Wiki FKKT - User contributions [en]

Metabolni inženiring E. coli za izboljšano produkcijo diolov iz acetata

2025-05-04T19:05:38Z

Teo Trošt:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.4c00839 Metabolic Engineering of''E. coli'' for Enhanced Diols Production from Acetate]

==Uvod==
Industrijska fermentacija zahteva gojišča oz. medij, ki je sestavljen iz štirih glavnih komponent: vode, vira ogljika, vira dušika in mineralov oz. drugih dodatkov. Komponente gojišča morajo biti poceni, na voljo in dati čim večji izkoristek želenega produkta. Pogosti viri ogljika, ki se uporabljajo v industriji so glukoza, fruktoza, ksiloza, škrob... Pridobljeni so iz surovin, kot so ekstrakti rastlin (celuloza, lignoceluloza, hemiceluloza...), melase... Njihova pogosta uporaba povzroča 'tekmovanje' z drugimi industrijami (npr. prehrambena industrija) [1].
Dobra alternativa tem virom ogljika je acetat. Proizvedemo ga lahko ceneje in v velikih količinah, tako po kemijski kot biotehnološki poti. Acetat lahko pretvorimo v acetil koencim A, ki je substrat za Krebsov cikel. Kemikalije na osnovi acetata, ki so že v uporabi za te namene, so npr. aceton, izopropanol, sukcionat [2] ...
V tem članku so razvili seve ''E. coli'' za proizvodnjo hidroksibutanona (acetoina) in 2,3-butandiola (2,3-BDO). Ti sevi kot edini vir ogljika uporabljajo acetat. 2,3-BDO ima direktne aplikacije: aditivi v prehrambeni industriji, sredstvo proti zamrzovanju; in indirektne aplikacije: pretvorba v etil metil keton (MEK) za sintetične barve, smole in ekstrakcijsko sredstvo [2, 3], ali 1,3-butadien za proizvodnjo gum v avtomobilski industriji [4]. Acetoin je pogosto uporabljen v kozmetični industriji in kot ojačevalec okusa v prehrambeni industriji zaradi maslenega okusa.
Po pretvorbi acetata v acetil-CoA se ta vključi v Krebsov cikel. Malat, ki v tem ciklu nastane, se lahko pretvori v oksaloacetat ali pa v piruvat. Acetolaktat sintaza (BudB/alaS) poveže dve molekuli piruvata in tvori acetolaktat in CO2. Acetolaktat se z dekarboksilazo (BudA) cepi na še en CO2 in acetoin. Tako nastane eden izmed želenih produktov. Ta pa se lahko preko 2,3-BDO dehidrogenaze (BudC) reducira do 2,3-BDO. Ob tem pride do oksidacije NAD+. Kljub temu, da acetoin tehnično ni diol, pa se zaradi enostavnejšega poimenovanja in iste sintezne poti proces smatra kot sinteza diolov [2].

==Izbira seva
Za produkcijo diolov so preizkusili dva seva ''E. coli'': sev W (ATCC 9637), od tu naprej imenovan sev W in sev BL21 (DE3), od tu naprej imenovan sev BL21. Ker ''E. coli'' ne vsebuje genov za produkcijo diolov, so iz bakterije ''Enterobacter cloacae'' izolirali in vstavili gene ''budA'', ''budB'' in ''budC''. Zanimalo jih je, ali je vrstni red genov v operonu pomemben, zato so v plazmid vstavili gene v zaporedju ''budBAC'', kot se pojavljajo v metabolni poti, in ''budCAB''. Druga spremenljivka, ki so jo želeli preveriti, je bila število kopij plazmida. Vzeli so plazmid p5T7, ki ima nizko število kopij in pETDuet1, ki ima visoko število kopij.
S temi kombinacijami so pripravili štiri različne seve ''E. coli'', ki so bili sposobni sinteze 2,3-BDO iz glukoze. Glede na koncentracije proizvedenih diolov in izkoristke pri rasti na mediju z glukozo so ugotovili, da izbor seva ''E. coli'', število kopij plazmida in zaporedje genov na operonu ne vplivajo na sintezo. Ko pa so medij z glukozo zamenjali z medijem z natrijevim acetatom (5 g/L), so ugotovili, da sev W proizvede do 10x večje koncentracije diolov od ostalih treh pripravljenih sevov. Za nadaljnjo analizo so torej uporabljali sev ''E. coli'' W_pET_''bud-BAC'' (oz. sev W-BDO) [2].

==Prekomerno izražanje genov==
V ''E. coli'' obstajata dve poti pretvorbe acetata do acetil-CoA in sicer preko encimov AckA-Pta (acetat kinaza in fosfat acetiltransferaza) ali Acs (acetil-CoA sintetaza). Nastali acetil-CoA nato vstopa v Krebsov cikel, kjer se pretvori do citrata in izocitrata. Ta lahko gre naprej po normalni poti do α-ketoglutarata, ali pa preko t.i. glioksilatnega šunta do malata. Šunt promovirata izocitrat liaza (AceA) in malat sintaza (GlcB). Nastali malat se lahko po normalni poti pretvori do oksaloacetata ali pa se preko malat dehidrogenaz (MaeA in MaeB) pretvori do piruvata. Ta dva encima se razlikujeta po strukturi in regulaciji aktivnosti. MaeA je odvisen od NAD+ ali NADP+ medtem, ko je MaeB odvisen le od NADP+. Razlikujeta se tudi po reverzibilnosti reakcije. MaeA lahko katalizira reakcijo oksidativne dekarboksilacije malata ali reduktivne karboksilacije piruvata, MaeB pa reverzibilno bistveno manj aktiven. Glede na aktivnost posamezne reduktaze so ugotovili, da MaeA sodeluje bolj pri pretvorbi malata v piruvat, MaeB pa pri redukciji NADP+ v NADPH [5]. Glede na encime, ki sodelujejo v tej poti so pripravili še šest dodatnih sevov ''E. coli'' za analizo prekomernega izražanja posameznega ali večih genov hkrati. Izbrali so gene ''acs'', ''ackA-pta'', ''maeA'', ''maeB'', ''aceA'' in ''glcB'', ki so jih vstavili v plazmid pCDF ter primerjali rast celic, privzem acetata in produkcijo diolov.
Prvi modificirani sev so imenovali ''E. coli'' W-BDO-AC. Pripravili so ga tako, da so v ''E. coli'' W-BDO vstavili plazmid pCDF, ki je vseboval gene ''acs-aceA-glcB-maeA''. Ugotovili so, da je bil privzem acetata večji pri sevu W-BDO-AC napram W-BDO. Da bi določili, kateri izmed izbranih encimov ima največjo vlogo pri tem, so pripravili še šest modificiranih sevov: AC1-6.
Ugotovili so, da je bila rast celic bistveno počasnejša pri sevih s prekomernim izražanjem ''ackA-pta'', kot pri tistih z ''acs''. To lahko najverjetneje pripišemo vlogi acetil fosfata. Ta je namreč intermediat AckA-Pta poti, deluje pa tudi kot signalna molekula v večih procesih. Zaradi porabe acetil fosfata v namen pretvorbe do acetil-CoA lahko sklepamo, da ga ostane premalo za izvršitev ostalih nalog v celici, zato celica raste počasneje. Pri dodatnem prekomernem izražanju ''maeA'' so opazili povečano rast celic v obeh primerih (pri prekomernem izražanju ''ackA-pta'' in ''acs''), pri ''maeB'' pa le ob dodatnem prekomernem izražanju ''acs''. Razlog je zopet v porabi acetil fosfata – tako MaeA kot MaeB delujeta bolje ob prisotnosti acetil fosfata.
Pri privzemu acetata so ugotovili, da je hitrost privzema višja pri prekomernem izražanju ''ackA-pta''. Razlog je v manjši porabi ATP, ko se acetat pretvori preko AckA-Pta poti. Prekomerno izražanje malat dehidrogenaz ni signifikantno vplivalo na privzem acetata.
Pri produkciji diolov so prav tako ugotovili, da je prekomerno izražanje ''ackA-pta'' favorizirano. Spet je razlog v nižji energiji AckA-Pta poti oz. v manjši porabi ATP. Glede na prekomerno izražanje malat dehidrogenaz pa so ugotovili, da so bile koncentracije proizvedenih diolov bistveno večje ob večjem delovanju MaeA. Eden izmed razlogov je v dejstvu, da je MaeB uporaben predvsem za redukcijo NADP+ [2]. V nekaterih študijah pa so ugotovili tudi, da acetil-CoA inhibira MaeB in temu podobne encime. Gre namreč za kompetitivno inhibicijo na fosfotransacetilazni domeni teh encimov. S tem lahko koncentracija acetil-CoA v celicah nadzira porazdelitev ogljika na piruvat/oksaloacetat [6].

