Wiki FKKT - User contributions [en]

Genetsko vezje na osnovi rekombinaze za spremljanje težkih kovin

2022-05-23T18:39:30Z

Tevz Levstek:

Izhodiščni članek: [https://www.mdpi.com/2079-6374/12/2/122 D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.]

==Uvod==

Spremljanje toksičnosti težkih kovin v okolju postaja nujna skrb, ker se industrija vse bolj razvija. Težke kovine tvorijo kovalentne vezi z organskimi molekulami, pri čemer vplivajo na celične organele in ireverzibilno poškodujejo DNA, ter zavirajo celični cikel. To vodi v apoptozo in karcinogenezo. Trenutno so metode določanja toksičnosti težkih kovin sekvenčna sedimentacija, masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS), atomska absorpcijska spektrometrija. Te analitične metode zahtevajo drage instrumente in usposobljeno osebje. Izziv pri pravilni oceni toksičnosti predstavlja odkrivanje frakcij težkih kovin, ki so biološko razpoložljive, saj lahko spremljanje biološke uporabnosti dodatno pomaga pri merjenju kvantitativnih učinkov teh kovin na okolje. Z izzivom odkrivanja biološko uporabnih frakcij se spopadajo biosenzorji na osnovi celice s pomočjo intrinzičnih regulatornih mehanizmov [1].

Hiter razvoj pri načrtovanju genetskega vezja je omogočil, da so biosenzorji na osnovi celic postali pomembni pri odkrivanju širokega spektra analitov in postajajo obetavni na številnih področjih, od medicinske diagnostike do ocene onesnaženosti okolja. Sintezna biologija je napredovala v konceptu biosenzorja, ki temelji na pristopu z moduli bioloških delov, ki so povezani in dobijo odziv logičnih vrat. Glavni mehanizem biosenzorja na osnovi celice je odkrivanje določene vrste analita in ojačanje te identifikacije v električni in optični signal prek procesorja. Sestavljen je iz treh modulov, modula ki zazna vhodni signal, reporterskega modula, ki pretvarja vhodni signal v izhodni signal znotraj celice šasije, ter izhodnega modula. Prednosti uporabe biosenzorjev na osnovi celice je njihovo enostavno gojenje, zaznava širokega spektra snovi in da ne zahtevajo posebnih tehnik za analizo [1,2,3].

Modularnost bioloških delov olajša konstrukcijo pol specifičnih biosenzorjev (izkoriščajo odziv mikroba na stres) in specifičnih biosenzorjev (specifična ciljna molekula aktivira ali zavira transkripcijo določenega izhoda). Poleg tega so rekombinaze eno od orodij sintezne biologije, ki se pogosto uporablja v logičnih vratih. Z obračanjem/izrezovanjem ciljnega zaporedja, ki ga obdajajo mesta prepoznavanja, rekombinaze zagotavljajo mehanizem ON/OFF. Odziv ON/OFF lahko zniža signal ozadja biosenzorja, ki temelji na vezju, ko je aktivacija promotorja odvisna od aktivnosti rekombinaze [1].

V študiji so predlagali biosenzorni sistem za težke kovine na osnovi rekombinaze. Združili so pol specifično biosenzorno napravo, predhodno izdelan mehanizem odziva na toplotni šok s specifičnim biosenzornim modulom. Optimizirali so pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, da bi dosegli povečano spremembo in krajši odzivni čas. Ta sistem je mogoče razširiti za različne težke kovine, da bi naredili vrsto biosenzorjev na osnovi celic, tudi z uporabo na pol specifičnih delov sistema zaznavanja [1].

==Konstrukcija senzorja na osnovi rekombinaze za detekcijo kadmija==

V biosenzorju na osnovi celice so uporabili pol specifični biosenzorski sistem toplotnega šoka. Konstitutivno izražen transkripcijski represor proteina toplotnega šoka (HspR) negativno uravnava promotor, PdnaK. Promotor vsebuje dvojne motive vezave HspR (IR3). Uvedba stresnega faktorja vpliva na vezavo proteina HspR na regulativne domene promotorja PdnaK. Obstajajo različni faktorji stresa, kot so toplota, oksidativni stres in težke kovine [1].

Za povečanje specifičnosti takšnih biosenzorjev so uporabili biosenzor, ki ga sestavljajo geni za odpornost proti ionom težkih kovin. Za konstruiranje senzorja za zaznavanje kadmija, so vključili predhodno izdelan sistem odgovora na toplotni šok, ki nadzoruje izražanje za kadmij specifičnega transkripcijskega faktorja, CadR, in mestno specifične rekombinaze Bxb1. Brez faktorja stresa je kognitivni promotor CadR, PcadA, inaktiviran, saj je njegovo zaporedje obrnjeno v začetnem vezju. Obkrožajo ga mesta za prepoznavanje Bxb1. V prisotnosti kadmijevih ionov se HspR sprosti iz PdnaK, kar omogoča izražanje Bxb1 in CadR. Medtem ko Bxb1 rekombinira obrnjeni promotor PcadA, CadR tvori heterodimerne komplekse s kadmijevimi ioni in se veže na PcadA, kar sproži izražanje fluorescenčnega reporterja GFP [1].

==Rezultati==

===Karakterizacija sistema za optimalne delovne pogoje===

Na začetku so optimizirali vezje s pogoji za aktivnost rekombinaze iz literature. Eden od ciljev študije je opredeliti vgradnjo rekombinaze in pridobiti optimalne pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, tako da ima sistem strog nadzor nad puščanjem in skrajšan odzivni čas glede na zahtevo po dolgem času zaradi pravilne ekspresije in aktivnosti rekombinaze Bxb1. Dodatno so želeli izboljšati odmerek-odziv biosenzorja, zato so želeli doseči nizko bazalno ekspresijo v stanju OFF. Občutljivost odzivnosti je v skladu z naraščajočimi koncentracijami kadmijevih ionov [1].

Optimizacijo sistema so začeli z gojišči. Najprej so uporabili gojišče LB, vendar je njegova nedefinirana narava povzročila nizek izhodni signal, za kar se je tudi predhodno izkazalo, da zmanjša občutljivost na kovine v takih biosenzorjih. Nato so prešli na minimalno gojišče težkih kovin MOPS, vendar je to tudi zagotovilo slab potencial rasti za biosenzorje na osnovi celic na osnovi rekombinaze, inducirane z visoko toksičnimi kadmijevimi ioni. Boljše rezultate so opazili z uporabo MOPS minimalnega medija. Intenzivnost fluorescence se je povečala glede na naraščajoče koncentracije kadmija [1].

Ob uporabi minimalnega medija MOPS za biosenzor na osnovi celice so nato testirali optimalno začetno število celic pred indukcijo, s spremembo faktorja redčenja za čez nočne celične kulture. Domnevali so, da lahko sprememba začetnega števila celic izpostavljenih kadmijevim ionom, vpliva na občutljivost mehanizma celičnega stresa. Primerjali so učinke začetnih števil celic na odziv senzorja z uporabo razredčitev čez nočnih kultur 1:250, 1:100 in 1:50. Izhodni signal je bil je bil od koncentracije začetnega števila celic značilno različen. Celice razredčene na 1:50 in inducirane v logaritemski fazi (OD600 ~ 0,5), so izboljšale obnašanje glede na odmerek in zmanjšale odzivni čas za kasnejše korake optimizacije na 14 ur [1].

Sprva so reakcijo izvedli pri 30 °C, saj je optimalna za ''in vitro'' reakcije integraze z uporabo linearnih DNA substratov. Domnevali so, da lahko biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi zahteva drugačno temperaturo. Senzor so inkubirali pri 23 °C, 30 °C in 37 °C, da bi primerjali njihove učinke. Več t-testov, ki primerjajo koncentracije 0–50 µM kadmijevih ionov za tri različne temperature, je pokazalo, da ima biosenzor, gojen pri 37 °C, večji statistični pomen v prisotnosti induktorja. Poleg tega so optimizirali pH gojišča. Začetno temperaturo so ohranili pri 30 °C, da bi optimizirali delovanje biosenzorja. Najbolje je deloval pri pH 7,5, ki ustreza pH MOPS minimalnemu mediju. Rezultati so pokazali, da bi lahko izdelani biosenzor za kadmij najbolje deloval v minimalnem mediju MOPS (pH 7,5) pri 37 °C [1].

===Optimalni dinamični razpon in analiza navzkrižne reaktivnosti===

Po optimizaciji so postavili eksperiment, da preizkusijo biosenzor v optimalnih delovnih pogojih, opisanih prej. Rezultati so pokazali, da se je biosenzor na povečanje koncentracije kadmija v optimalnih delovnih pogojih odzval v 10 urah. Sistem se ni odzval na koncentracije kadmija, nižje od 50 µM. Nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Najvišja koncentracija kadmija, ki je povečala izhodni signal, je bila tudi pri 50 µM [1].

Nato so se odločili, da testirajo aktivnost biosenzorja, ki temelji na rekombinazi, proti drugim izbranim nabitim kationom težkih kovin (II) (arzen in svinec), saj so prejšnje raziskave razkrile navzkrižno reaktivno naravo transkripcijskih faktorjev družine MerR, v katero spada tudi CadR. Ugotovili so, da ima senzor signal v ozadju za arzenove in svinčeve ione, ampak niso opazili, da bi ustvarili pomemben signal pri 50 µM koncentracije kadmija, kar je optimalna odzivna točka za sistem. Testiranje z ioni težkih kovin je razkrilo bazalni signal za ta sistem [1].

Ta sistem je mogoče testirati z drugimi bakterijami za izboljšanje odzivne krivulje in doslednosti izhoda ter nižjega ozadja, saj je bilo ugotovljeno, da se meje zaznavanja lahko razlikujejo med bakterijskimi vrstami. Poleg tega, ker so mikroorganizmi razvili podobne mehanizme odpornosti na podobno skupino ionov ali molekul, bi morali razširiti analizo navzkrižne reaktivnosti in vključiti dele s samo specifičnimi reakcijami na njihove analite, ki nastanejo z usmerjeno evolucijo. Nazadnje bi lahko povratno vezje ali genetski ojačevalnik razširilo biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi, da bi izboljšali meje zaznavanja [1].

==Zaključek==

Z ugotovitvami poročajo o senzorju kadmija na osnovi rekombinaze, ki uporablja kombinirano zasnovo za pol specifične in specifične, vendar navzkrižno reaktivne transkripcijske enote. Sistem je optimiziran za doseganje največjega signala opaženega pri 50 µM, vendar nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Sistem pa je obetaven za uporabo rekombinaze v biosenzorju na osnovi celice za integracijo več transkripcijskih enot za pridobitev odziva organizma, ki temelji na težkih kovinah. Poglobljena prihodnja študija za izboljšanje značilnosti v smislu selektivnosti in občutljivosti bi lahko zagotovila biosenzor, ki je pripravljen za uporabo odkrivanja različnih težkih kovin [1].

==Viri==

[1] D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.

[2] Q. Gui, T. Lawson, S. Shan, L. Yan, Y. Liu: The Application of Whole Cell-Based Biosensors for Use in Environmental Analysis and in Medical Diagnostics. Sensors. 2017, 17, 1-17.

[3] K. J.Hyun, J. Haeyoung, J. L. Sang: Synthetic biology for microbial heavy metal biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410, 1191-1203.

Genetsko vezje na osnovi rekombinaze za spremljanje težkih kovin

2022-05-23T18:35:36Z

Tevz Levstek:

Izhodiščni članek: [https://www.mdpi.com/2079-6374/12/2/122 D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.]

==UVOD==

Spremljanje toksičnosti težkih kovin v okolju postaja nujna skrb, ker se industrija vse bolj razvija. Težke kovine tvorijo kovalentne vezi z organskimi molekulami, pri čemer vplivajo na celične organele in ireverzibilno poškodujejo DNA, ter zavirajo celični cikel. To vodi v apoptozo in karcinogenezo. Trenutno so metode določanja toksičnosti težkih kovin sekvenčna sedimentacija, masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS), atomska absorpcijska spektrometrija. Te analitične metode zahtevajo drage instrumente in usposobljeno osebje. Izziv pri pravilni oceni toksičnosti predstavlja odkrivanje frakcij težkih kovin, ki so biološko razpoložljive, saj lahko spremljanje biološke uporabnosti dodatno pomaga pri merjenju kvantitativnih učinkov teh kovin na okolje. Z izzivom odkrivanja biološko uporabnih frakcij se spopadajo biosenzorji na osnovi celice s pomočjo intrinzičnih regulatornih mehanizmov [1].

Hiter razvoj pri načrtovanju genetskega vezja je omogočil, da so biosenzorji na osnovi celic postali pomembni pri odkrivanju širokega spektra analitov in postajajo obetavni na številnih področjih, od medicinske diagnostike do ocene onesnaženosti okolja. Sintezna biologija je napredovala v konceptu biosenzorja, ki temelji na pristopu z moduli bioloških delov, ki so povezani in dobijo odziv logičnih vrat. Glavni mehanizem biosenzorja na osnovi celice je odkrivanje določene vrste analita in ojačanje te identifikacije v električni in optični signal prek procesorja. Sestavljen je iz treh modulov, modula ki zazna vhodni signal, reporterskega modula, ki pretvarja vhodni signal v izhodni signal znotraj celice šasije, ter izhodnega modula. Prednosti uporabe biosenzorjev na osnovi celice je njihovo enostavno gojenje, zaznava širokega spektra snovi in da ne zahtevajo posebnih tehnik za analizo [1,2,3].

Modularnost bioloških delov olajša konstrukcijo pol specifičnih biosenzorjev (izkoriščajo odziv mikroba na stres) in specifičnih biosenzorjev (specifična ciljna molekula aktivira ali zavira transkripcijo določenega izhoda). Poleg tega so rekombinaze eno od orodij sintezne biologije, ki se pogosto uporablja v logičnih vratih. Z obračanjem/izrezovanjem ciljnega zaporedja, ki ga obdajajo mesta prepoznavanja, rekombinaze zagotavljajo mehanizem ON/OFF. Odziv ON/OFF lahko zniža signal ozadja biosenzorja, ki temelji na vezju, ko je aktivacija promotorja odvisna od aktivnosti rekombinaze [1].

V študiji so predlagali biosenzorni sistem za težke kovine na osnovi rekombinaze. Združili so pol specifično biosenzorno napravo, predhodno izdelan mehanizem odziva na toplotni šok s specifičnim biosenzornim modulom. Optimizirali so pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, da bi dosegli povečano spremembo in krajši odzivni čas. Ta sistem je mogoče razširiti za različne težke kovine, da bi naredili vrsto biosenzorjev na osnovi celic, tudi z uporabo na pol specifičnih delov sistema zaznavanja [1].

==KONSTRUKCIJA SENZORJA NA OSNOVI REKOMBINAZE ZA DETEKCIJO KADMIJA==

V biosenzorju na osnovi celice so uporabili pol specifični biosenzorski sistem toplotnega šoka. Konstitutivno izražen transkripcijski represor proteina toplotnega šoka (HspR) negativno uravnava promotor, PdnaK. Promotor vsebuje dvojne motive vezave HspR (IR3). Uvedba stresnega faktorja vpliva na vezavo proteina HspR na regulativne domene promotorja PdnaK. Obstajajo različni faktorji stresa, kot so toplota, oksidativni stres in težke kovine [1].

Za povečanje specifičnosti takšnih biosenzorjev so uporabili biosenzor, ki ga sestavljajo geni za odpornost proti ionom težkih kovin. Za konstruiranje senzorja za zaznavanje kadmija, so vključili predhodno izdelan sistem odgovora na toplotni šok, ki nadzoruje izražanje za kadmij specifičnega transkripcijskega faktorja, CadR, in mestno specifične rekombinaze Bxb1. Brez faktorja stresa je kognitivni promotor CadR, PcadA, inaktiviran, saj je njegovo zaporedje obrnjeno v začetnem vezju. Obkrožajo ga mesta za prepoznavanje Bxb1. V prisotnosti kadmijevih ionov se HspR sprosti iz PdnaK, kar omogoča izražanje Bxb1 in CadR. Medtem ko Bxb1 rekombinira obrnjeni promotor PcadA, CadR tvori heterodimerne komplekse s kadmijevimi ioni in se veže na PcadA, kar sproži izražanje fluorescenčnega reporterja GFP [1].

==REZULTATI==

===Karakterizacija sistema za optimalne delovne pogoje===

Na začetku so optimizirali vezje s pogoji za aktivnost rekombinaze iz literature. Eden od ciljev študije je opredeliti vgradnjo rekombinaze in pridobiti optimalne pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, tako da ima sistem strog nadzor nad puščanjem in skrajšan odzivni čas glede na zahtevo po dolgem času zaradi pravilne ekspresije in aktivnosti rekombinaze Bxb1. Dodatno so želeli izboljšati odmerek-odziv biosenzorja, zato so želeli doseči nizko bazalno ekspresijo v stanju OFF. Občutljivost odzivnosti je v skladu z naraščajočimi koncentracijami kadmijevih ionov [1].

Optimizacijo sistema so začeli z gojišči. Najprej so uporabili gojišče LB, vendar je njegova nedefinirana narava povzročila nizek izhodni signal, za kar se je tudi predhodno izkazalo, da zmanjša občutljivost na kovine v takih biosenzorjih. Nato so prešli na minimalno gojišče težkih kovin MOPS, vendar je to tudi zagotovilo slab potencial rasti za biosenzorje na osnovi celic na osnovi rekombinaze, inducirane z visoko toksičnimi kadmijevimi ioni. Boljše rezultate so opazili z uporabo MOPS minimalnega medija. Intenzivnost fluorescence se je povečala glede na naraščajoče koncentracije kadmija [1].

Ob uporabi minimalnega medija MOPS za biosenzor na osnovi celice so nato testirali optimalno začetno število celic pred indukcijo, s spremembo faktorja redčenja za čez nočne celične kulture. Domnevali so, da lahko sprememba začetnega števila celic izpostavljenih kadmijevim ionom, vpliva na občutljivost mehanizma celičnega stresa. Primerjali so učinke začetnih števil celic na odziv senzorja z uporabo razredčitev čez nočnih kultur 1:250, 1:100 in 1:50. Izhodni signal je bil je bil od koncentracije začetnega števila celic značilno različen. Celice razredčene na 1:50 in inducirane v logaritemski fazi (OD600 ~ 0,5), so izboljšale obnašanje glede na odmerek in zmanjšale odzivni čas za kasnejše korake optimizacije na 14 ur [1].

Sprva so reakcijo izvedli pri 30 °C, saj je optimalna za ''in vitro'' reakcije integraze z uporabo linearnih DNA substratov. Domnevali so, da lahko biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi zahteva drugačno temperaturo. Senzor so inkubirali pri 23 °C, 30 °C in 37 °C, da bi primerjali njihove učinke. Več t-testov, ki primerjajo koncentracije 0–50 µM kadmijevih ionov za tri različne temperature, je pokazalo, da ima biosenzor, gojen pri 37 °C, večji statistični pomen v prisotnosti induktorja. Poleg tega so optimizirali pH gojišča. Začetno temperaturo so ohranili pri 30 °C, da bi optimizirali delovanje biosenzorja. Najbolje je deloval pri pH 7,5, ki ustreza pH MOPS minimalnemu mediju. Rezultati so pokazali, da bi lahko izdelani biosenzor za kadmij najbolje deloval v minimalnem mediju MOPS (pH 7,5) pri 37 °C [1].

===Optimalni dinamični razpon in analiza navzkrižne reaktivnosti===

Po optimizaciji so postavili eksperiment, da preizkusijo biosenzor v optimalnih delovnih pogojih, opisanih prej. Rezultati so pokazali, da se je biosenzor na povečanje koncentracije kadmija v optimalnih delovnih pogojih odzval v 10 urah. Sistem se ni odzval na koncentracije kadmija, nižje od 50 µM. Nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Najvišja koncentracija kadmija, ki je povečala izhodni signal, je bila tudi pri 50 µM [1].

