Wiki FKKT - User contributions [en]

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-12T14:53:00Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za sintezo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih genov za encime so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli z rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne sintetizira encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža gen za D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem gena za D-treoza aldolazo, D-treoza dehidrogenazo in D-treono-1,4-laktonazo (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je sintetiziral vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali s tekočinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije '' Gluconobacter oxydans ''. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi gen za NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Izražanje so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije '' Paraburkholderia caryophylli '' (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih genov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža gen za transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ''ISC'', odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje gena za katalazo KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje gena za superoksid dismutazo SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili nabor produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-12T06:09:49Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za sintezo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih genov za encime so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne sintetizira encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža gen za D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem gena za D-treoza aldolazo, D-treoza dehidrogenazo in D-treono-1,4-laktonazo (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je sintetiziral vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali s tekočinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije '' Gluconobacter oxydans ''. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi gen za NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Izražanje so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije '' Paraburkholderia caryophylli '' (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih genov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža gen za transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ''ISC'', odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje gena za katalazo KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje gena za superoksid dismutazo SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili nabor produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-12T06:04:51Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih genov za encime so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne sintetizira encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža gen za D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem gena za D-treoza aldolazo, D-treoza dehidrogenazo in D-treono-1,4-laktonazo (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je sintetiziral vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali s tekočinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije '' Gluconobacter oxydans ''. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi gen za NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Izražanje so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije '' Paraburkholderia caryophylli '' (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih genov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža gen za transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ''ISC'', odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje gena za katalazo KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje gena za superoksid dismutazo SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili nabor produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-12T06:04:08Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih genov za encime so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne sintetizira encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža gen za D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem gena za D-treoza aldolazo, D-treoza dehidrogenazo in D-treono-1,4-laktonazo (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je sintetiziral vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali s tekočinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi gen za NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Izražanje so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije '' Paraburkholderia caryophylli '' (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih genov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža gen za transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ''ISC'', odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje gena za katalazo KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje gena za superoksid dismutazo SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili nabor produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-12T06:02:42Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih genov za encime so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne sintetizira encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža gen za D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem gena za D-treoza aldolazo, D-treoza dehidrogenazo in D-treono-1,4-laktonazo (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je sintetiziral vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali s tekočinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi gen za NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Izražanje so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih genov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža gen za transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ''ISC'', odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje gena za katalazo KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje gena za superoksid dismutazo SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili nabor produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T18:17:20Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih genov za encime so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne sintetizira encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža gen za D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem gena za D-treoza aldolazo, D-treoza dehidrogenazo in D-treono-1,4-laktonazo (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je sintetiziral vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali s tekočinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi gen za NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Izražanje so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih genov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža gen za transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ''ISC'', odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje gena za katalazo KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje gena za superoksid dismutazo SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T18:12:57Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih genov za encime so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne sintetizira encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža gen za D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem gena za D-treoza aldolazo, D-treoza dehidrogenazo in D-treono-1,4-laktonazo (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je sintetiziral vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali s tekočinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi gen za NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Izražanje so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih genov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža gen za transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje gena za katalazo KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje gena za superoksid dismutazo SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T16:45:56Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektrometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Izražanje so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:50:05Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektrometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:27:36Z

Tbutara: /* VIri in literatura */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:27:06Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD+ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== VIri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:25:33Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili &sup13;C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da &sup13;C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja &sup13;C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD&sup+; odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD&sup+; in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== VIri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:12:24Z

Tbutara: /* Načrtovanje in metode za izgradnjo metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD⁺ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== VIri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:11:50Z

Tbutara: /* Rezulatti in razprava */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Načrtovanje in metode za izgradnjo metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD⁺ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== VIri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:11:40Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Načrtovanje in metode za izgradnjo metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulatti in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD⁺ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== VIri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:10:25Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Načrtovanje in metode za izgradnjo metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ==
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ==
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ==
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD⁺ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ==
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== VIri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:07:58Z

Tbutara: /* Načrtovanje in metodologija */

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Načrtovanje in metodologija za izgradnjo metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ==
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ==
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ==
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD⁺ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ==
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== VIri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:05:33Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol]

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Načrtovanje in metodologija ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ==
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ==
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ==
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD⁺ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ==
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== VIri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

2025-05-11T15:02:14Z

Tbutara: Created page with "== Uvod == 9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za..."

