je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.
Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.
Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

== Viri ==

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg
[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens
[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.
[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017
[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.
[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.

Popravljanje mutacij in rekombinacijski procesi

2016-05-24T15:32:56Z

Tadej Satler:

V študijskem letu 2015/16 bodo seminarji obsegali dve med seboj povezani temi: Popravljanje okvar in mutacij ter mehanizme rekombinacije genetskega materiala. Tema je razdeljena na 18 poglavij, pri čemer zadnja poglavja zajemajo posebne primere in mehanizme popravljanja, ki niso vezani na DNA, pač pa na proces translacije pri poškodovani RNA, zadnji dve temi pa sta dodani kasneje in bosta predstavljeni v angleščini kot individualna seminarja. Kot izhodišče za pripravo si najprej preberite ustrezna poglavja v učbeniku, kjer so ta navedena na spodnjem seznamu. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se odmakniti od osnovne teme seminarja.

Vsako temo obdelajo praviloma dva ali trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje en dan pred predstavitvijo (do polnoči), torej najkasneje v nedeljo ali v torek za ponedeljkove oziroma sredine seminarje. Predstavitve seminarjev 1-4 bodo 23. maja, 5-8 25. maja, 9-12 30. maja, 13-16 1. junija 2016, 17-18 pa sta kratka seminarja in bosta na vrsti 6. junija. Za vsak seminar imate na voljo 14-18 minut časa, da ga predstavite, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki strani uporabite zavihek 'discussion').

Vsebina seminarjev je izpitna snov, razen seminarjev št. 4 ter 13-18.

Poglavja za seminarje so:

# Direktno popravljanje mutacij (Principles of Molecular Biology: 9.7)
# Popravljanje z izcepom baze (9.8)
# Popravljanje z izcepom nukleotida (9.9)
# Xeroderma pigmentosum
# Popravljanje neujemanja (9.10)
# SOS-popravljanje (9.11)
# Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic (10.1)
# Mitozna rekombinacija (10.2)
# Nehomologno povezovanje koncev (10.4)
# Mejozna rekombinacija (10.5)
# Razreševanje Hollidayevega križišča (Lewin's Essential Genes: 15.6)
# Popravljanje DNA v kontekstu kromatina (Lewin's Essential Genes: 16.9)
# Menjava spola pri kvasovki (Lewin's Essential Genes: 15.9)
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Lewin's Essential Genes: str. 400)
# Trans-translacija (translacija pri poškodovani mRNA)
# Od RNA neodvisna elongacija (Science 347, 75 (2015))
# Mehanizmi izjemne odpornosti proti radioaktivnemu sevanju pri prokariontih
# Kompleksne preureditve kromosomov

----

Vpišite se v oklepaj za naslovom seminarja:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Neposredno_popravljanje_mutacij Direktno popravljanje mutacij] (Matej Hvalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/POPRAVLJANJE_Z_IZCEPOM_BAZE_%28BER%29 Popravljanje z izcepom baze (BER)] (Urša Čerček, Urša Kopač, Ema Gašperšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_z_izcepom_nukleotida#Sklopitev_GG-NER_in_TC-NER Popravljanje z izcepom nukleotida] (Petra Hruševar, Gašper Žun, Uroš Zavrtanik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Xeroderma_pigmentosum Xeroderma pigmentosum] (Maja Zupanc, Elvira Boršič)
# Popravljanje neujemanja (Kristjan Stibilj, Rok Miklavčič, Sara Tekavec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SOS-popravljanje SOS-popravljanje] (Tadej Satler, Gašper Virant)
# Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic (Tilen Tršelič, Klara Lenart)
# Mitozna rekombinacija (Peter Pečan, Valentina Levak, Janja Krapež)
# Nehomologno povezovanje koncev (Klara Kuret, Blaž Lebar, Neža Koritnik)
# Mejozna rekombinacija (Eva Rajh, Katja Čop)
# Razreševanje Hollidayevega križišča (Nejc Kejžar, Lovro Kotnik)
# Popravljanje DNA v kontekstu kromatina (Špela Malenšek, Tjaša Lukšič)
# Menjava spola pri kvasovki
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Miha Koprivnikar Krajnc, Katja Brezovar)
# Trans-translacija (Lara Jerman, Aleksandra Uzar, Simon Aleksič)
# Od RNA neodvisna elongacija
# "Unraveling the mechanisms of extreme radioresistance in prokaryotes: Lessons from nature"(Fran Krstanović)
# "Mechanisms of origin, phenotypic effects and diagnostic implications of complex chromosome rearrangements" (Javier Fraguas)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

Talk:SOS-popravljanje

2016-05-24T15:29:51Z

Tadej Satler: New page: Celoten povzetek sva napisala skupaj.