Nato so se odločili, da testirajo aktivnost biosenzorja, ki temelji na rekombinazi, proti drugim izbranim nabitim kationom težkih kovin (II) (arzen in svinec), saj so prejšnje raziskave razkrile navzkrižno reaktivno naravo transkripcijskih faktorjev družine MerR, v katero spada tudi CadR. Ugotovili so, da ima senzor signal v ozadju za arzenove in svinčeve ione, ampak niso opazili, da bi ustvarili pomemben signal pri 50 µM koncentracije kadmija, kar je optimalna odzivna točka za sistem. Testiranje z ioni težkih kovin je razkrilo bazalni signal za ta sistem [1].

Ta sistem je mogoče testirati z drugimi bakterijami za izboljšanje odzivne krivulje in doslednosti izhoda ter nižjega ozadja, saj je bilo ugotovljeno, da se meje zaznavanja lahko razlikujejo med bakterijskimi vrstami. Poleg tega, ker so mikroorganizmi razvili podobne mehanizme odpornosti na podobno skupino ionov ali molekul, bi morali razširiti analizo navzkrižne reaktivnosti in vključiti dele s samo specifičnimi reakcijami na njihove analite, ki nastanejo z usmerjeno evolucijo. Nazadnje bi lahko povratno vezje ali genetski ojačevalnik razširilo biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi, da bi izboljšali meje zaznavanja [1].

==ZAKLJUČEK==

Z ugotovitvami poročajo o senzorju kadmija na osnovi rekombinaze, ki uporablja kombinirano zasnovo za pol specifične in specifične, vendar navzkrižno reaktivne transkripcijske enote. Sistem je optimiziran za doseganje največjega signala opaženega pri 50 µM, vendar nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Sistem pa je obetaven za uporabo rekombinaze v biosenzorju na osnovi celice za integracijo več transkripcijskih enot za pridobitev odziva organizma, ki temelji na težkih kovinah. Poglobljena prihodnja študija za izboljšanje značilnosti v smislu selektivnosti in občutljivosti bi lahko zagotovila biosenzor, ki je pripravljen za uporabo odkrivanja različnih težkih kovin [1].

==VIRI==

[1] D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.

[2] Q. Gui, T. Lawson, S. Shan, L. Yan, Y. Liu: The Application of Whole Cell-Based Biosensors for Use in Environmental Analysis and in Medical Diagnostics. Sensors. 2017, 17, 1-17.

[3] K. J.Hyun, J. Haeyoung, J. L. Sang: Synthetic biology for microbial heavy metal biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410, 1191-1203.

Genetsko vezje na osnovi rekombinaze za spremljanje težkih kovin

2022-05-23T18:30:30Z

Tevz Levstek:

==UVOD==

Spremljanje toksičnosti težkih kovin v okolju postaja nujna skrb, ker se industrija vse bolj razvija. Težke kovine tvorijo kovalentne vezi z organskimi molekulami, pri čemer vplivajo na celične organele in ireverzibilno poškodujejo DNA, ter zavirajo celični cikel. To vodi v apoptozo in karcinogenezo. Trenutno so metode določanja toksičnosti težkih kovin sekvenčna sedimentacija, masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS), atomska absorpcijska spektrometrija. Te analitične metode zahtevajo drage instrumente in usposobljeno osebje. Izziv pri pravilni oceni toksičnosti predstavlja odkrivanje frakcij težkih kovin, ki so biološko razpoložljive, saj lahko spremljanje biološke uporabnosti dodatno pomaga pri merjenju kvantitativnih učinkov teh kovin na okolje. Z izzivom odkrivanja biološko uporabnih frakcij se spopadajo biosenzorji na osnovi celice s pomočjo intrinzičnih regulatornih mehanizmov [1].

Hiter razvoj pri načrtovanju genetskega vezja je omogočil, da so biosenzorji na osnovi celic postali pomembni pri odkrivanju širokega spektra analitov in postajajo obetavni na številnih področjih, od medicinske diagnostike do ocene onesnaženosti okolja. Sintezna biologija je napredovala v konceptu biosenzorja, ki temelji na pristopu z moduli bioloških delov, ki so povezani in dobijo odziv logičnih vrat. Glavni mehanizem biosenzorja na osnovi celice je odkrivanje določene vrste analita in ojačanje te identifikacije v električni in optični signal prek procesorja. Sestavljen je iz treh modulov, modula ki zazna vhodni signal, reporterskega modula, ki pretvarja vhodni signal v izhodni signal znotraj celice šasije, ter izhodnega modula. Prednosti uporabe biosenzorjev na osnovi celice je njihovo enostavno gojenje, zaznava širokega spektra snovi in da ne zahtevajo posebnih tehnik za analizo [1,2,3].

Modularnost bioloških delov olajša konstrukcijo pol specifičnih biosenzorjev (izkoriščajo odziv mikroba na stres) in specifičnih biosenzorjev (specifična ciljna molekula aktivira ali zavira transkripcijo določenega izhoda). Poleg tega so rekombinaze eno od orodij sintezne biologije, ki se pogosto uporablja v logičnih vratih. Z obračanjem/izrezovanjem ciljnega zaporedja, ki ga obdajajo mesta prepoznavanja, rekombinaze zagotavljajo mehanizem ON/OFF. Odziv ON/OFF lahko zniža signal ozadja biosenzorja, ki temelji na vezju, ko je aktivacija promotorja odvisna od aktivnosti rekombinaze [1].

V študiji so predlagali biosenzorni sistem za težke kovine na osnovi rekombinaze. Združili so pol specifično biosenzorno napravo, predhodno izdelan mehanizem odziva na toplotni šok s specifičnim biosenzornim modulom. Optimizirali so pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, da bi dosegli povečano spremembo in krajši odzivni čas. Ta sistem je mogoče razširiti za različne težke kovine, da bi naredili vrsto biosenzorjev na osnovi celic, tudi z uporabo na pol specifičnih delov sistema zaznavanja [1].

==KONSTRUKCIJA SENZORJA NA OSNOVI REKOMBINAZE ZA DETEKCIJO KADMIJA==

V biosenzorju na osnovi celice so uporabili pol specifični biosenzorski sistem toplotnega šoka. Konstitutivno izražen transkripcijski represor proteina toplotnega šoka (HspR) negativno uravnava promotor, PdnaK. Promotor vsebuje dvojne motive vezave HspR (IR3). Uvedba stresnega faktorja vpliva na vezavo proteina HspR na regulativne domene promotorja PdnaK. Obstajajo različni faktorji stresa, kot so toplota, oksidativni stres in težke kovine [1].

Za povečanje specifičnosti takšnih biosenzorjev so uporabili biosenzor, ki ga sestavljajo geni za odpornost proti ionom težkih kovin. Za konstruiranje senzorja za zaznavanje kadmija, so vključili predhodno izdelan sistem odgovora na toplotni šok, ki nadzoruje izražanje za kadmij specifičnega transkripcijskega faktorja, CadR, in mestno specifične rekombinaze Bxb1. Brez faktorja stresa je kognitivni promotor CadR, PcadA, inaktiviran, saj je njegovo zaporedje obrnjeno v začetnem vezju. Obkrožajo ga mesta za prepoznavanje Bxb1. V prisotnosti kadmijevih ionov se HspR sprosti iz PdnaK, kar omogoča izražanje Bxb1 in CadR. Medtem ko Bxb1 rekombinira obrnjeni promotor PcadA, CadR tvori heterodimerne komplekse s kadmijevimi ioni in se veže na PcadA, kar sproži izražanje fluorescenčnega reporterja GFP [1].

==REZULTATI==

===Karakterizacija sistema za optimalne delovne pogoje===

Na začetku so optimizirali vezje s pogoji za aktivnost rekombinaze iz literature. Eden od ciljev študije je opredeliti vgradnjo rekombinaze in pridobiti optimalne pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, tako da ima sistem strog nadzor nad puščanjem in skrajšan odzivni čas glede na zahtevo po dolgem času zaradi pravilne ekspresije in aktivnosti rekombinaze BxB1. Dodatno so želeli izboljšati odmerek-odziv biosenzorja, zato so želeli doseči nizko bazalno ekspresijo v stanju OFF. Občutljivost odzivnosti je v skladu z naraščajočimi koncentracijami kadmijevih ionov [1].

Optimizacijo sistema so začeli z gojišči. Najprej so uporabili gojišče LB, vendar je njegova nedefinirana narava povzročila nizek izhodni signal, za kar se je tudi predhodno izkazalo, da zmanjša občutljivost na kovine v takih biosenzorjih. Nato so prešli na minimalno gojišče težkih kovin MOPS, vendar je to tudi zagotovilo slab potencial rasti za biosenzorje na osnovi celic na osnovi rekombinaze, inducirane z visoko toksičnimi kadmijevimi ioni. Boljše rezultate so opazili z uporabo MOPS minimalnega medija. Intenzivnost fluorescence se je povečala glede na naraščajoče koncentracije kadmija [1].

Ob uporabi minimalnega medija MOPS za biosenzor na osnovi celice so nato testirali optimalno začetno število celic pred indukcijo, s spremembo faktorja redčenja za čez nočne celične kulture. Domnevali so, da lahko sprememba začetnega števila celic izpostavljenih kadmijevim ionom, vpliva na občutljivost mehanizma celičnega stresa. Primerjali so učinke začetnih števil celic na odziv senzorja z uporabo razredčitev čez nočnih kultur 1:250, 1:100 in 1:50. Izhodni signal je bil je bil od koncentracije začetnega števila celic značilno različen. Celice razredčene na 1:50 in inducirane v logaritemski fazi (OD600 ~ 0,5), so izboljšale obnašanje glede na odmerek in zmanjšale odzivni čas za kasnejše korake optimizacije na 14 ur [1].

Sprva so reakcijo izvedli pri 30 °C, saj je optimalna za ''in vitro'' reakcije integraze z uporabo linearnih DNA substratov. Domnevali so, da lahko biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi zahteva drugačno temperaturo. Senzor so inkubirali pri 23 °C, 30 °C in 37 °C, da bi primerjali njihove učinke. Več t-testov, ki primerjajo koncentracije 0–50 µM kadmijevih ionov za tri različne temperature, je pokazalo, da ima biosenzor, gojen pri 37 °C, večji statistični pomen v prisotnosti induktorja. Poleg tega so optimizirali pH gojišča. Začetno temperaturo so ohranili pri 30 °C, da bi optimizirali delovanje biosenzorja. Najbolje je deloval pri pH 7,5, ki ustreza pH MOPS minimalnemu mediju. Rezultati so pokazali, da bi lahko izdelani biosenzor za kadmij najbolje deloval v minimalnem mediju MOPS (pH 7,5) pri 37 °C [1].

===Optimalni dinamični razpon in analiza navzkrižne reaktivnosti===

Po optimizaciji so postavili eksperiment, da preizkusijo biosenzor v optimalnih delovnih pogojih, opisanih prej. Rezultati so pokazali, da se je biosenzor na povečanje koncentracije kadmija v optimalnih delovnih pogojih odzval v 10 urah. Sistem se ni odzval na koncentracije kadmija, nižje od 50 µM. Nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Najvišja koncentracija kadmija, ki je povečala izhodni signal, je bila tudi pri 50 µM [1].

Nato so se odločili, da testirajo aktivnost biosenzorja, ki temelji na rekombinazi, proti drugim izbranim nabitim kationom težkih kovin (II) (arzen in svinec), saj so prejšnje raziskave razkrile navzkrižno reaktivno naravo transkripcijskih faktorjev družine MerR, v katero spada tudi CadR. Ugotovili so, da ima senzor signal v ozadju za arzenove in svinčeve ione, ampak niso opazili, da bi ustvarili pomemben signal pri 50 µM koncentracije kadmija, kar je optimalna odzivna točka za sistem. Testiranje z ioni težkih kovin je razkrilo bazalni signal za ta sistem [1].

Ta sistem je mogoče testirati z drugimi bakterijami za izboljšanje odzivne krivulje in doslednosti izhoda ter nižjega ozadja, saj je bilo ugotovljeno, da se meje zaznavanja lahko razlikujejo med bakterijskimi vrstami. Poleg tega, ker so mikroorganizmi razvili podobne mehanizme odpornosti na podobno skupino ionov ali molekul, bi morali razširiti analizo navzkrižne reaktivnosti in vključiti dele s samo specifičnimi reakcijami na njihove analite, ki nastanejo z usmerjeno evolucijo. Nazadnje bi lahko povratno vezje ali genetski ojačevalnik razširilo biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi, da bi izboljšali meje zaznavanja [1].

==ZAKLJUČEK==

Z ugotovitvami poročajo o senzorju kadmija na osnovi rekombinaze, ki uporablja kombinirano zasnovo za pol specifične in specifične, vendar navzkrižno reaktivne transkripcijske enote. Sistem je optimiziran za doseganje največjega signala opaženega pri 50 µM, vendar nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Sistem pa je obetaven za uporabo rekombinaze v biosenzorju na osnovi celice za integracijo več transkripcijskih enot za pridobitev odziva organizma, ki temelji na težkih kovinah. Poglobljena prihodnja študija za izboljšanje značilnosti v smislu selektivnosti in občutljivosti bi lahko zagotovila biosenzor, ki je pripravljen za uporabo odkrivanja različnih težkih kovin [1].

==VIRI==

[1] D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.

[2] Q. Gui, T. Lawson, S. Shan, L. Yan, Y. Liu: The Application of Whole Cell-Based Biosensors for Use in Environmental Analysis and in Medical Diagnostics. Sensors. 2017, 17, 1-17.

[3] K. J.Hyun, J. Haeyoung, J. L. Sang: Synthetic biology for microbial heavy metal biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410, 1191-1203.

Genetsko vezje na osnovi rekombinaze za spremljanje težkih kovin

2022-05-23T18:29:07Z

Tevz Levstek:

==UVOD==

Spremljanje toksičnosti težkih kovin v okolju postaja nujna skrb, ker se industrija vse bolj razvija. Težke kovine tvorijo kovalentne vezi z organskimi molekulami, pri čemer vplivajo na celične organele in ireverzibilno poškodujejo DNA, ter zavirajo celični cikel. To vodi v apoptozo in karcinogenezo. Trenutno so metode določanja toksičnosti težkih kovin sekvenčna sedimentacija, masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS), atomska absorpcijska spektrometrija. Te analitične metode zahtevajo drage instrumente in usposobljeno osebje. Izziv pri pravilni oceni toksičnosti predstavlja odkrivanje frakcij težkih kovin, ki so biološko razpoložljive, saj lahko spremljanje biološke uporabnosti dodatno pomaga pri merjenju kvantitativnih učinkov teh kovin na okolje. Z izzivom odkrivanja biološko uporabnih frakcij se spopadajo biosenzorji na osnovi celice s pomočjo intrinzičnih regulatornih mehanizmov [1].

Hiter razvoj pri načrtovanju genetskega vezja je omogočil, da so biosenzorji na osnovi celic postali pomembni pri odkrivanju širokega spektra analitov in postajajo obetavni na številnih področjih, od medicinske diagnostike do ocene onesnaženosti okolja. Sintezna biologija je napredovala v konceptu biosenzorja, ki temelji na pristopu z moduli bioloških delov, ki so povezani in dobijo odziv logičnih vrat. Glavni mehanizem biosenzorja na osnovi celice je odkrivanje določene vrste analita in ojačanje te identifikacije v električni in optični signal prek procesorja. Sestavljen je iz treh modulov, modula ki zazna vhodni signal, reporterskega modula, ki pretvarja vhodni signal v izhodni signal znotraj celice šasije, ter izhodnega modula. Prednosti uporabe biosenzorjev na osnovi celice je njihovo enostavno gojenje, zaznava širokega spektra snovi in da ne zahtevajo posebnih tehnik za analizo [1,2,3].

Modularnost bioloških delov olajša konstrukcijo pol specifičnih biosenzorjev (izkoriščajo odziv mikroba na stres) in specifičnih biosenzorjev (specifična ciljna molekula aktivira ali zavira transkripcijo določenega izhoda). Poleg tega so rekombinaze eno od orodij sintezne biologije, ki se pogosto uporablja v logičnih vratih. Z obračanjem/izrezovanjem ciljnega zaporedja, ki ga obdajajo mesta prepoznavanja, rekombinaze zagotavljajo mehanizem ON/OFF. Odziv ON/OFF lahko zniža signal ozadja biosenzorja, ki temelji na vezju, ko je aktivacija promotorja odvisna od aktivnosti rekombinaze [1].

V študiji so predlagali biosenzorni sistem za težke kovine na osnovi rekombinaze. Združili so pol specifično biosenzorno napravo, predhodno izdelan mehanizem odziva na toplotni šok s specifičnim biosenzornim modulom. Optimizirali so pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, da bi dosegli povečano spremembo in krajši odzivni čas. Ta sistem je mogoče razširiti za različne težke kovine, da bi naredili vrsto biosenzorjev na osnovi celic, tudi z uporabo na pol specifičnih delov sistema zaznavanja [1].

==KONSTRUKCIJA SENZORJA NA OSNOVI REKOMBINAZE ZA DETEKCIJO KADMIJA==

V biosenzorju na osnovi celice so uporabili pol specifični biosenzorski sistem toplotnega šoka. Konstitutivno izražen transkripcijski represor proteina toplotnega šoka (HspR) negativno uravnava promotor, PdnaK. Promotor vsebuje dvojne motive vezave HspR (IR3). Uvedba stresnega faktorja vpliva na vezavo proteina HspR na regulativne domene promotorja PdnaK. Obstajajo različni faktorji stresa, kot so toplota, oksidativni stres in težke kovine [1].

Za povečanje specifičnosti takšnih biosenzorjev so uporabili biosenzor, ki ga sestavljajo geni za odpornost proti ionom težkih kovin. Za konstruiranje senzorja za zaznavanje kadmija, so vključili predhodno izdelan sistem odgovora na toplotni šok, ki nadzoruje izražanje za kadmij specifičnega transkripcijskega faktorja, CadR, in mestno specifične rekombinaze Bxb1. Brez faktorja stresa je kognitivni promotor CadR, PcadA, inaktiviran, saj je njegovo zaporedje obrnjeno v začetnem vezju. Obkrožajo ga mesta za prepoznavanje Bxb1. V prisotnosti kadmijevih ionov se HspR sprosti iz PdnaK, kar omogoča izražanje Bxb1 in CadR. Medtem ko Bxb1 rekombinira obrnjeni promotor PcadA, CadR tvori heterodimerne komplekse s kadmijevimi ioni in se veže na PcadA, kar sproži izražanje fluorescenčnega reporterja GFP [1].

==REZULTATI==

===Karakterizacija sistema za optimalne delovne pogoje===

Na začetku so optimizirali vezje s pogoji za aktivnost rekombinaze iz literature. Eden od ciljev študije je opredeliti vgradnjo rekombinaze in pridobiti optimalne pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, tako da ima sistem strog nadzor nad puščanjem in skrajšan odzivni čas glede na zahtevo po dolgem času zaradi pravilne ekspresije in aktivnosti rekombinaze BxB1. Dodatno so želeli izboljšati odmerek-odziv biosenzorja, zato so želeli doseči nizko bazalno ekspresijo v stanju OFF. Občutljivost odzivnosti je v skladu z naraščajočimi koncentracijami kadmijevih ionov [1].