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Načrtovanje in metodologija ==
Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina ==
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense '' (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ==
V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ==
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD⁺ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ==
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== VIri in literatura ==
[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.

Seminarji SB 2024/25

2025-05-11T14:54:57Z

Tbutara:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T15:05:58Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/ Engineering ''Nicotiana benthamiana'' for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].

Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z ''Agrobacterium tumefaciens'' v rastlini ''Nicotiana benthamiana'' [1].

== Z ''Agrobacterium'' povzročeno prehodno izražanje v ''N. benthamiana'' ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v ''N. benthamiana''. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste ''N. benthamiane'', pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale prazen plazmid. Ker ''N. benthamiana'' sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retencijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6'-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije ''A. tumefaciens'' z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic ''A. tumefaciens'' in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini ''Nicotiana tabacum'' listne diske inficirali z ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni ''N. tabacum''. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v ''N. tabacum'' ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v ''N. benthamiana'', kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ne glede na starost listov [1].

Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v ''N. benthamiani''. Z ''Agrobacterium tumefaciens'' povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T15:05:46Z

Tbutara:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering ''Nicotiana benthamiana'' for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].

Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z ''Agrobacterium tumefaciens'' v rastlini ''Nicotiana benthamiana'' [1].

== Z ''Agrobacterium'' povzročeno prehodno izražanje v ''N. benthamiana'' ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v ''N. benthamiana''. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste ''N. benthamiane'', pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale prazen plazmid. Ker ''N. benthamiana'' sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retencijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6'-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije ''A. tumefaciens'' z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic ''A. tumefaciens'' in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini ''Nicotiana tabacum'' listne diske inficirali z ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni ''N. tabacum''. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v ''N. tabacum'' ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v ''N. benthamiana'', kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ne glede na starost listov [1].

Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v ''N. benthamiani''. Z ''Agrobacterium tumefaciens'' povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Seminarji SB 2024/25

2025-04-14T15:05:06Z

Tbutara:

Seminarji SB 2024/25

2025-04-14T15:04:46Z

Tbutara:

Seminarji SB 2024/25

2025-04-14T15:00:13Z

Tbutara:

Seminarji SB 2024/25

2025-04-14T14:59:57Z

Tbutara:

Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:50:48Z

Tbutara: Tbutara moved page Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije to Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije over redirect

#REDIRECT [[Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije]]

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:50:48Z

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].

Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z ''Agrobacterium tumefaciens'' v rastlini ''Nicotiana benthamiana'' [1].

== Z ''Agrobacterium'' povzročeno prehodno izražanje v ''N. benthamiana'' ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v ''N. benthamiana''. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste ''N. benthamiane'', pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale prazen plazmid. Ker ''N. benthamiana'' sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retencijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6'-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije ''A. tumefaciens'' z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic ''A. tumefaciens'' in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini ''Nicotiana tabacum'' listne diske inficirali z ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni ''N. tabacum''. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v ''N. tabacum'' ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v ''N. benthamiana'', kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ne glede na starost listov [1].

Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v ''N. benthamiani''. Z ''Agrobacterium tumefaciens'' povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:50:32Z

Tbutara: Tbutara moved page Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije to Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

Seminarji SB 2024/25

2025-04-14T14:46:32Z

Tbutara:

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:45:58Z

Tbutara: /* Uvod */

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:45:22Z

Tbutara: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].
Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z ''Agrobacterium tumefaciens'' v rastlini ''Nicotiana benthamiana'' [1].

== Z ''Agrobacterium'' povzročeno prehodno izražanje v ''N. benthamiana'' ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v ''N. benthamiana''. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste ''N. benthamiane'', pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale prazen plazmid. Ker ''N. benthamiana'' sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retencijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6'-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije ''A. tumefaciens'' z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic ''A. tumefaciens'' in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini ''Nicotiana tabacum'' listne diske inficirali z ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni ''N. tabacum''. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v ''N. tabacum'' ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v ''N. benthamiana'', kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ne glede na starost listov [1].

Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v ''N. benthamiani''. Z ''Agrobacterium tumefaciens'' povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:45:10Z

Tbutara: /* Antioksidativna aktivnost krisoeriola */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].
Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z ''Agrobacterium tumefaciens'' v rastlini ''Nicotiana benthamiana'' [1].