Celoten povzetek sva napisala skupaj.

SOS-popravljanje

2016-05-24T15:29:20Z

Tadej Satler:

Dedovanje genetske informacije je ključen proces za preživetje organizmov. Za njeno ohranitev ni potrebna le izjemna natančnost pri podvojevanju DNA, temveč tudi sposobnost, da se ta izogne napakam in zmanjša število mutacij. Celice so razvile številne popravljalne mehanizme, ki služijo temu, da je število napak v zaporedju DNA minimalno. Ko začnejo mutacije posegat v delovanje celičnega cikla in ovirajo njegovo napredovanje, pride do odziva SOS.

== SOS-popravljanje ==

Termin SOS popravljanje je vpeljal Miroslav Radman. Predpostavil je, da gre za multigenski odziv, ki inducira popravilo poškodovane DNA. SOS odziv, kot že ime samo namiguje, omogoča celici preživetje v skrajni situaciji. Konceptualno temelji na dejstvu, da je boljše, da celica mutira, kot pa da zaradi nezmožnosti napredovanja v celičnem ciklu ostane v fazi podvojevanja DNA in umre.
Pri SOS signalizaciji sodeluje več kot 40 genov, ki kodirajo za proteine ključne pri popravljanju, zaščiti, mutagenezi, podvojevanju in metabolizmu DNA. Najpomembnejša proteina sta LexA in RecA. LexA deluje kot represor transkripcije SOS genov ter zavira odziv. RecA pa deluje kot pozitivni regulator SOS odziva.
Pojav SOS popravljanja je možno opaziti le pri bakterijah. Tudi pri ostalih organizmih so poznani proteini, ki so tako v aminokislinskem zaporedju kot po delovanju podobni bakterijskim SOS proteinom, vendar ti niso sistemsko organizirani kot celota, ki je potrebna, da pride do odziva.

== LexA ==

LexA, 27 kDa velik protein, je homodimer vezan na regulatorno mesto, v bližini začetka transkripcije, dolgo 20 baznih parov imenovano operator. Operator predstavlja LexA škatlo, določeno pa je bilo tudi konsenzno zaporedje: 5'-CTGTN8ACAG-3' (pri E.Coli je to zaporedje 5 – 'TACTG(TA)5CAGTA-3'). LexA je sestavljen iz dveh domen. N-končne domene, ki s pomočjo motiva vijačnica-zavoj-vijačnica vsebuje DNA vezavno domeno, in C-končne domene, ki ima proteolitično funkcijo.
Ena N-končna domena LexA dimera se poveže z levo stranjo operatorja, druga pa z desno. Lastnost LexA vezavnih mest so palindromne ponovitve, saj se na različnih mestih kjer se pojavljajo le malo razlikujejo. Bolj kot določeno zaporedje vezavnega mesta odstopa od konsenznega zaporedja, šibkeje se LexA veže.
LexA se kljub temu, da je represor, med odzivom samim prepisuje. Deluje po principu negativne povratne zanke in se takoj ob koncu SOS odziva veže na operatorsko mesto ter s tem prepreči nastanek mutacij na nepoškodovani DNA.

Pomebno je, da so geni odziva SOS močno uravnavani in primarno niso poškodovani že sami. V primeru da so le ti mutirani, bi lahko polimeraza pod okriljem SOS odziva povzročila dodatne mutacije tudi na mestih kjer njeno delovanje sploh ne bi bilo potrebno, t.j. tam kjer ni poškodb DNA. Temu pojavu pravimo kronični SOS odziv.