Optimizacijo sistema so začeli z gojišči. Najprej so uporabili gojišče LB, vendar je njegova nedefinirana narava povzročila nizek izhodni signal, za kar se je tudi predhodno izkazalo, da zmanjša občutljivost na kovine v takih biosenzorjih. Nato so prešli na minimalno gojišče težkih kovin MOPS, vendar je to tudi zagotovilo slab potencial rasti za biosenzorje na osnovi celic na osnovi rekombinaze, inducirane z visoko toksičnimi kadmijevimi ioni. Boljše rezultate so opazili z uporabo MOPS minimalnega medija. Intenzivnost fluorescence se je povečala glede na naraščajoče koncentracije kadmija [1].

Ob uporabi minimalnega medija MOPS za biosenzor na osnovi celice so nato testirali optimalno začetno število celic pred indukcijo, s spremembo faktorja redčenja za čez nočne celične kulture. Domnevali so, da lahko sprememba začetnega števila celic izpostavljenih kadmijevim ionom, vpliva na občutljivost mehanizma celičnega stresa. Primerjali so učinke začetnih števil celic na odziv senzorja z uporabo razredčitev čez nočnih kultur 1:250, 1:100 in 1:50. Izhodni signal je bil je bil od koncentracije začetnega števila celic značilno različen. Celice razredčene na 1:50 in inducirane v logaritemski fazi (OD600 ~ 0,5), so izboljšale obnašanje glede na odmerek in zmanjšale odzivni čas za kasnejše korake optimizacije na 14 ur [1].

Sprva so reakcijo izvedli pri 30 °C, saj je optimalna za ''in vitro'' reakcije integraze z uporabo linearnih DNA substratov. Domnevali so, da lahko biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi zahteva drugačno temperaturo. Senzor so inkubirali pri 23 °C, 30 °C in 37 °C, da bi primerjali njihove učinke. Več t-testov, ki primerjajo koncentracije 0–50 µM kadmijevih ionov za tri različne temperature, je pokazalo, da ima biosenzor, gojen pri 37 °C, večji statistični pomen v prisotnosti induktorja. Poleg tega so optimizirali pH gojišča. Začetno temperaturo so ohranili pri 30 °C, da bi optimizirali delovanje biosenzorja. Najbolje je deloval pri pH 7,5, ki ustreza pH MOPS minimalnemu mediju. Rezultati so pokazali, da bi lahko izdelani biosenzor za kadmij najbolje deloval v minimalnem mediju MOPS (pH 7,5) pri 37 °C [1].

===Optimalni dinamični razpon in analiza navzkrižne reaktivnosti===

Po optimizaciji so postavili eksperiment, da preizkusijo biosenzor v optimalnih delovnih pogojih, opisanih prej. Rezultati so pokazali, da se je biosenzor na povečanje koncentracije kadmija v optimalnih delovnih pogojih odzval v 10 urah. Sistem se ni odzval na koncentracije kadmija, nižje od 50 µM. Nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Najvišja koncentracija kadmija, ki je povečala izhodni signal, je bila tudi pri 50 µM [1].

Nato so se odločili, da testirajo aktivnost biosenzorja, ki temelji na rekombinazi, proti drugim izbranim nabitim kationom težkih kovin (II) (arzen in svinec), saj so prejšnje raziskave razkrile navzkrižno reaktivno naravo transkripcijskih faktorjev družine MerR, v katero spada tudi CadR. Ugotovili so, da ima senzor signal v ozadju za arzenove in svinčeve ione, ampak niso opazili, da bi ustvarili pomemben signal pri 50 µM koncentracije kadmija, kar je optimalna odzivna točka za sistem. Testiranje z ioni težkih kovin je razkrilo bazalni signal za ta sistem [1].

Ta sistem je mogoče testirati z drugimi bakterijami za izboljšanje odzivne krivulje in doslednosti izhoda ter nižjega ozadja, saj je bilo ugotovljeno, da se meje zaznavanja lahko razlikujejo med bakterijskimi vrstami. Poleg tega, ker so mikroorganizmi razvili podobne mehanizme odpornosti na podobno skupino ionov ali molekul, bi morali razširiti analizo navzkrižne reaktivnosti in vključiti dele s samo specifičnimi reakcijami na njihove analite, ki nastanejo z usmerjeno evolucijo. Nazadnje bi lahko povratno vezje ali genetski ojačevalnik razširilo biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi, da bi izboljšali meje zaznavanja [1].

==ZAKLJUČEK==

Z ugotovitvami poročajo o senzorju kadmija na osnovi rekombinaze, ki uporablja kombinirano zasnovo za pol specifične in specifične, vendar navzkrižno reaktivne transkripcijske enote. Sistem je optimiziran za doseganje največjega signala opaženega pri 50 µM, vendar nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Sistem pa je obetaven za uporabo rekombinaze v biosenzorju na osnovi celice za integracijo več transkripcijskih enot za pridobitev odziva organizma, ki temelji na težkih kovinah. Poglobljena prihodnja študija za izboljšanje značilnosti v smislu selektivnosti in občutljivosti bi lahko zagotovila biosenzor, ki je pripravljen za uporabo odkrivanja različnih težkih kovin [1].

==VIRI==

[1] D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.
[2] Q. Gui, T. Lawson, S. Shan, L. Yan, Y. Liu: The Application of Whole Cell-Based Biosensors for Use in Environmental Analysis and in Medical Diagnostics. Sensors. 2017, 17, 1-17.
[3] K. J.Hyun, J. Haeyoung, J. L. Sang: Synthetic biology for microbial heavy metal biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410, 1191-1203.

Genetsko vezje na osnovi rekombinaze za spremljanje težkih kovin

2022-05-23T18:27:55Z

Tevz Levstek: /* UVOD */

==UVOD==

Spremljanje toksičnosti težkih kovin v okolju postaja nujna skrb, ker se industrija vse bolj razvija. Težke kovine tvorijo kovalentne vezi z organskimi molekulami, pri čemer vplivajo na celične organele in ireverzibilno poškodujejo DNA, ter zavirajo celični cikel. To vodi v apoptozo in karcinogenezo. Trenutno so metode določanja toksičnosti težkih kovin sekvenčna sedimentacija, masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS), atomska absorpcijska spektrometrija. Te analitične metode zahtevajo drage instrumente in usposobljeno osebje. Izziv pri pravilni oceni toksičnosti predstavlja odkrivanje frakcij težkih kovin, ki so biološko razpoložljive, saj lahko spremljanje biološke uporabnosti dodatno pomaga pri merjenju kvantitativnih učinkov teh kovin na okolje. Z izzivom odkrivanja biološko uporabnih frakcij se spopadajo biosenzorji na osnovi celice s pomočjo intrinzičnih regulatornih mehanizmov [1].

Hiter razvoj pri načrtovanju genetskega vezja je omogočil, da so biosenzorji na osnovi celic postali pomembni pri odkrivanju širokega spektra analitov in postajajo obetavni na številnih področjih, od medicinske diagnostike do ocene onesnaženosti okolja. Sintezna biologija je napredovala v konceptu biosenzorja, ki temelji na pristopu z moduli bioloških delov, ki so povezani in dobijo odziv logičnih vrat. Glavni mehanizem biosenzorja na osnovi celice je odkrivanje določene vrste analita in ojačanje te identifikacije v električni in optični signal prek procesorja. Sestavljen je iz treh modulov, modula ki zazna vhodni signal, reporterskega modula, ki pretvarja vhodni signal v izhodni signal znotraj celice šasije, ter izhodnega modula. Prednosti uporabe biosenzorjev na osnovi celice je njihovo enostavno gojenje, zaznava širokega spektra snovi in da ne zahtevajo posebnih tehnik za analizo [1,2,3].

Modularnost bioloških delov olajša konstrukcijo pol specifičnih biosenzorjev (izkoriščajo odziv mikroba na stres) in specifičnih biosenzorjev (specifična ciljna molekula aktivira ali zavira transkripcijo določenega izhoda). Poleg tega so rekombinaze eno od orodij sintezne biologije, ki se pogosto uporablja v logičnih vratih. Z obračanjem/izrezovanjem ciljnega zaporedja, ki ga obdajajo mesta prepoznavanja, rekombinaze zagotavljajo mehanizem ON/OFF. Odziv ON/OFF lahko zniža signal ozadja biosenzorja, ki temelji na vezju, ko je aktivacija promotorja odvisna od aktivnosti rekombinaze [1].

V študiji so predlagali biosenzorni sistem za težke kovine na osnovi rekombinaze. Združili so pol specifično biosenzorno napravo, predhodno izdelan mehanizem odziva na toplotni šok s specifičnim biosenzornim modulom. Optimizirali so pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, da bi dosegli povečano spremembo in krajši odzivni čas. Ta sistem je mogoče razširiti za različne težke kovine, da bi naredili vrsto biosenzorjev na osnovi celic, tudi z uporabo na pol specifičnih delov sistema zaznavanja [1].

==KONSTRUKCIJA SENZORJA NA OSNOVI REKOMBINAZE ZA DETEKCIJO KADMIJA==

V biosenzorju na osnovi celice so uporabili pol specifični biosenzorski sistem toplotnega šoka. Konstitutivno izražen transkripcijski represor proteina toplotnega šoka (HspR) negativno uravnava promotor, PdnaK. Promotor vsebuje dvojne motive vezave HspR (IR3). Uvedba stresnega faktorja vpliva na vezavo proteina HspR na regulativne domene promotorja PdnaK. Obstajajo različni faktorji stresa, kot so toplota, oksidativni stres in težke kovine [1].
Za povečanje specifičnosti takšnih biosenzorjev so uporabili biosenzor, ki ga sestavljajo geni za odpornost proti ionom težkih kovin. Za konstruiranje senzorja za zaznavanje kadmija, so vključili predhodno izdelan sistem odgovora na toplotni šok, ki nadzoruje izražanje za kadmij specifičnega transkripcijskega faktorja, CadR, in mestno specifične rekombinaze Bxb1. Brez faktorja stresa je kognitivni promotor CadR, PcadA, inaktiviran, saj je njegovo zaporedje obrnjeno v začetnem vezju. Obkrožajo ga mesta za prepoznavanje Bxb1. V prisotnosti kadmijevih ionov se HspR sprosti iz PdnaK, kar omogoča izražanje Bxb1 in CadR. Medtem ko Bxb1 rekombinira obrnjeni promotor PcadA, CadR tvori heterodimerne komplekse s kadmijevimi ioni in se veže na PcadA, kar sproži izražanje fluorescenčnega reporterja GFP [1].

==REZULTATI==

===Karakterizacija sistema za optimalne delovne pogoje===
Na začetku so optimizirali vezje s pogoji za aktivnost rekombinaze iz literature. Eden od ciljev študije je opredeliti vgradnjo rekombinaze in pridobiti optimalne pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, tako da ima sistem strog nadzor nad puščanjem in skrajšan odzivni čas glede na zahtevo po dolgem času zaradi pravilne ekspresije in aktivnosti rekombinaze BxB1. Dodatno so želeli izboljšati odmerek-odziv biosenzorja, zato so želeli doseči nizko bazalno ekspresijo v stanju OFF. Občutljivost odzivnosti je v skladu z naraščajočimi koncentracijami kadmijevih ionov [1].
Optimizacijo sistema so začeli z gojišči. Najprej so uporabili gojišče LB, vendar je njegova nedefinirana narava povzročila nizek izhodni signal, za kar se je tudi predhodno izkazalo, da zmanjša občutljivost na kovine v takih biosenzorjih. Nato so prešli na minimalno gojišče težkih kovin MOPS, vendar je to tudi zagotovilo slab potencial rasti za biosenzorje na osnovi celic na osnovi rekombinaze, inducirane z visoko toksičnimi kadmijevimi ioni. Boljše rezultate so opazili z uporabo MOPS minimalnega medija. Intenzivnost fluorescence se je povečala glede na naraščajoče koncentracije kadmija [1].
Ob uporabi minimalnega medija MOPS za biosenzor na osnovi celice so nato testirali optimalno začetno število celic pred indukcijo, s spremembo faktorja redčenja za čez nočne celične kulture. Domnevali so, da lahko sprememba začetnega števila celic izpostavljenih kadmijevim ionom, vpliva na občutljivost mehanizma celičnega stresa. Primerjali so učinke začetnih števil celic na odziv senzorja z uporabo razredčitev čez nočnih kultur 1:250, 1:100 in 1:50. Izhodni signal je bil je bil od koncentracije začetnega števila celic značilno različen. Celice razredčene na 1:50 in inducirane v logaritemski fazi (OD600 ~ 0,5), so izboljšale obnašanje glede na odmerek in zmanjšale odzivni čas za kasnejše korake optimizacije na 14 ur [1].
Sprva so reakcijo izvedli pri 30 °C, saj je optimalna za ''in vitro'' reakcije integraze z uporabo linearnih DNA substratov. Domnevali so, da lahko biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi zahteva drugačno temperaturo. Senzor so inkubirali pri 23 °C, 30 °C in 37 °C, da bi primerjali njihove učinke. Več t-testov, ki primerjajo koncentracije 0–50 µM kadmijevih ionov za tri različne temperature, je pokazalo, da ima biosenzor, gojen pri 37 °C, večji statistični pomen v prisotnosti induktorja. Poleg tega so optimizirali pH gojišča. Začetno temperaturo so ohranili pri 30 °C, da bi optimizirali delovanje biosenzorja. Najbolje je deloval pri pH 7,5, ki ustreza pH MOPS minimalnemu mediju. Rezultati so pokazali, da bi lahko izdelani biosenzor za kadmij najbolje deloval v minimalnem mediju MOPS (pH 7,5) pri 37 °C [1].

===Optimalni dinamični razpon in analiza navzkrižne reaktivnosti===
Po optimizaciji so postavili eksperiment, da preizkusijo biosenzor v optimalnih delovnih pogojih, opisanih prej. Rezultati so pokazali, da se je biosenzor na povečanje koncentracije kadmija v optimalnih delovnih pogojih odzval v 10 urah. Sistem se ni odzval na koncentracije kadmija, nižje od 50 µM. Nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Najvišja koncentracija kadmija, ki je povečala izhodni signal, je bila tudi pri 50 µM [1].
Nato so se odločili, da testirajo aktivnost biosenzorja, ki temelji na rekombinazi, proti drugim izbranim nabitim kationom težkih kovin (II) (arzen in svinec), saj so prejšnje raziskave razkrile navzkrižno reaktivno naravo transkripcijskih faktorjev družine MerR, v katero spada tudi CadR. Ugotovili so, da ima senzor signal v ozadju za arzenove in svinčeve ione, ampak niso opazili, da bi ustvarili pomemben signal pri 50 µM koncentracije kadmija, kar je optimalna odzivna točka za sistem. Testiranje z ioni težkih kovin je razkrilo bazalni signal za ta sistem [1].
Ta sistem je mogoče testirati z drugimi bakterijami za izboljšanje odzivne krivulje in doslednosti izhoda ter nižjega ozadja, saj je bilo ugotovljeno, da se meje zaznavanja lahko razlikujejo med bakterijskimi vrstami. Poleg tega, ker so mikroorganizmi razvili podobne mehanizme odpornosti na podobno skupino ionov ali molekul, bi morali razširiti analizo navzkrižne reaktivnosti in vključiti dele s samo specifičnimi reakcijami na njihove analite, ki nastanejo z usmerjeno evolucijo. Nazadnje bi lahko povratno vezje ali genetski ojačevalnik razširilo biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi, da bi izboljšali meje zaznavanja [1].

==ZAKLJUČEK==

Z ugotovitvami poročajo o senzorju kadmija na osnovi rekombinaze, ki uporablja kombinirano zasnovo za pol specifične in specifične, vendar navzkrižno reaktivne transkripcijske enote. Sistem je optimiziran za doseganje največjega signala opaženega pri 50 µM, vendar nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Sistem pa je obetaven za uporabo rekombinaze v biosenzorju na osnovi celice za integracijo več transkripcijskih enot za pridobitev odziva organizma, ki temelji na težkih kovinah. Poglobljena prihodnja študija za izboljšanje značilnosti v smislu selektivnosti in občutljivosti bi lahko zagotovila biosenzor, ki je pripravljen za uporabo odkrivanja različnih težkih kovin [1].

==VIRI==

[1] D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.
[2] Q. Gui, T. Lawson, S. Shan, L. Yan, Y. Liu: The Application of Whole Cell-Based Biosensors for Use in Environmental Analysis and in Medical Diagnostics. Sensors. 2017, 17, 1-17.
[3] K. J.Hyun, J. Haeyoung, J. L. Sang: Synthetic biology for microbial heavy metal biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410, 1191-1203.

Genetsko vezje na osnovi rekombinaze za spremljanje težkih kovin

2022-05-23T18:27:26Z

Tevz Levstek: New page: ==UVOD== Spremljanje toksičnosti težkih kovin v okolju postaja nujna skrb, ker se industrija vse bolj razvija. Težke kovine tvorijo kovalentne vezi z organskimi molekulami, pri čemer ...

==UVOD==

Spremljanje toksičnosti težkih kovin v okolju postaja nujna skrb, ker se industrija vse bolj razvija. Težke kovine tvorijo kovalentne vezi z organskimi molekulami, pri čemer vplivajo na celične organele in ireverzibilno poškodujejo DNA, ter zavirajo celični cikel. To vodi v apoptozo in karcinogenezo. Trenutno so metode določanja toksičnosti težkih kovin sekvenčna sedimentacija, masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS), atomska absorpcijska spektrometrija. Te analitične metode zahtevajo drage instrumente in usposobljeno osebje. Izziv pri pravilni oceni toksičnosti predstavlja odkrivanje frakcij težkih kovin, ki so biološko razpoložljive, saj lahko spremljanje biološke uporabnosti dodatno pomaga pri merjenju kvantitativnih učinkov teh kovin na okolje. Z izzivom odkrivanja biološko uporabnih frakcij se spopadajo biosenzorji na osnovi celice s pomočjo intrinzičnih regulatornih mehanizmov [1].
Hiter razvoj pri načrtovanju genetskega vezja je omogočil, da so biosenzorji na osnovi celic postali pomembni pri odkrivanju širokega spektra analitov in postajajo obetavni na številnih področjih, od medicinske diagnostike do ocene onesnaženosti okolja. Sintezna biologija je napredovala v konceptu biosenzorja, ki temelji na pristopu z moduli bioloških delov, ki so povezani in dobijo odziv logičnih vrat. Glavni mehanizem biosenzorja na osnovi celice je odkrivanje določene vrste analita in ojačanje te identifikacije v električni in optični signal prek procesorja. Sestavljen je iz treh modulov, modula ki zazna vhodni signal, reporterskega modula, ki pretvarja vhodni signal v izhodni signal znotraj celice šasije, ter izhodnega modula. Prednosti uporabe biosenzorjev na osnovi celice je njihovo enostavno gojenje, zaznava širokega spektra snovi in da ne zahtevajo posebnih tehnik za analizo [1,2,3].
Modularnost bioloških delov olajša konstrukcijo pol specifičnih biosenzorjev (izkoriščajo odziv mikroba na stres) in specifičnih biosenzorjev (specifična ciljna molekula aktivira ali zavira transkripcijo določenega izhoda). Poleg tega so rekombinaze eno od orodij sintezne biologije, ki se pogosto uporablja v logičnih vratih. Z obračanjem/izrezovanjem ciljnega zaporedja, ki ga obdajajo mesta prepoznavanja, rekombinaze zagotavljajo mehanizem ON/OFF. Odziv ON/OFF lahko zniža signal ozadja biosenzorja, ki temelji na vezju, ko je aktivacija promotorja odvisna od aktivnosti rekombinaze [1].
V študiji so predlagali biosenzorni sistem za težke kovine na osnovi rekombinaze. Združili so pol specifično biosenzorno napravo, predhodno izdelan mehanizem odziva na toplotni šok s specifičnim biosenzornim modulom. Optimizirali so pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, da bi dosegli povečano spremembo in krajši odzivni čas. Ta sistem je mogoče razširiti za različne težke kovine, da bi naredili vrsto biosenzorjev na osnovi celic, tudi z uporabo na pol specifičnih delov sistema zaznavanja [1].