== Z ''Agrobacterium'' povzročeno prehodno izražanje v ''N. benthamiana'' ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v ''N. benthamiana''. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste ''N. benthamiane'', pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale prazen plazmid. Ker ''N. benthamiana'' sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retencijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6'-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije ''A. tumefaciens'' z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic ''A. tumefaciens'' in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini ''Nicotiana tabacum'' listne diske inficirali z ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni ''N. tabacum''. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v ''N. tabacum'' ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v ''N. benthamiana'', kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ne glede na starost listov [1].

Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v N. benthamiani. Z Agrobacterium tumefaciens povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:44:55Z

Tbutara: /* Prehodno in stabilno izražanje */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].
Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z ''Agrobacterium tumefaciens'' v rastlini ''Nicotiana benthamiana'' [1].

== Z ''Agrobacterium'' povzročeno prehodno izražanje v ''N. benthamiana'' ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v ''N. benthamiana''. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste ''N. benthamiane'', pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale prazen plazmid. Ker ''N. benthamiana'' sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retencijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6'-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije ''A. tumefaciens'' z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic ''A. tumefaciens'' in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini ''Nicotiana tabacum'' listne diske inficirali z ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni ''N. tabacum''. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v ''N. tabacum'' ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v ''N. benthamiana'', kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah ''N. tabacum'', ne glede na starost listov [1].

Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v N. benthamiani. Z Agrobacterium tumefaciens povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:44:35Z

Tbutara: /* Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].
Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z ''Agrobacterium tumefaciens'' v rastlini ''Nicotiana benthamiana'' [1].

== Z ''Agrobacterium'' povzročeno prehodno izražanje v ''N. benthamiana'' ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v ''N. benthamiana''. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste ''N. benthamiane'', pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale prazen plazmid. Ker ''N. benthamiana'' sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retencijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6'-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije ''A. tumefaciens'' z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic ''A. tumefaciens'' in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini Nicotiana tabacum listne diske inficirali z A. tumefaciens, ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni N. tabacum. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah N. tabacum, ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v N. tabacum ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v N. benthamiana, kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah N. tabacum, ne glede na starost listov [1].
Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v N. benthamiani. Z Agrobacterium tumefaciens povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:44:20Z

Tbutara: /* Z Agrobacterium povzročeno prehodno izražanje v N. benthamiana */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].
Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z ''Agrobacterium tumefaciens'' v rastlini ''Nicotiana benthamiana'' [1].

== Z ''Agrobacterium'' povzročeno prehodno izražanje v ''N. benthamiana'' ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v ''N. benthamiana''. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste ''N. benthamiane'', pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale prazen plazmid. Ker ''N. benthamiana'' sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami ''A. tumefaciens'', ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retencijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6'-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije ''A. tumefaciens'' z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic A. tumefaciens in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini Nicotiana tabacum listne diske inficirali z A. tumefaciens, ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni N. tabacum. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah N. tabacum, ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v N. tabacum ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v N. benthamiana, kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah N. tabacum, ne glede na starost listov [1].
Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v N. benthamiani. Z Agrobacterium tumefaciens povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Seminarji SB 2024/25

2025-04-14T14:43:34Z

Tbutara:

Seminarji SB 2024/25

2025-04-14T14:43:24Z

Tbutara:

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:42:35Z

Tbutara: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].
Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z ''Agrobacterium tumefaciens'' v rastlini ''Nicotiana benthamiana'' [1].

== Z Agrobacterium povzročeno prehodno izražanje v N. benthamiana ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v N. benthamiana. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste N. benthamiane, pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam A. tumefaciens, ki so vsebovale prazen plazmid. Ker N. benthamiana sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami A. tumefaciens, ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retenzijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6''-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije A. tumefaciens z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic A. tumefaciens in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini Nicotiana tabacum listne diske inficirali z A. tumefaciens, ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni N. tabacum. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah N. tabacum, ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v N. tabacum ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v N. benthamiana, kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah N. tabacum, ne glede na starost listov [1].
Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v N. benthamiani. Z Agrobacterium tumefaciens povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:33:04Z

Tbutara: /* Z Agrobacterium povzročeno prehodno izražanje v N. benthamiana */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].
Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z Agrobacterium tumefaciens v rastlini Nicotiana benthamiana [1].