== RecA ==

Drugi pomemben protein in induktor SOS odziva - RecA. Ta ima več funkcij in je pomemben tudi pri podvojevanju DNA brez napak (angl. error-prone) ter homolognih rekombinacijah.
RecA je 36 kDa velik protein, prisoten v skoraj vseh bakterijah in ohranjen v vseh organizmih, vključno s človeškim. S pomočjo proteina RecFOR se veže na enoverižno DNA (ssDNA),ki je nastala zaradi lezij (slednje preprečujejo nadaljevanje poti replikacijskim vilicam) in tvori nukleofilament. Nastali filament ima lahko dve vlogi. Prva je, da napade homologno zaporedje dvoverižne DNA (dsDNA) in v procesu homologne rekombinacije povzroči izmenjavo verig. Druga možnost pa je s ko-proteazno aktivnostjo posredovana avto-katalitična cepitev LexA in s tem indukcija odziv SOS.

== Indukcija odziva SOS ==

Faktorji, ki inducirajo SOS - odziv so v glavnem UV sevanje in kemikalije, ki povzročajo prelome in mutacije DNA. Polimeraza III se na mestih, kjer pride do mutacij, ustavi in sinteza DNA je onemogočena, kar tudi ustavi celični cikel. Začne se kopičiti enoverižna DNA.

Molekule RecA se vežejo na enoverižno DNA in tvorijo nukleofilament, ki katalizira avto-proteolizo represorja LexA. Ta razpade na dva fragmenta in se odcepi iz operatorskega mesta, kar povzroči aktivacijo trankripcije okoli 40 SOS genov. Med njimi so urv geni (NER), LexA, RecA (homologna rekombinacija) in geni translezijskih polimeraz (pol II, pol IV, pol V).

Popravljanje DNA nastopi v treh osnovnih mehanizmih. S popravljanjem z izrezom nukleotida (NER), homologno rekombinacijo in translezijsko DNA sintezo (TLS).

Vsi geni SOS odziva niso izraženi istočasno, temveč se kot prvi inducirajo uvrA, uvrB in uvrD. Ti proteini skupaj z endonukleazo UvrC katalizirajo popravljanje z izrezom nukleotida (NER). Ta izključi poškodovane nukleotide iz dvoverižne DNA, nato pa DNA polimeraza I zapolni njihova mesta.

Pri homologni rekombinaciji (HR) je pomembno izražanje RecA. Ta privabi ostale pomembne proteine, kot so RecBCD in RecFOR, ki omogočajo popravo lezij na enoverižni DNA na mestu replikacijskih vilic.

Če škoda ni v celoti odpravljena z izrezom nukleotida in homologno rekombinacijo, pride do translezijske DNA sinteze. Ta mehanizem uporabljajo mutagene polimeraze Pol II, Pol IV in Pol V (v E. coli). Slednje celici omogočijo preživetje, saj imajo zmožnost podvojevanja na mestih kjer se pojavijo lezije. Od vrste lezije je odvisno katera polimeraza bo sodelovala pri SOS odzivu. Med prej naštetimi je polimeraza II edina, ki ima eksonukleazno aktivnost in je zelo natančna.

== Sodelujoče polimeraze ==

'''POL II'''
DNA polimerazo II kodira gen polB. Gre za zelo natančno polimerazo z 3’ → 5’ eksonukleazno aktivnostjo, ki služi kontrolnemu branju (angl. proofreading). V normalnih pogojih je je v celici zelo malo, ob SOS odzivu pa se njeno izražanje poveča za sedemkrat. Polimeraza II lahko podvojuje preko abazičnih mest, kar pomeni, da manjkata purinska ali pirimidinska baza. Povzroči pa lahko tudi ponovno podvojevanje DNA, potem ko je bilo podvojevanje brez napak (angl. error-free) ustavljeno.

'''POL IV'''
DNA polimerazo IV kodira gen dinB. Ob SOS signalu se njeno izražanje desetkrat poveča iz 250 molekul na 2500. DNA lahko podvojuje brez napak (angl. error-free) ali pa nenatančno z napakami (angl. error-prone). Pomembna pri adaptivnih točkovnih mutacijah.

'''POL V in mutasom'''
V nasprotju s polimerazo II in IV, ki sta neposredno kodirani in se pojavita v zgodnji stopnji odziva SOS, se polimeraza V pojavi v pozni stopnji. Je najmanj natančna. Nastane pod vpliom recA, ko se združita dimera UmuD’2 in UmuC v kompleks UmuD’2C, ki predstavlja polimerazo V.