==KONSTRUKCIJA SENZORJA NA OSNOVI REKOMBINAZE ZA DETEKCIJO KADMIJA==

V biosenzorju na osnovi celice so uporabili pol specifični biosenzorski sistem toplotnega šoka. Konstitutivno izražen transkripcijski represor proteina toplotnega šoka (HspR) negativno uravnava promotor, PdnaK. Promotor vsebuje dvojne motive vezave HspR (IR3). Uvedba stresnega faktorja vpliva na vezavo proteina HspR na regulativne domene promotorja PdnaK. Obstajajo različni faktorji stresa, kot so toplota, oksidativni stres in težke kovine [1].
Za povečanje specifičnosti takšnih biosenzorjev so uporabili biosenzor, ki ga sestavljajo geni za odpornost proti ionom težkih kovin. Za konstruiranje senzorja za zaznavanje kadmija, so vključili predhodno izdelan sistem odgovora na toplotni šok, ki nadzoruje izražanje za kadmij specifičnega transkripcijskega faktorja, CadR, in mestno specifične rekombinaze Bxb1. Brez faktorja stresa je kognitivni promotor CadR, PcadA, inaktiviran, saj je njegovo zaporedje obrnjeno v začetnem vezju. Obkrožajo ga mesta za prepoznavanje Bxb1. V prisotnosti kadmijevih ionov se HspR sprosti iz PdnaK, kar omogoča izražanje Bxb1 in CadR. Medtem ko Bxb1 rekombinira obrnjeni promotor PcadA, CadR tvori heterodimerne komplekse s kadmijevimi ioni in se veže na PcadA, kar sproži izražanje fluorescenčnega reporterja GFP [1].

==REZULTATI==

===Karakterizacija sistema za optimalne delovne pogoje===
Na začetku so optimizirali vezje s pogoji za aktivnost rekombinaze iz literature. Eden od ciljev študije je opredeliti vgradnjo rekombinaze in pridobiti optimalne pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, tako da ima sistem strog nadzor nad puščanjem in skrajšan odzivni čas glede na zahtevo po dolgem času zaradi pravilne ekspresije in aktivnosti rekombinaze BxB1. Dodatno so želeli izboljšati odmerek-odziv biosenzorja, zato so želeli doseči nizko bazalno ekspresijo v stanju OFF. Občutljivost odzivnosti je v skladu z naraščajočimi koncentracijami kadmijevih ionov [1].
Optimizacijo sistema so začeli z gojišči. Najprej so uporabili gojišče LB, vendar je njegova nedefinirana narava povzročila nizek izhodni signal, za kar se je tudi predhodno izkazalo, da zmanjša občutljivost na kovine v takih biosenzorjih. Nato so prešli na minimalno gojišče težkih kovin MOPS, vendar je to tudi zagotovilo slab potencial rasti za biosenzorje na osnovi celic na osnovi rekombinaze, inducirane z visoko toksičnimi kadmijevimi ioni. Boljše rezultate so opazili z uporabo MOPS minimalnega medija. Intenzivnost fluorescence se je povečala glede na naraščajoče koncentracije kadmija [1].
Ob uporabi minimalnega medija MOPS za biosenzor na osnovi celice so nato testirali optimalno začetno število celic pred indukcijo, s spremembo faktorja redčenja za čez nočne celične kulture. Domnevali so, da lahko sprememba začetnega števila celic izpostavljenih kadmijevim ionom, vpliva na občutljivost mehanizma celičnega stresa. Primerjali so učinke začetnih števil celic na odziv senzorja z uporabo razredčitev čez nočnih kultur 1:250, 1:100 in 1:50. Izhodni signal je bil je bil od koncentracije začetnega števila celic značilno različen. Celice razredčene na 1:50 in inducirane v logaritemski fazi (OD600 ~ 0,5), so izboljšale obnašanje glede na odmerek in zmanjšale odzivni čas za kasnejše korake optimizacije na 14 ur [1].
Sprva so reakcijo izvedli pri 30 °C, saj je optimalna za ''in vitro'' reakcije integraze z uporabo linearnih DNA substratov. Domnevali so, da lahko biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi zahteva drugačno temperaturo. Senzor so inkubirali pri 23 °C, 30 °C in 37 °C, da bi primerjali njihove učinke. Več t-testov, ki primerjajo koncentracije 0–50 µM kadmijevih ionov za tri različne temperature, je pokazalo, da ima biosenzor, gojen pri 37 °C, večji statistični pomen v prisotnosti induktorja. Poleg tega so optimizirali pH gojišča. Začetno temperaturo so ohranili pri 30 °C, da bi optimizirali delovanje biosenzorja. Najbolje je deloval pri pH 7,5, ki ustreza pH MOPS minimalnemu mediju. Rezultati so pokazali, da bi lahko izdelani biosenzor za kadmij najbolje deloval v minimalnem mediju MOPS (pH 7,5) pri 37 °C [1].

===Optimalni dinamični razpon in analiza navzkrižne reaktivnosti===
Po optimizaciji so postavili eksperiment, da preizkusijo biosenzor v optimalnih delovnih pogojih, opisanih prej. Rezultati so pokazali, da se je biosenzor na povečanje koncentracije kadmija v optimalnih delovnih pogojih odzval v 10 urah. Sistem se ni odzval na koncentracije kadmija, nižje od 50 µM. Nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Najvišja koncentracija kadmija, ki je povečala izhodni signal, je bila tudi pri 50 µM [1].
Nato so se odločili, da testirajo aktivnost biosenzorja, ki temelji na rekombinazi, proti drugim izbranim nabitim kationom težkih kovin (II) (arzen in svinec), saj so prejšnje raziskave razkrile navzkrižno reaktivno naravo transkripcijskih faktorjev družine MerR, v katero spada tudi CadR. Ugotovili so, da ima senzor signal v ozadju za arzenove in svinčeve ione, ampak niso opazili, da bi ustvarili pomemben signal pri 50 µM koncentracije kadmija, kar je optimalna odzivna točka za sistem. Testiranje z ioni težkih kovin je razkrilo bazalni signal za ta sistem [1].
Ta sistem je mogoče testirati z drugimi bakterijami za izboljšanje odzivne krivulje in doslednosti izhoda ter nižjega ozadja, saj je bilo ugotovljeno, da se meje zaznavanja lahko razlikujejo med bakterijskimi vrstami. Poleg tega, ker so mikroorganizmi razvili podobne mehanizme odpornosti na podobno skupino ionov ali molekul, bi morali razširiti analizo navzkrižne reaktivnosti in vključiti dele s samo specifičnimi reakcijami na njihove analite, ki nastanejo z usmerjeno evolucijo. Nazadnje bi lahko povratno vezje ali genetski ojačevalnik razširilo biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi, da bi izboljšali meje zaznavanja [1].

==ZAKLJUČEK==

Z ugotovitvami poročajo o senzorju kadmija na osnovi rekombinaze, ki uporablja kombinirano zasnovo za pol specifične in specifične, vendar navzkrižno reaktivne transkripcijske enote. Sistem je optimiziran za doseganje največjega signala opaženega pri 50 µM, vendar nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Sistem pa je obetaven za uporabo rekombinaze v biosenzorju na osnovi celice za integracijo več transkripcijskih enot za pridobitev odziva organizma, ki temelji na težkih kovinah. Poglobljena prihodnja študija za izboljšanje značilnosti v smislu selektivnosti in občutljivosti bi lahko zagotovila biosenzor, ki je pripravljen za uporabo odkrivanja različnih težkih kovin [1].

==VIRI==

[1] D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.
[2] Q. Gui, T. Lawson, S. Shan, L. Yan, Y. Liu: The Application of Whole Cell-Based Biosensors for Use in Environmental Analysis and in Medical Diagnostics. Sensors. 2017, 17, 1-17.
[3] K. J.Hyun, J. Haeyoung, J. L. Sang: Synthetic biology for microbial heavy metal biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410, 1191-1203.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-23T18:21:35Z

Tevz Levstek:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inženiring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CelloSelect_%E2%80%93_sinteti%C4%8Dna_celobiozna_presnovna_pot_za_izbor_stabilnih_transgenih_celi%C4%8Dnih_linij_CHO CelloSelect – sintetična celobiozna presnovna pot za izbor stabilnih transgenih celičnih linij CHO] (Nika Vegelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hipersensitiven_genetsko_kodiran_fluorescen%C4%8Dni_indikator_%28roGFP2-Prx1%29_za_kontinuirno_merjenje_znotrajceli%C4%8Dnega_H2O2_med_mikro-kultivacijo_celic#Literatura Hipersensitiven genetsko kodiran fluorescenčni indikator (roGFP2-Prx1) za kontinuirno merjenje znotrajceličnega H2O2 med mikro-kultivacijo celic] (Eva Kanalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zasnova_in_karakterizacija_s_salicilno_kislino_induciranega_genskega_ekspresijskega_sistema_za_celice_Jurkat Zasnova in karakterizacija s salicilno kislino induciranega genskega ekspresijskega sistema za celice Jurkat] (Tina Arnšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_sinteti%C4%8Dni_kromosomi_kot_novo_orodje_za_in%C5%BEenirstvo_metabolizma Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma] (Špela Kladnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dni_mikrobni_konzorcij_za_biosintezo_2-keto-L-glukonske_kisline_%282-KLG%29 Sintetični mikrobni konzorcij za biosintezo 2-keto-L-glukonske kisline (2-KLG)] (Anastasija Nechevska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Računalništvo_znotraj_bakterij:_Programiranje_bakterijskega_obnašanja_s_pomočjo_plazmida,_ki_kodira_perceptronsko_nevronsko_mrežo Računalništvo znotraj bakterij: Programiranje bakterijskega obnašanja s pomočjo plazmida, ki kodira perceptronsko nevronsko mrežo] (Tevž Levstek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_vezje_na_osnovi_rekombinaze_za_spremljanje_težkih_kovin Genetsko vezje na osnovi rekombinaze za spremljanje težkih kovin] (Mija Šulin)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-Mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah ELIXIO Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Agrobactory_593_-_Modularna_bakterijska_platforma_za_pripravo_biopesticidov Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidev] (Tim Nograšek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CyaSalt_-_metoda_za_razsoljevanje_morskih_voda] (Michelle Oletič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke] (Nika Malečkar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Remi,_du_et!_-_bioremediacija_razlitij_nafte Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte] (Jošt Hren)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Minicelice_kot_proizvodna_platforma Minicelice kot proizvodna platforma] (Mladen Davidovikj)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Računalništvo znotraj bakterij: Programiranje bakterijskega obnašanja s pomočjo plazmida, ki kodira perceptronsko nevronsko mrežo

2022-05-22T22:34:25Z

Tevz Levstek:

Izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608 A. G. Becerra, M. Gutiérrez, in R. Lahoz-Beltra, „Computing within bacteria: Programming of bacterial behavior by means of a plasmid encoding a perceptron neural network“, Biosystems, let. 213, str. 104608, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608]
==Uvod==
V znanosti je dalj časa veljala dogma, da imajo lastnosti kompleksnega obnašanja, inteligence in učenja lahko samo večcelični organizmi, ki vsebujejo kompleksno nevronsko mrežo. Kljub temu, da za najzahtevnejše oblike omenjenih delovanj to še zmeraj drži, pa novejše raziskave razširjajo zmožnost teh operacij tudi na druge vrste organizmov. Primer tega so na primer nekatere rastline, ki lahko shranjujejo in kasneje priklicujejo informacije povezane z dotikom, poškodbo, temperaturo, sušo in elektromagnetnim sevanjem, kar jim omogoči drugačen in primernejši odziv, če se podobne okoliščine ponovijo [1], [2]. Preboj o dojemanju obnašanja in učenja pa se je zgodil tudi v enoceličnih organizmih, kot so bakterije, nekatere glive, protisti itd. Pri teh organizmih je obnašanje v največji meri zapisano v genetskem materialu, v molekuli DNA. Enocelične organizme lahko opišemo kot senzorno-motorične agente. S tem označujemo osnovno enoto predvsem v okviru nevronskih mrež, ki ima sposobnost zaznavanja okolja, integracije signalov in ustreznega odziva. Odziv senzorno-motoričnega agenta ni pogojen izključno z dražljajem, ampak se neprestano posodablja, izboljšuje in uči. Torej ob različnih preteklih izkušnjah in različnih časovnih obdobjih lahko odreagira drugače. Bakterije pa so celo inteligentni senzorno-motorični agenti. Močne vzporednice lahko namreč vidimo med obnašanjem prokariontov in med nevronskim omrežjem [3], [4]. Primer tega je recimo poskus s ''Physarum polycephalum'', ki je zmožna učenja in reševanja labirintov podobnih tistim, s katerimi navadno preizkušajo nevronske sposobnosti sesalcev, kot so miši [5]. Inteligentnost prokariontov lahko obrazložimo s kompleksnostjo integracije signala med zaznavo in odzivom, pa tudi učenjem, predvsem pa z dejstvom, da ločijo sebe od zunanjega okolja [3]. Drug pogled na inteligenco bakterije pa je ta, da kolonija kot skupnost predstavlja kvazi-večcelični organizem, ki se kot celota odziva na zunanje dražljaje – podobno kot celice v telesu gradijo živ organizem [3], [6]. Pri tem seveda lahko pomislimo, ali tudi ljudje na podoben način gradimo družbo, oziroma ali je npr. država/civilizacija inteligentno, samozavedno bitje. Sociološki koncept, ki to opisuje, se imenuje socialni organizem. Razvila sta ga Herbert Spencer in Émile Durkheim. Podobna filozofska teorija se imenuje organicizem. Bakterije bi potemtakem lahko imele inteligenco gruče, ki se vzpostavi, ko gradi družbo izjemno veliko osnovnih enot, ki so sposobne medsebojen komunikacije in imajo vsaj minimalno inteligenco [6]. Podobno je bilo ugotovljeno tudi pri rastlinskih celicah v koreninskih kapicah. Njihova vloga je, da se ob hitri delitvi širijo po zemlji proti območjem, kjer je najvišji delež mineralov, hkrati pa ni ovir. Naloga je seveda izredno zahtevna, poleg tega pa tudi ena sama koreninska kapica težko razvozla »podtalni zemljevid«. Znanstveniki so ugotovili, da med koreninskimi kapicami poteka komunikacija in da problem rešujejo skupaj. Presenetljivo so ugotovili, da če korenine enega organizma ločijo in posadijo v ločena lončka, komunikacija še vedno poteka – zaznavanje ene korenine vpliva na rast druge korenine, ki je v popolnoma drugem lončku. Najverjetneje signalizacija poteka prek elektromagnetnih polj [7]. Konec koncev pa je podobno tudi pri ljudeh, kar enostavno in neznanstveno opiše rek »več glav več ve.«
Liberman je z izrekom »Celica je računalnik« želel opisati, kako kompleksni procesi potekajo v celicah, ki jih po delovanju lahko primerjamo s tistimi v računalniku [8]. DNA ali RNA predstavljata programsko kodo, proteini, ki nastanejo pa so po tej analogiji izvajalci operacij na sebi, okolju in programski kodi (DNA in RNA). Toda v resnici ne gre le za analogijo, ampak dejansko stanje. Poleg tega pa so celice celo inteligentni računalniki, zaradi učenja s Pavlovim kondicioniranjem, zaznavanjem okolja in sebe, njihove odločitve pa so kompleksne in pomembno – individualne. Primer je recimo poskus z amebami, kjer so jih postavili v električno polje. Vsi organizmi so plavali proti katodi (osnovno obnašanje). Nato so na strani anode pripravili gradient kemotaksina (privablja amebe) in 53 % jih je plavalo proti anodi, 45 % ponovno proti katodi, ostale pa so ostale na mestu. Te, ki so plavali proti kemotaksinu, torej anodi, so postavili v novo gojišče brez gradienta kemotaksina. Ob vključitvi električnega polja jih je 82 % plavalo proti anodi, kar ni osnovno obnašanje, hkrati pa tudi ni mogoče razložiti drugače kot z učenjem [9].
==Vnos nevronske mreže v bakterijo==
Z razvojem sintezne biologije so se možnosti programiranja celic bistveno povečale. Pripravljeno nevronsko mrežo lahko pretvorimo v zaporedje DNA in vnesemo v bakterije. A pomembna razlika od programiranja računalnika je pri bakterijah difuzija signala – z drugimi besedami, v bakterijah ni možno neskončno operacij, pri katerih predstavlja prejšnja rešitev (''ang.'' output) vnos (''ang.'' input) za naslednjo operacijo. Temu se lahko izognemu z uporabo preprostih operacij, ali pa uporabimo komunikacijo med bakterijami. Lahko bi uporabili konzorcij bakterij, ki rešuje isti problem, nato pa večinsko rešitev med seboj sporoči, tako da vse bakterije v naslednjem koraku začnejo z istim začetnim vnosom. Druga možnost pa je ta, da v konzorcij uvedemo več različnih tipov bakterij, ki potem rešujejo le nekaj operacij vsaka preden signal difundira, nato pa podajo rezultate naprej naslednjemu tipu bakterij. S pomočjo sintezne biologije, programiranja in informatike so do sedaj že oblikovali konzorcij sprejemnih (''ang.'' reciever) in oddajnih (''ang.'' sender) bakterij, ki so zmožne prepoznave 3×3 bitnega vzorca. Za razumevanje področja pa je pomembno tudi poznavanje delovanja nevronskih mrež in strojnega učenja. Nevronske mreže lahko najpreprosteje razložimo kot sistem, ki signale sprejme, nato integrira s pomočjo uteževanja pomembnosti posameznih nevronskih povezav in nato poda odgovor. Ene najpreprostejših nevronskih mrež so perceptroni. Pri teh informacija teče izkjučno v smeri od signala proti odgovoru, poleg tega pa vsebujejo le en sloj integrativnih nevronov. Za kompleksnejše naloge niso uporabni. S strojnim učenjem omogočimo sistemu nevronskih mrež, da čim bolj pravilno uteži določene nevronske poti. Načeloma se to dela s poskušanjem in odbiranjem boljših nevronskih mrež, saj bi človeško nastavljanje utežitev »na roko« bilo prekompleksno. V celici kot že rečeno potekajo podobne povezave kot pri nevronski mreži. Primer tega so medproteinske interakcije pri signalnih poteh. Celica ogromno količino signalov pretvori v nekaj odzivov, kar poteče preko fosforilacije in defosforilacije velikega števila proteinov, ki med seboj interagirajo. Prav zato nekateri tem signalnim potem pravijo fosfonevronsko omrežje, saj spominja na kompleksno nevronsko omrežje v človeških možganih. Druga možnost izgraditve nevronskega omrežja pa je na nivoju DNA, kjer en del genoma regulira delovanje drugega dela in obratno. Regulacijo na osnovi DNA so uporabili v raziskavi, ki jo bom predstavil.
==Rezultati raziskave==
Vse poskuse v raziskavi so izvajali ''in silico'' s pomočjo različnih računalniških programov in simulatorja. Izvrstno poznavanje delovanja nevronskih mrež v celicah ''in silico'' je predpogoj za nadaljevanje dela v laboratoriju s pravimi bakterijami. Prvi poskus je predvideval optimizacije sintezne poti polihidroksibutirata (PHB) (bioplastika). Trije vnosi v nevronsko mrežo so predvidevali koncentracije melase, sečnine in propionske kisline, rezultat pa je bil koncentracija nastalega PHB. Z drugimi besedami, s pomočjo poznavanja bakterijskega metabolizma, simulacije in nevronske mreže so ugotovili optimalne pogoje za nastajanje PHB iz treh vhodnih snovi.
Drug poskus pa je bil kompleksnejši, saj so s pomočjo nevronske mreže želeli programirati odziv bakterije glede na vhodne podatke. Štirje vhodni podatki so bili: prisotnost galaktoze (kemotaksin), kisika, avtoinduktorja furanozil borat diestra (sodeluje pri komunikaciji bakterij) in arabinoze (vir ogljika). Prisotnost signala je bila ali 0 (ni prisoten) ali 1 (je prisoten) glede na to, ali preseže določeno vrednost. Štirje možni odgovori po integraciji signalov pa so bili aerobni odgovor, premikanje, priskledništvo (nadaljnja razgradnja metabolnih produktov drugih celic) ali stresni odziv. Treniranje nevronskega omrežja lahko poteka na dva načina. En je zunaj celic, torej preden ga implementiramo in se po namestitvi ne spreminja. Prednost je ta, da se ne spreminja, torej, če smo uporabili najboljše utežitve med treningom, bodo te take tudi ostale. Iz tega tudi izhaja slabost, ki je, da se nevronsko omrežje z novimi podatki ne bo posodabljalo in lahko zastara. Po drugi možnosti pa lahko nevronsko omrežje treniramo v bakterijah samih. To pomeni, da se bo s časom in uporabo izboljševalo, utežitve bodo vedno boljše. Slabost pa je ta, da ni nikakor nujno, da bo konvergiralo k optimalnim utežitvam, torej ni nujno, da dobimo uporabno nevronsko omrežje. Pri poskusu so zato uporabili prvo možnost, torej s treningom so utežili nevronske poti, pretvorili nevronsko mrežo v logične operacije, to spremenili v zaporedje DNA in vnesli v ''in silico'' plazmid, ki so ga vnesli v ''in silico'' celice ter opazovali dogajanje. Vsak odziv celice je bil povezan z nastajanjem drugega fluorescentnega proteina, kar je omogočalo ugotavljanje signalov. Prav tako je celica proizvedla več reporterjev, če je bila v več stanjih odgovorov naenkrat. Rezultati so bili pričakovani, torej pokazali so, da vsaj ''in silico'' tovrstno nevronsko omrežje v obliki plazmida deluje dobro.
==Zaključek==
V prihodnosti bo gotovo še več raziskav v tej smeri, še posebej zanimive bi bile tiste, ki bi uporabljale prave celice. Pa vendar so tudi računalniške simulacije pomemben prvi korak pri uvajanju kompleksnih nevronskih mrež v bakterije in preko njih vplivanja na obnašanje. Uporaba takih bakterij bi bila koristna pri praktično vseh biotehnoloških aplikacijah, pa tudi v medicini, sintezi biogoriv in morda zdravljenju v telesu. Kdo ve, morda pa bodo nekoč kompleksne populacije bakterij lahko reševale tudi probleme, ki jih trenutno rešujejo računalniki? Upajmo, da se ob uvedbi večslojnih nevronskih mrež in vse bolj raznolikega obnašanja bakterije ne bodo naveličale petrijevk in neprestanega centrifugiranja.
==Viri==
[1] M. Gagliano, M. Renton, M. Depczynski, in S. Mancuso, „Experience teaches plants to learn faster and forget slower in environments where it matters“, Oecologia, let. 175, št. 1, str. 63–72, 2014, doi: 10.1007/s00442-013-2873-7.