== Z Agrobacterium povzročeno prehodno izražanje v N. benthamiana ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v N. benthamiana. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste N. benthamiane, pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam A. tumefaciens, ki so vsebovale prazen plazmid. Ker N. benthamiana sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami A. tumefaciens, ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retenzijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6''-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije A. tumefaciens z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic A. tumefaciens in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini Nicotiana tabacum listne diske inficirali z A. tumefaciens, ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni N. tabacum. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah N. tabacum, ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v N. tabacum ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v N. benthamiana, kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah N. tabacum, ne glede na starost listov [1].
Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v N. benthamiani. Z Agrobacterium tumefaciens povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Priprava

2025-04-14T14:30:03Z

Tbutara: Tbutara moved page Priprava to Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

#REDIRECT [[Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije]]

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:30:03Z

Tbutara: Tbutara moved page Priprava to Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].
Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z Agrobacterium tumefaciens v rastlini Nicotiana benthamiana [1].

== Z Agrobacterium povzročeno prehodno izražanje v N. benthamiana ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v N. benthamiana. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste N. benthamiane, pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam A. tumefaciens, ki so vsebovale prazen plazmid. Ker N. benthamiana sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami A. tumefaciens, ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retenzijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6''-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije A. tumefaciens z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic A. tumefaciens in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini Nicotiana tabacum listne diske inficirali z A. tumefaciens, ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni N. tabacum. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah N. tabacum, ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v N. tabacum ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v N. benthamiana, kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah N. tabacum, ne glede na starost listov [1].
Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v N. benthamiani. Z Agrobacterium tumefaciens povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

2025-04-14T14:27:14Z

Tbutara: Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39741678/Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches]

== Uvod ==
Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].
Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z Agrobacterium tumefaciens v rastlini Nicotiana benthamiana [1].

== Z Agrobacterium povzročeno prehodno izražanje v N. benthamiana ==
Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v N. benthamiana. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste N. benthamiane, pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam A. tumefaciens, ki so vsebovale prazen plazmid. Ker N. benthamiana sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami A. tumefaciens, ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retenzijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6''-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije A. tumefaciens z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

== Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola ==
V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic A. tumefaciens in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

== Prehodno in stabilno izražanje ==
Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini Nicotiana tabacum listne diske inficirali z A. tumefaciens, ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni N. tabacum. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah N. tabacum, ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v N. tabacum ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v N. benthamiana, kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah N. tabacum, ne glede na starost listov [1].
Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

== Antioksidativna aktivnost krisoeriola ==
Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

== Zaključek ==
V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v N. benthamiani. Z Agrobacterium tumefaciens povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

== Literatura ==
[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.

Seminarji SB 2024/25

2025-04-14T14:22:19Z

Tbutara:

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T15:14:58Z

Tbutara:

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T13:27:26Z

Tbutara:

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s trans regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in tako dodatno vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

BIO2 Povzetki seminarjev 2021

2021-10-31T14:30:11Z

Tbutara:

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 =

==Urša Štefan - Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji==

Pojav dvovijačne DNA v citosolu je v celici največkrat pokazatelj celične abnormalnosti – virusne okužbe, poškodbe dednega materiala, oksidativnega stresa ali rakave transformacije. Celice so zato razvile načine zaznavanja prisotnosti DNA v citosolu. Eden izmed takšnih je signalna pot STING. Protein ciklična GMP-AMP sintetaza po vezavi z DNA sintetizira cGAMP, ki aktivira protein STING, vezan v membrani endoplazmatskega retikuluma. Ta se transportira do Golgijevega aparata, kjer mu vezava kinaze TBK1 omogoča aktivacijo transkripcijskih faktorjev IRF3 in NF-κB za citokine. Poleg odziva na citosolno DNA protein STING sodeluje tudi v regulaciji celičnega metabolizma, celičnega cikla, pri indukciji avtofagije, regulaciji ravni kalcija in kot senzor poškodb DNA. Zaradi svojega velikega obsega delovanja je signalna pot STING tarča razvoja številnih zdravil, ki pa je do zdaj bil le delno uspešen. Članek opiše signalno pot STING, njene funkcije v celici in na kratko povzame vlogo signalne poti pri zdravljenju rakavih obolenj.

