Wiki FKKT - User contributions [en]

2017-bionano-seminar

2017-06-03T17:58:03Z

Tajda Buh: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 2'''
|-
| Peter Prezelj||22.03.17||Spreminjanje vsebnosti in karakteristik hranilnih snovi v živilih in pripravljeni hrani z uporabo kovalentnih modifikacij, prečnega povezovanja in encimov||Vita Vidmar||Zala Gluhić
|-
| Boštjan Petrič||22.03.17||Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi||Luka Kavčič||Judita Avbelj
|-
| Ema Guštin||22.03.17||Nanoprevleka hrustanca za preprečitev osteoartritisa||Mojca Juteršek||Vid Jazbec
|-
| Tjaša Lapanja||29.03.17||Modificirana CHO celična linija prilagojena za ultrazvočno indukcijo izražanja proteinov v industrijskih bioreaktorjih||Bojana Lazović||Vita Vidmar
|-
| Maruša Prolič Kalinšek||29.03.17||Senzor za detekcijo Legionella bakterij na osnovi polidiacetilena||Eva Korošec||Luka Kavčič
|-
| Domen Klofutar||29.03.17||Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula||Tajda Buh||Mojca Juteršek
|-
| Simon Bolta||05.04.17||Z vezavo zunajceličnega kalcija do zmanjšanja bolečine v mišicah po treningu||Peter Prezelj||Bojana Lazović
|-
| Tomaž Rozmarič||05.04.17||Korekcija vida s pomočjo nano robotov||Boštjan Petrič||Eva Korošec
|-
| Urša Kapš||05.04.17||Nanodelci za strjevanje krvi||Ema Guštin||Tajda Buh
|-
| Julija Mazej||12.04.17||kapsule za vzpostavitev ravnovesja crevesne mikrobiote||Tjaša Lapanja||Peter Prezelj
|-
| Nataša Žigante||12.04.17||opis teme ali naslov||Maruša Prolič Kalinšek||Boštjan Petrič
|-
| Anja Herceg||12.04.17||Boj proti koroziji s pomočjo superhidrofobnega sol-gela z enkapsuliranimi zaščitnimi bakterijami||Domen Klofutar||Ema Guštin
|-
| Mirjam Kmetič||19.04.17||Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib||Simon Bolta||Tjaša Lapanja
|-
| Mojca Kostanjevec||19.04.17||Nanodiski - dostavni sistem za tarčno ciljanje EpCAM na površini rakavih epitelijskih celic||Tomaž Rozmarič||Maruša Prolič Kalinšek
|-
| Jan Rozman||19.04.17||Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo||Urša Kapš||Domen Klofutar
|-
| Barbara Dušak||03.05.17||Izboljšava gojenja mesa n vitro||Julija Mazej||Simon Bolta
|-
| Mateja Cigoj||03.05.17||Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.||Nataša Žigante||Tomaž Rozmarič
|-
| Toni Nagode||03.05.17||Reverzibilno pritrjevanje predmetov na osnovi nanoslojev iz biotina in avidina||Anja Herceg||Urša Kapš
|-
| Tim Božič||10.05.17||Optimizacija pigmentov povodnega konja za proizvodnjo sončne kreme||Mirjam Kmetič||Julija Mazej
|-
| Darja Božič||10.05.17||Kontaktne leče iz proteinsko vtisnjenega polimera za zmanjšanje verjetnosti pojava proteinskih depozitov in okužb||Mojca Kostanjevec||Nataša Žigante
|-
| Petra Tavčar||10.05.17||Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov||Jan Rozman||Anja Herceg
|-
| Marjeta Horvat||17.05.17||FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa||Barbara Dušak||Mirjam Kmetič
|-
| Danijela Jošić||17.05.17||Gensko spremenjen Lactobacillus s spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.||Mateja Cigoj||Mojca Kostanjevec
|-
| Tina Kuhar||17.05.17||Cigareti z gensko spremenjenim tobakom in izboljšanim filtrom za lažje odvajanje od kajenja||Toni Nagode||Jan Rozman
|-
| Nika Strašek||24.05.17||Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom||Tim Božič||Barbara Dušak
|-
| Eva Vidak||24.05.17||Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega aktivatorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''||Darja Božič||Mateja Cigoj
|-
| Alja Zgonc||24.05.17||Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni||Petra Tavčar||Toni Nagode
|-
| Zala Gluhić||31.05.17||Komora, ki omogoča vzpostavitev naravne mikrobiote novorojenčkom, rojenim s carskim rezom.||Marjeta Horvat||Tim Božič
|-
| Judita Avbelj||31.05.17||Allergy nanocathcher za nevtralizacijo aeroalergenov v nosu.||Danijela Jošić||Darja Božič
|-
| Vid Jazbec||31.05.17||Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.||Tina Kuhar||Petra Tavčar
|-
| Vita Vidmar||31.05.17||'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic||Nika Strašek||Marjeta Horvat
|-
| Luka Kavčič||31.05.17||Preparat »Safe-freeze« z rekombinantno fuzijo proteina EfcIBP s TAT-HA2p, ki ščiti pred poškodbami pri zamrzovanju celic, tkiv ali organov||Eva Vidak||Danijela Jošić
|-
| Mojca Juteršek||31.05.17||Zdravljenje trimetilaminurijem na principu vsadka iz makroenkapsuliranih celic||Alja Zgonc||Tina Kuhar
|-
| Bojana Lazović||07.06.17||Razgradnja plastike do okolju neškodljivih produktov||Zala Gluhić||Nika Strašek
|-
| Eva Korošec||07.06.17||Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.||Judita Avbelj||Eva Vidak
|-
| Tajda Buh||07.06.17||Detekcija izpostavljenosti ionizirajočemu sevanju||Vid Jazbec||Alja Zgonc
|}

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte '''dva dneva pred datumom predstavitve''', ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Vsak recenzent predlaga izboljšavo projekta.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik dva dneva pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-02T21:42:49Z

Tajda Buh: /* Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G */

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3 CRISPRi-mediated metabolic engineering of E. coli for O-methylated anthocyanin production]

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikoziltransferaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z majhnim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substrata. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z majhnim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo transkripcije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-02T21:42:14Z

Tajda Buh: /* Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov */

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3 CRISPRi-mediated metabolic engineering of E. coli for O-methylated anthocyanin production]

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikoziltransferaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z majhnim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substrata. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo transkripcije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-02T21:09:54Z

Tajda Buh: /* Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov */

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3 CRISPRi-mediated metabolic engineering of E. coli for O-methylated anthocyanin production]

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikoziltransferaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substrata. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo transkripcije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-02T21:07:16Z

Tajda Buh:

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3 CRISPRi-mediated metabolic engineering of E. coli for O-methylated anthocyanin production]

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikoziltransferaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo transkripcije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-02T21:06:15Z

Tajda Buh: /* Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi */

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3 CRISPRi-mediated metabolic engineering of E. coli for O-methylated anthocyanin production]

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom] in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikoziltransferaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo transkripcije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-02T11:25:06Z

Tajda Buh:

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3 CRISPRi-mediated metabolic engineering of E. coli for O-methylated anthocyanin production]

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom] in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikoziltransferaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:39:21Z

Tajda Buh:

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3 CRISPRi-mediated metabolic engineering of E. coli for O-methylated anthocyanin production]

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom] in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:35:21Z

Tajda Buh:

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3]

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:34:20Z

Tajda Buh: /* Uvod */

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

MBT seminarji 2017

2017-05-01T20:29:59Z

Tajda Buh:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-05-01T20:28:48Z

Tajda Buh:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring ''E. coli'' za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:25:55Z

Tajda Buh: /* Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov */

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E. coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:25:23Z

Tajda Buh: /* Uvod */

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:24:13Z

Tajda Buh: /* Zaključek */

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:23:43Z

Tajda Buh: /* Uvod */

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:23:28Z

Tajda Buh: /* Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi */

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:23:13Z

Tajda Buh: /* Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov */

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:22:39Z

Tajda Buh: /* Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G */

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:20:37Z

Tajda Buh: /* Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov */

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Ph''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:18:51Z

Tajda Buh:

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ckm''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Pf''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ckm''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ckm''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:16:40Z

Tajda Buh:

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ck''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Pf''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ck''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.
----

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ck''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:13:38Z

Tajda Buh:

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).
----

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ck''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Pf''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ck''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.
----

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ck''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.
----

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.
----

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.
----

== Viri ==

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:05:12Z

Tajda Buh:

== Uvod ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).
----

== Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ck''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Pf''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ck''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.
----

== Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ck''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.
----

== Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.
----

== Zaključek ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

2017-05-01T20:00:56Z

Tajda Buh: New page: == UVOD == Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med...

== UVOD ==

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev ''E.coli'', ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (''Ph''ANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikozilsintetaza (''At''3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).
----

== ANTOCIANIN O-METILTRANSFERAZE IZ RAZLIČNIH ORGANIZMOV ==

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija ''E. coli'' BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (''Vv''AOMT), sledili so AOMT iz ciklame (''Ck''OMT2), paradižnika (''Sl''AOMT) in petunije (''Pf''MF2 in ''Ph''MF1). Sinteza z ''Vv''AOMT je bila trikrat večja od sinteze s ''Ck''OMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da ''E.coli'' BL21 ne vsebuje endogene AOMT.
----

== ŠTEVILO KOPIJ GENA VPLIVA NA TITER C3G IN P3G ==

Sprva sta bila zapisa za encima ''Ph''ANS in ''At''3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za ''Vv''AOMT oziroma ''Ck''OMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima ''Ph''ANS in ''At''3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP).
S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru ''Vv''AOMT, in sicer za devetkrat.
----

== REGULACIJA METIONIN IN S-ADENOZILMETIONIN BIOSINTEZNE POTI S CRISPRi ==

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.
----

== ZAKLJUČEK ==

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali produkcijo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

MBT seminarji 2017

2017-05-01T19:34:19Z

Tajda Buh:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar,3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) Metabolni inženiring ''E. coli'' za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-05-01T19:32:33Z

Tajda Buh:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar,3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring ''E. coli'' za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-04-25T11:16:45Z

Tajda Buh:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001 [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v ''Mycobacterium tuberculosis'']] Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkritoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) Inženiring ''Streptococcus zooepidemicus'' za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) Metabolni inženiring ''E. coli'' za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2017-03-16T13:41:43Z

Tajda Buh: /* Proteinske kletke */

http://2016.igem.org/Team:UCLA

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le-te. Izbrali so dva različna pristopa. Prvi vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je izbrala dve geometrijsko različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezane. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh peptidov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost ene podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki bodo omogočali to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vključitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila kletke. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek krvnih strdkov. Tako bi lahko potekalo zdravljenje tromboze in s tem preprečili srčne zastoje ali kapi.