==Znižanje ravni izražanja genov==
Drug pristop povečanja produkcije diolov na osnovi acetata je bilo znižanje ravni izražanja genov, ki negativno regulirajo metabolno pot acetata. Represor izocitrat liaze (IclR) vpliva na operon ''aceBAK'', ki nadzoruje gene glioksilatnega šunta. Drug gen, katerega aktivnost so spreminjali je bil ''pka'', ki kodira za peptidil-lizin N-acetiltransferazo. Ta acetilira lizin acetil-CoA sintetaze (acs) in s tem zavira njeno delovanje. Izvedli so delecijo enega ali obeh genov v sevih ''E. coli'' W-BDO in ''E. coli'' W-BDO-AC. Delecije so sicer povečale privzem acetata, niso pa signifikantno povečale produkcije diolov, niti izkoristka reakcije. Privzeti acetat se očitno porabi drugje v celici ali pa zaide v drugo smer v biosintezni poti. Opazili so, da delecija gena ''pka'' vodi v statistično nižje izkoristke. Točnega razloga za to niso našli, so pa predpostavili, da je prišlo do inhibicije acs na drug način. V ''E. coli'' so namreč prisotne tudi manj specifične lizin acetiltransferaze. V tem delu eksperimentov so zaključili, da delecije genov, ki bi vplivale na metabolno pot acetata do piruvata, ne vplivajo na produkcijo diolov [2].

==Zaključek==
Edini večji problem, na katerega so naleteli je bila velika koncentracija proizvedenega CO2. Na en mol 2,3-BDO se namreč sintetizirajo štirje moli CO2. V bodoče bi bilo smiselno izboljšati sposobnost recikliranja CO2 ali pa izbrati možnost redukcije CO2 v format z vodikom. Slednja opcija je mogoča z encimoma hidrogenazo in format dehidrogenazo. Problem v tem procesu pa je občutljivost teh encimov na že zelo nizke koncentracije kisika – primerno le za anaerobne organizme. Možna rešitev bi bila modificirati te encime, da bi bili bolj primerni za uporabo v aerobnih pogojih [2,7].

V študiji so želeli pripraviti sev ''E. coli'', ki bi bil sposoben produkcije industrijsko pomembnih diolov acetoina in 2,3-BDO iz lažje pridobljenega vira ogljika – acetata. Končni koraki sinteze teh dveh so regulirani s strani encimov BudA, BudB in BudC. Gene za te encime so vstavili v ''E. coli'' sev W in dobili sev W-BDO. S prekomernim izražanjem genov za encime, ki sodelujejo v metabolni poti acetata in z delecijo genov za inhibitorje določenih encimov so dosegli višji izkoristek produkcije diolov. Končno so dobili sev W-BDO-AC4 (''E. coli'' W_pET_''budB-budA-budC'' − pCDF_''ackA-pta-maeA''), za katerega verjamejo, da bo uporaben v nadaljnjih raziskavah industrijske produkcije diolov [2].

==Literatura==
[1] „Media for Industrial Fermentation“. SlideShare, 10. junij 2021, https://www.slideshare.net/slideshow/media-for-industrial-fermentation/249294453. [2] Ricci, Luca, idr. „Metabolic Engineering of E. Coli for Enhanced Diols Production from Acetate“. ACS Synthetic Biology, let. 14, št. 4, april 2025, str. 1204–19. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1021/acssynbio.4c00839. [3] PubChem. Methyl Ethyl Ketone. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6569. Pridobljeno 18. april 2025. [4] PubChem. 1,3-Butadiene. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/7845. Pridobljeno 18. april 2025. [5] Afzal, Aqeel Rana, idr. „Fumarase activity in NAD-dependent malic enzyme, MaeA, from Escherichia coli“. Biochemical and Biophysical Research Communications, let. 678, oktober 2023, str. 144–47. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2023.08.045. [6] Huergo, Luciano F., idr. „The NADP-dependent malic enzyme MaeB is a central metabolic hub controlled by the acetyl-CoA to CoASH ratio“. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, let. 1868, št. 9, september 2020, str. 140462. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2020.140462. [7] Cha, Jaehyun, idr. „Hydrogen-Fueled CO2 Reduction Using Oxygen-Tolerant Oxidoreductases“. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, let. 10, januar 2023. Frontiers, https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.1078164.

Metabolni inženiring E. coli za izboljšano produkcijo diolov iz acetata

2025-05-04T19:03:59Z

Teo Trošt: /* Literatura */

2025-05-04T18:55:17Z

Teo Trošt:

Seminarji SB 2024/25

2025-05-04T18:54:35Z

Teo Trošt:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_''E._coli''_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

2023-05-13T19:29:15Z

Teo Trošt: /* Halobakterije */

== Uvod ==
SSB proteini (angl. single strand binding proteins) oziroma proteini, ki se vežejo na enojno vijačnico, igrajo pomembno vlogo pri podvojevanju, popravljanju in rekombinaciji DNA v vseh treh domenah. Gre za vezavo teh proteinov z namenom zavarovanja enovijačne DNA pred razgradnjo. Medtem ko to nalogo pri bakterijah opravljajo SSB proteini, so pri evkariontih prisotni RPA kompleksi (angl. replication protein A). Vezava SSB ali RPA na ssDNA (angl. single-stranded DNA) ni sekvenčno specifična, kar pomeni, da niso omejeni na določena vezavna mesta (lahko se vežejo kjerkoli na ssDNA). Vsi imajo OB zvitje oz. “OB fold” (angl. oligonucleotide/oligosaccharide binding domain), ki je bila najverjetneje prisotna pri skupnem predniku vseh treh domen življenja. OB zvitja so domene, na katere se veže ssDNA.

V glavnem lahko RPA/SSB proteine pri arhejah razdelimo v štiri glavne skupine: RPA41, RPA32, proteine s samskim OB zvitjem in proteine z večimi OB zvitji. Najpomembnejša sta RPA41 in RPA32. RPA41 so evolucijsko precej podobni evkariontskim RPA1 in jih definira ena ali več OB zvitij ter značilen motiv cinkovega prsta. RPA32 so evolucijsko bolj podobni evkariontskim RPA2 in jih prepoznamo po eni ali dveh OB zvitjih ter motivom vijačnica-zavoj-vijačnica oziroma motivom HTH (angl. helix-turn-helix).