==Hana Glavnik - S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida==

S-glutationilacija proteinov ima v celici pomembno vlogo. Ob zvišanju koncentracije reaktivnih kisikovih spojin (ROS), se v celici vzpostavi stanje oksidativnega stresa. Ker so za celico te spojine toksične, je razvila mehanizme, ki ji pomagajo uravnavati njihovo koncentracijo in zaščitijo ostale spojine v celici pred ireverzibilno oksidacijo. Najbolj pomembna spojina med ROS je vodikov peroksid, ki ima poleg toksičnih vplivov tudi lastnosti sekundarnega sporočevalca. Ob nastopu oksidativnega stresa v celici in povišane koncentracije vodikovega peroksida, zaznata signale encima GRX1 in GRX2, ki glutationilirata proteine z vezavo glutationa (GSH) na tiolne skupine cisteinov (-SH) in jih tako zaščitita pred poškodbami. Hkrati se s potekom S-glutationilacije aktivirajo tiste metabolične poti, pri katerih nastajajo antioksidanti, največkrat NADPH, ki pomagajo razgraditi vodikov peroksid in ostale ROS spojine. Tiste poti, pri katerih nastajajo ROS spojine so inhibirane s strani S-glutationilacije, dokler ne pride do signala, ki ga sprejmeta GRX1/2. To sproži njune deglutationilacijske aktivnosti in z deglutationilacijo encimov se stanje v celici se normalizira in metabolične poti lahko potekajo nemoteno.

==Tinkara Butara - Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih==
Kemotaksija je oblika gibanja, kjer se organizem giba k ugodnemu kemijskemu gradientu ali stran od toksičnega oziroma neugodnega. Oblika gibanja je značilna za premikajoče se bakterije in arheje. Kemotaksija igra pomembno vlogo pri iskanju hrane, oblikovanju biofilma in tudi pri patogenezi. Takšno gibanje, s prepoznavanjem različnih kemijskih zvrsti, nadzorujejo kemoreceptorji. To so transmembranski proteini, ki vežejo snovi iz okolice in tako sprožijo nadaljnjo signalizacijo znotraj celice, ta pa vodi do spremembe v rotaciji bička. Vezava ugodne signalne molekule vodi do konformacijskih sprememb v kemoreceptorju, ki preprečijo avtofosforilacijo kinaze CheA, ki omogoča fosforilacijo proteina CheY. Fosforiliran CheY se namreč veže na motor bička in tako spremeni njegovo rotacijo iz nasprotne smeri urinega kazalca v smer urinega kazalca. Ko biček rotira v smeri urinega kazalca to spodbudi naključno gibanje v prostoru, ki na novo orientira bakterijsko celico. Če biček rotira v nasprotni smeri urinega kazalca pa se celica giba naravnost proti ugodnemu kemijskemu gradientu. Prilagoditev na signal nadzorujejo regulatorni proteini (CheR, CheB), za zaključek signala pa je pomemben protein CheZ, ki hidrolizira CheY-P. Kemoreceptorji se nahajajo na polih bakterijske celice in se združujejo v skupke, kar predstavlja dodatno možnost prilagoditve na kemijski signal.

BIO2 Povzetki seminarjev 2021

2021-10-31T14:27:38Z

Tbutara:

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 =

==Urša Štefan - Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji==

Pojav dvovijačne DNA v citosolu je v celici največkrat pokazatelj celične abnormalnosti – virusne okužbe, poškodbe dednega materiala, oksidativnega stresa ali rakave transformacije. Celice so zato razvile načine zaznavanja prisotnosti DNA v citosolu. Eden izmed takšnih je signalna pot STING. Protein ciklična GMP-AMP sintetaza po vezavi z DNA sintetizira cGAMP, ki aktivira protein STING, vezan v membrani endoplazmatskega retikuluma. Ta se transportira do Golgijevega aparata, kjer mu vezava kinaze TBK1 omogoča aktivacijo transkripcijskih faktorjev IRF3 in NF-κB za citokine. Poleg odziva na citosolno DNA protein STING sodeluje tudi v regulaciji celičnega metabolizma, celičnega cikla, pri indukciji avtofagije, regulaciji ravni kalcija in kot senzor poškodb DNA. Zaradi svojega velikega obsega delovanja je signalna pot STING tarča razvoja številnih zdravil, ki pa je do zdaj bil le delno uspešen. Članek opiše signalno pot STING, njene funkcije v celici in na kratko povzame vlogo signalne poti pri zdravljenju rakavih obolenj.