Polimeraza V tvori aktivni kompleks UmuD'2C – RecA – ATP, imenovan mutasom. Podenota UmuC vsebuje DNA polimerazno aktivnost. Mutasom je tisiti, ki katalizira translezijsko sintezo pri različnih vrstah lezij. Nizka natančnost pri vstavljanju nukleotidov na mesto nasproti lezije dovoljuje, da so nukleotidi vstavljeni naključno. Tako bakterija brez funkcionalnega mutasoma ne more kopičiti mutacij pod vplivom UV svetlobe oz. drugih mutagenih sredstev. Potrebno je poudariti, da so tu mutacije ključne za preživetje, saj je v skrajnem primeru bolje, da celica na področju lezije mutira, kot pa da kar propade zaradi ne zmožnosti podvojevanja DNA. Seveda mora biti mutasom pod strogim nadzorom, da ne kopiči mutacij na ne poškodovanem delu DNA, t.j. tam kjer ni lezij.

Ko je napaka popravljena, kar v tem primeru pomeni zmožnost nadaljevanja podvajanja, pride do razpada RecA nukleofilamenta s hidrolizo ATP. Sledi vezava dimera LexA nazaj na operatorsko mesto in posledična inhibicija SOS genov.

== Viri ==

[1]      Z. Baharoglu and D. Mazel, “SOS, the formidable strategy of bacteria against aggressions,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 38, no. 6, pp. 1126–1145, 2014.

[2]      R. P. Fuchs and S. Fujii, “Translesion DNA synthesis and mutagenesis in prokaryotes,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol., vol. 5, no. 12, 2013.

[3]      K. Schlacher, K. Leslie, C. Wyman, R. Woodgate, M. M. Cox, and M. F. Goodman, “DNA polymerase V and RecA protein, a minimal mutasome,” Mol. Cell, vol. 17, no. 4, pp. 561–572, 2005.

[4]      C. Janion, “Inducible SOS response system of DNA repair and mutagenesis in Escherichia coli.,” Int. J. Biol. Sci., vol. 4, no. 6, pp. 338–44, 2008.

[5]      B.E. Tropp: Principles of Molecular Biology, 1. izdaja. Burlington: Jones & Bartlett Learning, 2014.

SOS-popravljanje

2016-05-24T15:26:18Z

Tadej Satler:

SOS-popravljanje

2016-05-24T10:09:49Z

Tadej Satler: /* SOS popravljanje */

SOS-popravljanje

2016-05-24T10:09:08Z

Tadej Satler: New page: Dedovanje genetske informacije je ključen proces za preživetje organizmov. Za njeno ohranitev ni potrebna le izjemna natančnost pri podvojevanju DNA, temveč tudi sposobnost, da se ta i...

Popravljanje mutacij in rekombinacijski procesi

2016-04-04T10:11:42Z

Tadej Satler:

V študijskem letu 2015/16 bodo seminarji obsegali dve med seboj povezani temi: Popravljanje okvar in mutacij ter mehanizme rekombinacije genetskega materiala. Tema je razdeljena na 16 poglavij, pri čemer zadnja poglavja zajemajo posebne primere in mehanizme popravljanja, ki niso vezani na DNA, pač pa na proces translacije pri poškodovani RNA. Kot izhodišče za pripravo si najprej preberite ustrezna poglavja v učbeniku, kjer so ta navedena na spodnjem seznamu. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se odmakniti od osnovne teme seminarja.

Vsako temo obdelajo praviloma dva ali trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje en dan pred predstavitvijo (do polnoči), torej najkasneje v nedeljo ali v torek za ponedeljkove oziroma sredine seminarje. Predstavitve seminarjev 1-4 bodo 23. maja, 5-8 25. maja, 9-12 30. maja, 13-16 pa 1. junija 2016. Za vsak seminar imate na voljo 14-18 minut časa, da ga predstavite, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki strani uporabite zavihek 'discussion').

Vsebina seminarjev je izpitna snov, razen seminarjev št. 4 ter 13-16.