V arhejah so do zdaj našli tako RPA kot tudi SSB-ju podobne proteine. Zaradi podobnosti lahko eno skupino teh proteinov imenujemo kar “evriarhejski” RPA proteini (angl. euryarcheal) in jih najdemo pri deblu arhej “euryarchaeota”. V to deblo spadajo metanogene arheje, ki proizvajajo velike količine CH4, halobakterije, ki kljub imenu niso bakterije, pač pa arheje in lahko preživijo pri visokih koncentracijah soli ter termofile, ki živijo na temperaturah od 40 pa do 120 °C. Bakterijam bolj podobni proteini pa spadajo v deblo crenarchaeota in lahko govorimo o krenarhejskih SSB proteinih.

== RPA proteini pri evriarhejah ==
=== Metanogene arheje ===
Metanogene arheje lahko ločimo na dva razreda (I in II). Metanogeni razreda I so obligatni anaerobi. Do danes so raziskali RPA proteine v treh različnih vrstah: Methanocaldococcus jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus in Methanopyrus kandleri. Kljub temu, da ti proteini opravljajo enako nalogo, so si sekvenčno precej različni – manj kot 30% podobnost.

- ''Methanocaldococcus jannaschii'' vsebuje MthRPA oziroma MjaRPA proteine (645 aminokislinskih ostankov), ki spadajo med RPA41 proteine. MthRPA vsebuje 5 OB zvitij. Kljub temu, da ta vrsta vsebuje tudi zapis za RPA32 protein, tega še niso našli (hipotetično bi lahko ta s RPA41 tvoril dimer). So pa dokazali, da se lahko MthRPA veže na ssDNA s podobno afiniteto kot človeški RPA (močno).

- ''Methanopyrus kandleri'' vsebuje MkaRPA proteine (432 aminokislinskih ostankov). Tudi ti proteini spadajo med RPA41 proteine in imajo tri OB zvitja ter prav tako vsebujejo zapis za RPA32 protein.

Metanogeni razreda II so sicer bolj podobni halobakterijam, a vseeno proizvajajo velike količine metana, zato jih uvrščamo v drug razred. Zaenkrat je znana le ena vrsta z RPA proteini:

- ''Methanosarcina acetivorans'' ima zapis za tri homologe RPA (MacRPA1, MacRPA2 in MacRPA3). MacRPA1 (484 aminokislinskih ostankov) ima 4 OB zvitja, a nima cinkovega prsta, zato je bolj podoben RPA proteinom v halobakterijah. MacRPA2 in MacRPA3 pa sta si bistveno bolj podobna. Sta podobno velika (417 in 450 aminokislinskih ostankov) in spadata med RPA41 proteine. Zaradi podobnosti ju najdemo tudi v obliki dimerov.

=== Halobakterije ===
Druga glavna podvrsta arhej so halobakterije. Halobakterije so zelo sorodne Metanogenim arhejam (npr. ''M. acetivorans'') ter raznim drugim evkariontskim organizmom, ki živijo v močno zasoljenih vodah, par takih primerov je v solnih jezerih in sončnih solinah.

- ''Haloferax volcanii'' vsebuje proteina Rpa1 in Rpa3 (zdaj naprej HvoRpa1 in HvoRpa3) sta RPA41 ter sta homologa MacRPA2 in MacRPA3. HvoRpa1 je sestavljen iz 427 aminokislinskih ostankov ter vsebuje le 3 OB zvitja. Največ se jih nahaja v C-končni regiji v obliki zinkovega prsta. S tem, da se nahaja v C-končni regiji, si je kar podoben s tipom DBD-C (DNA vezavna domena modela C) z integralskim C3H (cistein3histidin) cinkovim prstom. Pri evkariontih se DBD-C zvije okrog cinka, tako da se 3 alfa vijačnice zvijejo v trojni heliks in ovijejo okrog cinka. HvoRpa3 je dolg samo 311 aminokislinskih ostankov ter vsebuje le 2 OB zvitja. Drugo zvitje je spet podobno tipu DBD-C z C3H cinkom. Oba proteina HvoRPA sta lahko skupaj prečiščena iz celic, ki ju prekomerno izražajo. Razlika te arheje od ostalih je, da v njej, tako kot pri evkariontih, ne obstaja RPA41-RPA32 kompleks. V evkariontih obstajajo kompleksi, ki so sestavljeni iz večih RPA-jev v sebi, npr. človeški kompleks, ki je iz teh dveh in še enega.
Kompleksa HvoRpa1-HvoRpap1 in HvoRpa3-HvoRpap3 oz. prisotnost vsaj enega od njiju je nujno za delovanje celice. Pomanjkanje enega celici še omogoča preživetje, vendar je pomanjkanje dveh usodno. Če kateri od njiju manjka, povzroči da celica raste počasneje oz. da zamuja z rastjo. Posledica manjkanja HvoRpa3-HvoRpap3 kompleksa je povzročilo povečanje arhej na poškodovanje mitomicina C v DNA in na UV svetlobo. Če pa manjka kompleks HvoRpa1-HvoRpap1, pa celica ne more popravit vseh poškodb v sebi. Če je občutljiva na UV svetlobo to potem vodi v tvorbo CPD-jev (ciklobutan pirimidinskih dimerov) in 6-4PP-jev (pirimidin 6-4-fotoproduktov). Ta dva kompleksa sta kritična za popravljanje DNA poškodb. Problemov, ki jih povzročijo produkti občutljivosti na UV svetlobo, še ne razumejo oz. še ne vedo kakšne so posledice.
HvoRpa2 je ortolog RPA1 M. acetivoransa in je dolg 483 aminokislinskih ostankov. Ima ohranjeno N-končno domeno, s štirimi OB zvitji vendar nimajo cinkovega prsta. Je esencialen za viabilnost celice in ne sme manjkat v genomu, saj to zopet vodi do zmanjšanja celične rasti, ki pa je ključna. HvoRpa3-HvoRpap3 kompleks je delno lahko nadomeščen z HvoRpa2 in vivo. Če so ostranili OB1 in OB2, je to povzročilo malo zmanjšanje zmožnosti nadomeščanja, če pa so odstranili OB3 pa je prišlo do konkretnega zmanjšanja in je zaradi tega skorajda esencialen. Zanimiva stvar tega je, da kljub temu, da imajo ohranjeno N-končno regijo, nimajo cinkovega prsta, kar bi pričakovali, saj ga evkarionti imajo.
- ''Halobacterium salinarum'' kodira homologe HvoRpa in HvoRpap proteinom imenovane HsaRfa proteini. So podobne sestave in velikosti, razen protein RPA32 HsaRfa7, ki je manjši za 160 aminokislinskih ostankov v osrednji regiji. Glavna razlika med temi homologi je, da med HsaRfa-ji ni nobene interakcije, kot je med HvoRpap, vsi pa imajo afiniteto za vezavo na ssDNA. Če odstranimo Rfa3 in Rfa8 povzroči, da celica postane bolj občutljiva na UV in IR svetlobo. Če odstranimo Rfa2 (homolog HvoRpa2) je razlika tukaj, da je za celico to usodno.