==Hana Glavnik - S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida==

S-glutationilacija proteinov ima v celici pomembno vlogo. Ob zvišanju koncentracije reaktivnih kisikovih spojin (ROS), se v celici vzpostavi stanje oksidativnega stresa. Ker so za celico te spojine toksične, je razvila mehanizme, ki ji pomagajo uravnavati njihovo koncentracijo in zaščitijo ostale spojine v celici pred ireverzibilno oksidacijo. Najbolj pomembna spojina med ROS je vodikov peroksid, ki ima poleg toksičnih vplivov tudi lastnosti sekundarnega sporočevalca. Ob nastopu oksidativnega stresa v celici in povišane koncentracije vodikovega peroksida, zaznata signale encima GRX1 in GRX2, ki glutationilirata proteine z vezavo glutationa (GSH) na tiolne skupine cisteinov (-SH) in jih tako zaščitita pred poškodbami. Hkrati se s potekom S-glutationilacije aktivirajo tiste metabolične poti, pri katerih nastajajo antioksidanti, največkrat NADPH, ki pomagajo razgraditi vodikov peroksid in ostale ROS spojine. Tiste poti, pri katerih nastajajo ROS spojine so inhibirane s strani S-glutationilacije, dokler ne pride do signala, ki ga sprejmeta GRX1/2. To sproži njune deglutationilacijske aktivnosti in z deglutationilacijo encimov se stanje v celici se normalizira in metabolične poti lahko potekajo nemoteno.

==Tinkara Butara - Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih==
Kemotaksija je oblika gibanja, kjer se organizem giba k ugodnemu kemičnemu gradientu ali stran od toksičnega oziroma neugodnega. Oblika gibanja je značilna za premikajoče se bakterije in arheje. Kemotaksija igra pomembno vlogo pri iskanju hrane, oblikovanju biofilma in tudi pri patogenezi. Takšno gibanje, s prepoznavanjem različnih kemijskih zvrsti, nadzorujejo kemoreceptorji. To so transmembranski proteini, ki vežejo snovi iz okolice in tako sprožijo nadaljnjo signalizacijo znotraj celice, ta pa vodi do spremembe v rotaciji bička. Vezava ugodne signalne molekule vodi do konformacijskih sprememb v kemoreceptorju, ki preprečijo avtofosforilacijo kinaze CheA, ki omogoča fosforilacijo proteina CheY. Fosforiliran CheY se namreč veže na motor bička in tako spremeni njegovo rotacijo iz nasprotne smeri urinega kazalca v smer urinega kazalca. Ko biček rotira v smeri urinega kazalca to spodbudi naključno gibanje v prostoru, ki na novo orientira bakterijsko celico. Če biček rotira v nasprotni smeri urinega kazalca pa se celica giba naravnost proti ugodnemu kemičnemu gradientu. Prilagoditev na signal nadzorujejo regulatorni proteini (CheR, CheB), za zaključek signala pa je pomemben protein CheZ, ki hidrolizira CheY-P. Kemoreceptorji se nahajajo na polih bakterijske celice in se združujejo v skupke, kar predstavlja dodatno možnost prilagoditve na kemijski signal.

BIO2 Povzetki seminarjev 2021

2021-10-31T14:08:59Z

Tbutara:

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 =

==Urša Štefan - Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji==

Pojav dvovijačne DNA v citosolu je v celici največkrat pokazatelj celične abnormalnosti – virusne okužbe, poškodbe dednega materiala, oksidativnega stresa ali rakave transformacije. Celice so zato razvile načine zaznavanja prisotnosti DNA v citosolu. Eden izmed takšnih je signalna pot STING. Protein ciklična GMP-AMP sintetaza po vezavi z DNA sintetizira cGAMP, ki aktivira protein STING, vezan v membrani endoplazmatskega retikuluma. Ta se transportira do Golgijevega aparata, kjer mu vezava kinaze TBK1 omogoča aktivacijo transkripcijskih faktorjev IRF3 in NF-κB za citokine. Poleg odziva na citosolno DNA protein STING sodeluje tudi v regulaciji celičnega metabolizma, celičnega cikla, pri indukciji avtofagije, regulaciji ravni kalcija in kot senzor poškodb DNA. Zaradi svojega velikega obsega delovanja je signalna pot STING tarča razvoja številnih zdravil, ki pa je do zdaj bil le delno uspešen. Članek opiše signalno pot STING, njene funkcije v celici in na kratko povzame vlogo signalne poti pri zdravljenju rakavih obolenj.