[2] M. Thellier in U. Lüttge, „Plant memory: a tentative model“, Plant Biol., let. 15, št. 1, str. 1–12, jan. 2013, doi: https://doi.org/10.1111/j.1438-8677.2012.00674.x.

[3] A. G. Becerra, M. Gutiérrez, in R. Lahoz-Beltra, „Computing within bacteria: Programming of bacterial behavior by means of a plasmid encoding a perceptron neural network“, Biosystems, let. 213, str. 104608, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608.

[4] R. Lahoz-Beltra, J. Navarro, in P. Marijuan, „Bacterial computing: a form of natural computing and its applications “, Frontiers in Microbiology , let. 5. 2014.

[5] T. Nakagaki, H. Yamada, in A. Tóth, „Maze-solving by an amoeboid organism.“, Nature, let. 407, št. 6803, str. 470, sep. 2000, doi: 10.1038/35035159.

[6] S. Majumdar in S. Pal, „Bacterial intelligence: imitation games, time-sharing, and long-range quantum coherence“, J. Cell Commun. Signal., let. 11, št. 3, str. 281–284, sep. 2017, doi: 10.1007/s12079-017-0394-6.

[7] F. Baluška, S. Lev-Yadun, in S. Mancuso, „Swarm intelligence in plant roots“, Trends Ecol. Evol., let. 25, št. 12, str. 682–683, 2010, doi: https://doi.org/10.1016/j.tree.2010.09.003.

[8] E. A. Liberman in S. V Minina, „Cell molecular computers and biological information as the foundation of nature’s laws“, Biosystems, let. 38, št. 2, str. 173–177, 1996, doi: https://doi.org/10.1016/0303-2647(95)01588-4.

[9] I. M. De la Fuente idr., „Evidence of conditioned behavior in amoebae“, Nat. Commun., let. 10, št. 1, str. 3690, 2019, doi: 10.1038/s41467-019-11677-w.

Računalništvo znotraj bakterij: Programiranje bakterijskega obnašanja s pomočjo plazmida, ki kodira perceptronsko nevronsko mrežo

2022-05-22T22:02:32Z

Tevz Levstek:

Izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608 A. G. Becerra, M. Gutiérrez, in R. Lahoz-Beltra, „Computing within bacteria: Programming of bacterial behavior by means of a plasmid encoding a perceptron neural network“, Biosystems, let. 213, str. 104608, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608]
==Uvod==
V znanosti je dalj časa veljala dogma, da imajo lastnosti kompleksnega obnašanja, inteligence in učenja lahko samo večcelični organizmi, ki vsebujejo kompleksno nevronsko mrežo. Kljub temu, da za najzahtevnejše oblike omenjenih delovanj to še zmeraj drži, pa novejše raziskave razširjajo zmožnost teh operacij tudi na druge vrste organizmov. Primer tega so na primer nekatere rastline, ki lahko shranjujejo in kasneje priklicujejo informacije povezane z dotikom, poškodbo, temperaturo, sušo in elektromagnetnim sevanjem, kar jim omogoči drugačen in primernejši odziv, če se podobne okoliščine ponovijo [1], [2]. Preboj o dojemanju obnašanja in učenja pa se je zgodil tudi v enoceličnih organizmih, kot so bakterije, nekatere glive, protisti itd. Pri teh organizmih je obnašanje v največji meri zapisano v genetskem materialu, v molekuli DNA. Enocelične organizme lahko opišemo kot senzorno-motorične agente. S tem označujemo osnovno enoto predvsem v okviru nevronskih mrež, ki ima sposobnost zaznavanja okolja, integracije signalov in ustreznega odziva. Odziv senzorno-motoričnega agenta ni pogojen izključno z dražljajem, ampak se neprestano posodablja, izboljšuje in uči. Torej ob različnih preteklih izkušnjah, različnih časovnih obdobjih lahko odreagira drugače. Bakterije pa so celo inteligentni senzorno-motorični agenti. Močne vzporednice lahko namreč vidimo med obnašanjem prokariontov in med nevronskim omrežjem [3], [4]. Primer tega je recimo poskus s ''Physarum polycephalum'', ki je zmožna učenja in reševanja labirintov podobnih tistim, s katerimi navadno preizkušajo nevronske sposobnosti sesalcev, kot so miši [5]. Inteligentnost prokariontov lahko obrazložimo s kompleksnostjo integracije signala med zaznavo in odzivom, pa tudi učenjem, predvsem pa z dejstvom, da ločijo sebe od zunanjega okolja [3]. Drug pogled na inteligenco bakterije pa je ta, da kolonija kot skupnost predstavlja kvazi-večcelični organizem, ki se kot celota odziva na zunanje dražljaje – podobno kot celice v telesu gradijo živ organizem [3], [6]. Pri tem seveda lahko pomislimo, ali tudi ljudje na podoben način gradimo družbo, oziroma ali je npr. država/civilizacija inteligentno, samozavedno bitje. Sociološki koncept, ki to opisuje, se imenuje socialni organizem. Razvila sta ga Herbert Spencer in Émile Durkheim. Podobna filozofska teorija se imenuje organicizem. Bakterije bi potemtakem lahko imele inteligenco gruče, ki se vzpostavi, ko gradi družbo izjemno veliko osnovnih enot, ki so sposobne medsebojen komunikacije in imajo vsaj minimalno inteligenco [6]. Podobno je bilo ugotovljeno tudi pri rastlinskih celicah v koreninskih kapicah. Njihova vloga je, da se ob hitri delitvi širijo po zemlji proti območjem, kjer je najvišji delež mineralov, hkrati pa ni ovir. Naloga je seveda izredno zahtevna, poleg tega pa tudi ena sama koreninska kapica težko razvozla »podtalni zemljevid«. Znanstveniki so ugotovili, da med koreninskimi kapicami poteka komunikacija in da problem rešujejo skupaj. Presenetljivo so ugotovili, da če korenine enega organizma ločijo in posadijo v ločena lončka, komunikacija še vedno poteka – zaznavanje ene korenine vpliva na rast druge korenine, ki je v popolnoma drugem lončku. Najverjetneje signalizacija poteka prek elektromagnetnih polj [7]. Konec koncev pa je podobno tudi pri ljudeh, kar enostavno in neznanstveno opiše rek »več glav več ve.«
Liberman je z izrekom »Celica je računalnik« želel opisati, kako kompleksni procesi potekajo v celicah, ki jih po delovanju lahko primerjamo s tistimi v računalniku [8]. DNA ali RNA predstavljata programsko kodo, proteini, ki nastanejo pa so po tej analogiji izvajalci operacij na sebi, okolju in programski kodi (DNA in RNA). Toda v resnici ne gre le za analogijo, ampak dejansko stanje. Poleg tega pa so celice celo inteligentni računalniki, zaradi učenja s Pavlovim kondicioniranjem, zaznavanjem okolja in sebe, njihove odločitve pa so kompleksne in pomembno – individualne. Primer je recimo poskus z amebami, kjer so jih postavili v električno polje. Vsi organizmi so plavali proti katodi (osnovno obnašanje). Nato so na strani anode pripravili gradient kemotaksina (privablja amebe) in 53 % jih je plavalo proti anodi, 45 % ponovno proti katodi, ostale pa so ostale na mestu. Te, ki so plavali proti kemotaksinu, torej anodi, so postavili v novo gojišče brez gradienta kemotaksina. Ob vključitvi električnega polja jih je 82 % plavalo proti anodi, kar ni osnovno obnašanje, hkrati pa tudi ni mogoče razložiti drugače kot z učenjem [9].
==Vnos nevronske mreže v bakterijo==
Z razvojem sintezne biologije so se možnosti programiranja celic bistveno povečale. Pripravljeno nevronsko mrežo lahko pretvorimo v zaporedje DNA in vnesemo v bakterije. A pomembna razlika od programiranja računalnika je pri bakterijah difuzija signala – z drugimi besedami, v bakterijah ni možno neskončno operacij, pri katerih predstavlja prejšnja rešitev (''ang.'' output) vnos (''ang.'' input) za naslednjo operacijo. Temu se lahko izognemu z uporabo preprostih operacij, ali pa uporabimo komunikacijo med bakterijami. Lahko bi uporabili konzorcij bakterij, ki rešuje isti problem, nato pa večinsko rešitev med seboj sporoči, tako da vse bakterije v naslednjem koraku začnejo z istim začetnim vnosom. Druga možnost pa je ta, da v konzorcij uvedemo več različnih tipov bakterij, ki potem rešujejo le nekaj operacij vsaka preden signal difundira, nato pa podajo rezultate naprej naslednjemu tipu bakterij. S pomočjo sintezne biologije, programiranja in informatike so do sedaj že oblikovali konzorcij sprejemnih (''ang.'' reciever) in oddajnih (''ang.'' sender) bakterij, ki so zmožne prepoznave 3×3 bitnega vzorca. Za razumevanje področja pa je pomembno tudi poznavanje delovanja nevronskih mrež in strojnega učenja. Nevronske mreže lahko najpreprosteje razložimo kot sistem, ki signale sprejme, nato integrira s pomočjo uteževanja in nato poda odgovor. Ene najpreprostejših nevronskih mrež so perceptroni. Pri teh informacija teče izkjučno v smeri od signala proti odgovoru, poleg tega pa vsebujejo le en sloj integrativnih nevronov. Za kompleksnejše naloge niso uporabni. S strojnim učenjem omogočimo sistemu nevronskih mrež, da čim bolj pravilno uteži določene nevronske poti. Načeloma se to dela s poskušanjem in odbiranjem boljših nevronskih mrež, saj bi človeško nastavljanje utežitev »na roko« bilo prekompleksno. V celici kot že rečeno potekajo podobne povezave kot pri nevronski mreži. Primer tega so medproteinske interakcije pri signalnih poteh. Celica ogromno količino signalov pretvori v nekaj odzivov, kar poteče preko fosforilacije in defosforilacije velikega števila proteinov, ki med seboj interagirajo. Prav zato nekateri tem signalnim potem pravijo fosfonevronsko omrežje, saj spominja na kompleksno nevronsko omrežje v človeških možganih. Druga možnost izgraditve nevronskega omrežja pa je na nivoju DNA, kjer en del genoma regulira delovanje drugega dela in obratno. Regulacijo na osnovi DNA so uporabili v raziskavi, ki jo bom predstavil.
==Rezultati raziskave==
Vse poskuse v raziskavi so izvajali ''in silico'', s pomočjo različnih računalniških programov in simulatorja. Izvrstno poznavanje delovanja nevronskih mrež v celicah ''in silico'' je predpogoj za nadaljevanje dela v laboratoriju s pravimi bakterijami. Prvi poskus je predvideval optimizacije sintezne poti polihidroksibutirata (PHB) (bioplastika). Trije vnosi v nevronsko mrežo so predvidevali koncentracije melase, sečnine in propionske kisline, rezultat pa je bil koncentracija nastalega PHB. Z drugimi besedami, s pomočjo poznavanja bakterijskega metabolizma, simulacije in nevronske mreže so ugotovili optimalne pogoje za nastajanje PHB glede treh vhodnih snovi.
Drug poskus pa je bil kompleksnejši, saj so s pomočjo nevronske mreže želeli programirati odziv bakterije glede na vhodne podatke. Štirje vhodni podatki so bili: prisotnost galaktoze (kemotaktik), kisika, avtoinduktorja furanozil borat diestra (sodeluje pri komunikaciji bakterij) in arabinoze (vir ogljika). Prisotnost signala je bila ali 0 (ni prisoten) ali 1 (je prisoten) glede na to, ali preseže določeno vrednost. Štirje možni odgovori po integraciji signalov pa so bili aerobni odgovor, premikanje, priskledništvo (nadaljnja razgradnja metabolnih produktov drugih celic) ali stresni odziv. Treniranje nevronskega omrežja lahko poteka na dva načina. En je zunaj celic, torej preden ga implementiramo in se po namestitvi ne spreminja. Prednost je ta, da se ne spreminja, torej, če smo uporabili najboljše utežitve med treningom, bodo te take tudi ostale. Iz tega tudi izhaja slabost, ki je, da se nevronsko omrežje z novimi podatki ne bo posodabljalo in lahko zastara. Po drugi možnosti pa lahko nevronsko omrežje treniramo v bakterijah samih. To pomeni, da se bo s časom in uporabo izboljševalo, utežitve bodo vedno boljše. Slabost pa je ta, da ni nikakor nujno, da bo konvergiralo k optimalnim utežitvam, torej ni nujno, da dobimo uporabno nevronsko omrežje. Pri poskusu so zato uporabili prvo možnost, torej s treningom so utežili nevronske poti, pretvorili nevronsko mrežo v logične operacije, to spremenili v zaporedje DNA in vnesli v ''in silico'' plazmid, ki so ga vnesli v ''in silico'' celice ter opazovali dogajanje. Vsak odziv celice je bil povezan z nastajanjem drugega fluorescentnega proteina, kar je omogočalo ugotavljanje signalov. Prav tako je celica proizvedla več reporterjev, če je bila v več stanjih odgovorov naenkrat. Rezultati so bili pričakovani, torej pokazali so, da vsaj ''in silico'' tovrstno nevronsko omrežje v obliki plazmida deluje dobro.
==Zaključek==
V prihodnosti bo gotovo še več raziskav v tej smeri, še posebej zanimive bi bile tiste, ki bi uporabljale prave celice. Pa vendar so tudi računalniške simulacije pomemben prvi korak pri uvajanju kompleksnih nevronskih mrež v bakterije in preko njih vplivanja na obnašanje. Uporaba takih bakterij bi bila koristna pri praktično vseh biotehnoloških aplikacijah, pa tudi v medicini, sintezi biogoriv in morda zdravljenju v telesu. Kdo ve, morda pa bodo nekoč kompleksne populacije bakterij lahko reševale tudi probleme, ki jih trenutno rešujejo računalniki? Upajmo, da se ob uvedbi večslojnih nevronskih mrež in vse bolj raznolikega obnašanja bakterije ne bodo naveličale petrijevk in neprestanega centrifugiranja.
==Viri==
[1] M. Gagliano, M. Renton, M. Depczynski, in S. Mancuso, „Experience teaches plants to learn faster and forget slower in environments where it matters“, Oecologia, let. 175, št. 1, str. 63–72, 2014, doi: 10.1007/s00442-013-2873-7.

[2] M. Thellier in U. Lüttge, „Plant memory: a tentative model“, Plant Biol., let. 15, št. 1, str. 1–12, jan. 2013, doi: https://doi.org/10.1111/j.1438-8677.2012.00674.x.

[3] A. G. Becerra, M. Gutiérrez, in R. Lahoz-Beltra, „Computing within bacteria: Programming of bacterial behavior by means of a plasmid encoding a perceptron neural network“, Biosystems, let. 213, str. 104608, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608.

[4] R. Lahoz-Beltra, J. Navarro, in P. Marijuan, „Bacterial computing: a form of natural computing and its applications “, Frontiers in Microbiology , let. 5. 2014.

[5] T. Nakagaki, H. Yamada, in A. Tóth, „Maze-solving by an amoeboid organism.“, Nature, let. 407, št. 6803, str. 470, sep. 2000, doi: 10.1038/35035159.

[6] S. Majumdar in S. Pal, „Bacterial intelligence: imitation games, time-sharing, and long-range quantum coherence“, J. Cell Commun. Signal., let. 11, št. 3, str. 281–284, sep. 2017, doi: 10.1007/s12079-017-0394-6.

[7] F. Baluška, S. Lev-Yadun, in S. Mancuso, „Swarm intelligence in plant roots“, Trends Ecol. Evol., let. 25, št. 12, str. 682–683, 2010, doi: https://doi.org/10.1016/j.tree.2010.09.003.

[8] E. A. Liberman in S. V Minina, „Cell molecular computers and biological information as the foundation of nature’s laws“, Biosystems, let. 38, št. 2, str. 173–177, 1996, doi: https://doi.org/10.1016/0303-2647(95)01588-4.

[9] I. M. De la Fuente idr., „Evidence of conditioned behavior in amoebae“, Nat. Commun., let. 10, št. 1, str. 3690, 2019, doi: 10.1038/s41467-019-11677-w.