== SSB proteini pri krenarhejah ==
Najbolje opredeljeni organizmi krenarhej spadajo v red Sulfulobales, ki vključuje tudi rod Sulfolobus. Veliko vrst iz tega rodu se uporablja za modelne organizme v biologiji arhej, med katerimi ima ključno vlogo S. solfataricus.

=== ''Sulfolobus solfataricus'' ===
SSB protein S. solfataricus (SsoSSB) je bil prvi biokemijsko opredeljen krenarhejski SSB protein in prav tako prvi, za katerega je bila določena tridimenzionalna struktura. Identificirali so ga na podlagi sposobnosti vezave na ssDNA, zaradi njegove pogostosti in preproste strukture, ki je podobna strukturi bakterijskega SSB proteina. 148 aminokislin dolga struktura vsebuje zvitje OB na N-končni domeni in fleksibilen C-končni rep bogat z glicinom, argininom in glutamatom. Oligomerno stanje SsoSSB je še zmeraj tema razprav, saj je predlagano tako monomerno kot tetramerno stanje proteina. Novejše raziskave kažejo, da se SsoSSB z visoko afiniteto ne veže zgolj na ssDNA temveč tudi RNA. Strukturna poravnava zvitja OB na N-koncu krenarhejskega proteina s SSB E. coli in evkariontskim RPA je razkrila večjo podobnost evkariontskemu zvitju DNA vezavne domene B (DBD-B), ki je odgovorno za vezavo ssDNA. Ta vezava je odvisna od nalaganja baz, ki vključuje tri ohranjene triptofanske aminokislinske ostanke in ne deluje specifično.

SsoSSB lahko destabilizira dvojno vijačnico DNA, kar je pogosto tudi pri ostalih SSB proteinih. Ta lastnost je dodatno ojačana/pride do izraza, ko so v DNA prisotna neujemanja ene baze ali pa pri bolj zapletenih poškodbah DNA. To opažanje namiguje, da ima SsoSSB morda vlogo pri prepoznavanju in izbrisu napak DNA in vezavo proteinov, vpletenih v popravilo DNA. Kompleks SsoSSB proteinov in vanje vezane ssDNA interagira s številnimi proteini, med katerimi so XPB helikaza Rad50, topoizomeraza 1, RNA polimeraza in reverzna giraza. Slednji sta v neposredni interakciji s SsoSSB, za ostale pa obstaja možnost da interagirajo zgolj s ssDNA v kompleksu. Interakcija z RNA polimerazo spodbudi transkripcijo, interakcija z reverzno transkriptazo pa sproži korake vezave, cepitve in ligacije DNA.

=== ''Thermoproteales'' ===
Ena izmed klad znotraj krenarhej je Thermoproteales. Večina do sedaj sekvenciranih genomov te klade, namesto zapisa za arhejsko obliko RPA ali SSB proteinov, vsebuje zapis za poseben ssDNA vezavni protein – ThermoDBP. Opažanja nakazujejo, da je v Thermoproteales nekoč bil prisoten gen za SSB, ki ga je skozi evolucijo nadomestil gen za 196 aminokislin dolg ThermoDBP z neortologno zamenjavo gena. Takšna oblika ssDNA vezavnih proteinov je prisotna pri organizmu T. tenax (TteThermoDBP), kjer odraža močno vezavo na ssDNA, šibko vezavo na RNA in ne odraža vezave na dsDNA, kar je skladno s funkcijo SSB proteinov. Rešena struktura TteThermoDBP je razkrila kompaktno/jedrnato globularno domeno, ki jo sestavljajo štiri α-vijačnice in ena β-ploskev iz štirih antiparalelnih trakov. Prepoznana je bila tudi jamica za vezavo DNA, ki ima obliko idealno za interakcije z bazami kot tudi ogrodjem DNA.

Zraven ThermoDBP obstajata še dve skupini ThermoDBP sorodnih proteinov (ThermoDBP-RP), ki so jih identificirali na podlagi podobnosti njihovega aminokislinskega zaporedja z N-končno vezavno domeno TteThermoDBP. Obe skupini - ThermoDBP-RP1 in ThermoDBP-RP2 najdemo v različnih organizmih krenarhejskih in evriarhejskih vrst. Modelni ThermoDBP-RP2 (iz A. pernix) se z visoko afiniteto veže na kratke (21 nt) hetero- ali homopirimidinsko ssDNA, ne veže pa se na homopurinsko ssDNA, na dsDNA ali na RNA. Modelni ThermoDBP-RP1 (iz P. furiosus) se na vse te kratke oblike DNA in RNA ne veže, kaže pa šibko vezavo na daljša zaporedja ssRNA. Strukturi obeh modelnih ThermoDBP-RP sta tetramerni. Kako je funkcija ThermoDBP-RP povezana s funkcijo ThermoDBP in ali je protein ključen za preživetje celic še ni znano.

== Zaključek ==
V arhejah tako najdemo številne različice proteinov, ki se vežejo na enoverižno DNA (SSB proteinov), ki imajo veliko raznolikost arhitekture domen in sestavnih podenot. V nekaterih arhejah so ti proteini bolj podobni bakterijskim SSB proteinom, v nekaterih evkariontskim RPA proteinom, ponekod pa so prisotne lastnosti obojih. Še zmeraj pa arhejski SSB/RPA proteini ostajajo dokaj neraziskano področje.

==Viri ==
[1] Najwa Taib, Simonetta Gribaldo, Stuart Macneill. Single-Stranded DNA-Binding Proteins in the Archaea. Single Stranded DNA Binding Proteins, 2281, Springer US; Springer US, pp.23-47, 2021, Methods in Molecular Biology, 978-1-07-161290-3.
[2] Thauer, Rudolf K., idr. „Methanogenic Archaea: Ecologically Relevant Differences in Energy Conservation“. Nature Reviews Microbiology, let. 6, št. 8, avgust 2008, str. 579–91. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/nrmicro1931.
[3] Liu, Chunxiao, idr. „Genome-wide analysis of the C3H zinc finger family reveals its functions in salt stress responses of Pyrus betulaefolia“. PeerJ, let. 8, junij 2020, str. e9328. PubMed Central, https://doi.org/10.7717/peerj.9328.
[4] Paytubi, Sonia, idr. „Displacement of the Canonical Single-Stranded DNA-Binding Protein in the Thermoproteales“. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, let. 109, št. 7, februar 2012, str. E398-405. PubMed, https://doi.org/10.1073/pnas.1113277108.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proteini SSB pri arhejah

2023-05-13T19:28:51Z

Teo Trošt: /* Halobakterije */

== Uvod ==
SSB proteini (angl. single strand binding proteins) oziroma proteini, ki se vežejo na enojno vijačnico, igrajo pomembno vlogo pri podvojevanju, popravljanju in rekombinaciji DNA v vseh treh domenah. Gre za vezavo teh proteinov z namenom zavarovanja enovijačne DNA pred razgradnjo. Medtem ko to nalogo pri bakterijah opravljajo SSB proteini, so pri evkariontih prisotni RPA kompleksi (angl. replication protein A). Vezava SSB ali RPA na ssDNA (angl. single-stranded DNA) ni sekvenčno specifična, kar pomeni, da niso omejeni na določena vezavna mesta (lahko se vežejo kjerkoli na ssDNA). Vsi imajo OB zvitje oz. “OB fold” (angl. oligonucleotide/oligosaccharide binding domain), ki je bila najverjetneje prisotna pri skupnem predniku vseh treh domen življenja. OB zvitja so domene, na katere se veže ssDNA.