Poglavja za seminarje so:

# Direktno popravljanje mutacij (9.7)
# Popravljanje z izcepom baze (9.8)
# Popravljanjem z izcepom nukleotida (9.9)
# Xeroderma pigmentosum
# Popravljanje neujemanja (9.10)
# SOS-popravljanje (9.11)
# Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic (10.1)
# Mitozna rekombinacija (10.2)
# Nehomologno povezovanje koncev (10.4)
# Mejozna rekombinacija (10.5)
# Razreševanje Hollidayevega križišča (15.6)
# Popravljanje DNA v kontekstu kromatina (16.9)
# Menjava spola pri kvasovki (15.9.)
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (str. 400)
# Trans-translacija (translacija pri poškodovani mRNA)
# Od RNA neodvisna elongacija (Science 347, 75 (2015)

----

Vpišite se v oklepaj za naslovom seminarja:

# Direktno popravljanje mutacij
# Popravljanje z izcepom baze
# Popravljanjem z izcepom nukleotida (Petra Hruševar, Gašper Žun, Uroš Zavrtanik)
# Xeroderma pigmentosum (Maja Zupanc, Elvira Boršič)
# Popravljanje neujemanja
# SOS-popravljanje (Tadej Satler, Gašper Virant)
# Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic (Tilen Tršelič, Klara Lenart)
# Mitozna rekombinacija
# Nehomologno povezovanje koncev (Klara Kuret, Blaž Lebar, Neža Koritnik)
# Mejozna rekombinacija
# Razreševanje Hollidayevega križišča (Nejc Kejžar, Lovro Kotnik)
# Popravljanje DNA v kontekstu kromatina (Špela Malenšek, Tjaša Lukšič)
# Menjava spola pri kvasovki (Kristjan Stibilj, Rok Miklavčič, Sara Tekavec)
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Miha Koprivnikar Krajnc, Katja Brezovar)
# Trans-translacija
# Od RNA neodvisna elongacija (Aleksandra Uzar, )

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

BIO2 Seminar 2015

2015-10-28T16:34:50Z

Tadej Satler: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||Pentoza-fosfatna pot in rak||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||PKM2 in njegova vloga pri razvoju tumorjev||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na posttranslacijske modifikacije in DNA metilacijo ||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18||||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||14/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/19bnx0Yh4RIuC2Kzkdaa8t8WqRTBgXYNTV_IWfjrO0W4/viewform?usp=send_form mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2015

2015-10-28T16:31:57Z

Tadej Satler: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2015 stran]

=== Kristjan Stibilj: PI3K kaskada in njihova vloga pri rakavih obolenjih ===
Dandanes je zdravljenje rakavih obolenj poglavitna točka v razvoju farmacevtskih zdravil. Velike multinacionalke vlagajo ogromno denarja v razvoj zdravila, ki bi ozdravil tumorje oz. omilil njihovo delovanje. Za nastanek rakavih obolenj so v veliki meri krivi receptorji tirozin kinaze (RTK) in njihova PI3K/AKT/mTOR signalna pot. Ta namreč nadzoruje celično proliferacijo, metabolizem, premikanje in preživetje. Mutacije ključnih proteinov v PI3K kaskadi vodijo do nenadzorovane rasti in delitve celic, kar privede do nastanka tumorjev. Glavni princip zdravljenja oz. iskanje zdravila za rakava obolenja je torej poiskati takšno molekulo, ki bi uspešno inhibirala mutiran protein in s tem ustavila njegovo hiperaktivacjo. Znanstveniki so v zadnjih letih odkrili precej inhibitorjev, ki so bolj ali majn specifični in so sedaj v preiskavah kot morebitno zdravilo. Za inhibiranje PI3K molekule sta se v predkličninih študijah pokazala kot uspešna pictilisib in buparlisib, ki se vežeta na ATP-vezavno mesto. Na enak način deluje tudi večina AKT inhibitorjev, kamor spada tudi dobro raziskan Inhibitor VIII. mTOR, zadnja molekula v PI3K kaskadi, pa ima prav tako kar nekaj sintetičnih inhibitorjev, ki so analogni naravni molekuli rapamcin. Vsi našteti inhibitorji pa žal še niso zdravila za raka, saj so interakcije z ostalimi encimi v celici še vedno nepoznane.