==Hana Glavnik - S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida==

S-glutationilacija proteinov ima v celici pomembno vlogo. Ob zvišanju koncentracije reaktivnih kisikovih spojin (ROS), se v celici vzpostavi stanje oksidativnega stresa. Ker so za celico te spojine toksične, je razvila mehanizme, ki ji pomagajo uravnavati njihovo koncentracijo in zaščitijo ostale spojine v celici pred ireverzibilno oksidacijo. Najbolj pomembna spojina med ROS je vodikov peroksid, ki ima poleg toksičnih vplivov tudi lastnosti sekundarnega sporočevalca. Ob nastopu oksidativnega stresa v celici in povišane koncentracije vodikovega peroksida, zaznata signale encima GRX1 in GRX2, ki glutationilirata proteine z vezavo glutationa (GSH) na tiolne skupine cisteinov (-SH) in jih tako zaščitita pred poškodbami. Hkrati se s potekom S-glutationilacije aktivirajo tiste metabolične poti, pri katerih nastajajo antioksidanti, največkrat NADPH, ki pomagajo razgraditi vodikov peroksid in ostale ROS spojine. Tiste poti, pri katerih nastajajo ROS spojine so inhibirane s strani S-glutationilacije, dokler ne pride do signala, ki ga sprejmeta GRX1/2. To sproži njune deglutationilacijske aktivnosti in z deglutationilacijo encimov se stanje v celici se normalizira in metabolične poti lahko potekajo nemoteno.

==Tinkara Butara - Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih ==
Kemotaksija je oblika gibanja, kjer se organizem giba k ugodnemu kemičnemu gradientu ali stran od toksičnega oziroma neugodnega. Oblika gibanja je značilna za premikajoče se bakterije in arheje. Kemotaksija igra pomembno vlogo pri iskanju hrane, oblikovanju biofilma in tudi pri patogenezi. Takšno gibanje, s prepoznavanjem različnih kemijskih zvrsti, nadzorujejo kemoreceptorji. To so transmembranski proteini, ki vežejo snovi iz okolice in tako sprožijo nadaljnjo signalizacijo znotraj celice, ta pa vodi do spremembe v rotaciji bička. Vezava ugodne signalne molekule vodi do konformacijskih sprememb v kemoreceptorju, ki preprečijo avtofosforilacijo kinaze CheA, ki omogoča fosforilacijo proteina CheY. Fosforiliran CheY se namreč veže na motor bička in tako spremeni njegovo rotacijo iz nasprotne smeri urinega kazalca v smer urinega kazalca. Ko biček rotira v smeri urinega kazalca to spodbudi naključno gibanje v prostoru, ki na novo orientira bakterijsko celico. Če biček rotira v nasprotni smeri urinega kazalca pa se celica giba naravnost proti ugodnemu kemijskemu gradientu. Prilagoditev na signal nadzorujejo regulatorni proteini (CheR, CheB), za zaključek signala pa je pomemben protein CheZ, ki hidrolizira CheY-P. Kemoreceptorji se nahajajo na polih bakterijske celice in se združujejo v skupke, kar predstavlja dodatno možnost prilagoditve na kemijski signal.