V glavnem lahko RPA/SSB proteine pri arhejah razdelimo v štiri glavne skupine: RPA41, RPA32, proteine s samskim OB zvitjem in proteine z večimi OB zvitji. Najpomembnejša sta RPA41 in RPA32. RPA41 so evolucijsko precej podobni evkariontskim RPA1 in jih definira ena ali več OB zvitij ter značilen motiv cinkovega prsta. RPA32 so evolucijsko bolj podobni evkariontskim RPA2 in jih prepoznamo po eni ali dveh OB zvitjih ter motivom vijačnica-zavoj-vijačnica oziroma motivom HTH (angl. helix-turn-helix).

V arhejah so do zdaj našli tako RPA kot tudi SSB-ju podobne proteine. Zaradi podobnosti lahko eno skupino teh proteinov imenujemo kar “evriarhejski” RPA proteini (angl. euryarcheal) in jih najdemo pri deblu arhej “euryarchaeota”. V to deblo spadajo metanogene arheje, ki proizvajajo velike količine CH4, halobakterije, ki kljub imenu niso bakterije, pač pa arheje in lahko preživijo pri visokih koncentracijah soli ter termofile, ki živijo na temperaturah od 40 pa do 120 °C. Bakterijam bolj podobni proteini pa spadajo v deblo crenarchaeota in lahko govorimo o krenarhejskih SSB proteinih.

== RPA proteini pri evriarhejah ==
=== Metanogene arheje ===
Metanogene arheje lahko ločimo na dva razreda (I in II). Metanogeni razreda I so obligatni anaerobi. Do danes so raziskali RPA proteine v treh različnih vrstah: Methanocaldococcus jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus in Methanopyrus kandleri. Kljub temu, da ti proteini opravljajo enako nalogo, so si sekvenčno precej različni – manj kot 30% podobnost.

- ''Methanocaldococcus jannaschii'' vsebuje MthRPA oziroma MjaRPA proteine (645 aminokislinskih ostankov), ki spadajo med RPA41 proteine. MthRPA vsebuje 5 OB zvitij. Kljub temu, da ta vrsta vsebuje tudi zapis za RPA32 protein, tega še niso našli (hipotetično bi lahko ta s RPA41 tvoril dimer). So pa dokazali, da se lahko MthRPA veže na ssDNA s podobno afiniteto kot človeški RPA (močno).

- ''Methanopyrus kandleri'' vsebuje MkaRPA proteine (432 aminokislinskih ostankov). Tudi ti proteini spadajo med RPA41 proteine in imajo tri OB zvitja ter prav tako vsebujejo zapis za RPA32 protein.

Metanogeni razreda II so sicer bolj podobni halobakterijam, a vseeno proizvajajo velike količine metana, zato jih uvrščamo v drug razred. Zaenkrat je znana le ena vrsta z RPA proteini:

- ''Methanosarcina acetivorans'' ima zapis za tri homologe RPA (MacRPA1, MacRPA2 in MacRPA3). MacRPA1 (484 aminokislinskih ostankov) ima 4 OB zvitja, a nima cinkovega prsta, zato je bolj podoben RPA proteinom v halobakterijah. MacRPA2 in MacRPA3 pa sta si bistveno bolj podobna. Sta podobno velika (417 in 450 aminokislinskih ostankov) in spadata med RPA41 proteine. Zaradi podobnosti ju najdemo tudi v obliki dimerov.

=== Halobakterije ===
Druga glavna podvrsta arhej so halobakterije. Halobakterije so zelo sorodne Metanogenim arhejam (npr. ''M. acetivorans'') ter raznim drugim evkariontskim organizmom, ki živijo v močno zasoljenih vodah, par takih primerov so v solnih jezerih in sončnih solinah.

- ''Haloferax volcanii'' vsebuje proteina Rpa1 in Rpa3 (zdaj naprej HvoRpa1 in HvoRpa3) sta RPA41 ter sta homologa MacRPA2 in MacRPA3. HvoRpa1 je sestavljen iz 427 aminokislinskih ostankov ter vsebuje le 3 OB zvitja. Največ se jih nahaja v C-končni regiji v obliki zinkovega prsta. S tem, da se nahaja v C-končni regiji, si je kar podoben s tipom DBD-C (DNA vezavna domena modela C) z integralskim C3H (cistein3histidin) cinkovim prstom. Pri evkariontih se DBD-C zvije okrog cinka, tako da se 3 alfa vijačnice zvijejo v trojni heliks in ovijejo okrog cinka. HvoRpa3 je dolg samo 311 aminokislinskih ostankov ter vsebuje le 2 OB zvitja. Drugo zvitje je spet podobno tipu DBD-C z C3H cinkom. Oba proteina HvoRPA sta lahko skupaj prečiščena iz celic, ki ju prekomerno izražajo. Razlika te arheje od ostalih je, da v njej, tako kot pri evkariontih, ne obstaja RPA41-RPA32 kompleks. V evkariontih obstajajo kompleksi, ki so sestavljeni iz večih RPA-jev v sebi, npr. človeški kompleks, ki je iz teh dveh in še enega.
Kompleksa HvoRpa1-HvoRpap1 in HvoRpa3-HvoRpap3 oz. prisotnost vsaj enega od njiju je nujno za delovanje celice. Pomanjkanje enega celici še omogoča preživetje, vendar je pomanjkanje dveh usodno. Če kateri od njiju manjka, povzroči da celica raste počasneje oz. da zamuja z rastjo. Posledica manjkanja HvoRpa3-HvoRpap3 kompleksa je povzročilo povečanje arhej na poškodovanje mitomicina C v DNA in na UV svetlobo. Če pa manjka kompleks HvoRpa1-HvoRpap1, pa celica ne more popravit vseh poškodb v sebi. Če je občutljiva na UV svetlobo to potem vodi v tvorbo CPD-jev (ciklobutan pirimidinskih dimerov) in 6-4PP-jev (pirimidin 6-4-fotoproduktov). Ta dva kompleksa sta kritična za popravljanje DNA poškodb. Problemov, ki jih povzročijo produkti občutljivosti na UV svetlobo, še ne razumejo oz. še ne vedo kakšne so posledice.
HvoRpa2 je ortolog RPA1 M. acetivoransa in je dolg 483 aminokislinskih ostankov. Ima ohranjeno N-končno domeno, s štirimi OB zvitji vendar nimajo cinkovega prsta. Je esencialen za viabilnost celice in ne sme manjkat v genomu, saj to zopet vodi do zmanjšanja celične rasti, ki pa je ključna. HvoRpa3-HvoRpap3 kompleks je delno lahko nadomeščen z HvoRpa2 in vivo. Če so ostranili OB1 in OB2, je to povzročilo malo zmanjšanje zmožnosti nadomeščanja, če pa so odstranili OB3 pa je prišlo do konkretnega zmanjšanja in je zaradi tega skorajda esencialen. Zanimiva stvar tega je, da kljub temu, da imajo ohranjeno N-končno regijo, nimajo cinkovega prsta, kar bi pričakovali, saj ga evkarionti imajo.
- ''Halobacterium salinarum'' kodira homologe HvoRpa in HvoRpap proteinom imenovane HsaRfa proteini. So podobne sestave in velikosti, razen protein RPA32 HsaRfa7, ki je manjši za 160 aminokislinskih ostankov v osrednji regiji. Glavna razlika med temi homologi je, da med HsaRfa-ji ni nobene interakcije, kot je med HvoRpap, vsi pa imajo afiniteto za vezavo na ssDNA. Če odstranimo Rfa3 in Rfa8 povzroči, da celica postane bolj občutljiva na UV in IR svetlobo. Če odstranimo Rfa2 (homolog HvoRpa2) je razlika tukaj, da je za celico to usodno.