=== Klara Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv ===
Patogene bakterije uporabljajo efektorje za zatiranje imunskega odziva gostitelja. Tarča mnogih efektorskih proteinov je celični ubikvitinacijski sistem (UBS), ki je pomemben regulator imunskega odgovora. Ubikvitinska signalizacija poteka preko treh encimskih kompleksov, ki na proteinske substrate vežejo molekule ubikvitina. Dolžina in oblika ubikvitinske verige narekujeta, kakšen bo biološki odgovor celice na ubikvitinacijo oz. kaj se bo s substratom zgodilo. Ker prokarionti nimajo lastnega ubikvitinacijskega sistema, so morali razviti drugačne mehanizme, ki jim omogočajo interakcijo z evkariontskimi proteini, kateri nastopajo pri ubikvitinaciji. Efektorji lahko gostiteljski UBS izkoriščajo tako, da strukturno ali funkcijsko posnemajo evkariontske komponente UBS, ali pa so homologi evkariontskih proteinov. Lahko tudi pospešujejo ali inhibirajo delovanje 26S proteasoma. Efektorski proteini torej izkoriščajo evkariontske strategije za nadzor in manipulacijo gostiteljevih celičnih procesov, v smeri, ki patogenu omogoča čim boljšo možnost razvoja in množitve. Efektorji AvrPtoB, HopM1 ter VirF so nastali z različnim evolucijskim razvojem, zato se tudi mehanizmi njihovega delovanja na UBS razlikujejo. Patogeni efektorji lahko preko ubikvitinacije pomembnih signalnih proteinov v imunskih kaskadah povzročijo nezmožnost celice, da aktivira PAMP ter ETI imunost. Razgradnja gostiteljevih proteinov vodi lahko do motenj v izražanju genov, motenj v vezikularnem transportu in številnih drugih nepravilnosti v celičnih procesih, ki pripeljejo do večje dovzetnosti celice za okužbo.

=== Tjaša Lukšič: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini ===
Alternativno izrezovanje GPCR-jev je pogost pojav, še posebej pri sekretinski in nekaterih sorodnih družinah. Receptorji sekretinske družine se pojavljajo v zanimivih izooblikah, ki odstirajo nove poglede na regulacijo celične signalizacije. V sedmi transmembranski vijačnici sekretinskih GPCR-jev je dobro ohranjen ekson 12 oz. zaporedje 14 aminokislin, ki je tarča izrezovalno-povezovalnega kompleksa pri nekaterih receptorjih. Delecija eksona 12 nima izrazitega vpliva na vezavo primarnih sporočevalcev, ima pa zato toliko večje posledice pri prenosu signalov. Povezovanje z G-proteini je onemogočeno, ker skrajšana TMD7 ne omogoča normalne konformacijske spremembe. Le-ta se v običajnih izooblikah zgodi zaradi premika TMD6 in TMD7 proti statični TMD3, kar razkrije intracelularno vezavno domeno za navzdolnje efektorje. Poleg omenjene funkcije lažnega receptorja, se oslabi tudi membranska ekspresija kratkih-TMD7 receptorjev, saj je izbrisan transportni motiv v eksonu 12 in zmanjšana hidrofobnost C konca. Najbolj fascinantna posledica je zagotovo dominantno negativna regulacija membranske ekspresije ostalih izooblik. Za transport GPCR-jev iz kontrolnega sistema endoplazmatskega retikuluma je potrebna oligomerizacija. Hetero-oligomeri določenih kombinacij s kratkim-TMD7 receptorjem ne uspejo zapustiti ER, število delujočih receptorjev v membrani se zmanjšuje in celica je slabše odzivna na njihove primarne sporočevalce. Med tem pa nekateri receptorji nimajo težav pri transportu skupaj s skrajšanimi izooblikami. Številna bolezenska stanja so povezana s patološkimi izooblikami ali z neuspešnim transportom proteinov iz ER, za kar obstaja potencialna rešitev v farmakoloških šaperonih.