Računalništvo znotraj bakterij: Programiranje bakterijskega obnašanja s pomočjo plazmida, ki kodira perceptronsko nevronsko mrežo

2022-05-22T21:55:41Z

Tevz Levstek:

Izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608 A. G. Becerra, M. Gutiérrez, in R. Lahoz-Beltra, „Computing within bacteria: Programming of bacterial behavior by means of a plasmid encoding a perceptron neural network“, Biosystems, let. 213, str. 104608, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608]
==Uvod==
V znanosti je dalj časa veljala dogma, da imajo lastnosti kompleksnega obnašanja, inteligence in učenja lahko samo večcelični organizmi, ki vsebujejo kompleksno nevronsko mrežo. Kljub temu, da za najzahtevnejše oblike omenjenih delovanj to še zmeraj drži, pa novejše raziskave razširjajo zmožnost teh operacij tudi na druge vrste organizmov. Primer tega so na primer nekatere rastline, ki lahko shranjujejo in kasneje priklicujejo informacije povezane z dotikom, poškodbo, temperaturo, sušo in elektromagnetnim sevanjem, kar jim omogoči drugačen in primernejši odziv, če se podobne okoliščine ponovijo [1], [2]. Preboj o dojemanju obnašanja in učenja pa se je zgodil tudi v enoceličnih organizmih, kot so bakterije, nekatere glive, protisti itd. Pri teh organizmih je obnašanje v največji meri zapisano v genetskem materialu, v molekuli DNA. Enocelične organizme lahko opišemo kot senzorno-motorične agente. S tem označujemo osnovno enoto predvsem v okviru nevronskih mrež, ki ima sposobnost zaznavanja okolja, integracije signalov in ustreznega odziva. Odziv senzorno-motoričnega agenta ni pogojen izključno z dražljajem, ampak se neprestano posodablja, izboljšuje in uči. Torej ob različnih preteklih izkušnjah, različnih časovnih obdobjih lahko odreagira drugače. Bakterije pa so celo inteligentni senzorno-motorični agenti. Močne vzporednice lahko namreč vidimo med obnašanjem prokariontov in med nevronskim omrežjem [3], [4]. Primer tega je recimo poskus s Physarum polycephalum, ki je zmožna učenja in reševanja labirintov podobnih tistim, s katerimi navadno preizkušajo nevronske sposobnosti sesalcev, kot so miši [5]. Inteligentnost prokariontov lahko obrazložimo s kompleksnostjo integracije signala med zaznavo in odzivom, pa tudi učenjem, predvsem pa z dejstvom, da ločijo sebe od zunanjega okolja [3]. Drug pogled na inteligenco bakterije pa je ta, da kolonija kot skupnost predstavlja kvazi-večcelični organizem, ki se kot celota odziva na zunanje dražljaje – podobno kot celice v telesu gradijo živ organizem [3], [6]. Pri tem seveda lahko pomislimo, ali tudi ljudje na podoben način gradimo družbo, oziroma ali je npr. država/civilizacija inteligentno, samozavedno bitje. Sociološki koncept, ki to opisuje, se imenuje socialni organizem. Razvila sta ga Herbert Spencer in Émile Durkheim. Podobna filozofska teorija se imenuje organicizem. Bakterije bi potemtakem lahko imele inteligenco gruče, ki se vzpostavi, ko gradi družbo izjemno veliko osnovnih enot, ki so sposobne medsebojen komunikacije in imajo vsaj minimalno inteligenco [6]. Podobno je bilo ugotovljeno tudi pri rastlinskih celicah v koreninskih kapicah. Njihova vloga je, da se ob hitri delitvi širijo po zemlji proti območjem, kjer je najvišji delež mineralov, hkrati pa ni ovir. Naloga je seveda izredno zahtevna, poleg tega pa tudi ena sama koreninska kapica težko razvozla »podtalni zemljevid«. Znanstveniki so ugotovili, da med koreninskimi kapicami poteka komunikacija in da problem rešujejo skupaj. Presenetljivo so ugotovili, da če korenine enega organizma ločijo in posadijo v ločena lončka, komunikacija še vedno poteka – zaznavanje ene korenine vpliva na rast druge korenine, ki je v popolnoma drugem lončku. Najverjetneje signalizacija poteka prek elektromagnetnih polj [7]. Konec koncev pa je podobno tudi pri ljudeh, kar enostavno in neznanstveno opiše rek »več glav več ve.«
Liberman je z izrekom »Celica je računalnik« želel opisati, kako kompleksni procesi potekajo v celicah, ki jih po delovanju lahko primerjamo s tistimi v računalniku [8]. DNA ali RNA predstavljata programsko kodo, proteini, ki nastanejo pa so po tej analogiji izvajalci operacij na sebi, okolju in programski kodi (DNA in RNA). Toda v resnici ne gre le za analogijo, ampak dejansko stanje. Poleg tega pa so celice celo inteligentni računalniki, zaradi učenja s Pavlovim kondicioniranjem, zaznavanjem okolja in sebe, njihove odločitve pa so kompleksne in pomembno – individualne. Primer je recimo poskus z amebami, kjer so jih postavili v električno polje. Vsi organizmi so plavali proti katodi (osnovno obnašanje). Nato so na strani anode pripravili gradient kemotaksina (privablja amebe) in 53 % jih je plavalo proti anodi, 45 % ponovno proti katodi, ostale pa so ostale na mestu. Te, ki so plavali proti kemotaksinu, torej anodi, so postavili v novo gojišče brez gradienta kemotaksina. Ob vključitvi električnega polja jih je 82 % plavalo proti anodi, kar ni osnovno obnašanje, hkrati pa tudi ni mogoče razložiti drugače kot z učenjem [9].
==Vnos nevronske mreže v bakterijo==
Z razvojem sintezne biologije so se možnosti programiranja celic bistveno povečale. Pripravljeno nevronsko mrežo lahko pretvorimo v zaporedje DNA in vnesemo v bakterije. A pomembna razlika od programiranja računalnika je pri bakterijah difuzija signala – z drugimi besedami, v bakterijah ni možno neskončno operacij, pri katerih predstavlja prejšnja rešitev (ang. output) vnos (ang. input) za naslednjo operacijo. Temu se lahko izognemu z uporabo preprostih operacij, ali pa uporabimo komunikacijo med bakterijami. Lahko bi uporabili konzorcij bakterij, ki rešuje isti problem, nato pa večinsko rešitev med seboj sporoči, tako da vse bakterije v naslednjem koraku začnejo z istim začetnim vnosom. Druga možnost pa je ta, da v konzorcij uvedemo več različnih tipov bakterij, ki potem rešujejo le nekaj operacij vsaka preden signal difundira, nato pa podajo rezultate naprej naslednjemu tipu bakterij. S pomočjo sintezne biologije, programiranja in informatike so do sedaj že oblikovali konzorcij sprejemnih (ang. reciever) in oddajnih (ang. sender) bakterij, ki so zmožne prepoznave 3×3 bitnega vzorca. Za razumevanje področja pa je pomembno tudi poznavanje delovanja nevronskih mrež in strojnega učenja. Nevronske mreže lahko najpreprosteje razložimo kot sistem, ki signale sprejme, nato integrira s pomočjo uteževanja in nato poda odgovor. Ene najpreprostejših nevronskih mrež so perceptroni. Pri teh informacija teče izkjučno v smeri od signala proti odgovoru, poleg tega pa vsebujejo le en sloj integrativnih nevronov. Za kompleksnejše naloge niso uporabni. S strojnim učenjem omogočimo sistemu nevronskih mrež, da čim bolj pravilno uteži določene nevronske poti. Načeloma se to dela s poskušanjem in odbiranjem boljših nevronskih mrež, saj bi človeško nastavljanje utežitev »na roko« bilo prekompleksno. V celici kot že rečeno potekajo podobne povezave kot pri nevronski mreži. Primer tega so medproteinske interakcije pri signalnih poteh. Celica ogromno količino signalov pretvori v nekaj odzivov, kar poteče preko fosforilacije in defosforilacije velikega števila proteinov, ki med seboj interagirajo. Prav zato nekateri tem signalnim potem pravijo fosfonevronsko omrežje, saj spominja na kompleksno nevronsko omrežje v človeških možganih. Druga možnost izgraditve nevronskega omrežja pa je na nivoju DNA, kjer en del genoma regulira delovanje drugega dela in obratno. Regulacijo na osnovi DNA so uporabili v raziskavi, ki jo bom predstavil.
==Rezultati raziskave==
Vse poskuse v raziskavi so izvajali in silico, s pomočjo različnih računalniških programov in simulatorja. Izvrstno poznavanje delovanja nevronskih mrež v celicah in silico je predpogoj za nadaljevanje dela v laboratoriju s pravimi bakterijami. Prvi poskus je predvideval optimizacije sintezne poti polihidroksibutirata (PHB) (bioplastika). Trije vnosi v nevronsko mrežo so predvidevali koncentracije melase, sečnine in propionske kisline, rezultat pa je bil koncentracija nastalega PHB. Z drugimi besedami, s pomočjo poznavanja bakterijskega metabolizma, simulacije in nevronske mreže so ugotovili optimalne pogoje za nastajanje PHB glede treh vhodnih snovi.
Drug poskus pa je bil kompleksnejši, saj so s pomočjo nevronske mreže želeli programirati odziv bakterije glede na vhodne podatke. Štirje vhodni podatki so bili: prisotnost galaktoze (kemotaktik), kisika, avtoinduktorja furanozil borat diestra (sodeluje pri komunikaciji bakterij) in arabinoze (vir ogljika). Prisotnost signala je bila ali 0 (ni prisoten) ali 1 (je prisoten) glede na to, ali preseže določeno vrednost. Štirje možni odgovori po integraciji signalov pa so bili aerobni odgovor, premikanje, priskledništvo (nadaljnja razgradnja metabolnih produktov drugih celic) ali stresni odziv. Treniranje nevronskega omrežja lahko poteka na dva načina. En je zunaj celic, torej preden ga implementiramo in se po namestitvi ne spreminja. Prednost je ta, da se ne spreminja, torej, če smo uporabili najboljše utežitve med treningom, bodo te take tudi ostale. Iz tega tudi izhaja slabost, ki je, da se nevronsko omrežje z novimi podatki ne bo posodabljalo in lahko zastara. Po drugi možnosti pa lahko nevronsko omrežje treniramo v bakterijah samih. To pomeni, da se bo s časom in uporabo izboljševalo, utežitve bodo vedno boljše. Slabost pa je ta, da ni nikakor nujno, da bo konvergiralo k optimalnim utežitvam, torej ni nujno, da dobimo uporabno nevronsko omrežje. Pri poskusu so zato uporabili prvo možnost, torej s treningom so utežili nevronske poti, pretvorili nevronsko mrežo v logične operacije, to spremenili v zaporedje DNA in vnesli v in silico plazmid, ki so ga vnesli v in silico celice ter opazovali dogajanje. Vsak odziv celice je bil povezan z nastajanjem drugega fluorescentnega proteina, kar je omogočalo ugotavljanje signalov. Prav tako je celica proizvedla več reporterjev, če je bila v več stanjih odgovorov naenkrat. Rezultati so bili pričakovani, torej pokazali so, da vsaj in silico tovrstno nevronsko omrežje v obliki plazmida deluje dobro.
==Zaključek==
V prihodnosti bo gotovo še več raziskav v tej smeri, še posebej zanimive bi bile tiste, ki bi uporabljale prave celice. Pa vendar so tudi računalniške simulacije pomemben prvi korak pri uvajanju kompleksnih nevronskih mrež v bakterije in preko njih vplivanja na obnašanje. Uporaba takih bakterij bi bila koristna pri praktično vseh biotehnoloških aplikacijah, pa tudi v medicini, sintezi biogoriv in morda zdravljenju v telesu. Kdo ve, morda pa bodo nekoč kompleksne populacije bakterij lahko reševale tudi probleme, ki jih trenutno rešujejo računalniki? Upajmo, da se ob uvedbi večslojnih nevronskih mrež in vse bolj raznolikega obnašanja bakterije ne bodo naveličale petrijevk in neprestanega centrifugiranja.
==Viri==
[1] M. Gagliano, M. Renton, M. Depczynski, in S. Mancuso, „Experience teaches plants to learn faster and forget slower in environments where it matters“, Oecologia, let. 175, št. 1, str. 63–72, 2014, doi: 10.1007/s00442-013-2873-7.

[2] M. Thellier in U. Lüttge, „Plant memory: a tentative model“, Plant Biol., let. 15, št. 1, str. 1–12, jan. 2013, doi: https://doi.org/10.1111/j.1438-8677.2012.00674.x.

[3] A. G. Becerra, M. Gutiérrez, in R. Lahoz-Beltra, „Computing within bacteria: Programming of bacterial behavior by means of a plasmid encoding a perceptron neural network“, Biosystems, let. 213, str. 104608, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608.

[4] R. Lahoz-Beltra, J. Navarro, in P. Marijuan, „Bacterial computing: a form of natural computing and its applications “, Frontiers in Microbiology , let. 5. 2014.

[5] T. Nakagaki, H. Yamada, in A. Tóth, „Maze-solving by an amoeboid organism.“, Nature, let. 407, št. 6803, str. 470, sep. 2000, doi: 10.1038/35035159.

[6] S. Majumdar in S. Pal, „Bacterial intelligence: imitation games, time-sharing, and long-range quantum coherence“, J. Cell Commun. Signal., let. 11, št. 3, str. 281–284, sep. 2017, doi: 10.1007/s12079-017-0394-6.

[7] F. Baluška, S. Lev-Yadun, in S. Mancuso, „Swarm intelligence in plant roots“, Trends Ecol. Evol., let. 25, št. 12, str. 682–683, 2010, doi: https://doi.org/10.1016/j.tree.2010.09.003.

[8] E. A. Liberman in S. V Minina, „Cell molecular computers and biological information as the foundation of nature’s laws“, Biosystems, let. 38, št. 2, str. 173–177, 1996, doi: https://doi.org/10.1016/0303-2647(95)01588-4.

[9] I. M. De la Fuente idr., „Evidence of conditioned behavior in amoebae“, Nat. Commun., let. 10, št. 1, str. 3690, 2019, doi: 10.1038/s41467-019-11677-w.

Računalništvo znotraj bakterij: Programiranje bakterijskega obnašanja s pomočjo plazmida, ki kodira perceptronsko nevronsko mrežo