== SSB proteini pri krenarhejah ==
Najbolje opredeljeni organizmi krenarhej spadajo v red Sulfulobales, ki vključuje tudi rod Sulfolobus. Veliko vrst iz tega rodu se uporablja za modelne organizme v biologiji arhej, med katerimi ima ključno vlogo S. solfataricus.

=== ''Sulfolobus solfataricus'' ===
SSB protein S. solfataricus (SsoSSB) je bil prvi biokemijsko opredeljen krenarhejski SSB protein in prav tako prvi, za katerega je bila določena tridimenzionalna struktura. Identificirali so ga na podlagi sposobnosti vezave na ssDNA, zaradi njegove pogostosti in preproste strukture, ki je podobna strukturi bakterijskega SSB proteina. 148 aminokislin dolga struktura vsebuje zvitje OB na N-končni domeni in fleksibilen C-končni rep bogat z glicinom, argininom in glutamatom. Oligomerno stanje SsoSSB je še zmeraj tema razprav, saj je predlagano tako monomerno kot tetramerno stanje proteina. Novejše raziskave kažejo, da se SsoSSB z visoko afiniteto ne veže zgolj na ssDNA temveč tudi RNA. Strukturna poravnava zvitja OB na N-koncu krenarhejskega proteina s SSB E. coli in evkariontskim RPA je razkrila večjo podobnost evkariontskemu zvitju DNA vezavne domene B (DBD-B), ki je odgovorno za vezavo ssDNA. Ta vezava je odvisna od nalaganja baz, ki vključuje tri ohranjene triptofanske aminokislinske ostanke in ne deluje specifično.

SsoSSB lahko destabilizira dvojno vijačnico DNA, kar je pogosto tudi pri ostalih SSB proteinih. Ta lastnost je dodatno ojačana/pride do izraza, ko so v DNA prisotna neujemanja ene baze ali pa pri bolj zapletenih poškodbah DNA. To opažanje namiguje, da ima SsoSSB morda vlogo pri prepoznavanju in izbrisu napak DNA in vezavo proteinov, vpletenih v popravilo DNA. Kompleks SsoSSB proteinov in vanje vezane ssDNA interagira s številnimi proteini, med katerimi so XPB helikaza Rad50, topoizomeraza 1, RNA polimeraza in reverzna giraza. Slednji sta v neposredni interakciji s SsoSSB, za ostale pa obstaja možnost da interagirajo zgolj s ssDNA v kompleksu. Interakcija z RNA polimerazo spodbudi transkripcijo, interakcija z reverzno transkriptazo pa sproži korake vezave, cepitve in ligacije DNA.

=== ''Thermoproteales'' ===
Ena izmed klad znotraj krenarhej je Thermoproteales. Večina do sedaj sekvenciranih genomov te klade, namesto zapisa za arhejsko obliko RPA ali SSB proteinov, vsebuje zapis za poseben ssDNA vezavni protein – ThermoDBP. Opažanja nakazujejo, da je v Thermoproteales nekoč bil prisoten gen za SSB, ki ga je skozi evolucijo nadomestil gen za 196 aminokislin dolg ThermoDBP z neortologno zamenjavo gena. Takšna oblika ssDNA vezavnih proteinov je prisotna pri organizmu T. tenax (TteThermoDBP), kjer odraža močno vezavo na ssDNA, šibko vezavo na RNA in ne odraža vezave na dsDNA, kar je skladno s funkcijo SSB proteinov. Rešena struktura TteThermoDBP je razkrila kompaktno/jedrnato globularno domeno, ki jo sestavljajo štiri α-vijačnice in ena β-ploskev iz štirih antiparalelnih trakov. Prepoznana je bila tudi jamica za vezavo DNA, ki ima obliko idealno za interakcije z bazami kot tudi ogrodjem DNA.

Zraven ThermoDBP obstajata še dve skupini ThermoDBP sorodnih proteinov (ThermoDBP-RP), ki so jih identificirali na podlagi podobnosti njihovega aminokislinskega zaporedja z N-končno vezavno domeno TteThermoDBP. Obe skupini - ThermoDBP-RP1 in ThermoDBP-RP2 najdemo v različnih organizmih krenarhejskih in evriarhejskih vrst. Modelni ThermoDBP-RP2 (iz A. pernix) se z visoko afiniteto veže na kratke (21 nt) hetero- ali homopirimidinsko ssDNA, ne veže pa se na homopurinsko ssDNA, na dsDNA ali na RNA. Modelni ThermoDBP-RP1 (iz P. furiosus) se na vse te kratke oblike DNA in RNA ne veže, kaže pa šibko vezavo na daljša zaporedja ssRNA. Strukturi obeh modelnih ThermoDBP-RP sta tetramerni. Kako je funkcija ThermoDBP-RP povezana s funkcijo ThermoDBP in ali je protein ključen za preživetje celic še ni znano.

== Zaključek ==
V arhejah tako najdemo številne različice proteinov, ki se vežejo na enoverižno DNA (SSB proteinov), ki imajo veliko raznolikost arhitekture domen in sestavnih podenot. V nekaterih arhejah so ti proteini bolj podobni bakterijskim SSB proteinom, v nekaterih evkariontskim RPA proteinom, ponekod pa so prisotne lastnosti obojih. Še zmeraj pa arhejski SSB/RPA proteini ostajajo dokaj neraziskano področje.

==Viri ==
[1] Najwa Taib, Simonetta Gribaldo, Stuart Macneill. Single-Stranded DNA-Binding Proteins in the Archaea. Single Stranded DNA Binding Proteins, 2281, Springer US; Springer US, pp.23-47, 2021, Methods in Molecular Biology, 978-1-07-161290-3.
[2] Thauer, Rudolf K., idr. „Methanogenic Archaea: Ecologically Relevant Differences in Energy Conservation“. Nature Reviews Microbiology, let. 6, št. 8, avgust 2008, str. 579–91. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/nrmicro1931.
[3] Liu, Chunxiao, idr. „Genome-wide analysis of the C3H zinc finger family reveals its functions in salt stress responses of Pyrus betulaefolia“. PeerJ, let. 8, junij 2020, str. e9328. PubMed Central, https://doi.org/10.7717/peerj.9328.
[4] Paytubi, Sonia, idr. „Displacement of the Canonical Single-Stranded DNA-Binding Protein in the Thermoproteales“. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, let. 109, št. 7, februar 2012, str. E398-405. PubMed, https://doi.org/10.1073/pnas.1113277108.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proteini SSB pri arhejah

2023-05-13T19:27:13Z

Teo Trošt:

== Uvod ==
SSB proteini (angl. single strand binding proteins) oziroma proteini, ki se vežejo na enojno vijačnico, igrajo pomembno vlogo pri podvojevanju, popravljanju in rekombinaciji DNA v vseh treh domenah. Gre za vezavo teh proteinov z namenom zavarovanja enovijačne DNA pred razgradnjo. Medtem ko to nalogo pri bakterijah opravljajo SSB proteini, so pri evkariontih prisotni RPA kompleksi (angl. replication protein A). Vezava SSB ali RPA na ssDNA (angl. single-stranded DNA) ni sekvenčno specifična, kar pomeni, da niso omejeni na določena vezavna mesta (lahko se vežejo kjerkoli na ssDNA). Vsi imajo OB zvitje oz. “OB fold” (angl. oligonucleotide/oligosaccharide binding domain), ki je bila najverjetneje prisotna pri skupnem predniku vseh treh domen življenja. OB zvitja so domene, na katere se veže ssDNA.