V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo po cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo NaDS PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije proteze in čas cepitve. Z NaDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi omenjena proteaza. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Po vezavi CdiA na receptor pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira njeno rast. Inhibicija temleji na tem, da CdiA-CT tvori pore v notranji membrani bakterij. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči tvorbo CdiA-CT por v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil prenos treh različnih CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α. Ta naj bi bil sposoben inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDI(EC93) bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamA(E.coli). Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93), je potrebno spremeniti CdiA-CT(EC93) domeno s C končno domeno iz ''Enterobacter aerogenes''. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal C končno domeno (toksin) in ga inaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem iz ''Enterobacter aerogenes'' s spremenjeno C končno domeno in CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDI(EC93) in CDI(EC869) ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI sistema. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin s pomočjo proteinskih kletk.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

MBT seminarji 2017

2017-03-01T22:53:09Z

Tajda Buh:

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-15T20:41:09Z

Tajda Buh: /* Proteinske kletke */

http://2016.igem.org/Team:UCLA

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le-te. Izbrali so dva različna pristopa. Prvi vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je izbrala dve geometrijsko različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezane. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh peptidov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost ene podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki bodo omogočali to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vključitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila kletke. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek krvnih strdkov. Tako bi lahko potekalo zdravljenje tromboze in s tem preprečili srčne zastoje ali kapi.

V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo po cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RFC 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RFC 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo NaDS PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije proteze in čas cepitve. Z NaDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi omenjena proteaza. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Po vezavi CdiA na receptor pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira njeno rast. Inhibicija temleji na tem, da CdiA-CT tvori pore v notranji membrani bakterij. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči tvorbo CdiA-CT por v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil prenos treh različnih CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α. Ta naj bi bil sposoben inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDI(EC93) bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamA(E.coli). Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93), je potrebno spremeniti CdiA-CT(EC93) domeno s C končno domeno iz ''Enterobacter aerogenes''. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal C končno domeno (toksin) in ga inaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem iz ''Enterobacter aerogenes'' s spremenjeno C končno domeno in CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDI(EC93) in CDI(EC869) ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI sistema. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin s pomočjo proteinskih kletk.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T22:59:49Z

Tajda Buh: /* Uvod */

http://2016.igem.org/Team:UCLA

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le-te. Izbrali so dva različna pristopa. Prvi vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je izbrala dve geometrijsko različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezane. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh peptidov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost ene podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki bodo omogočali to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vključitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila kletke. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek krvnih strdkov. Tako bi lahko potekalo zdravljenje tromboze in s tem preprečili srčne zastoje ali kapi.

V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo po cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo NaDS PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije proteze in čas cepitve. Z NaDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi omenjena proteaza. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Po vezavi CdiA na receptor pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira njeno rast. Inhibicija temleji na tem, da CdiA-CT tvori pore v notranji membrani bakterij. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči tvorbo CdiA-CT por v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil prenos treh različnih CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α. Ta naj bi bil sposoben inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDI(EC93) bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamA(E.coli). Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93), je potrebno spremeniti CdiA-CT(EC93) domeno s C končno domeno iz ''Enterobacter aerogenes''. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal C končno domeno (toksin) in ga inaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem iz ''Enterobacter aerogenes'' s spremenjeno C končno domeno in CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDI(EC93) in CDI(EC869) ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI sistema. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin s pomočjo proteinskih kletk.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T22:58:54Z

Tajda Buh: /* Sistem super vojakov */

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le-te. Izbrali so dva različna pristopa. Prvi vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je izbrala dve geometrijsko različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezane. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh peptidov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost ene podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki bodo omogočali to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vključitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila kletke. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek krvnih strdkov. Tako bi lahko potekalo zdravljenje tromboze in s tem preprečili srčne zastoje ali kapi.

V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo po cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo NaDS PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije proteze in čas cepitve. Z NaDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi omenjena proteaza. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Po vezavi CdiA na receptor pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira njeno rast. Inhibicija temleji na tem, da CdiA-CT tvori pore v notranji membrani bakterij. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči tvorbo CdiA-CT por v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil prenos treh različnih CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α. Ta naj bi bil sposoben inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDI(EC93) bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamA(E.coli). Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93), je potrebno spremeniti CdiA-CT(EC93) domeno s C končno domeno iz ''Enterobacter aerogenes''. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal C končno domeno (toksin) in ga inaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem iz ''Enterobacter aerogenes'' s spremenjeno C končno domeno in CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDI(EC93) in CDI(EC869) ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI sistema. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin s pomočjo proteinskih kletk.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T22:48:30Z

Tajda Buh: /* Sistem super vojakov */

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le-te. Izbrali so dva različna pristopa. Prvi vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je izbrala dve geometrijsko različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezane. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh peptidov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost ene podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki bodo omogočali to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vključitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila kletke. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek krvnih strdkov. Tako bi lahko potekalo zdravljenje tromboze in s tem preprečili srčne zastoje ali kapi.

V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo po cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo NaDS PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije proteze in čas cepitve. Z NaDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi omenjena proteaza. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Po vezavi CdiA na receptor pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira njeno rast. Inhibicija temleji na tem, da CdiA-CT tvori pore v notranji membrani bakterij. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči tvorbo CdiA-CT por v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil translocirati tri različne CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α, ki bo sposoben selektivno inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDIEC93 bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamAE.coli. Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93+), je potrebno zamenjati CdiA-CTEC93 domeno s C končno domeno iz ATCC 13048. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal toksin (C končno domeno) in ga deaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem s spremenjeno C končno domeno in ustreznim CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali s pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDIEC93 in CDIEC869 ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI lokusa. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin s pomočjo proteinskih kletk.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T22:45:54Z

Tajda Buh: /* Sistem super vojakov */

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le-te. Izbrali so dva različna pristopa. Prvi vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je izbrala dve geometrijsko različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezane. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh peptidov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost ene podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki bodo omogočali to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vključitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila kletke. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek krvnih strdkov. Tako bi lahko potekalo zdravljenje tromboze in s tem preprečili srčne zastoje ali kapi.

V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo po cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo NaDS PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije proteze in čas cepitve. Z NaDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi omenjena proteaza. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Po vezavi CdiA na receptor pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira rast. CdiA-CT tvori pore v notranji membrani bakterij. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči odprtje CdiA-CT por v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil translocirati tri različne CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α, ki bo sposoben selektivno inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDIEC93 bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamAE.coli. Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93+), je potrebno zamenjati CdiA-CTEC93 domeno s C končno domeno iz ATCC 13048. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal toksin (C končno domeno) in ga deaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem s spremenjeno C končno domeno in ustreznim CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali s pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDIEC93 in CDIEC869 ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI lokusa. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin s pomočjo proteinskih kletk.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T22:37:05Z

Tajda Buh: /* Zaključek */

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le-te. Izbrali so dva različna pristopa. Prvi vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je izbrala dve geometrijsko različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezane. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh peptidov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost ene podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki bodo omogočali to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vključitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila kletke. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek krvnih strdkov. Tako bi lahko potekalo zdravljenje tromboze in s tem preprečili srčne zastoje ali kapi.

V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo po cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo NaDS PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije proteze in čas cepitve. Z NaDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi omenjena proteaza. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Po vezavi pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira rast tako, da v notranji membrani bakterij tvori pore. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči odprtje CdiA-CT pore v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil translocirati tri različne CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α, ki bo sposoben selektivno inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDIEC93 bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamAE.coli. Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93+), je potrebno zamenjati CdiA-CTEC93 domeno s C končno domeno iz ATCC 13048. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal toksin (C končno domeno) in ga deaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem s spremenjeno C končno domeno in ustreznim CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali s pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDIEC93 in CDIEC869 ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI lokusa. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin s pomočjo proteinskih kletk.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T22:35:50Z

Tajda Buh: /* Proteinske kletke */

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le-te. Izbrali so dva različna pristopa. Prvi vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je izbrala dve geometrijsko različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezane. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh peptidov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost ene podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki bodo omogočali to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vključitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila kletke. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek krvnih strdkov. Tako bi lahko potekalo zdravljenje tromboze in s tem preprečili srčne zastoje ali kapi.

V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo po cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo NaDS PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije proteze in čas cepitve. Z NaDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi omenjena proteaza. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Po vezavi pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira rast tako, da v notranji membrani bakterij tvori pore. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči odprtje CdiA-CT pore v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil translocirati tri različne CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α, ki bo sposoben selektivno inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDIEC93 bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamAE.coli. Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93+), je potrebno zamenjati CdiA-CTEC93 domeno s C končno domeno iz ATCC 13048. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal toksin (C končno domeno) in ga deaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem s spremenjeno C končno domeno in ustreznim CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali s pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDIEC93 in CDIEC869 ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI lokusa. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz in tako nekoč tarčno dostavljali mnogo zdravilnih učinkovin. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T22:05:39Z

Tajda Buh: /* Uvod */

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le-te. Izbrali so dva različna pristopa. Prvi vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je za osnovno proteinsko kletko izbrala dve, po geometriji različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezana. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh oligomerov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki omogočajo to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vklopitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek strdkov. Na ta način bi lahko zdravili trombozo in s tem nastanek srčnih zastojev ali kapi.
V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo ob cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi, in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Pri PCQuad M13 ni prišlo do sestave večjih struktur, saj je DLS prikazal, da imajo nastale molekule premer približno 0,9 nm. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije trombina in čas cepitve. Z SDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi trombin. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada celotne proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Po vezavi pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira rast tako, da v notranji membrani bakterij tvori pore. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči odprtje CdiA-CT pore v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil translocirati tri različne CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α, ki bo sposoben selektivno inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDIEC93 bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamAE.coli. Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93+), je potrebno zamenjati CdiA-CTEC93 domeno s C končno domeno iz ATCC 13048. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal toksin (C končno domeno) in ga deaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem s spremenjeno C končno domeno in ustreznim CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali s pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDIEC93 in CDIEC869 ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI lokusa. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz in tako nekoč tarčno dostavljali mnogo zdravilnih učinkovin. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

Seminarji SB 2016/17

2016-12-12T12:16:33Z

Tajda Buh:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)
# [[Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema]]. Tomaž Rozmarič (6.12.2016)
# [[Robusten oscilator sinteznih genov z različnimi nastavitvami periode]]. Domen Klofutar (13.12.2016)
# [[Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov]]. Petra Tavčar (13.12.2016)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)
#[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)
#[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)
#[[InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov]]. Alja Zgonc (6. 12. 2016)
#[[Mos(kit)o]]. Judita Avbelj (6. 12. 2016)
#[[BioSynthAge - Kvalitetno staranje]]. Tina Kuhar (6.12.2016)
#[[PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil]]. Tajda Buh (13.12.2016)
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2016/17

2016-12-12T12:16:08Z

Tajda Buh:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)
# [[Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema]]. Tomaž Rozmarič (6.12.2016)
# [[Robusten oscilator sinteznih genov z različnimi nastavitvami periode]]. Domen Klofutar (13.12.2016)
# [[Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov]]. Petra Tavčar (13.12.2016)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)
#[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)
#[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)
#[[InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov]]. Alja Zgonc (6. 12. 2016)
#[[Mos(kit)o]]. Judita Avbelj (6. 12. 2016)
#[[BioSynthAge - Kvalitetno staranje]]. Tina Kuhar (6.12.2016)
#[[PC SQUAD - Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil]]. Tajda Buh (13.12.2016)
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T12:07:47Z