2022-05-22T21:47:42Z

Tevz Levstek: /* Viri */

==Uvod==
V znanosti je dalj časa veljala dogma, da imajo lastnosti kompleksnega obnašanja, inteligence in učenja lahko samo večcelični organizmi, ki vsebujejo kompleksno nevronsko mrežo. Kljub temu, da za najzahtevnejše oblike omenjenih delovanj to še zmeraj drži, pa novejše raziskave razširjajo zmožnost teh operacij tudi na druge vrste organizmov. Primer tega so na primer nekatere rastline, ki lahko shranjujejo in kasneje priklicujejo informacije povezane z dotikom, poškodbo, temperaturo, sušo in elektromagnetnim sevanjem, kar jim omogoči drugačen in primernejši odziv, če se podobne okoliščine ponovijo [1], [2]. Preboj o dojemanju obnašanja in učenja pa se je zgodil tudi v enoceličnih organizmih, kot so bakterije, nekatere glive, protisti itd. Pri teh organizmih je obnašanje v največji meri zapisano v genetskem materialu, v molekuli DNA. Enocelične organizme lahko opišemo kot senzorno-motorične agente. S tem označujemo osnovno enoto predvsem v okviru nevronskih mrež, ki ima sposobnost zaznavanja okolja, integracije signalov in ustreznega odziva. Odziv senzorno-motoričnega agenta ni pogojen izključno z dražljajem, ampak se neprestano posodablja, izboljšuje in uči. Torej ob različnih preteklih izkušnjah, različnih časovnih obdobjih lahko odreagira drugače. Bakterije pa so celo inteligentni senzorno-motorični agenti. Močne vzporednice lahko namreč vidimo med obnašanjem prokariontov in med nevronskim omrežjem [3], [4]. Primer tega je recimo poskus s Physarum polycephalum, ki je zmožna učenja in reševanja labirintov podobnih tistim, s katerimi navadno preizkušajo nevronske sposobnosti sesalcev, kot so miši [5]. Inteligentnost prokariontov lahko obrazložimo s kompleksnostjo integracije signala med zaznavo in odzivom, pa tudi učenjem, predvsem pa z dejstvom, da ločijo sebe od zunanjega okolja [3]. Drug pogled na inteligenco bakterije pa je ta, da kolonija kot skupnost predstavlja kvazi-večcelični organizem, ki se kot celota odziva na zunanje dražljaje – podobno kot celice v telesu gradijo živ organizem [3], [6]. Pri tem seveda lahko pomislimo, ali tudi ljudje na podoben način gradimo družbo, oziroma ali je npr. država/civilizacija inteligentno, samozavedno bitje. Sociološki koncept, ki to opisuje, se imenuje socialni organizem. Razvila sta ga Herbert Spencer in Émile Durkheim. Podobna filozofska teorija se imenuje organicizem. Bakterije bi potemtakem lahko imele inteligenco gruče, ki se vzpostavi, ko gradi družbo izjemno veliko osnovnih enot, ki so sposobne medsebojen komunikacije in imajo vsaj minimalno inteligenco [6]. Podobno je bilo ugotovljeno tudi pri rastlinskih celicah v koreninskih kapicah. Njihova vloga je, da se ob hitri delitvi širijo po zemlji proti območjem, kjer je najvišji delež mineralov, hkrati pa ni ovir. Naloga je seveda izredno zahtevna, poleg tega pa tudi ena sama koreninska kapica težko razvozla »podtalni zemljevid«. Znanstveniki so ugotovili, da med koreninskimi kapicami poteka komunikacija in da problem rešujejo skupaj. Presenetljivo so ugotovili, da če korenine enega organizma ločijo in posadijo v ločena lončka, komunikacija še vedno poteka – zaznavanje ene korenine vpliva na rast druge korenine, ki je v popolnoma drugem lončku. Najverjetneje signalizacija poteka prek elektromagnetnih polj [7]. Konec koncev pa je podobno tudi pri ljudeh, kar enostavno in neznanstveno opiše rek »več glav več ve.«
Liberman je z izrekom »Celica je računalnik« želel opisati, kako kompleksni procesi potekajo v celicah, ki jih po delovanju lahko primerjamo s tistimi v računalniku [8]. DNA ali RNA predstavljata programsko kodo, proteini, ki nastanejo pa so po tej analogiji izvajalci operacij na sebi, okolju in programski kodi (DNA in RNA). Toda v resnici ne gre le za analogijo, ampak dejansko stanje. Poleg tega pa so celice celo inteligentni računalniki, zaradi učenja s Pavlovim kondicioniranjem, zaznavanjem okolja in sebe, njihove odločitve pa so kompleksne in pomembno – individualne. Primer je recimo poskus z amebami, kjer so jih postavili v električno polje. Vsi organizmi so plavali proti katodi (osnovno obnašanje). Nato so na strani anode pripravili gradient kemotaksina (privablja amebe) in 53 % jih je plavalo proti anodi, 45 % ponovno proti katodi, ostale pa so ostale na mestu. Te, ki so plavali proti kemotaksinu, torej anodi, so postavili v novo gojišče brez gradienta kemotaksina. Ob vključitvi električnega polja jih je 82 % plavalo proti anodi, kar ni osnovno obnašanje, hkrati pa tudi ni mogoče razložiti drugače kot z učenjem [9].
==Vnos nevronske mreže v bakterijo==
Z razvojem sintezne biologije so se možnosti programiranja celic bistveno povečale. Pripravljeno nevronsko mrežo lahko pretvorimo v zaporedje DNA in vnesemo v bakterije. A pomembna razlika od programiranja računalnika je pri bakterijah difuzija signala – z drugimi besedami, v bakterijah ni možno neskončno operacij, pri katerih predstavlja prejšnja rešitev (ang. output) vnos (ang. input) za naslednjo operacijo. Temu se lahko izognemu z uporabo preprostih operacij, ali pa uporabimo komunikacijo med bakterijami. Lahko bi uporabili konzorcij bakterij, ki rešuje isti problem, nato pa večinsko rešitev med seboj sporoči, tako da vse bakterije v naslednjem koraku začnejo z istim začetnim vnosom. Druga možnost pa je ta, da v konzorcij uvedemo več različnih tipov bakterij, ki potem rešujejo le nekaj operacij vsaka preden signal difundira, nato pa podajo rezultate naprej naslednjemu tipu bakterij. S pomočjo sintezne biologije, programiranja in informatike so do sedaj že oblikovali konzorcij sprejemnih (ang. reciever) in oddajnih (ang. sender) bakterij, ki so zmožne prepoznave 3×3 bitnega vzorca. Za razumevanje področja pa je pomembno tudi poznavanje delovanja nevronskih mrež in strojnega učenja. Nevronske mreže lahko najpreprosteje razložimo kot sistem, ki signale sprejme, nato integrira s pomočjo uteževanja in nato poda odgovor. Ene najpreprostejših nevronskih mrež so perceptroni. Pri teh informacija teče izkjučno v smeri od signala proti odgovoru, poleg tega pa vsebujejo le en sloj integrativnih nevronov. Za kompleksnejše naloge niso uporabni. S strojnim učenjem omogočimo sistemu nevronskih mrež, da čim bolj pravilno uteži določene nevronske poti. Načeloma se to dela s poskušanjem in odbiranjem boljših nevronskih mrež, saj bi človeško nastavljanje utežitev »na roko« bilo prekompleksno. V celici kot že rečeno potekajo podobne povezave kot pri nevronski mreži. Primer tega so medproteinske interakcije pri signalnih poteh. Celica ogromno količino signalov pretvori v nekaj odzivov, kar poteče preko fosforilacije in defosforilacije velikega števila proteinov, ki med seboj interagirajo. Prav zato nekateri tem signalnim potem pravijo fosfonevronsko omrežje, saj spominja na kompleksno nevronsko omrežje v človeških možganih. Druga možnost izgraditve nevronskega omrežja pa je na nivoju DNA, kjer en del genoma regulira delovanje drugega dela in obratno. Regulacijo na osnovi DNA so uporabili v raziskavi, ki jo bom predstavil.
==Rezultati raziskave==
Vse poskuse v raziskavi so izvajali in silico, s pomočjo različnih računalniških programov in simulatorja. Izvrstno poznavanje delovanja nevronskih mrež v celicah in silico je predpogoj za nadaljevanje dela v laboratoriju s pravimi bakterijami. Prvi poskus je predvideval optimizacije sintezne poti polihidroksibutirata (PHB) (bioplastika). Trije vnosi v nevronsko mrežo so predvidevali koncentracije melase, sečnine in propionske kisline, rezultat pa je bil koncentracija nastalega PHB. Z drugimi besedami, s pomočjo poznavanja bakterijskega metabolizma, simulacije in nevronske mreže so ugotovili optimalne pogoje za nastajanje PHB glede treh vhodnih snovi.
Drug poskus pa je bil kompleksnejši, saj so s pomočjo nevronske mreže želeli programirati odziv bakterije glede na vhodne podatke. Štirje vhodni podatki so bili: prisotnost galaktoze (kemotaktik), kisika, avtoinduktorja furanozil borat diestra (sodeluje pri komunikaciji bakterij) in arabinoze (vir ogljika). Prisotnost signala je bila ali 0 (ni prisoten) ali 1 (je prisoten) glede na to, ali preseže določeno vrednost. Štirje možni odgovori po integraciji signalov pa so bili aerobni odgovor, premikanje, priskledništvo (nadaljnja razgradnja metabolnih produktov drugih celic) ali stresni odziv. Treniranje nevronskega omrežja lahko poteka na dva načina. En je zunaj celic, torej preden ga implementiramo in se po namestitvi ne spreminja. Prednost je ta, da se ne spreminja, torej, če smo uporabili najboljše utežitve med treningom, bodo te take tudi ostale. Iz tega tudi izhaja slabost, ki je, da se nevronsko omrežje z novimi podatki ne bo posodabljalo in lahko zastara. Po drugi možnosti pa lahko nevronsko omrežje treniramo v bakterijah samih. To pomeni, da se bo s časom in uporabo izboljševalo, utežitve bodo vedno boljše. Slabost pa je ta, da ni nikakor nujno, da bo konvergiralo k optimalnim utežitvam, torej ni nujno, da dobimo uporabno nevronsko omrežje. Pri poskusu so zato uporabili prvo možnost, torej s treningom so utežili nevronske poti, pretvorili nevronsko mrežo v logične operacije, to spremenili v zaporedje DNA in vnesli v in silico plazmid, ki so ga vnesli v in silico celice ter opazovali dogajanje. Vsak odziv celice je bil povezan z nastajanjem drugega fluorescentnega proteina, kar je omogočalo ugotavljanje signalov. Prav tako je celica proizvedla več reporterjev, če je bila v več stanjih odgovorov naenkrat. Rezultati so bili pričakovani, torej pokazali so, da vsaj in silico tovrstno nevronsko omrežje v obliki plazmida deluje dobro.
==Zaključek==
V prihodnosti bo gotovo še več raziskav v tej smeri, še posebej zanimive bi bile tiste, ki bi uporabljale prave celice. Pa vendar so tudi računalniške simulacije pomemben prvi korak pri uvajanju kompleksnih nevronskih mrež v bakterije in preko njih vplivanja na obnašanje. Uporaba takih bakterij bi bila koristna pri praktično vseh biotehnoloških aplikacijah, pa tudi v medicini, sintezi biogoriv in morda zdravljenju v telesu. Kdo ve, morda pa bodo nekoč kompleksne populacije bakterij lahko reševale tudi probleme, ki jih trenutno rešujejo računalniki? Upajmo, da se ob uvedbi večslojnih nevronskih mrež in vse bolj raznolikega obnašanja bakterije ne bodo naveličale petrijevk in neprestanega centrifugiranja.
==Viri==
[1] M. Gagliano, M. Renton, M. Depczynski, in S. Mancuso, „Experience teaches plants to learn faster and forget slower in environments where it matters“, Oecologia, let. 175, št. 1, str. 63–72, 2014, doi: 10.1007/s00442-013-2873-7.

[2] M. Thellier in U. Lüttge, „Plant memory: a tentative model“, Plant Biol., let. 15, št. 1, str. 1–12, jan. 2013, doi: https://doi.org/10.1111/j.1438-8677.2012.00674.x.

[3] A. G. Becerra, M. Gutiérrez, in R. Lahoz-Beltra, „Computing within bacteria: Programming of bacterial behavior by means of a plasmid encoding a perceptron neural network“, Biosystems, let. 213, str. 104608, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608.

[4] R. Lahoz-Beltra, J. Navarro, in P. Marijuan, „Bacterial computing: a form of natural computing and its applications “, Frontiers in Microbiology , let. 5. 2014.

[5] T. Nakagaki, H. Yamada, in A. Tóth, „Maze-solving by an amoeboid organism.“, Nature, let. 407, št. 6803, str. 470, sep. 2000, doi: 10.1038/35035159.

[6] S. Majumdar in S. Pal, „Bacterial intelligence: imitation games, time-sharing, and long-range quantum coherence“, J. Cell Commun. Signal., let. 11, št. 3, str. 281–284, sep. 2017, doi: 10.1007/s12079-017-0394-6.

[7] F. Baluška, S. Lev-Yadun, in S. Mancuso, „Swarm intelligence in plant roots“, Trends Ecol. Evol., let. 25, št. 12, str. 682–683, 2010, doi: https://doi.org/10.1016/j.tree.2010.09.003.

[8] E. A. Liberman in S. V Minina, „Cell molecular computers and biological information as the foundation of nature’s laws“, Biosystems, let. 38, št. 2, str. 173–177, 1996, doi: https://doi.org/10.1016/0303-2647(95)01588-4.

[9] I. M. De la Fuente idr., „Evidence of conditioned behavior in amoebae“, Nat. Commun., let. 10, št. 1, str. 3690, 2019, doi: 10.1038/s41467-019-11677-w.

Računalništvo znotraj bakterij: Programiranje bakterijskega obnašanja s pomočjo plazmida, ki kodira perceptronsko nevronsko mrežo

2022-05-22T21:47:01Z

Tevz Levstek: New page: ==Uvod== V znanosti je dalj časa veljala dogma, da imajo lastnosti kompleksnega obnašanja, inteligence in učenja lahko samo večcelični organizmi, ki vsebujejo kompleksno nevronsko mre...

==Uvod==
V znanosti je dalj časa veljala dogma, da imajo lastnosti kompleksnega obnašanja, inteligence in učenja lahko samo večcelični organizmi, ki vsebujejo kompleksno nevronsko mrežo. Kljub temu, da za najzahtevnejše oblike omenjenih delovanj to še zmeraj drži, pa novejše raziskave razširjajo zmožnost teh operacij tudi na druge vrste organizmov. Primer tega so na primer nekatere rastline, ki lahko shranjujejo in kasneje priklicujejo informacije povezane z dotikom, poškodbo, temperaturo, sušo in elektromagnetnim sevanjem, kar jim omogoči drugačen in primernejši odziv, če se podobne okoliščine ponovijo [1], [2]. Preboj o dojemanju obnašanja in učenja pa se je zgodil tudi v enoceličnih organizmih, kot so bakterije, nekatere glive, protisti itd. Pri teh organizmih je obnašanje v največji meri zapisano v genetskem materialu, v molekuli DNA. Enocelične organizme lahko opišemo kot senzorno-motorične agente. S tem označujemo osnovno enoto predvsem v okviru nevronskih mrež, ki ima sposobnost zaznavanja okolja, integracije signalov in ustreznega odziva. Odziv senzorno-motoričnega agenta ni pogojen izključno z dražljajem, ampak se neprestano posodablja, izboljšuje in uči. Torej ob različnih preteklih izkušnjah, različnih časovnih obdobjih lahko odreagira drugače. Bakterije pa so celo inteligentni senzorno-motorični agenti. Močne vzporednice lahko namreč vidimo med obnašanjem prokariontov in med nevronskim omrežjem [3], [4]. Primer tega je recimo poskus s Physarum polycephalum, ki je zmožna učenja in reševanja labirintov podobnih tistim, s katerimi navadno preizkušajo nevronske sposobnosti sesalcev, kot so miši [5]. Inteligentnost prokariontov lahko obrazložimo s kompleksnostjo integracije signala med zaznavo in odzivom, pa tudi učenjem, predvsem pa z dejstvom, da ločijo sebe od zunanjega okolja [3]. Drug pogled na inteligenco bakterije pa je ta, da kolonija kot skupnost predstavlja kvazi-večcelični organizem, ki se kot celota odziva na zunanje dražljaje – podobno kot celice v telesu gradijo živ organizem [3], [6]. Pri tem seveda lahko pomislimo, ali tudi ljudje na podoben način gradimo družbo, oziroma ali je npr. država/civilizacija inteligentno, samozavedno bitje. Sociološki koncept, ki to opisuje, se imenuje socialni organizem. Razvila sta ga Herbert Spencer in Émile Durkheim. Podobna filozofska teorija se imenuje organicizem. Bakterije bi potemtakem lahko imele inteligenco gruče, ki se vzpostavi, ko gradi družbo izjemno veliko osnovnih enot, ki so sposobne medsebojen komunikacije in imajo vsaj minimalno inteligenco [6]. Podobno je bilo ugotovljeno tudi pri rastlinskih celicah v koreninskih kapicah. Njihova vloga je, da se ob hitri delitvi širijo po zemlji proti območjem, kjer je najvišji delež mineralov, hkrati pa ni ovir. Naloga je seveda izredno zahtevna, poleg tega pa tudi ena sama koreninska kapica težko razvozla »podtalni zemljevid«. Znanstveniki so ugotovili, da med koreninskimi kapicami poteka komunikacija in da problem rešujejo skupaj. Presenetljivo so ugotovili, da če korenine enega organizma ločijo in posadijo v ločena lončka, komunikacija še vedno poteka – zaznavanje ene korenine vpliva na rast druge korenine, ki je v popolnoma drugem lončku. Najverjetneje signalizacija poteka prek elektromagnetnih polj [7]. Konec koncev pa je podobno tudi pri ljudeh, kar enostavno in neznanstveno opiše rek »več glav več ve.«
Liberman je z izrekom »Celica je računalnik« želel opisati, kako kompleksni procesi potekajo v celicah, ki jih po delovanju lahko primerjamo s tistimi v računalniku [8]. DNA ali RNA predstavljata programsko kodo, proteini, ki nastanejo pa so po tej analogiji izvajalci operacij na sebi, okolju in programski kodi (DNA in RNA). Toda v resnici ne gre le za analogijo, ampak dejansko stanje. Poleg tega pa so celice celo inteligentni računalniki, zaradi učenja s Pavlovim kondicioniranjem, zaznavanjem okolja in sebe, njihove odločitve pa so kompleksne in pomembno – individualne. Primer je recimo poskus z amebami, kjer so jih postavili v električno polje. Vsi organizmi so plavali proti katodi (osnovno obnašanje). Nato so na strani anode pripravili gradient kemotaksina (privablja amebe) in 53 % jih je plavalo proti anodi, 45 % ponovno proti katodi, ostale pa so ostale na mestu. Te, ki so plavali proti kemotaksinu, torej anodi, so postavili v novo gojišče brez gradienta kemotaksina. Ob vključitvi električnega polja jih je 82 % plavalo proti anodi, kar ni osnovno obnašanje, hkrati pa tudi ni mogoče razložiti drugače kot z učenjem [9].
==Vnos nevronske mreže v bakterijo==
Z razvojem sintezne biologije so se možnosti programiranja celic bistveno povečale. Pripravljeno nevronsko mrežo lahko pretvorimo v zaporedje DNA in vnesemo v bakterije. A pomembna razlika od programiranja računalnika je pri bakterijah difuzija signala – z drugimi besedami, v bakterijah ni možno neskončno operacij, pri katerih predstavlja prejšnja rešitev (ang. output) vnos (ang. input) za naslednjo operacijo. Temu se lahko izognemu z uporabo preprostih operacij, ali pa uporabimo komunikacijo med bakterijami. Lahko bi uporabili konzorcij bakterij, ki rešuje isti problem, nato pa večinsko rešitev med seboj sporoči, tako da vse bakterije v naslednjem koraku začnejo z istim začetnim vnosom. Druga možnost pa je ta, da v konzorcij uvedemo več različnih tipov bakterij, ki potem rešujejo le nekaj operacij vsaka preden signal difundira, nato pa podajo rezultate naprej naslednjemu tipu bakterij. S pomočjo sintezne biologije, programiranja in informatike so do sedaj že oblikovali konzorcij sprejemnih (ang. reciever) in oddajnih (ang. sender) bakterij, ki so zmožne prepoznave 3×3 bitnega vzorca. Za razumevanje področja pa je pomembno tudi poznavanje delovanja nevronskih mrež in strojnega učenja. Nevronske mreže lahko najpreprosteje razložimo kot sistem, ki signale sprejme, nato integrira s pomočjo uteževanja in nato poda odgovor. Ene najpreprostejših nevronskih mrež so perceptroni. Pri teh informacija teče izkjučno v smeri od signala proti odgovoru, poleg tega pa vsebujejo le en sloj integrativnih nevronov. Za kompleksnejše naloge niso uporabni. S strojnim učenjem omogočimo sistemu nevronskih mrež, da čim bolj pravilno uteži določene nevronske poti. Načeloma se to dela s poskušanjem in odbiranjem boljših nevronskih mrež, saj bi človeško nastavljanje utežitev »na roko« bilo prekompleksno. V celici kot že rečeno potekajo podobne povezave kot pri nevronski mreži. Primer tega so medproteinske interakcije pri signalnih poteh. Celica ogromno količino signalov pretvori v nekaj odzivov, kar poteče preko fosforilacije in defosforilacije velikega števila proteinov, ki med seboj interagirajo. Prav zato nekateri tem signalnim potem pravijo fosfonevronsko omrežje, saj spominja na kompleksno nevronsko omrežje v človeških možganih. Druga možnost izgraditve nevronskega omrežja pa je na nivoju DNA, kjer en del genoma regulira delovanje drugega dela in obratno. Regulacijo na osnovi DNA so uporabili v raziskavi, ki jo bom predstavil.
==Rezultati raziskave==
Vse poskuse v raziskavi so izvajali in silico, s pomočjo različnih računalniških programov in simulatorja. Izvrstno poznavanje delovanja nevronskih mrež v celicah in silico je predpogoj za nadaljevanje dela v laboratoriju s pravimi bakterijami. Prvi poskus je predvideval optimizacije sintezne poti polihidroksibutirata (PHB) (bioplastika). Trije vnosi v nevronsko mrežo so predvidevali koncentracije melase, sečnine in propionske kisline, rezultat pa je bil koncentracija nastalega PHB. Z drugimi besedami, s pomočjo poznavanja bakterijskega metabolizma, simulacije in nevronske mreže so ugotovili optimalne pogoje za nastajanje PHB glede treh vhodnih snovi.
Drug poskus pa je bil kompleksnejši, saj so s pomočjo nevronske mreže želeli programirati odziv bakterije glede na vhodne podatke. Štirje vhodni podatki so bili: prisotnost galaktoze (kemotaktik), kisika, avtoinduktorja furanozil borat diestra (sodeluje pri komunikaciji bakterij) in arabinoze (vir ogljika). Prisotnost signala je bila ali 0 (ni prisoten) ali 1 (je prisoten) glede na to, ali preseže določeno vrednost. Štirje možni odgovori po integraciji signalov pa so bili aerobni odgovor, premikanje, priskledništvo (nadaljnja razgradnja metabolnih produktov drugih celic) ali stresni odziv. Treniranje nevronskega omrežja lahko poteka na dva načina. En je zunaj celic, torej preden ga implementiramo in se po namestitvi ne spreminja. Prednost je ta, da se ne spreminja, torej, če smo uporabili najboljše utežitve med treningom, bodo te take tudi ostale. Iz tega tudi izhaja slabost, ki je, da se nevronsko omrežje z novimi podatki ne bo posodabljalo in lahko zastara. Po drugi možnosti pa lahko nevronsko omrežje treniramo v bakterijah samih. To pomeni, da se bo s časom in uporabo izboljševalo, utežitve bodo vedno boljše. Slabost pa je ta, da ni nikakor nujno, da bo konvergiralo k optimalnim utežitvam, torej ni nujno, da dobimo uporabno nevronsko omrežje. Pri poskusu so zato uporabili prvo možnost, torej s treningom so utežili nevronske poti, pretvorili nevronsko mrežo v logične operacije, to spremenili v zaporedje DNA in vnesli v in silico plazmid, ki so ga vnesli v in silico celice ter opazovali dogajanje. Vsak odziv celice je bil povezan z nastajanjem drugega fluorescentnega proteina, kar je omogočalo ugotavljanje signalov. Prav tako je celica proizvedla več reporterjev, če je bila v več stanjih odgovorov naenkrat. Rezultati so bili pričakovani, torej pokazali so, da vsaj in silico tovrstno nevronsko omrežje v obliki plazmida deluje dobro.
==Zaključek==
V prihodnosti bo gotovo še več raziskav v tej smeri, še posebej zanimive bi bile tiste, ki bi uporabljale prave celice. Pa vendar so tudi računalniške simulacije pomemben prvi korak pri uvajanju kompleksnih nevronskih mrež v bakterije in preko njih vplivanja na obnašanje. Uporaba takih bakterij bi bila koristna pri praktično vseh biotehnoloških aplikacijah, pa tudi v medicini, sintezi biogoriv in morda zdravljenju v telesu. Kdo ve, morda pa bodo nekoč kompleksne populacije bakterij lahko reševale tudi probleme, ki jih trenutno rešujejo računalniki? Upajmo, da se ob uvedbi večslojnih nevronskih mrež in vse bolj raznolikega obnašanja bakterije ne bodo naveličale petrijevk in neprestanega centrifugiranja.
==Viri==
[1] M. Gagliano, M. Renton, M. Depczynski, in S. Mancuso, „Experience teaches plants to learn faster and forget slower in environments where it matters“, Oecologia, let. 175, št. 1, str. 63–72, 2014, doi: 10.1007/s00442-013-2873-7.
[2] M. Thellier in U. Lüttge, „Plant memory: a tentative model“, Plant Biol., let. 15, št. 1, str. 1–12, jan. 2013, doi: https://doi.org/10.1111/j.1438-8677.2012.00674.x.
[3] A. G. Becerra, M. Gutiérrez, in R. Lahoz-Beltra, „Computing within bacteria: Programming of bacterial behavior by means of a plasmid encoding a perceptron neural network“, Biosystems, let. 213, str. 104608, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104608.
[4] R. Lahoz-Beltra, J. Navarro, in P. Marijuan, „Bacterial computing: a form of natural computing and its applications “, Frontiers in Microbiology , let. 5. 2014.
[5] T. Nakagaki, H. Yamada, in A. Tóth, „Maze-solving by an amoeboid organism.“, Nature, let. 407, št. 6803, str. 470, sep. 2000, doi: 10.1038/35035159.
[6] S. Majumdar in S. Pal, „Bacterial intelligence: imitation games, time-sharing, and long-range quantum coherence“, J. Cell Commun. Signal., let. 11, št. 3, str. 281–284, sep. 2017, doi: 10.1007/s12079-017-0394-6.
[7] F. Baluška, S. Lev-Yadun, in S. Mancuso, „Swarm intelligence in plant roots“, Trends Ecol. Evol., let. 25, št. 12, str. 682–683, 2010, doi: https://doi.org/10.1016/j.tree.2010.09.003.
[8] E. A. Liberman in S. V Minina, „Cell molecular computers and biological information as the foundation of nature’s laws“, Biosystems, let. 38, št. 2, str. 173–177, 1996, doi: https://doi.org/10.1016/0303-2647(95)01588-4.
[9] I. M. De la Fuente idr., „Evidence of conditioned behavior in amoebae“, Nat. Commun., let. 10, št. 1, str. 3690, 2019, doi: 10.1038/s41467-019-11677-w.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-22T21:44:33Z