V glavnem lahko RPA/SSB proteine pri arhejah razdelimo v štiri glavne skupine: RPA41, RPA32, proteine s samskim OB zvitjem in proteine z večimi OB zvitji. Najpomembnejša sta RPA41 in RPA32. RPA41 so evolucijsko precej podobni evkariontskim RPA1 in jih definira ena ali več OB zvitij ter značilen motiv cinkovega prsta. RPA32 so evolucijsko bolj podobni evkariontskim RPA2 in jih prepoznamo po eni ali dveh OB zvitjih ter motivom vijačnica-zavoj-vijačnica oziroma motivom HTH (angl. helix-turn-helix).

V arhejah so do zdaj našli tako RPA kot tudi SSB-ju podobne proteine. Zaradi podobnosti lahko eno skupino teh proteinov imenujemo kar “evriarhejski” RPA proteini (angl. euryarcheal) in jih najdemo pri deblu arhej “euryarchaeota”. V to deblo spadajo metanogene arheje, ki proizvajajo velike količine CH4, halobakterije, ki kljub imenu niso bakterije, pač pa arheje in lahko preživijo pri visokih koncentracijah soli ter termofile, ki živijo na temperaturah od 40 pa do 120 °C. Bakterijam bolj podobni proteini pa spadajo v deblo crenarchaeota in lahko govorimo o krenarhejskih SSB proteinih.

== RPA proteini pri evriarhejah ==
=== Metanogene arheje ===
Metanogene arheje lahko ločimo na dva razreda (I in II). Metanogeni razreda I so obligatni anaerobi. Do danes so raziskali RPA proteine v treh različnih vrstah: Methanocaldococcus jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus in Methanopyrus kandleri. Kljub temu, da ti proteini opravljajo enako nalogo, so si sekvenčno precej različni – manj kot 30% podobnost.

- ''Methanocaldococcus jannaschii'' vsebuje MthRPA oziroma MjaRPA proteine (645 aminokislinskih ostankov), ki spadajo med RPA41 proteine. MthRPA vsebuje 5 OB zvitij. Kljub temu, da ta vrsta vsebuje tudi zapis za RPA32 protein, tega še niso našli (hipotetično bi lahko ta s RPA41 tvoril dimer). So pa dokazali, da se lahko MthRPA veže na ssDNA s podobno afiniteto kot človeški RPA (močno).

- ''Methanopyrus kandleri'' vsebuje MkaRPA proteine (432 aminokislinskih ostankov). Tudi ti proteini spadajo med RPA41 proteine in imajo tri OB zvitja ter prav tako vsebujejo zapis za RPA32 protein.

Metanogeni razreda II so sicer bolj podobni halobakterijam, a vseeno proizvajajo velike količine metana, zato jih uvrščamo v drug razred. Zaenkrat je znana le ena vrsta z RPA proteini:

- ''Methanosarcina acetivorans'' ima zapis za tri homologe RPA (MacRPA1, MacRPA2 in MacRPA3). MacRPA1 (484 aminokislinskih ostankov) ima 4 OB zvitja, a nima cinkovega prsta, zato je bolj podoben RPA proteinom v halobakterijah. MacRPA2 in MacRPA3 pa sta si bistveno bolj podobna. Sta podobno velika (417 in 450 aminokislinskih ostankov) in spadata med RPA41 proteine. Zaradi podobnosti ju najdemo tudi v obliki dimerov.

=== Halobakterije ===
Druga glavna podvrsta arhej so halobakterije. Halobakterije so zelo sorodne Metanogenim arhejam (npr. M. acetivorans) ter raznim drugim evkariontskim organizmom, ki živijo v močno zasoljenih vodah, par takih primerov so v solnih jezerih in sončnih solinah.

- ''Haloferax volcanii'' vsebuje proteina Rpa1 in Rpa3 (zdaj naprej HvoRpa1 in HvoRpa3) sta RPA41 ter sta homologa MacRPA2 in MacRPA3. HvoRpa1 je sestavljen iz 427 aminokislinskih ostankov ter vsebuje le 3 OB zvitja. Največ se jih nahaja v C-končni regiji v obliki zinkovega prsta. S tem, da se nahaja v C-končni regiji, si je kar podoben s tipom DBD-C (DNA vezavna domena modela C) z integralskim C3H (cistein3histidin) cinkovim prstom. Pri evkariontih se DBD-C zvije okrog cinka, tako da se 3 alfa vijačnice zvijejo v trojni heliks in ovijejo okrog cinka. HvoRpa3 je dolg samo 311 aminokislinskih ostankov ter vsebuje le 2 OB zvitja. Drugo zvitje je spet podobno tipu DBD-C z C3H cinkom. Oba proteina HvoRPA sta lahko skupaj prečiščena iz celic, ki ju prekomerno izražajo. Razlika te arheje od ostalih je, da v njej, tako kot pri evkariontih, ne obstaja RPA41-RPA32 kompleks. V evkariontih obstajajo kompleksi, ki so sestavljeni iz večih RPA-jev v sebi, npr. človeški kompleks, ki je iz teh dveh in še enega.
Kompleksa HvoRpa1-HvoRpap1 in HvoRpa3-HvoRpap3 oz. prisotnost vsaj enega od njiju je nujno za delovanje celice. Pomanjkanje enega celici še omogoča preživetje, vendar je pomanjkanje dveh usodno. Če kateri od njiju manjka, povzroči da celica raste počasneje oz. da zamuja z rastjo. Posledica manjkanja HvoRpa3-HvoRpap3 kompleksa je povzročilo povečanje arhej na poškodovanje mitomicina C v DNA in na UV svetlobo. Če pa manjka kompleks HvoRpa1-HvoRpap1, pa celica ne more popravit vseh poškodb v sebi. Če je občutljiva na UV svetlobo to potem vodi v tvorbo CPD-jev (ciklobutan pirimidinskih dimerov) in 6-4PP-jev (pirimidin 6-4-fotoproduktov). Ta dva kompleksa sta kritična za popravljanje DNA poškodb. Problemov, ki jih povzročijo produkti občutljivosti na UV svetlobo, še ne razumejo oz. še ne vedo kakšne so posledice.
HvoRpa2 je ortolog RPA1 M. acetivoransa in je dolg 483 aminokislinskih ostankov. Ima ohranjeno N-končno domeno, s štirimi OB zvitji vendar nimajo cinkovega prsta. Je esencialen za viabilnost celice in ne sme manjkat v genomu, saj to zopet vodi do zmanjšanja celične rasti, ki pa je ključna. HvoRpa3-HvoRpap3 kompleks je delno lahko nadomeščen z HvoRpa2 in vivo. Če so ostranili OB1 in OB2, je to povzročilo malo zmanjšanje zmožnosti nadomeščanja, če pa so odstranili OB3 pa je prišlo do konkretnega zmanjšanja in je zaradi tega skorajda esencialen. Zanimiva stvar tega je, da kljub temu, da imajo ohranjeno N-končno regijo, nimajo cinkovega prsta, kar bi pričakovali, saj ga evkarionti imajo.
- ''Halobacterium salinarum'' kodira homologe HvoRpa in HvoRpap proteinom imenovane HsaRfa proteini. So podobne sestave in velikosti, razen protein RPA32 HsaRfa7, ki je manjši za 160 aminokislinskih ostankov v osrednji regiji. Glavna razlika med temi homologi je, da med HsaRfa-ji ni nobene interakcije, kot je med HvoRpap, vsi pa imajo afiniteto za vezavo na ssDNA. Če odstranimo Rfa3 in Rfa8 povzroči, da celica postane bolj občutljiva na UV in IR svetlobo. Če odstranimo Rfa2 (homolog HvoRpa2) je razlika tukaj, da je za celico to usodno.