Tajda Buh: /* Sistem super vojakov */

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le te. Izbrali so dva različna pristopa, ki bosta tarčno delovala na izbrano molekulo. Prvi pristop vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je za osnovno proteinsko kletko izbrala dve, po geometriji različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezana. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh oligomerov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki omogočajo to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vklopitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek strdkov. Na ta način bi lahko zdravili trombozo in s tem nastanek srčnih zastojev ali kapi.
V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo ob cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi, in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Pri PCQuad M13 ni prišlo do sestave večjih struktur, saj je DLS prikazal, da imajo nastale molekule premer približno 0,9 nm. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije trombina in čas cepitve. Z SDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi trombin. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada celotne proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''cdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Po vezavi pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira rast tako, da v notranji membrani bakterij tvori pore. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči odprtje CdiA-CT pore v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil translocirati tri različne CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α, ki bo sposoben selektivno inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDIEC93 bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamAE.coli. Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93+), je potrebno zamenjati CdiA-CTEC93 domeno s C končno domeno iz ATCC 13048. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal toksin (C končno domeno) in ga deaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem s spremenjeno C končno domeno in ustreznim CdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali s pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDIEC93 in CDIEC869 ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI lokusa. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz in tako nekoč tarčno dostavljali mnogo zdravilnih učinkovin. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T12:01:38Z

Tajda Buh: /* Uvod */

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil povzroča razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili le te. Izbrali so dva različna pristopa, ki bosta tarčno delovala na izbrano molekulo. Prvi pristop vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je za osnovno proteinsko kletko izbrala dve, po geometriji različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezana. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh oligomerov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki omogočajo to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vklopitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek strdkov. Na ta način bi lahko zdravili trombozo in s tem nastanek srčnih zastojev ali kapi.
V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo ob cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi, in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Pri PCQuad M13 ni prišlo do sestave večjih struktur, saj je DLS prikazal, da imajo nastale molekule premer približno 0,9 nm. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije trombina in čas cepitve. Z SDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi trombin. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada celotne proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''CdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Po vezavi pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira rast tako, da v notranji membrani bakterij tvori pore. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči odprtje CdiA-CT pore v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil translocirati tri različne CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α, ki bo sposoben selektivno inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDIEC93 bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamAE.coli. Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93+), je potrebno zamenjati CdiA-CTEC93 domeno s C končno domeno iz ATCC 13048. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal toksin (C končno domeno) in ga deaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem s spremenjeno C končno domeno in ustreznim cdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali s pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDIEC93 in CDIEC869 ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI lokusa. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz in tako nekoč tarčno dostavljali mnogo zdravilnih učinkovin. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil

2016-12-12T09:37:30Z

Tajda Buh: New page: == ''' Uvod''' == Nespecifična dostava zdravil vodi v razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili omenjene probl...

== ''' Uvod''' ==

Nespecifična dostava zdravil vodi v razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili omenjene probleme. Izbrali so dva različna pristopa s katerim bi tarčno delovali na izbrano molekulo. Prvi pristop vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
----

== ''' Proteinske kletke''' ==

Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je za osnovno proteinsko kletko izbrala dve, po geometriji različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezana. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh oligomerov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.

Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.

Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki omogočajo to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vklopitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek strdkov. Na ta način bi lahko zdravili trombozo in s tem nastanek srčnih zastojev ali kapi.
V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo ob cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.

Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi, in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.

Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Pri PCQuad M13 ni prišlo do sestave večjih struktur, saj je DLS prikazal, da imajo nastale molekule premer približno 0,9 nm. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.

V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije trombina in čas cepitve. Z SDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi trombin. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada celotne proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
----

== ''' Sistem super vojakov''' ==

Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno.
Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. ''Yershinia pseudotuberculosis'' in uropatogeni sevi ''Escherichie coli''. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri ''E. coli'', EC93.

CDI sistem je pod vplivom gruče genov ''CdiBAI''. Gen ''cdiB'' zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Po vezavi pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira rast tako, da v notranji membrani bakterij tvori pore. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Gen ''cdiI'' zapisuje za protein, ki prepreči odprtje CdiA-CT pore v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.

Cilj skupine je bil translocirati tri različne CDI sisteme iz EC93 in ''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α, ki bo sposoben selektivno inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDIEC93 bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamAE.coli. Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93+), je potrebno zamenjati CdiA-CTEC93 domeno s C končno domeno iz ATCC 13048. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal toksin (C končno domeno) in ga deaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz ''Enterobacter aerogenes'' v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem s spremenjeno C končno domeno in ustreznim cdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali s pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDIEC93 in CDIEC869 ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.

Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.

''Enterobacter aerogenes'' ATCC 13048 ima 2 CDI lokusa. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
----

== ''' Zaključek''' ==

Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz in tako nekoč tarčno dostavljali mnogo zdravilnih učinkovin. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin.
----

== ''' Viri''' ==

iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA

BIO2 Povzetki seminarjev 2013

2013-11-20T21:28:37Z

Tajda Buh: /* Tajda Buh: Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2013/2014 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2013 stran]
===Tajda Buh: Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku===

IDH sodeluje pri pomembnih presnovnih poteh. IDH je asimetričen homodimer, ki lahko prehaja iz neaktivne odprte v aktivno zaprto konformacijo. Poznamo tri vrste izocitrat dehidrogenaz. IDH3 se nahaja v mitohondriju in katalizira prehod izocitrata v α-ketoglutarat, hkrati poteče redukcija NAD+ v NADH. IDH2 se prav tako nahaja v mitohondriju, IDH1 pa najdemo v citosolu in peroksisomih. Obliki 1 in 2 reducirata NADP+ v NADPH. Mutacije se pojavljajo samo pri IDH1/2, ne pa tudi pri IDH3. Mutirana IDH lahko pridobi novo aktivnost, to je kataliziranje pretvorbe α-ketoglutarata v 2-hidroksiglutarat, aktivnost encima pa se lahko tudi močno zmanjša. Nova aktivnost povzroči prekomerno sintezo 2-hidroksiglutarata. Povečanje koncentracije slednjega pa vpliva na α-ketoglutaratno odvisne presnovne encime, kot sta prolil hidroksilaza in histonska demetilaza. Študije so do tega trenutka potrdile prisotnost mutirane IDH1 in IDH2 v nižjih stopnjah glioma, v sekundarnem glioblastomu in v akutni mieloični levkemiji.

===Vid Jazbec: Vpliv mašobnih kislin na rakave celice===

Celice ob tvorbi rakastega obolenja spremenijo svoje delovanje. Predvsem je to vidno v metabolizmu, ki je v rakastih celicah spremenjen. Novejše raziskave dokazujejo, da je odvisnost metabolima odvisna od maščobnih kislin v večji meri, kot je bilo domnevano do sedaj. Metabolizem maščobnih kislin, predvsem beta oksidacijo, rakave celice izkoristijo ob pomanjkanju ATP, kot je pokazano pri celicah z igubo stika t izvenceličnim matriksom. Proces beta oksidacije je prav tako pomemben tudi kot proces, ki vodi v nastanek NADPH, ki se potrebuje za soočanje celice z metabolnim stresom reaktivnih kisikovih zvrsti ter rast in razvoj. Za v uvodu naštete značilnosti rakavih celic pa so poleg samega procea beta oksidacije in produktov tega procesa pomembni tudi proteini, ki spremljajo ta proces. Ti so ob nastopu rakavega obolenja deregulirani in večinoma preprečujejo prehod obolele celice v apoptozo.
Raziskave pa so pokazale tudi problem dosedajšnje dogme, pri kateri sta beta oksidacija maščobnih kislin in njihova sinteza med seboj izključujoča procesa odvisna od ACC. To zavračajo raziskave rakavih celic, pri katerih se oba procesa vršita istočasno in sta enako pomemba za delovaje in ravoj celice.
Nove raziskave na področju rakavih obolenj pa so pomembne predvsem za zdravljenje bolezni.

===Rok Ferenc: Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis===

Večina proteinov živih celic deluje v kompleksih, ne posamično. Poleg stalnih proteinskih kompleksov znanstveniki po zaslugi naprednejših eksperimentalnih tehnik odkrivajo tudi medproteinske interakcije bolj prehodne narave, značilne predvsem za metabolične poti. V raziskavi se osredotočijo na formacijo metabolona (skupka proteinov) v citratnem ciklu Bacillus subtilis, ki je zelo pomemben modelni organizem in vir proizvodnje vitaminov in encimov za pralne praške. Ta bi pripomogel k organiziranosti metabolnih poti v sicer kaotični notranjosti prokariontskih celic brez organelov.
Dokazan je bil obstoj metabolona v ciklu trikarboksilnih kislin, v katerega se povezuje tudi nekaj encimov anabolizma, katerih substrati so intermediati TCA cikla (citratni cikel). V metabolonu obstaja jedro iz treh encimov: citrat sintetaze, malat dehidrogenaze in izocitrat dehidrogenaze. Interakcija med encimi glukoneogeneze, bolj natančno med malat dehidrogenazo in fosfoenol piruvat karboksikinazo je uravnavana s strani razlik v koncentracijah intermediatov glikolize in TCA cikla, torej za formacijo metabolona ni potreben noben zunanji signal, le povečana koncentracija ustreznih substratov.

===Sara Košenina: Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla===

Hipoksija je stanje, ko celice in tkiva ne dobijo dovolj kisika, zato pride do motenj v delovanju organa ali pa celo celotnega organizma. Ljudje smo za prilagoditev na hipoksijo razvili mehanizem, ki je reguliran preko heterodimernega proteinskega kompleksa HIF-1. Glavna podenota je HIF-1α, saj je občutljiva na kisik. Aktivnost HIF-1 je regulirana z različnimi mehanizmi, eni so odvisni od hipoksije, drugi pa so od nje neodvisni. Slednji so pomembni pri razvoju in napredovanju tomorjev. Eden od hipoksije neodvisnih regulatorjev je tudi piruvat, ki je začetni substrat cikla citronske kisline. V hipoksičnih pogojih pride do motenj v elektronskem transportu, zato je proizvodnja ROS (reaktivnega kisika) povečana. To je kompenzira z uravnavanjem piruvat dehidrogenaznega kompleksa (PDH) s piruvat dehidrogenazo kinazo (PDK1). Raziskave so pokazale, da etil piruvat poveča stabilnost HIF-1 s stimulacijo proizvodnje ROS v mitohondriju in blokira s pVHL regulirano razgradnjo HIF-1. Indukcija HIF-1 z etil piruvatom je povezana s pospeševanjem citratnega cikla. Etil piruvat pospeši tako citratni cikel kot tudi proizvodnjo ROS v mitohondriju. Rezultati raziskav podpirajo obstoj regulatornega mehanizma za prilagoditev na hipoksijo, pri katerem PDK1 deaktivira PDH kompleks in inhibira cikel citronske kisline in na ta način zmanjša proizvodnjo ROS. Vse te ugotovitve bi lahko pripomogle k zdravljenju hipoksije in z njo povezanega razvoja raka. Potrebnih bo še veliko raziskav, preden se bo lahko etil piruvat uporabljalo v klinične namene.