=== Ema Gašperšič: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen ===
Protein kinaze C (PKC) so družina encimov, ki sodelujejo v številnih signalnih poteh v celici. S fosforilacijo serina ali treonina nekega drugega proteina regulira njegovo aktivnost. Vplivajo na proliferacijo in diferenciacijo celice, apoptozo, oblikovanje sinaps, učenje ter shranjevanje spominov, nevrološke motnje in mnogo drugih procesov v celici. Za aktivacijo PKC sta ključni povečani koncentraciji diacilglicerola (DAG) in kalcijevih ionov Ca2+, ki z vezavo na PKC povzročita prehod iz neaktivne v aktivno obliko. Aktivacija PKC vpliva na spodbujanje oziroma inhibiranje razvoja raznih bolezni, kot so rak, ishemična možganska kap ali Alzheimerjeva bolezen in druge nevrodegenerativne bolezni. Problem je v tem, da je pri zdravljenju raka potrebno rast celic čim prej zaustaviti, med tem ko morajo pri nevrodegenerativnih boleznih nevroni ostajati živi. Poleg tega je zanimivo, da naj bi nekateri aktivatorji protein kinaz C rast rakavih celic spodbujali, drugi pa zavirali. Običajen mehanizem delovanja PKC je težko opisati, saj obstaja več oblik PKC izoencimov, ki so po različnih tkivih različno razporejeni, v celici imajo različne funkcije, poleg tega pa obstaja več signalnih poti, ki vodijo do aktivacije PKC. Vse to so razlogi za oteženo delo raziskovalcev, ki želijo odkriti načine zdravljenja prej omenjenih boleznih, zato torej to področje zahteva še precej raziskav, ki bi posledično lahko olajšale njihovo zdravljenje.

=== Tadej Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic ===
Melanom je najnevarnejša oblika kožnega raka in znanstveniki že desetletja borijo izboljšali rezultate zdravljenja. Vzpodbuditi želijo proti-tumorski odziv imunskega sistema, vendar so zaradi kontrolnih točk neuspešni. Kontrolne točke so ključne za ohranjanje imunske homeostaze, saj bi brez njih bili žrtev številnim avtoimunskim boleznim in poškodbam tkiva ob prevelikem odzivu sistema na patogene vnetje. Med imunske kontrolne točke spada tudi receptor PD-1. Je monomer sestavljen iz imunoglobulinske in citoplazemske domene. Zanj sta značilna tudi dva liganda (PD-L1 in PD-L2), ki sta potrebna za njegovo aktivacijo. Najdemo ga predvsem pri limfocitih T in nekaterih melanomskih celicah. Izražanje PD-1 je raziskano predvsem pri limfocitih T, kjer ob interakciji z ligandoma inhibira delovanje in funkcije limfocitov ter povzroča njihovo apoptozo. To doseže s pomočjo zaviranja številnih ključnih procesov znotraj celice, ki so potrebni za njeno normalno delovanje. Pri melanomskih celicah je pa delovanje PD-1 še dokaj neraziskano. Do zdaj njegova prisotnost ni bila znana, vendar so nedavne raziskave pokazale njegovo izražanje na nekaterih celicah limfocitov. Obnašanje PD-1 melanomskih celic je drugačno kot pa pri limfocitih, saj njegovo izražanje spodbuja rast tumorja. S pomočjo boljšega poznavanja delovanja PD-1 v limfocitih T in melanomskih celicah, bo lažje razviti učinkovitejše metode boja proti raku.

=== Ime Priimek: Naslov mojega seminarja ===
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Aliquam id lorem nulla. Nam malesuada venenatis velit imperdiet finibus. Aenean dignissim fermentum nisl, eget suscipit nibh ultrices quis. Aliquam scelerisque pharetra nisl non dignissim. Duis ac eros tristique, venenatis ante sit amet, tristique neque. Suspendisse maximus metus posuere nisi auctor, ac vulputate leo ultrices. Duis bibendum sollicitudin neque, ac tristique dolor ornare et. Mauris tristique consequat varius. Proin finibus orci urna, in ultrices justo efficitur dictum. Cras eget finibus justo. Morbi feugiat erat nec metus luctus, eu fermentum libero vestibulum. Proin lobortis ligula et quam ultricies pharetra. Proin et tellus ut nulla pellentesque fringilla interdum eget lorem. Suspendisse potenti. Curabitur quis sem eu purus blandit euismod. Fusce convallis rutrum lorem, quis feugiat sapien porta et. Nulla facilisi. Pellentesque imperdiet, elit vel euismod hendrerit, metus mauris feugiat nulla, vel pellentesque sapien ligula vel sapien. Donec nibh odio, facilisis ut orci ut, feugiat dictum orci. Aliquam aliquet lacus et dapibus faucibus. Mauris ac ipsum pulvinar, auctor enim in, mollis libero. Curabitur porttitor, velit vel pretium ullamcorper, nulla arcu blandit orci, vel fermentum metus est et nisl. Cras et nunc lacus. Suspendisse tempus sagittis libero, quis rutrum ante faucibus nec. Sed ac eros eget.