== SSB proteini pri krenarhejah ==
Najbolje opredeljeni organizmi krenarhej spadajo v red Sulfulobales, ki vključuje tudi rod Sulfolobus. Veliko vrst iz tega rodu se uporablja za modelne organizme v biologiji arhej, med katerimi ima ključno vlogo S. solfataricus.

=== ''Sulfolobus solfataricus'' ===
SSB protein S. solfataricus (SsoSSB) je bil prvi biokemijsko opredeljen krenarhejski SSB protein in prav tako prvi, za katerega je bila določena tridimenzionalna struktura. Identificirali so ga na podlagi sposobnosti vezave na ssDNA, zaradi njegove pogostosti in preproste strukture, ki je podobna strukturi bakterijskega SSB proteina. 148 aminokislin dolga struktura vsebuje zvitje OB na N-končni domeni in fleksibilen C-končni rep bogat z glicinom, argininom in glutamatom. Oligomerno stanje SsoSSB je še zmeraj tema razprav, saj je predlagano tako monomerno kot tetramerno stanje proteina. Novejše raziskave kažejo, da se SsoSSB z visoko afiniteto ne veže zgolj na ssDNA temveč tudi RNA. Strukturna poravnava zvitja OB na N-koncu krenarhejskega proteina s SSB E. coli in evkariontskim RPA je razkrila večjo podobnost evkariontskemu zvitju DNA vezavne domene B (DBD-B), ki je odgovorno za vezavo ssDNA. Ta vezava je odvisna od nalaganja baz, ki vključuje tri ohranjene triptofanske aminokislinske ostanke in ne deluje specifično.

SsoSSB lahko destabilizira dvojno vijačnico DNA, kar je pogosto tudi pri ostalih SSB proteinih. Ta lastnost je dodatno ojačana/pride do izraza, ko so v DNA prisotna neujemanja ene baze ali pa pri bolj zapletenih poškodbah DNA. To opažanje namiguje, da ima SsoSSB morda vlogo pri prepoznavanju in izbrisu napak DNA in vezavo proteinov, vpletenih v popravilo DNA. Kompleks SsoSSB proteinov in vanje vezane ssDNA interagira s številnimi proteini, med katerimi so XPB helikaza Rad50, topoizomeraza 1, RNA polimeraza in reverzna giraza. Slednji sta v neposredni interakciji s SsoSSB, za ostale pa obstaja možnost da interagirajo zgolj s ssDNA v kompleksu. Interakcija z RNA polimerazo spodbudi transkripcijo, interakcija z reverzno transkriptazo pa sproži korake vezave, cepitve in ligacije DNA.

=== ''Thermoproteales'' ===
Ena izmed klad znotraj krenarhej je Thermoproteales. Večina do sedaj sekvenciranih genomov te klade, namesto zapisa za arhejsko obliko RPA ali SSB proteinov, vsebuje zapis za poseben ssDNA vezavni protein – ThermoDBP. Opažanja nakazujejo, da je v Thermoproteales nekoč bil prisoten gen za SSB, ki ga je skozi evolucijo nadomestil gen za 196 aminokislin dolg ThermoDBP z neortologno zamenjavo gena. Takšna oblika ssDNA vezavnih proteinov je prisotna pri organizmu T. tenax (TteThermoDBP), kjer odraža močno vezavo na ssDNA, šibko vezavo na RNA in ne odraža vezave na dsDNA, kar je skladno s funkcijo SSB proteinov. Rešena struktura TteThermoDBP je razkrila kompaktno/jedrnato globularno domeno, ki jo sestavljajo štiri α-vijačnice in ena β-ploskev iz štirih antiparalelnih trakov. Prepoznana je bila tudi jamica za vezavo DNA, ki ima obliko idealno za interakcije z bazami kot tudi ogrodjem DNA.

Zraven ThermoDBP obstajata še dve skupini ThermoDBP sorodnih proteinov (ThermoDBP-RP), ki so jih identificirali na podlagi podobnosti njihovega aminokislinskega zaporedja z N-končno vezavno domeno TteThermoDBP. Obe skupini - ThermoDBP-RP1 in ThermoDBP-RP2 najdemo v različnih organizmih krenarhejskih in evriarhejskih vrst. Modelni ThermoDBP-RP2 (iz A. pernix) se z visoko afiniteto veže na kratke (21 nt) hetero- ali homopirimidinsko ssDNA, ne veže pa se na homopurinsko ssDNA, na dsDNA ali na RNA. Modelni ThermoDBP-RP1 (iz P. furiosus) se na vse te kratke oblike DNA in RNA ne veže, kaže pa šibko vezavo na daljša zaporedja ssRNA. Strukturi obeh modelnih ThermoDBP-RP sta tetramerni. Kako je funkcija ThermoDBP-RP povezana s funkcijo ThermoDBP in ali je protein ključen za preživetje celic še ni znano.

== Zaključek ==
V arhejah tako najdemo številne različice proteinov, ki se vežejo na enoverižno DNA (SSB proteinov), ki imajo veliko raznolikost arhitekture domen in sestavnih podenot. V nekaterih arhejah so ti proteini bolj podobni bakterijskim SSB proteinom, v nekaterih evkariontskim RPA proteinom, ponekod pa so prisotne lastnosti obojih. Še zmeraj pa arhejski SSB/RPA proteini ostajajo dokaj neraziskano področje.

==Viri ==
[1] Najwa Taib, Simonetta Gribaldo, Stuart Macneill. Single-Stranded DNA-Binding Proteins in the Archaea. Single Stranded DNA Binding Proteins, 2281, Springer US; Springer US, pp.23-47, 2021, Methods in Molecular Biology, 978-1-07-161290-3.
[2] Thauer, Rudolf K., idr. „Methanogenic Archaea: Ecologically Relevant Differences in Energy Conservation“. Nature Reviews Microbiology, let. 6, št. 8, avgust 2008, str. 579–91. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/nrmicro1931.
[3] Liu, Chunxiao, idr. „Genome-wide analysis of the C3H zinc finger family reveals its functions in salt stress responses of Pyrus betulaefolia“. PeerJ, let. 8, junij 2020, str. e9328. PubMed Central, https://doi.org/10.7717/peerj.9328.
[4] Paytubi, Sonia, idr. „Displacement of the Canonical Single-Stranded DNA-Binding Protein in the Thermoproteales“. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, let. 109, št. 7, februar 2012, str. E398-405. PubMed, https://doi.org/10.1073/pnas.1113277108.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]