===Tjaša Bensa: α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni===

α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks (KGDHC) je en izmed encimov v Krebsovem ciklu. V procesu oksidativne dekarboksilacije katalizira reakcijo α-ketoglutarat + NAD+ + CoA-SH -> sukcinil-CoA + NADH + H+ + CO2.
Sestavljen je iz 3 podenot: α -ketoglutarat dehidrogenaze (E1), dihidrolipoil sukcinil transferaze (E2) in dihidrolipoil dehidrogenaze (E3). E3 podenota oksidira NADH v NAD+.
Reaktivne kisikove spojine oziroma reaktivne kisikove zvrsti (ROS) so zelo reaktivni prosti radikali, snovi ali molekule s kisikom. Najpogostejši ROS sta O2- (superoksid) in H2O2 (vodikov peroksid). ROS lahko reagirajo s sestavinami celice, zelo radi pa napadejo tudi KGDHC. Oksidativni stres se pojavi v našem telesu zaradi povečane koncentracije ROS. Povzroča različne bolezni, naprimer Alzheimerjevo bolezen, Parkinsonovo bolezen, diabetes, revmatoidni artritis in nevrodegeneracijo. Po drugi strani pa tudi sam KGDHC proizvaja kisikove spojine in tako se ustvari začarn krog. Ker je vse regulirano, že ob najmanjši spremembi v metabolizmu pride do proizvodnje ROS in povzročitve oksidativnega stresa.

===Filip Mihalič: Pomen MicroRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih===

MicroRNA molekule, so vrsta nekodirajočih RNA molekul dolgih približno 22 nukleotidov, in imajo celo vrsto zelo pomembnih funkcij za razvoj organizma, ter za ohranjanje metabolne homeostaze v le tem. Primarno delujejo kot zaviralec transkripcije mRNA, s tem da se nanjo vežejo, in s tem ribosomu ne pustijo prepisovanja v proteine. Prve miRNA molekule so odkrili okoli leta 1990 v glisti Caenorhabditis elegans vendar njihove vloge kot enega pomembnejših metabolnih regulatorjev niso prepoznali do začetka dvajsetega stoletja. Najdemo jih v skoraj vseh bioloških procesih povezanih z ekspresijo mRNA, od metabolizma lipidov in holesterola do inzulinske signalizacije. Njihov vpliv je velikokrat povezan z transkripcijskimi faktorji, s katerimi sodelujejo v težnji po ravno pravšnji ekspresiji genov. So dokaj pred kratkim odkrita skupina molekul, zato še niso dobro raziskane, in mehanizmi njihovega delovanja še niso povsem pojasnjeni. Najbolje sta raziskana prav vpliva na lipidno in inzulinsko homeostazo, na kateri se bom osredotočil v seminarju. Do sedanje raziskave miRNA pa so predlagale njihovo veliko uporabnost v farmaciji ter kasneje medicini, saj njihovo nepravilno delovanje privede do bolezni kot so huda predebelost, inzulinska neodzivnost (diabetes tipa 2), zamaščena jetra itd.

===Vita Vidmar: Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic===

Pentozafosfatna pot v celicah zagotavlja NADPH, ki je potreben za ohranjanje redukcijskega okolja v celici in za redukcijske biosinteze, ter riboza 5-fosfat, ki je prekurzor za sintezo nukleotidov in se po potrebi lahko reciklira nazaj v glukoza 6-fosftat. Ta v celicah poteka v majhnem obsegu, saj je skrbno regulirana, predvsem z negativnimi regulatorji.
V rakavo spremenjenih celicah zaradi poslabšane regulacije pentozafosfatna pot poteka v povečanem obsegu, kar jim omogoča pomembne prednosti. Ker proizvedejo velike količine NADPH in riboza 5-fosfata, jim to omogoča preživetje in hitrejše razmnoževanje, vpliva pa tudi na širjenje metastaz in angiogenezo (rast novih krvnih žil proti tumorju).
Poznavanje vloge pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic lahko pripomore k odkritju učinkovitejšega načina zdravljenja rakavih obolenj.

===Gregor Gunčar: Do what you want, but post your abstract here!===

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Suspendisse sed justo congue, faucibus metus in, sodales tellus. Nulla nec erat in mauris condimentum rutrum. Maecenas vel scelerisque velit, at tincidunt massa. Praesent molestie euismod diam quis iaculis. Etiam non diam malesuada, pellentesque massa id, feugiat nulla. Integer eget euismod purus. Sed dignissim lectus quis fermentum ultrices. Nunc quis scelerisque ligula, nec laoreet justo. Morbi vitae felis in nibh commodo iaculis quis ac turpis. Nam feugiat a dui a faucibus.

Cras et elementum urna. Proin vel tortor sit amet urna facilisis ultrices lobortis sit amet neque. Sed luctus convallis urna, pulvinar ullamcorper sem adipiscing sit amet. Nullam fringilla ante est. Praesent viverra tortor vel felis convallis, non placerat enim condimentum. Suspendisse rutrum fermentum odio, in molestie risus consectetur ac. Sed interdum neque ultricies, fermentum tortor quis, consequat est. Sed vel faucibus felis.

===Ema Guštin: Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka===

Otto Heinrich Warburg je bil začetnik kvantitativnih raziskav metabolizma rakavih celic, ukvarjal pa se je tudi s fotosintezo in s celičnim dihanjem. Okoli leta 1920 je s sodelavci pokazal, da v aerobnih pogojih tumorska tkiva v mlečno kislino oz. laktat pretvorijo približno desetkrat več glukoze kot celice normalnega tkiva. Ta pojav danes imenujemo Warburgov efekt. Vendar pa je za to povečanje aerobne glikolize v rakavih celicah pogosto napačno mišljeno, da se zgodi namesto mitohondrijskega dihanja, in je bilo napačno interpretirano kot dokaz za poškodbe dihanja, čeprav gre v resnici za poškodbe v regulaciji glikolize. Pravzaprav mnoge vrste rakov kažejo Warburgov efekt in pri tem ohranijo mitohondrijsko dihanje. Warburgova opažanja v povezavi s sedanjimi koncepti metabolizma raka tesno povezujejo s spremembami na mitohondrijski DNK, onkogeni in zaviralci tumorjev, torej bi njegovo hipotezo lahko izkoristili za zdravljenje raka.

===Maja Zupančič: Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje eksoresijo genov in celično signalizacijo===

Z razrešitvijo kristalne strukture proteina menina, sta Huang in Murai ugotovila, da spada v skupino ogrodnih proteinov. Nahaja se v jedru, v manjših koncentracijah pa ga lahko najdemo tudi v citoplami, izražen pa je v vseh tkivih. Kristalno strukturo jedrnega proteina menina lahko opišemo z obliko zavite leve roke, kjer N-domena predstavlja β-lasnično zanko, zgornja domena palec in osrednja domena predstavlja dlan. Ko menin reagira z peptidom MLL1 ali transkripcijskim faktorjem JunD, se povežeta v globoki žep, ki ga oblikuje struktura menina. Menin reagira s številnimi proteini (JunD, MLL1, TGFβ, SUMO, β-katenin,…) in tako vpliva na espresijo genov in celično signalizacijo. Menin sodeluje tudi pri številnih signalnih poteh,, kot so signalna pot transformirajočega rastnega faktorja β, kostnega morfogenetskega proteina, kanonične poti Wnt in signalizacija jedrnega receptorja. Pri ljudeh je protein menin kodiran z genom MEN1. Če pride do mutacije tega gena, se pojavi dedna bolezen multipla endokrina neoplazija ali Wermerjev sindrom, za katerim vsako leto zboli 1 na 30 000 ljudi. Pri multipli endokrini neoplaziji pride do tvorbe številnih tumorjev v različnih endokrinih organih. Bolezen ni ozdravljiva, lahko pa zdravimo tumorje, ki nastanejo. Z zgodnjim odkritjem bolezni in primernim ter efektivnim zdravljenjem, se prognoza lahko izboljša.

===Vesna Radić: Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa===

Uveljavljen način zdravljenja sladkorne bolezni tipa 2 je dnevni vnos inzulina v telo z injekcijami in do nedavnega je prevladovalo mnenje, da alternative temu ni. Nova študija o delovanju beta celic trebušne slinavke pod vplivom hormona betatrofina namiguje, da so temu šteti dnevi.
Na Harvard Stem Cell Institute so z uporabo peptida, ki se veže na inzulinske receptorje spodbudili odpornost na inzulin in tako identificirali hormon betatrofin. Je peptidni hormon, najden v jetrih in maščevju miši, pri človeku pa le v jetrih. Pri ljudeh se ga da izslediti z metodo western blottinga. Posredno naj bi zvišal stopnjo razmnoževanja beta celic pankreasa v procesu celične delitve.
Za ugotovitev, ali betatrofin res vpliva na stopnjo razmnoževanja beta celic, so uporabili injekcijo v veno repa, da bi prenesli izražanje betatrofina v jetra – eno od običajnih mest njegovega delovanja - povišana stopnja pomnoževanja je bila tako drastična, da so lahko zlahka prepoznali otočke in beta celice pri majhni povečavi
Pomembna lastnost zdravljenja s tem hormonom je ta, da je betatrofin zelo specifičen; ne vpliva na druga tkiva in tako bi prišlo do manj zapletov, saj bi telo proizvajalo lasten inzulin. Poleg tega prednost tudi ta, da je ta študija podlaga za razvoj klinično uporabnih celic z reprogramiranjem odraslih beta celic trebušne slinavke brez uporabe izvornih celic.

===Luka Kavčič: Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice===

Piruvat kinaza (PK) je encim, ki katalizira zadnjo stopnjo glikolize, pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat in s tem fosforilacijo ADP v ATP. Izocimska oblika M2 je pomembna v metabolizmu rakavih celic, saj zaradi manjše aktivnosti v primerjavi z M1 obliko omogoča manjši pretok skozi glikolizo ob enaki absorpciji glukoze iz krvi, kar vodi do akumulacije glikoliznih intermediatov. Ti so tako bolj dostopni biosinteznim potem v celici, kar ji omogoča hitro celično delitev ter razvoj tumorja. Prav tako je pomemben pri odzivu na oksidativni stres, saj z svojo oksidacijo posredno omogoča aktivacijo pentoza-fosfate poti, v kateri nastaja NADPH, kar predstavlja zadosten redukcijski potencial za vzpostavitev homeostaze.
Pod določenimi pogoji se lahko PKM2 translocira v jedro, kjer deluje kot transkripcijski regulator s svojo protein kinazno aktivnostjo ter fosforilira transkripcijske faktorje, kot so Stat3, histon 1 in histon 3. Ugotovljeno je bilo, da lahko fosforilacijo proteinov izvaja le v dimerni obliki, katera je najbolj zastopana oligomerna oblika PKM2 v jedru. Zaradi svoje prisotnosti v skoraj vseh rakavih celicah, je PKM2 atraktivna tarča zdravljenja. Zadnje raziskave kažejo na testiranje različnih aktivatorjev, ki bi z povečano aktivnostjo encima preprečile kopičenje surovin za izgradnjo ter s tem zmanjšale rast tumorja.