BIO2 Seminar 2021

2021-10-21T11:27:21Z

Tbutara:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''priimek, ime'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Valte, David||12||||Mitkov, Kostadin||Brdnik, Nuša||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Kolar, Alliana||12||||Vukšinić, Ivana||Premrl, Petja||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Glavnik, Hana||12||||Kovač, Ela||Kavčič, Ema||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Štefan, Urša||12||||Vujović, Nataša||Zajec, Tina||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Butara, Tinkara||12||Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih||Sotlar, Špela||Žnidar, Žan||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Špehar, Pia||12||||Trošt, Pia||Rus, Metka||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Urh, Tina||12||||Maučec, Ana||Loborec, Mark||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Rotar, Andraž||12||||Priveršek, Maj||Kastelic, Ana||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Starc, Gaja||12||||Spruk, Teja||Možina, Gašper||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Resnik, Katja||12||||Deutsch, Maja||Sotlar, Pia||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Bohte, Janja||14-15||||Valte, David||Mitkov, Kostadin||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Miklošič, Maja||14-15||||Kolar, Alliana||Vukšinić, Ivana||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kovačić, Marko||14-15||||Glavnik, Hana||Kovač, Ela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kolbl, Karidia||14-15||||Štefan, Urša||Vujović, Nataša||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kos Thaler, Nuša||14-15||||Butara, Tinkara||Sotlar, Špela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Ažbe, Klara||16||||Špehar, Pia||Trošt, Pia||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Jerič, Sara||16||||Urh, Tina||Maučec, Ana||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Mencin, Pia||16||||Rotar, Andraž||Priveršek, Maj||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Weingerl, Zarja||16||||Starc, Gaja||Spruk, Teja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Kartal, Ena||16||||Resnik, Katja||Deutsch, Maja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Struna, Gašper||17||||Bohte, Janja||Valte, David||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Špenko, Andrej||17||||Miklošič, Maja||Kolar, Alliana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Zevnik, Urša||17||||Kovačić, Marko||Glavnik, Hana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Peternel, Neža||17||||Kolbl, Karidia||Štefan, Urša||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Vidmar, Nik||17||||Kos Thaler, Nuša||Butara, Tinkara||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Trebušak, Jan||18||||Ažbe, Klara||Špehar, Pia||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kores, Lana||18||||Jerič, Sara||Urh, Tina||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Razdevšek, Miha||18||||Mencin, Pia||Rotar, Andraž||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Javeršek, Tina||18||||Weingerl, Zarja||Starc, Gaja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kočman, Klara||18||||Kartal, Ena||Resnik, Katja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Jošt, Lev||19||||Struna, Gašper||Bohte, Janja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Razboršek, Klara||19||||Špenko, Andrej||Miklošič, Maja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Rapuš, Špela||19||||Zevnik, Urša||Kovačić, Marko||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Mencigar, Maša||19||||Peternel, Neža||Kolbl, Karidia||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Ivošević, Vanja||19||||Vidmar, Nik||Kos Thaler, Nuša||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Kogovšek, Jan||20||||Trebušak, Jan||Ažbe, Klara||||||
|-
| Brdnik, Nuša||20||||Kores, Lana||Jerič, Sara||||||
|-
| Premrl, Petja||20||||Razdevšek, Miha||Mencin, Pia||||||
|-
| Kavčič, Ema||20||||Javeršek, Tina||Weingerl, Zarja||||||
|-
| Zajec, Tina||20||||Kočman, Klara||Kartal, Ena||||||
|-
| Žnidar, Žan||21||||Jošt, Lev||Struna, Gašper||||||
|-
| Rus, Metka||21||||Razboršek, Klara||Špenko, Andrej||||||
|-
| Loborec, Mark||21||||Rapuš, Špela||Zevnik, Urša||||||
|-
| Kastelic, Ana||21||||Mencigar, Maša||Peternel, Neža||||||
|-
| Možina, Gašper||21||||Ivošević, Vanja||Vidmar, Nik||||||
|-
| Sotlar, Pia||22||||Kogovšek, Jan||Trebušak, Jan||||||
|-
| Mitkov, Kostadin||22||||Brdnik, Nuša||Kores, Lana||||||
|-
| Vukšinić, Ivana||22||||Premrl, Petja||Razdevšek, Miha||||||
|-
| Kovač, Ela||22||||Kavčič, Ema||Javeršek, Tina||||||
|-
| Vujović, Nataša||22||||Zajec, Tina||Kočman, Klara||||||
|-
| Sotlar, Špela||23||||Žnidar, Žan||Jošt, Lev||||||
|-
| Trošt, Pia||23||||Rus, Metka||Razboršek, Klara||||||
|-
| Maučec, Ana||23||||Loborec, Mark||Rapuš, Špela||||||
|-
| Priveršek, Maj||23||||Kastelic, Ana||Mencigar, Maša||||||
|-
| Spruk, Teja||23||||Možina, Gašper||Ivošević, Vanja||||||
|-
| Deutsch, Maja||23||||Sotlar, Pia||Kogovšek, Jan||||||
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim, da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo, in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [https://libgen.is/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5–12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli, v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva, določenega v tabeli, določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20–25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji. Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili, vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate, poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.docx za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.docx za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.docx za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.pptx za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje ... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.