===Ana Krišelj: Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih===

Sfingozin-1-fosfat (S1P) je signalna molekula, ključna za regulacijo mnogih celičnih procesov, med katere spadajo tudi celična rast in diferenciacija, apoptoza, migracija celic in mitoza. Nastane s fosforilacijo sfingozina, proces pa je reguliran preko sfingozin kinaze (SK), ki v celicah nastopa v dveh izooblikah – SK1 in SK2.
S1P lahko deluje znotraj ali zunajcelično - lahko se veže na proteine v celicah (HDAC1/2, TRAF2..) ali na membranske receptorje S1PR1-5, ki spadajo v družino z G-proteini sklopljenih receptorjev. Zaradi kompleksne regulacije je S1P možen povzročitelj bolezni, ki se kot le-te izrazijo zaradi napak v mehanizmu delovanja same signalne poti, bodisi zaradi SK ali S1PR receptorjev. Napake se izrazijo kot vrsta kardiovaskularnih (ateroskleroza), vnetnih (astma, multipla skleroza), rakavih in nekaterih drugih obolenjih (diabetes, ishemija).
Vloga S1P in razumevanje molekularnega mehanizma teh bolezni torej ponuja nova področja in možnost raziskovanja v smeri odkrivanja potencialnih zdravil.

===Katjuša Triplat:Signalizacija s člani TGF –ß pri žilni morfogenezi in boleznih===
TGF-β je vrsta citokina, ki uravnava proliferacijo, celično diferenciacijo in druge funkcije v večini celic. Transformirajoči rastni faktor – ß (TGF–ß) naddružina je velika skupina beljakovin, ki jo sestavlja 33 različnih članov, ki vključujejo: TGFß – proteine, kostne morfogenetične proteine (BMP), rastne diferenciacijske faktorje (GDF), aktivine, inhibine, nodalne in »lefty« proteine ter Müllerjevo inhibitorno substanco (MIS). Člani družine transformirajočih rastnih faktorjev – ß (TGF–ß) igrajo pomembno vlogo pri razvoju zarodka, homeostazi odraslega in pri različnih boleznih. Ti citokini izzovejo svoje učinke na celice preko specifičnih serin/treonin kinaznih receptorjev tipa I in II ter intracelularnih transkripcijskih foktorjev Smad in s tem povzročijo signalno kaskado. Prenos signalov lahko poteka po Smad – odvisni ali Smad – neodvisni poti. TGF-ß signalna pot kontrolira celično proliferacijo, prepoznavanje, diferenciacijo, apoptozo in specifikacijo razvojne usode med embriogenezo in v zrelih tkivih. Inaktivacija te poti tako prispeva k tumorogenezi. Genetske študije na miših in ljudeh so pokazale pomembno vlogo TGF-β signalnih elementov v žilni morfogenezi in njeni disfunkciji. Izguba TGF-β signalnih elementov privede, zaradi nepravilnega nastanka kapilar ali okvarjene diferenciacije in pridobivanja gladko mišičnih celic, do nenormalnega nastanka primitivnega žilnega pleteža in zmanjšane integritete žilnih sten.

===Urša Kapš: Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni===

Za življenje je pomembno uravnavanje metabolične energije. V mnogih organizmih so celične lipidne kapljice in trigliceridi največji shranjevalci energije. Preobilica zalog ali pomanjkanje tvorjenja in obnavljanja maščob vodijo do številnih človeških bolezni, kot so lipodistrofija (genetske okvare v lipidnih zalogah), rakava kaheksija (kompleksen metabolični sindrom, povezan z nenadno izgubo zaloge lipidov), prekomerna debelost, steatoza jeter (bolezen zamaščenih jeter) in kardiovaskularne bolezni (bolezni srca in ožilja, najpogostejša je ateroskleroza = poapnenje žil). Nevaren je tudi nastanek penastih celic (makrofagi, ki imajo nakopičeno veliko količino holesterolnih estrov), ki zamašijo žilo. Maščoba je shranjena v lipidnih kapljicah, vendar je, kljub njihovi pomembnosti za celico in fiziologijo organizma, relativno malo znano o njihovih mnogih osnovnih procesih v različnih tkivih. Pomembni proteini, ki regulirajo zalogo lipidov in številni geni, ki kodirajo proteine lipidnih kapljic, ki so povezani z metaboličnimi boleznimi, so že identificirani. Na primer BSCL2 so geni, ki kodirajo transmembranski protein seipin, katerega funkcija je izražena v lipidni biosintetski poti. V zadnjem času se je zanimanje in število raziskav na področju zalog lipidov, raznih novih pristopov za zdravljenje bolezni, povezanih s premalo ali preveliko zalogo maščob, drastično povečalo, kar nas bo pripeljalo do novih dognanj in boljšega znanja na tem področju znanosti.

===Tim Božič: Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje ===

Hormon serotonin nastane iz triptofana s pomočjo triptofan hidroksilaze in aktivira serotoninske receptorje, ki se nahajajo v živčnih celicah. Aktivirani, regulirajo številne druge nevrotransmitorje in hormone, ki vplivajo na naše razpoloženje. Serotoninski receptorji pravilno funkcionirajo le, kadar so izraženi na površini živčnih celic. Površinsko izražanje teh je pogojeno z motoričnimi proteini, kinezini, ki so sestavljeni iz glave, pecljatega dela in repa. Ti najprej vežejo vezikel serotoninskih receptorjev na svojo FHA domeno, nato pa se s tristopenjskim procesom, pri katerem je potrebna energija (v obliki ATP), pomikajo po mikrotubulih do plazmaleme. V primeru okvare kinezinskih transporterjev se vezikli s serotoninskimi receptorji akumulirajo v citoplazmi. Posledica je abnormalno vedenje osebkov, ki kaže na simptome tesnobe. Simptome je mogoče zdraviti z antidepresivi SSRI, kot so Prozac, Celexa, Luvox, Zoloft, Paxil, Lexapro in drugi. Ti z vezanjem na serotoninski transporter povečajo raven serotonina izven celice. Kljub temu mehanizem delovanja SSRI antidepresivov v celoti še ni poznan.

===Domen Klofutar: Lipoliza - reguliran multiencimski kompleks, ki vpliva na katabolizem zalog maščobe===

Maščobne kisline, ki v našem telesu služijo kot zaloga energije, se s pomočjo različnih encimov in transporterjev prenesejo do maščobnega tkiva, kjer se shranijo v obliki maščobnih kapljic. Maščobne kapljice so strukture obdane z enojnim lipidnim slojem, v katerih so shranjeni trigliceridi. Ko telo prejme signal, da primanjkuje energije, se njihove zaloge začnejo sproščati iz maščobnih kapljic v kri, nato pa se s serumskim albuminom prenesejo do oksidativnih tkiv, kjer se z β-oksidacijo pretvorijo v acetil CoA. Proces razgradnje trigliceridov in njihovo skladiščenje je močno reguliran proces. Njihovo razgradnjo katalizirajo različni encimi. Najpomembnejši so maščobna triglicerid lipaza, od hormonov odvisna lipaza in monoglicerid lipaza. Maščobna triglicerid lipaza ATGL je regulirana z aktivatorjem CGI-58 in inhibitorjem G0S2, aktivnost od hormonov odvisne lipaze HSL pa se uravnava s fosforilacijo. Monoglicerid lipaza MGL ima vlogo v katabolizmu trigliceridov in tudi pri endokanabinoidni signalizaciji. Če v telesu nastopi kakršnakoli okvara tega regulatornega sistema lipaz, nastopijo različne bolezni. Te bolezni so posledica kopičenja trigliceridov v celicah oziroma pomanjkanja prostih maščobnih kislin, ki se lahko prenesejo v kri.

===Aneja Tahirovič: Omega-3 maščobne kisline in njihov vpliv na človeško telo===

Esencialne maščobne kisline so tiste, ki so za telo pomembne, vendar jih ni sposobno sintetizirati samo. Mednje spadajo tudi omega-3 maščobne kisline in omega-6 maščobne kisline.
Omega-3 maščobne kisline se nahajajo v morskih živalih, školjkah in nekaterih suho-zemnih rastlinah.
Omega-6 maščobne kisline pa najdemo v oljih in hrani živalskega izvora. Pomembno je uravnavanje ravnotežja, obeh maščobnih kislin, v telesu.
V primeru presežka omega-6 maščobnih kislin, pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo provnetno. V tem primeru pride do večjega tveganja za razvoj bolezni, kot so rak, kardiovaskularne in avtoimunske bolezni.
Ob presežku omega-3 maščobnih kislin pa pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo protivnetno in zavirajo bolezenske procese. Ugotovljeno je bilo, da omega-3 maščobne kisline dobro delujejo kot preventiva za nastanek srčno-žilnih bolezni, rakavih obolenj, za preprečitev razvoja Alzheimerjeve bolezni ter drugih nevrodegenerativnih bolezni, zmanjšajo možnost za razvoj depresije ter povečajo absorbcijo kalcija in s tem zmanjšajo možnosti za nastanek revmatoidnega artritisa in parodontitisa.
Kolikšna količina omega-3 maščobnih kislin je za telo zdrava, je odvisno od starosti. Novorojenčki in otroci do prvega leta starosti, maščobnih kislin omega-3 še ne smejo uživati, zato je pomembno, da jih toliko več, uživajo matere že med nosečnostjo.

===Jure Fabjan: Oksidativni in nitrozativni stres v nevrotoksičnosti amonijaka===

Hiperamoniemija je stanje povišane koncentracije amonijaka v krvi. Korelacija med koncentracijo amonijaka v krvi in stopnjo HA ni dobro raziskana, saj so simptomi pri obolelih z isto koncentracijo amonijaka različni. Zdravi se jo z različnimi zdravili, odvisno od njenega vzroka. Zdravljenje deluje na principu omejevanja vnosa amonijaka ter povečanja njegovega izločanja. HA lahko nato preide v možganski edem ali hepatično encefalopatijo. Hepatična encefalopatija se zdravi z antibiotiki, intermediati cikla uree in drugimi substancami, vendar so zdravila bodisi dokaj neučinkovita, ali pa imajo stranske učinke. Pri bolnikih, katerih hepatična encefalopatija je posledica akutne odpovedi jeter, je že v začetnih stopnjah potrebna presaditev jeter.
Kakšne so poti na molekulski ravni, ki vodijo do takih posledic, je še vedno v veliki meri misterij, vendar je sedaj vsaj znano, da povišana koncentracija amonijaka povzroči tvorbo reaktivnih kisikovih in dušikovih zvrsti, te pa v veliki meri povzročajo simptome, ki so enaki simptomom hepatične encefalopatije.

===Maruša Prolič-Kalinšek: Vloga PPAR pri razgradnji maščobnih kislin===

Receptorji aktivirani s proliferatorjem periksosomov ( PPARs ) so del družine z ligandom aktiviranimi transkripcijskimi faktorji. Prvotno so jih identifirali kot receptorje, ki inducirajo proliferacijo peroksisomov v celici, od tod tudi ime. PPARs imajo pomembno vlogo pri regulaciji celične diferenciacije, razvoja, metabolizma ( maščob, ogljikovih hidratov in proteinov ), karcinogeneze in vnetja. Njihovi naravno nastopajoi ligandi so maščobne kislini in razni derivati maščobnih kislin, obstaja pa tudi že več sintetičnih ligandov. Poznamo PPAR alfa, PPAR beta in PPAR gama in imajo enak osnoven mehanizem delovanja, so aktivirani z maščobnimi kislinami in njihovimi derivati ter si delijo veliko tarčnih genov. V jedru reagirajo tako, da tvorijo heterodimerje z drugimi jedrnimi receptorji RXR ( retinoid X receptor ) in se nato vežejo na regulatorne regije DNA v bližini genov, katerim potem spremenijo hitrost transkripicije ( povečajo ali zmanjšajo ). Podtipi PPARs se razlikujejo v in vivo funkcijah. PPAR gama je največ v adipocitnem tkivu in jetrih. Ima vlogo pri vklopitvi genov potrebnih za diferenciacijo adipocitov in genov za proteine, ki so potrebni pri sintezi in shrambi lipidov. PPAR alfa je izražen v jetrih, ledvicah, srcu, skeletni mišici in BAT. V jetrih PPAR vklopi gene za vnos in beta oksidacijo maščobnih kislin ter formacijo ketonskih telesc med stradanjem. PPAR beta se odziva na spremembe v prehranskih lipidih. PPAR beta je aktiven v jetrih in mišicah in stimulira veliko genov, ki kodirajo proteine za beta oksidacijo. Povzroči kurjenje maščob, izgubo teže in termogenezo.

===Jan Rozman: Proteini - alternativni vir energije rastlin ob pomanjkanju ogljikovih hidratov===

Ker je celica najmanjša gradbena enota, ki kaže znake življenja, morajo biti procesi znotraj nje kar najbolj optimizirani in dobro regulirani. Poleg tega, mora celica ves čas izvajati regulacijo procesov glede na stanje metabolitov v njej sami in glede na okolje, hranila, ki jih pridobiva iz njega. Za množico teh procesov skrbi TOR omrežje. Običajno je vir energije glukoza, ki jo rastlina proizvede s fotosintezo, a če nastopi obdobje, ko je ni, se mora celica zateči k alternativnim substratom. V tem seminarju sem se najbolj osredotočil na proteine, sicer pa so lahko nadomestek še lipidi in klorofil. Proteini se lahko razgradijo na dva načina, z avtofagijo ali v proteosomu. S tem celica pridobi aminokisline, ki jih lahko porabi za sintezo novih proteinov, ali pa jih razgradi v mitohondriju in na ta način pridobi elektrone za dihalno verigo in energijo v obliki ATP. V primerjavi z energijo, ki se jo lahko pridobi z razkrojem saharoze, je ta pri degradaciji proteinov pičla, a zadostuje, da celica in z njo rastlina preživi temno obdobje, ko primanjkuje ogljika v obliki CO2 iz zraka.

===Simon Bolta: C4 fotosinteza===

V splošnem poznamo 3 različne fotosintetske poti, ki potekajo v različnih rastlinah. To so C3, C4 in CAM fotosinteza. Najbolj razširjena je C3 fotosinteza. Pri tej se pojavi problem zaradi nespecifičnosti encima rubisko. Ta načeloma veže CO2 na ribulozo-1,5-bisfosfat. Zaradi svoje nespecifičnosti pa lahko namesto CO2 veže O2. Posledično ne pride do fiksacije ogljika, produkt 2-fosfoglikolat pa je škodljiv za celico, in je metabolni odpadek. Temu procesu pravimo fotorespiracija. Tako prihaja do velikih energetskih izgub, prav tako pa tudi do manjše učinkovitosti izrabe dušika ter vode. Zato se je razvila C4 fotosinteza. Pri tej je vzpostavljen mehanizem, preko katerega je CO2 zelo koncentriran ob rubisku. To učinkovito zavira fotorespiracijo, ter izboljšuje efektivnost rastlin pri fiksaciji dušika in porabi vode. Dandanes so je vse večja problematika glede prehrane svetovnega prebivalstva. Če bi nam uspelo inducirati C4 fotosintezo v C3 rastlinah, bi to povečalo hektarski donos, zato se v zadnjih letih precej dela na tovrstnem inženiringu. Poleg tega bi bila zadeva koristna za uporabo biogoriv. Zaenkrat znanstveniki še niso uspeli ugotoviti uspešne metode, preko katerih bi lahko potem ustvarili korist za širše množice ljudi.

BIO2 Seminar 2013

2013-11-12T17:35:31Z

Tajda Buh: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 13:00 do 16:00.

Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema*'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Triplat Katjuša||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892410001212 Signalizacija s člani TGF – β pri žilni morfogenezi in boleznih]||Ipšek Rok||Štukelj Sabina||Krmpotić Luka||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Krišelj Ana||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892411001772 Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih] ||Tavčar Petra||Zgonc Alja||Petrič Boštjan||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Zupančič Maja||12||[http://www.cell.com/trends/biochemical-sciences//retrieve/pii/S0968000413000911?showall%3Dtrue&_returnURL=http%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0968000413000911%3Fshowall%3Dtrue Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje ekspresijo genov in celično signalizacijo]||Guštin Ema||Jakše Helena||Bolta Simon||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Božič Tim||12||[http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247%2813%2900021-1 Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje]||Oblak Zvonar Eva||Strašek Nika||Juteršek Mojca||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Vidmar Vita||14||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2013#Vita_Vidmar:_Vloga_pentozafosfatne_poti_v_metabolizmu_rakavih_celic Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic]||Rupert Jakob||Nagode Toni||Vidak Eva||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Radić Vesna||14||[http://www.nature.com/news/liver-hormone-offers-hope-for-diabetes-treatment-1.12878 Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa]||Triplat Katjuša||Ipšek Rok||Štukelj Sabina||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Guštin Ema||14||[http://www.nature.com/nrc/journal/v11/n5/full/nrc3038.html Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka]||Krišelj Ana||Tavčar Petra||Zgonc Alja||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Kapš Urša||15||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3721468/ Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni]||Zupančič Maja||Guštin Ema||Jakše Helena||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Kavčič Luka||15||[http://www.cell.com/trends/endocrinology-metabolism//retrieve/pii/S1043276012001166?_returnURL=http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1043276012001166?showall=true Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice]||Božič Tim||Oblak Zvonar Eva||Strašek Nika||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Mihalič Filip||15||[http://www.nature.com/nrm/journal/v13/n4/full/nrm3313.html Pomen microRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih]||Vidmar Vita||Rupert Jakob||Nagode Toni||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Košenina Sara||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0304383510001436? Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla]||Radić Vesna||Triplat Katjuša||Ipšek Rok||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Bensa Tjaša||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925443909001926 α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni]||Horvat Marjeta||Krišelj Ana||Tavčar Petra||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Ferenc Rok||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717610000868 Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis]||Kapš Urša||Zupančič Maja||Guštin Ema||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Buh Tajda||16||[http://jnci.oxfordjournals.org/content/102/13/932.long Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku]||Kavčič Luka||Božič Tim||Oblak Zvonar Eva||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Jazbec Vid||17||[http://www.nature.com/nrc/journal/v13/n4/full/nrc3483.html Vpliv maščobnih kislin na rakave celice]||Mihalič Filip||Vidmar Vita||Rupert Jakob||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Tahirović Aneja||17||[http://www.nature.com/news/fish-oil-supplement-research-remains-murky-1.11484 Omega - 3 maščobne kisline in njihov vpliv na človeško telo]||Košenina Sara||Radić Vesna||Triplat Katjuša||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Klofutar Domen||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163782710000524 Lipoliza - reguliran multiencimski kompleks, ki vpliva na katabolizem zalog maščobe]||Bensa Tjaša||Horvat Marjeta||Krišelj Ana||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Prolič - Kalinšek Maruša||17||[http://www.nature.com/cr/journal/v20/n2/abs/cr201013a.html Vloga PPAR pri razgradnji maščobnih kislin]||Ferenc Rok||Kapš Urša||Zupančič Maja||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Fabjan Jure||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0197018612003506 Oksidativni in nitrozativni stres v nevrotoksičnosti amoniaka]||Buh Tajda||Kavčič Luka||Božič Tim||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Rozman Jan||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1360138511001063 Proteini - Alternativni vir energije rastlin ob pomanjkanju ogljikovih hidratov]||Jazbec Vid||Mihalič Filip||Vidmar Vita||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Prezelj Peter||18||[http://ajcn.nutrition.org/content/83/2/500S.abstract?sid=e4e3425c-566d-4249-a604-0cfc846f1972 Aminokisline in regulacija proteinske sinteze v skeletnem mišičnem tkivu]||Tahirović Aneja||Košenina Sara||Radić Vesna||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Omahna Aljaž||18||Moj izbrani naslov||Klofutar Domen||Bensa Tjaša||Horvat Marjeta||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Taškar Jan||19||Moj izbrani naslov||Prolič - Kalinšek Maruša||Ferenc Rok||Kapš Urša||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Kašnik Urška||19||Moj izbrani naslov||Fabjan Jure||Buh Tajda||Kavčič Luka||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Kostanjevec Mojca||19||Moj izbrani naslov||Rozman Jan||Jazbec Vid||Mihalič Filip||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Krmpotić Luka||19||Moj izbrani naslov||Prezelj Peter||Tahirović Aneja||Košenina Sara||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Petrič Boštjan||19||Moj izbrani naslov||Omahna Aljaž||Klofutar Domen||Bensa Tjaša||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Bolta Simon||20||Moj izbrani naslov||Taškar Jan||Prolič - Kalinšek Maruša||Ferenc Rok||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Juteršek Mojca||20||Moj izbrani naslov||Kašnik Urška||Fabjan Jure||Buh Tajda||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Vidak Eva||20||Moj izbrani naslov||Kostanjevec Mojca||Rozman Jan||Jazbec Vid||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Štukelj Sabina||21||Moj izbrani naslov||Krmpotić Luka||Prezelj Peter||Tahirović Aneja||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Zgonc Alja||21||Moj izbrani naslov||Petrič Boštjan||Omahna Aljaž||Klofutar Domen||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Jakše Helena||21||Moj izbrani naslov||Bolta Simon||Taškar Jan||Prolič - Kalinšek Maruša||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Strašek Nika||22||[http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/120/23/4496.short Porfirija: napredek v diagnostiki in zdravljenju]||Juteršek Mojca||Kašnik Urška||Fabjan Jure||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Nagode Toni||22||Moj izbrani naslov||Vidak Eva||Kostanjevec Mojca||Rozman Jan||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Ipšek Rok||22||Moj izbrani naslov||Štukelj Sabina||Krmpotić Luka||Prezelj Peter||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Tavčar Petra||23||Moj izbrani naslov||Zgonc Alja||Petrič Boštjan||Omahna Aljaž||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Horvat Marjeta||23||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741000718X Uravnavanje metabolizma železa pri sesalcih] ||Jakše Helena||Bolta Simon||Taškar Jan||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Oblak Zvonar Eva||23||Moj izbrani naslov||Strašek Nika||Juteršek Mojca||Kovačič Matic||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Rupert Jakob||23||Moj izbrani naslov||Nagode Toni||Vidak Eva||Kostanjevec Mojca||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2013|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2013

2013-11-08T22:39:23Z

Tajda Buh: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2013/2014 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2013/2014 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2013 stran]
===Tajda Buh: Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku===

IDH je asimetričen homodimer, ki lahko prehaja iz neaktivne odprte v aktivno zaprto konformacijo. Poznamo tri vrste izocitrat dekarboksilaze. IDH3 se nahaja v mitohondriju in katalizira prehod izocitrata v α-ketoglutarat in NAD+/NADH. IDH2 se prav tako nahaja v mitohondriju, IDH1 pa najdemo v citosolu in peroksisomih. Oba pa pretvarjata NADP+ v NADPH. Pomembno je bilo odkritje, da se mutacije pojavljajo vedno na istem mestu. Mutirana IDH lahko pridobi novo aktivnost, to je kataliziranje pretvorbe α-ketoglutarata v 2-hidroksiglutarat. Mutirana IDH pa lahko tudi izgubi aktivnost in ni več zmožna katalizirati oksidativno dekarboksilacijo izocitrata. Nova aktivnost povzroči prekomerno sintezo 2-hidroksiglutarata. Povečanje koncentracije 2-hidroksiglutarata vplivajo na α-ketoglutaratne odvisne presnovne encime. Kot so PDH, p53-iduciran α (II) kolagen prolil-4-hidroksilaza... Študije so do tega trenutka potrdile prisotnost mutacij IDH1 in IDH2 v nižjih stopnjah glioma, v sekundarnem glioblastomu, kot pa tudi v akutni mieloični levkemiji.

===Vid Jazbec: Vpliv mašobnih kislin na rakave celice===

Celice ob tvorbi rakastega obolenja spremenijo svoje delovanje. Predvsem je to vidno v metabolizmu, ki je v rakastih celicah spremenjen. Novejše raziskave dokazujejo, da je odvisnost metabolima odvisna od maščobnih kislin v večji meri, kot je bilo domnevano do sedaj. Metabolizem maščobnih kislin, predvsem beta oksidacijo, rakave celice izkoristijo ob pomanjkanju ATP, kot je pokazano pri celicah z igubo stika t izvenceličnim matriksom. Proces beta oksidacije je prav tako pomemben tudi kot proces, ki vodi v nastanek NADPH, ki se potrebuje za soočanje celice z metabolnim stresom reaktivnih kisikovih zvrsti ter rast in razvoj. Za v uvodu naštete značilnosti rakavih celic pa so poleg samega procea beta oksidacije in produktov tega procesa pomembni tudi proteini, ki spremljajo ta proces. Ti so ob nastopu rakavega obolenja deregulirani in večinoma preprečujejo prehod obolele celice v apoptozo.
Raziskave pa so pokazale tudi problem dosedajšnje dogme, pri kateri sta beta oksidacija maščobnih kislin in njihova sinteza med seboj izključujoča procesa odvisna od ACC. To zavračajo raziskave rakavih celic, pri katerih se oba procesa vršita istočasno in sta enako pomemba za delovaje in ravoj celice.
Nove raziskave na področju rakavih obolenj pa so pomembne predvsem za zdravljenje bolezni.

===Rok Ferenc: Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis===

Večina proteinov živih celic deluje v kompleksih, ne posamično. Poleg stalnih proteinskih kompleksov znanstveniki po zaslugi naprednejših eksperimentalnih tehnik odkrivajo tudi medproteinske interakcije bolj prehodne narave, značilne predvsem za metabolične poti. V raziskavi se osredotočijo na formacijo metabolona (skupka proteinov) v citratnem ciklu Bacillus subtilis, ki je zelo pomemben modelni organizem in vir proizvodnje vitaminov in encimov za pralne praške. Ta bi pripomogel k organiziranosti metabolnih poti v sicer kaotični notranjosti prokariontskih celic brez organelov.
Dokazan je bil obstoj metabolona v ciklu trikarboksilnih kislin, v katerega se povezuje tudi nekaj encimov anabolizma, katerih substrati so intermediati TCA cikla (citratni cikel). V metabolonu obstaja jedro iz treh encimov: citrat sintetaze, malat dehidrogenaze in izocitrat dehidrogenaze. Interakcija med encimi glukoneogeneze, bolj natančno med malat dehidrogenazo in fosfoenol piruvat karboksikinazo je uravnavana s strani razlik v koncentracijah intermediatov glikolize in TCA cikla, torej za formacijo metabolona ni potreben noben zunanji signal, le povečana koncentracija ustreznih substratov.

===Sara Košenina: Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla===

Hipoksija je stanje, ko celice in tkiva ne dobijo dovolj kisika, zato pride do motenj v delovanju organa ali pa celo celotnega organizma. Ljudje smo za prilagoditev na hipoksijo razvili mehanizem, ki je reguliran preko heterodimernega proteinskega kompleksa HIF-1. Glavna podenota je HIF-1α, saj je občutljiva na kisik. Aktivnost HIF-1 je regulirana z različnimi mehanizmi, eni so odvisni od hipoksije, drugi pa so od nje neodvisni. Slednji so pomembni pri razvoju in napredovanju tomorjev. Eden od hipoksije neodvisnih regulatorjev je tudi piruvat, ki je začetni substrat cikla citronske kisline. V hipoksičnih pogojih pride do motenj v elektronskem transportu, zato je proizvodnja ROS (reaktivnega kisika) povečana. To je kompenzira z uravnavanjem piruvat dehidrogenaznega kompleksa (PDH) s piruvat dehidrogenazo kinazo (PDK1). Raziskave so pokazale, da etil piruvat poveča stabilnost HIF-1 s stimulacijo proizvodnje ROS v mitohondriju in blokira s pVHL regulirano razgradnjo HIF-1. Indukcija HIF-1 z etil piruvatom je povezana s pospeševanjem citratnega cikla. Etil piruvat pospeši tako citratni cikel kot tudi proizvodnjo ROS v mitohondriju. Rezultati raziskav podpirajo obstoj regulatornega mehanizma za prilagoditev na hipoksijo, pri katerem PDK1 deaktivira PDH kompleks in inhibira cikel citronske kisline in na ta način zmanjša proizvodnjo ROS. Vse te ugotovitve bi lahko pripomogle k zdravljenju hipoksije in z njo povezanega razvoja raka. Potrebnih bo še veliko raziskav, preden se bo lahko etil piruvat uporabljalo v klinične namene.

===Tjaša Bensa: α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni===

α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks (KGDHC) je en izmed encimov v Krebsovem ciklu. V procesu oksidativne dekarboksilacije katalizira reakcijo α-ketoglutarat + NAD+ + CoA-SH -> NADH + H+ + CO2.
Sestavljen je iz 3 podenot: α -ketoglutarat dehidrogenaze (E1), dihidrolipoil sukcinil transferaze (E2) in dihidrolipoil dehidrogenaze (E3). E3 podenota oksidira NADH v NAD+.
Reaktivne kisikove spojine oziroma reaktivne kisikove zvrsti (ROS) so zelo reaktivni prosti radikali, snovi ali molekule s kisikom. Najpogostejši ROS sta O2- (superoksid) in H2O2 (vodikov peroksid). ROS lahko reagirajo s sestavinami celice, zelo radi pa napadejo tudi KGDHC. Oksidativni stres se pojavi v našem telesu zaradi povečane koncentracije ROS. Povzroča različne bolezni, naprimer Alzheimerjevo bolezen, Parkinsonovo bolezen, diabetes, revmatoidni artritis in nevrodegeneracijo. Po drugi strani pa tudi sam KGDHC proizvaja kisikove spojine in tako se ustvari začarn krog. Ker je vse regulirano, že ob najmanjši spremembi v metabolizmu pride do proizvodnje ROS in povzročitve oksidativnega stresa.

===Filip Mihalič: Pomen MicroRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih===

MicroRNA molekule, so vrsta nekodirajočih RNA molekul dolgih približno 22 nukleotidov, in imajo celo vrsto zelo pomembnih funkcij za razvoj organizma, ter za ohranjanje metabolne homeostaze v le tem. Primarno delujejo kot zaviralec transkripcije mRNA, s tem da se nanjo vežejo, in s tem ribosomu ne pustijo prepisovanja v proteine. Prve miRNA molekule so odkrili okoli leta 1990 v glisti Caenorhabditis elegans vendar njihove vloge kot enega pomembnejših metabolnih regulatorjev niso prepoznali do začetka dvajsetega stoletja. Najdemo jih v skoraj vseh bioloških procesih povezanih z ekspresijo mRNA, od metabolizma lipidov in holesterola do inzulinske signalizacije. Njihov vpliv je velikokrat povezan z transkripcijskimi faktorji, s katerimi sodelujejo v težnji po ravno pravšnji ekspresiji genov. So dokaj pred kratkim odkrita skupina molekul, zato še niso dobro raziskane, in mehanizmi njihovega delovanja še niso povsem pojasnjeni. Najbolje sta raziskana prav vpliva na lipidno in inzulinsko homeostazo, na kateri se bom osredotočil v seminarju. Do sedanje raziskave miRNA pa so predlagale njihovo veliko uporabnost v farmaciji ter kasneje medicini, saj njihovo nepravilno delovanje privede do bolezni kot so huda predebelost, inzulinska neodzivnost (diabetes tipa 2), zamaščena jetra itd.

===Vita Vidmar: Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic===

Pentozafosfatna pot v celicah zagotavlja NADPH, ki je potreben za ohranjanje redukcijskega okolja v celici in za redukcijske biosinteze, ter riboza 5-fosfat, ki je prekurzor za sintezo nukleotidov in se po potrebi lahko reciklira nazaj v glukoza 6-fosftat. Ta v celicah poteka v majhnem obsegu, saj je skrbno regulirana, predvsem z negativnimi regulatorji.
V rakavo spremenjenih celicah zaradi poslabšane regulacije pentozafosfatna pot poteka v povečanem obsegu, kar jim omogoča pomembne prednosti. Ker proizvedejo velike količine NADPH in riboza 5-fosfata, jim to omogoča preživetje in hitrejše razmnoževanje, vpliva pa tudi na širjenje metastaz in angiogenezo (rast novih krvnih žil proti tumorju).
Poznavanje vloge pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic lahko pripomore k odkritju učinkovitejšega načina zdravljenja rakavih obolenj.

===Gregor Gunčar: Do what you want, but post your abstract here!===

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Suspendisse sed justo congue, faucibus metus in, sodales tellus. Nulla nec erat in mauris condimentum rutrum. Maecenas vel scelerisque velit, at tincidunt massa. Praesent molestie euismod diam quis iaculis. Etiam non diam malesuada, pellentesque massa id, feugiat nulla. Integer eget euismod purus. Sed dignissim lectus quis fermentum ultrices. Nunc quis scelerisque ligula, nec laoreet justo. Morbi vitae felis in nibh commodo iaculis quis ac turpis. Nam feugiat a dui a faucibus.

Cras et elementum urna. Proin vel tortor sit amet urna facilisis ultrices lobortis sit amet neque. Sed luctus convallis urna, pulvinar ullamcorper sem adipiscing sit amet. Nullam fringilla ante est. Praesent viverra tortor vel felis convallis, non placerat enim condimentum. Suspendisse rutrum fermentum odio, in molestie risus consectetur ac. Sed interdum neque ultricies, fermentum tortor quis, consequat est. Sed vel faucibus felis.

===Ema Guštin: Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka===

Otto Heinrich Warburg je bil začetnik kvantitativnih raziskav metabolizma rakavih celic, ukvarjal pa se je tudi s fotosintezo in s celičnim dihanjem. Okoli leta 1920 je s sodelavci pokazal, da v aerobnih pogojih tumorska tkiva v mlečno kislino oz. laktat pretvorijo približno desetkrat več glukoze kot celice normalnega tkiva. Ta pojav danes imenujemo Warburgov efekt. Vendar pa je za to povečanje aerobne glikolize v rakavih celicah pogosto napačno mišljeno, da se zgodi namesto mitohondrijskega dihanja, in je bilo napačno interpretirano kot dokaz za poškodbe dihanja, čeprav gre v resnici za poškodbe v regulaciji glikolize. Pravzaprav mnoge vrste rakov kažejo Warburgov efekt in pri tem ohranijo mitohondrijsko dihanje. Warburgova opažanja v povezavi s sedanjimi koncepti metabolizma raka tesno povezujejo s spremembami na mitohondrijski DNK, onkogeni in zaviralci tumorjev, torej bi njegovo hipotezo lahko izkoristili za zdravljenje raka.

===Maja Zupančič: Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje eksoresijo genov in celično signalizacijo===

Z razrešitvijo kristalne strukture proteina menina, sta Huang in Murai ugotovila, da spada v skupino ogrodnih proteinov. Nahaja se v jedru, v manjših koncentracijah pa ga lahko najdemo tudi v citoplami, izražen pa je v vseh tkivih. Kristalno strukturo jedrnega proteina menina lahko opišemo z obliko zavite leve roke, kjer N-domena predstavlja β-lasnično zanko, zgornja domena palec in osrednja domena predstavlja dlan. Ko menin reagira z peptidom MLL1 ali transkripcijskim faktorjem JunD, se povežeta v globoki žep, ki ga oblikuje struktura menina. Menin reagira s številnimi proteini (JunD, MLL1, TGFβ, SUMO, β-katenin,…) in tako vpliva na espresijo genov in celično signalizacijo. Menin sodeluje tudi pri številnih signalnih poteh,, kot so signalna pot transformirajočega rastnega faktorja β, kostnega morfogenetskega proteina, kanonične poti Wnt in signalizacija jedrnega receptorja. Pri ljudeh je protein menin kodiran z genom MEN1. Če pride do mutacije tega gena, se pojavi dedna bolezen multipla endokrina neoplazija ali Wermerjev sindrom, za katerim vsako leto zboli 1 na 30 000 ljudi. Pri multipli endokrini neoplaziji pride do tvorbe številnih tumorjev v različnih endokrinih organih. Bolezen ni ozdravljiva, lahko pa zdravimo tumorje, ki nastanejo. Z zgodnjim odkritjem bolezni in primernim ter efektivnim zdravljenjem, se prognoza lahko izboljša.

===Vesna Radić: Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa===

Uveljavljen način zdravljenja sladkorne bolezni tipa 2 je dnevni vnos inzulina v telo z injekcijami in do nedavnega je prevladovalo mnenje, da alternative temu ni. Nova študija o delovanju beta celic trebušne slinavke pod vplivom hormona betatrofina namiguje, da so temu šteti dnevi.
Na Harvard Stem Cell Institute so z uporabo peptida, ki se veže na inzulinske receptorje spodbudili odpornost na inzulin in tako identificirali hormon betatrofin. Je peptidni hormon, najden v jetrih in maščevju miši, pri človeku pa le v jetrih. Pri ljudeh se ga da izslediti z metodo western blottinga. Posredno naj bi zvišal stopnjo razmnoževanja beta celic pankreasa v procesu celične delitve.
Za ugotovitev, ali betatrofin res vpliva na stopnjo razmnoževanja beta celic, so uporabili injekcijo v veno repa, da bi prenesli izražanje betatrofina v jetra – eno od običajnih mest njegovega delovanja - povišana stopnja pomnoževanja je bila tako drastična, da so lahko zlahka prepoznali otočke in beta celice pri majhni povečavi
Pomembna lastnost zdravljenja s tem hormonom je ta, da je betatrofin zelo specifičen; ne vpliva na druga tkiva in tako bi prišlo do manj zapletov, saj bi telo proizvajalo lasten inzulin. Poleg tega prednost tudi ta, da je ta študija podlaga za razvoj klinično uporabnih celic z reprogramiranjem odraslih beta celic trebušne slinavke brez uporabe izvornih celic.

===Luka Kavčič: Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice===

Piruvat kinaza (PK) je encim, ki katalizira zadnjo stopnjo glikolize, pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat in s tem fosforilacijo ADP v ATP. Izocimska oblika M2 je pomembna v metabolizmu rakavih celic, saj zaradi manjše aktivnosti v primerjavi z M1 obliko omogoča manjši pretok skozi glikolizo ob enaki absorpciji glukoze iz krvi, kar vodi do akumulacije glikoliznih intermediatov. Ti so tako bolj dostopni biosinteznim potem v celici, kar ji omogoča hitro celično delitev ter razvoj tumorja. Prav tako je pomemben pri odzivu na oksidativni stres, saj z svojo oksidacijo posredno omogoča aktivacijo pentoza-fosfate poti, v kateri nastaja NADPH, kar predstavlja zadosten redukcijski potencial za vzpostavitev homeostaze.
Pod določenimi pogoji se lahko PKM2 translocira v jedro, kjer deluje kot transkripcijski regulator s svojo protein kinazno aktivnostjo ter fosforilira transkripcijske faktorje, kot so Stat3, histon 1 in histon 3. Ugotovljeno je bilo, da lahko fosforilacijo proteinov izvaja le v dimerni obliki, katera je najbolj zastopana oligomerna oblika PKM2 v jedru. Zaradi svoje prisotnosti v skoraj vseh rakavih celicah, je PKM2 atraktivna tarča zdravljenja. Zadnje raziskave kažejo na testiranje različnih aktivatorjev, ki bi z povečano aktivnostjo encima preprečile kopičenje surovin za izgradnjo ter s tem zmanjšale rast tumorja.

===Ana Krišelj: Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih===

Sfingozin-1-fosfat (S1P) je signalna molekula, ključna za regulacijo mnogih celičnih procesov, med katere spadajo tudi celična rast in diferenciacija, apoptoza, migracija celic in mitoza. Nastane s fosforilacijo sfingozina, proces pa je reguliran preko sfingozin kinaze (SK), ki v celicah nastopa v dveh izooblikah – SK1 in SK2.
S1P lahko deluje znotraj ali zunajcelično - lahko se veže na proteine v celicah (HDAC1/2, TRAF2..) ali na membranske receptorje S1PR1-5, ki spadajo v družino z G-proteini sklopljenih receptorjev. Zaradi kompleksne regulacije je S1P možen povzročitelj bolezni, ki se kot le-te izrazijo zaradi napak v mehanizmu delovanja same signalne poti, bodisi zaradi SK ali S1PR receptorjev. Napake se izrazijo kot vrsta kardiovaskularnih (ateroskleroza), vnetnih (astma, multipla skleroza), rakavih in nekaterih drugih obolenjih (diabetes, ishemija).
Vloga S1P in razumevanje molekularnega mehanizma teh bolezni torej ponuja nova področja in možnost raziskovanja v smeri odkrivanja potencialnih zdravil.

===Katjuša Triplat:Signalizacija s člani TGF –ß pri žilni morfogenezi in boleznih===
TGF-β je vrsta citokina, ki uravnava proliferacijo, celično diferenciacijo in druge funkcije v večini celic. Transformirajoči rastni faktor – ß (TGF–ß) naddružina je velika skupina beljakovin, ki jo sestavlja 33 različnih članov, ki vključujejo: TGFß – proteine, kostne morfogenetične proteine (BMP), rastne diferenciacijske faktorje (GDF), aktivine, inhibine, nodalne in »lefty« proteine ter Müllerjevo inhibitorno substanco (MIS). Člani družine transformirajočih rastnih faktorjev – ß (TGF–ß) igrajo pomembno vlogo pri razvoju zarodka, homeostazi odraslega in pri različnih boleznih. Ti citokini izzovejo svoje učinke na celice preko specifičnih serin/treonin kinaznih receptorjev tipa I in II ter intracelularnih transkripcijskih foktorjev Smad in s tem povzročijo signalno kaskado. Prenos signalov lahko poteka po Smad – odvisni ali Smad – neodvisni poti. TGF-ß signalna pot kontrolira celično proliferacijo, prepoznavanje, diferenciacijo, apoptozo in specifikacijo razvojne usode med embriogenezo in v zrelih tkivih. Inaktivacija te poti tako prispeva k tumorogenezi. Genetske študije na miših in ljudeh so pokazale pomembno vlogo TGF-β signalnih elementov v žilni morfogenezi in njeni disfunkciji. Izguba TGF-β signalnih elementov privede, zaradi nepravilnega nastanka kapilar ali okvarjene diferenciacije in pridobivanja gladko mišičnih celic, do nenormalnega nastanka primitivnega žilnega pleteža in zmanjšane integritete žilnih sten.

===Urša Kapš: Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni===

Za življenje je pomembno uravnavanje metabolične energije. V mnogih organizmih so celične lipidne kapljice in trigliceridi največji shranjevalci energije. Preobilica zalog ali pomanjkanje tvorjenja in obnavljanja maščob vodijo do številnih človeških bolezni, kot so lipodistrofija (genetske okvare v lipidnih zalogah), rakava kaheksija (kompleksen metabolični sindrom, povezan z nenadno izgubo zaloge lipidov), prekomerna debelost, steatoza jeter (bolezen zamaščenih jeter) in kardiovaskularne bolezni (bolezni srca in ožilja, najpogostejša je ateroskleroza = poapnenje žil). Nevaren je tudi nastanek penastih celic (makrofagi, ki imajo nakopičeno veliko količino holesterolnih estrov), ki zamašijo žilo. Maščoba je shranjena v lipidnih kapljicah, vendar je, kljub njihovi pomembnosti za celico in fiziologijo organizma, relativno malo znano o njihovih mnogih osnovnih procesih v različnih tkivih. Pomembni proteini, ki regulirajo zalogo lipidov in številni geni, ki kodirajo proteine lipidnih kapljic, ki so povezani z metaboličnimi boleznimi, so že identificirani. Na primer BSCL2 so geni, ki kodirajo transmembranski protein seipin, katerega funkcija je izražena v lipidni biosintetski poti. V zadnjem času se je zanimanje in število raziskav na področju zalog lipidov, raznih novih pristopov za zdravljenje bolezni, povezanih s premalo ali preveliko zalogo maščob, drastično povečalo, kar nas bo pripeljalo do novih dognanj in boljšega znanja na tem področju znanosti.

===Tim Božič: Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje ===

Hormon serotonin nastane iz triptofana s pomočjo triptofan hidroksilaze in aktivira serotoninske receptorje, ki se nahajajo v živčnih celicah. Aktivirani, regulirajo številne druge nevrotransmitorje in hormone, ki vplivajo na naše razpoloženje. Serotoninski receptorji pravilno funkcionirajo le, kadar so izraženi na površini živčnih celic. Površinsko izražanje teh je pogojeno z motoričnimi proteini, kinezini, ki so sestavljeni iz glave, pecljatega dela in repa. Ti najprej vežejo vezikel serotoninskih receptorjev na svojo FHA domeno, nato pa se s tristopenjskim procesom, pri katerem je potrebna energija (v obliki ATP), pomikajo po mikrotubulih do plazmaleme. V primeru okvare kinezinskih transporterjev se vezikli s serotoninskimi receptorji akumulirajo v citoplazmi. Posledica je abnormalno vedenje osebkov, ki kaže na simptome tesnobe. Simptome je mogoče zdraviti z antidepresivi SSRI, kot so Prozac, Celexa, Luvox, Zoloft, Paxil, Lexapro in drugi. Ti z vezanjem na serotoninski transporter povečajo raven serotonina izven celice. Kljub temu mehanizem delovanja SSRI antidepresivov v celoti še ni poznan.