Tevz Levstek:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inženiring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CelloSelect_%E2%80%93_sinteti%C4%8Dna_celobiozna_presnovna_pot_za_izbor_stabilnih_transgenih_celi%C4%8Dnih_linij_CHO CelloSelect – sintetična celobiozna presnovna pot za izbor stabilnih transgenih celičnih linij CHO] (Nika Vegelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hipersensitiven_genetsko_kodiran_fluorescen%C4%8Dni_indikator_%28roGFP2-Prx1%29_za_kontinuirno_merjenje_znotrajceli%C4%8Dnega_H2O2_med_mikro-kultivacijo_celic#Literatura Hipersensitiven genetsko kodiran fluorescenčni indikator (roGFP2-Prx1) za kontinuirno merjenje znotrajceličnega H2O2 med mikro-kultivacijo celic] (Eva Kanalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zasnova_in_karakterizacija_s_salicilno_kislino_induciranega_genskega_ekspresijskega_sistema_za_celice_Jurkat Zasnova in karakterizacija s salicilno kislino induciranega genskega ekspresijskega sistema za celice Jurkat] (Tina Arnšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_sinteti%C4%8Dni_kromosomi_kot_novo_orodje_za_in%C5%BEenirstvo_metabolizma Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma] (Špela Kladnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dni_mikrobni_konzorcij_za_biosintezo_2-keto-L-glukonske_kisline_%282-KLG%29 Sintetični mikrobni konzorcij za biosintezo 2-keto-L-glukonske kisline (2-KLG)] (Anastasija Nechevska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Računalništvo_znotraj_bakterij:_Programiranje_bakterijskega_obnašanja_s_pomočjo_plazmida,_ki_kodira_perceptronsko_nevronsko_mrežo Računalništvo znotraj bakterij: Programiranje bakterijskega obnašanja s pomočjo plazmida, ki kodira perceptronsko nevronsko mrežo] (Tevž Levstek)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-Mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah ELIXIO Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Agrobactory_593_-_Modularna_bakterijska_platforma_za_pripravo_biopesticidov Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidev] (Tim Nograšek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CyaSalt_-_metoda_za_razsoljevanje_morskih_voda] (Michelle Oletič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke] (Nika Malečkar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Remi,_du_et!_-_bioremediacija_razlitij_nafte Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte] (Jošt Hren)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-12T19:32:13Z

Tevz Levstek:

==Pritisk na odpornost proti antibiotikom==

Leta 1928 je Alexander Fleming odkril penicilin, izredno učinkovit antibiotik, ki je v prvi polovici dvajsetega stoletja rešil mnogo življenj in bil masovno uporabljan. Toda hkrati z uporabo antibiotikov, se je začela tekma, saj so začeli nastajati na antibiotike odporni sevi bakterij. Več kot se je nekega antibiotika uporabljalo, več vrst bakterij je nanj razvilo odpornost. Dandanes se antibiotiki uporabljajo predvsem v zdravstvu ter živinoreji. Ker pa je uporaba mnogokrat nepreudarna in pretirana, se poraja skrb, ali bo razvoj na antibiotike odpornih bakterij prehitel razvoj novih antibiotikov. Strah ni neracionalen, saj se vlaganje v razvoj povsem inovativnih antibiotikov zmanjšuje.
Antibiotiki se v ogromnih količinah porabljajo pri masovni živinoreji za prehranjevalne potrebe človeške populacije. Tako se v iztrebkih, ki seveda vsebujejo ostanke antibiotikov, začne selektivni pritisk na bakterije, kjer se favorizirajo tiste z antibiotsko odpornostjo, oziroma geni zanjo. V veliki meri se živalski iztrebki uporabljajo kot gnojila pri pridelovanju rastlinske hrane, kjer obstaja možnost prenosa na antibiotike odpornih bakterij na hrano, kar poraja vprašanja o nevarnostih za javno zdravje.

==Vloga bakteriofagov pri širjenju odpornosti na antibiotike==

Bakteriofagi, bakterijski virusi, imajo dva poznana načina razmnoževanja oziroma delovanja. Prvi, najenostavnejši, je litični, kjer fag vbrizga svojo dednino v bakterijo, ta pa nato po vneseni informaciji izdela nove viruse, ki jih sprosti v okolje. Drugi, kompleksnejši način, je lizogen, kjer se virusna dednina vstavi v bakterijsko dednino. Ob aktivatorju (na primer stres) se virusna DNA prepisuje in prevaja, virus pa vstopi v litični cikel. Virusna dednina vsebuje informacije za beljakovinske komponente faga, replikaze, v posebnih in za to temo pomembnih primerih pa tudi bakterijske gene. Omenjeni bakterijski geni, ki se pojavljajo v dednini lizogenih fagov lahko kodirajo toksine, superantigene, T3SS (strukture, ki patogenim bakterijam omogočijo prenos škodljivih proteinov iz bakterijskega citosola direktno v gostiteljsko celico), proteine za pritrjanje na podlago (gostitelja) in gene, ki omogočajo odpornost na antibiotike. Iz napisanega je razvidno, da imajo sami fagi pomemben vpliv na širjenje patogenih in drugih človeku nevarnih lastnosti po bakterijski populaciji.
V resnici so fagi zelo pomembni za kontrolo bakterijskih populacij, pri biogeokemijskih procesih in pri samem evolucijskem razvoju bakterij. Kar 20 % genov vseh bakterij naj bi bilo pridobljenih na omenjen način lizogenega cikla, a vpliv fagov na razvoj bakterij sploh še ni dobro raziskan. Ko virus prenese svojo dednino, ki vključuje bakterijske gene, v bakterijski kromosom, lahko to ne pomeni za gostiteljsko bakterijo nobenih sprememb, lahko so te negativne ali pozitivne. Prek evolucijskih mehanizmov se pozitivne lastnosti pri podvojevanjih, prek plazmidov, pa tudi prek litičnega cikla hitro razširijo po populaciji. V primeru živinoreje se torej ob prisotnosti fagov, ki vsebujejo bakterijske gene za antibiotsko odpornost, število odpornih bakterij v živalskem gnoju hitro razširi zaradi antibiotskega pritiska na bakterije. Na antibiotike odporne bakterije lahko nato preko gnojenja in rastlinske hrane konzumirajo ljudje, kar predstavlja tveganje za javno zdravje, saj je tovrstne okužbe težko zdraviti (pomanjkanje delujočih antibiotikov). Iz napisanega je torej razvidno, da je za celovito borbo proti razširjanju antibiotske odpornosti med bakterijami ključnega pomena, da se razišče vloga fagov v evoluciji bakterij, v odnosih z bakterijskimi kulturami in bolj usmerjeno, pri prenašanju in razširjanju genov antibiotske odpornosti po bakterijskih populacijah.
Nadalje bo v seminarski nalogi opisan mehanizem in regulacija prenosa določenih bakterijskih genov (npr. nosijo gene za antibiotsko odpornost) v virusno dednino, ki se nato preko litičnega cikla lahko razširja po populaciji.

==Posredniki prenosa genov==

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo vršijo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga vršijo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

===Življenjski cikel PPG===

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

Nastanek PPG se začne s transkripcijo in translacijo PPG genov. Nastali deli morajo dozoreti, torej proteini se morajo ustrezno sestaviti v določen del PPG. Sledi polnjenje glav PPG, kar regulira poseben terminazni encimski kompleks. Ta zapolni vsako glavo do maksimalne dolžine DNA, ki se lahko vstavi in se nato premakne naprej do naslednje glave. Maksimalna dolžina je 4 – 14 kb, kar je odvisno od bakterije, v splošnem pa velja, da lahko glave istega organizma sprejmejo enako količino DNA. Fagi lahko za razliko od PPG sprejmejo večjo količino DNA in prenašajo gene, ki kodirajo za nastanek več fagov. Po pakiranju pride do sestavljanja glav in repov ter končne lize celice.

===Prenos dednega materiala===

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le eno verigo DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

==Voda kot glavni problem onesnaženosti==

Odpadna voda in rastline, ki jih obdelujejo z odpadno vodo, so lahko pravi rezervoar naravnih ponudnikov rezistence na antibiotike. So žarišče horizontalne transferacije genov, kar omogoča razširjanje genov za rezistenco na antibiotike (ARG) med bakterijami. Odpadna voda namreč vsebuje antibiotike, razkužila in kovine, ki lahko pripomorejo k antibiotični rezistenci že v nizkih koncentracijah. Bolnišnice predstavljajo zelo majhen del med viri antibiotikov, na antibiotike rezistentnih bakterij (ARB) in ARG. Zelo veliko jih vsebujejo tudi reke, na katerih poteka več raziskav in primerjav različnih ARG na večih delih reke. Občutljive bakterije lahko pridobijo gen za rezistenco preko transformacije, transdukcije ali konjugacije. Med pridobivanjem enega gena za rezistenco pa lahko v teh procesih bakterija sočasno pridobi tudi številne druge gene za rezistenco na druge antibiotike. Trenutno se za raziskave na tem področju najpogosteje uporabljajo metode, kot so kvantitativna PCR, metagenomika in funkcionalna metagenomika, razvoj novih metod pa konstantno prinaša nove možnosti za analizo ARG.
Pridobitev rezistence je lahko naraven prilagoditveni proces, do nje pride preko spontanih mutacij ali pa se razvije preko horizontalne transferacije gena, ki ga pridobi od donorja, npr. druga bakterija, fagi, ali prosta DNA. Torej lahko tudi nepatogene bakterije, ki vsebujejo ARG, služijo kot rezervoar za patogene bakterije. Predvsem, ko gre za patogene bakterije, pa predstavlja rezistenca globalen problem. Več kot ena miljarda ljudi živi v pomanjkanju pitne vode. Čiščenje vode poteka preko filtracije in kloriranja, a za vse bolj onesnaženo vodo v sedanjem času, to ni zadovoljivo, saj ostane mnogo ARG v vodi. Pitje onesnažene vode je tako zelo ogrožajoče za javno zdravje. Predvsem ostanki neporabljenih antibiotikov v vodi verjetno spodbujajo ARB in ARG. Poleg tega lahko določeni mikrobi preživijo zdravljenje z antibiotiki, ter tako razvijejo rezistenco v odsotnosti genetske mutacije. Del populacije namreč ob velikem številu prisotnih bakterij, lahko preživi sicer letalno koncentracijo. Uporaba antibiotikov pod to koncentracijo tako lahko pripomore k razvoju rezistence tako v klinični medicini, kot v pridelavi rastlin in vzrejanju živali.

===Načini preprečevanja===

Obstaja več možnih sodobnih načinov za razkuževanje vode, ki pa zaenkrat še niso dobro raziskani. Ti vključujejo klor, ozon in železov reagent in lahko inaktivirajo ARB in ARG. Radikal ·OH je glavni oksidant v železovem reagentu. V reakciji radikala s proteinom, se ta razcepi na fragmente, njegova visoka reaktivnost s komponentami DNA in RNA pa povzroči njihovo poškodbo. Inaktivacija bakterij med razkuževanjem ne pomeni nujno uničenja ARG. Da deaktiviramo ARG, potrebujemo tako dezinfekcijsko sredstvo, ki čim hitreje prodre celično membrano in pride do DNA, ne da bi se vmes vezal kam drugam. Nekatere študije so preučevale tudi pomen ultravijoličnega (UV) obsevanja in ga primerjala s kloriranjem. Odkrili so, da tako kloriranje, kot UV obsevanje ne uničita veliko ARG, medtem ko v kombinaciji skupaj lahko zelo učinkovito inaktivirata ARG. Primerjava med obema metodama je pokazala, da UV obsevanje direktno uniči plazmid, ki vsebuje ARG, celična membrana pa ostane nespremenjena. Klor pa skupaj z amonijevim ionom, ki je prisoten v vodi, tvori kloramin, ki poveča permeabilnost celične membrane. Kloriranje vode lahko tako celo prispeva k transferaciji ARG, UV obsevanje je tako lahko primernejša oblika dezinfekcije za kontrolo ARG transferacije.

==Viri==

Sengupta S., Chattopadhyay M. K., Grossart H. P., 2013, "The multifaceted roles of antibiotics and antibiotic resistance in nature." Front Microbiol. 12, 4-47.

Redfield, R. J., Beatty, J. T., 2019, “Gene Transfer Agents.” Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition): 370 – 377.

Fogg, P.C.M., 2019, “Identification and characterization of a direct activator of a gene transfer agent.”Nature Communications 10. Article number: 595.

Sharma, V.K. et al. (2016) A review of the influence of treatment strategies on antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes. Chemosphere 150, 702–714

Karkman, A. et al. (2018) Antibiotic-resistance genes in waste water. Trends Microbiol. 26, 220–228

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-12T19:21:17Z

Tevz Levstek:

==Pritisk na odpornost proti antibiotikom==

Leta 1928 je Alexander Fleming odkril penicilin, izredno učinkovit antibiotik, ki je v prvi polovici dvajsetega stoletja rešil mnogo življenj in bil masovno uporabljan. Toda hkrati z uporabo antibiotikov, se je začela tekma, saj so začeli nastajati na antibiotike odporni sevi bakterij. Več kot se je nekega antibiotika uporabljalo, več vrst bakterij je nanj razvilo odpornost. Dandanes se antibiotiki uporabljajo predvsem v zdravstvu ter živinoreji. Ker pa je uporaba mnogokrat nepreudarna in pretirana, se poraja skrb, ali bo razvoj na antibiotike odpornih bakterij prehitel razvoj novih antibiotikov. Strah ni neracionalen, saj se vlaganje v razvoj povsem inovativnih antibiotikov zmanjšuje.
Antibiotiki se v ogromnih količinah porabljajo pri masovni živinoreji za prehranjevalne potrebe človeške populacije. Tako se v iztrebkih, ki seveda vsebujejo ostanke antibiotikov, začne selektivni pritisk na bakterije, kjer se favorizirajo tiste z antibiotsko odpornostjo, oziroma geni zanjo. V veliki meri se živalski iztrebki uporabljajo kot gnojila pri pridelovanju rastlinske hrane, kjer obstaja možnost prenosa na antibiotike odpornih bakterij na hrano, kar poraja vprašanja o nevarnostih za javno zdravje.

==Vloga bakteriofagov pri širjenju odpornosti na antibiotike==

Bakteriofagi, bakterijski virusi, imajo dva poznana načina razmnoževanja oziroma delovanja. Prvi, najenostavnejši, je litični, kjer fag vbrizga svojo dednino v bakterijo, ta pa nato po vneseni informaciji izdela nove viruse, ki jih sprosti v okolje. Drugi, kompleksnejši način, je lizogen, kjer se virusna dednina vstavi v bakterijsko dednino. Ob aktivatorju (na primer stres) se virusna DNA prepisuje in prevaja, virus pa vstopi v litični cikel. Virusna dednina vsebuje informacije za beljakovinske komponente faga, replikaze, v posebnih in za to temo pomembnih primerih pa tudi bakterijske gene. Omenjeni bakterijski geni, ki se pojavljajo v dednini lizogenih fagov lahko kodirajo toksine, superantigene, T3SS (strukture, ki patogenim bakterijam omogočijo prenos škodljivih proteinov iz bakterijskega citosola direktno v gostiteljsko celico), proteine za pritrjanje na podlago (gostitelja) in gene, ki omogočajo odpornost na antibiotike. Iz napisanega je razvidno, da imajo sami fagi pomemben vpliv na širjenje patogenih in drugih človeku nevarnih lastnosti po bakterijski populaciji.
V resnici so fagi zelo pomembni za kontrolo bakterijskih populacij, pri biogeokemijskih procesih in pri samem evolucijskem razvoju bakterij. Kar 20 % genov vseh bakterij naj bi bilo pridobljenih na omenjen način lizogenega cikla, a vpliv fagov na razvoj bakterij sploh še ni dobro raziskan. Ko virus prenese svojo dednino, ki vključuje bakterijske gene, v bakterijski kromosom, lahko to ne pomeni za gostiteljsko bakterijo nobenih sprememb, lahko so te negativne ali pozitivne. Prek evolucijskih mehanizmov se pozitivne lastnosti pri podvojevanjih, prek plazmidov, pa tudi prek litičnega cikla hitro razširijo po populaciji. V primeru živinoreje se torej ob prisotnosti fagov, ki vsebujejo bakterijske gene za antibiotsko odpornost, število odpornih bakterij v živalskem gnoju hitro razširi zaradi antibiotskega pritiska na bakterije. Na antibiotike odporne bakterije lahko nato preko gnojenja in rastlinske hrane konzumirajo ljudje, kar predstavlja tveganje za javno zdravje, saj je tovrstne okužbe težko zdraviti (pomanjkanje delujočih antibiotikov). Iz napisanega je torej razvidno, da je za celovito borbo proti razširjanju antibiotske odpornosti med bakterijami ključnega pomena, da se razišče vloga fagov v evoluciji bakterij, v odnosih z bakterijskimi kulturami in bolj usmerjeno, pri prenašanju in razširjanju genov antibiotske odpornosti po bakterijskih populacijah.
Nadalje bo v seminarski nalogi opisan mehanizem in regulacija prenosa določenih bakterijskih genov (npr. nosijo gene za antibiotsko odpornost) v virusno dednino, ki se nato preko litičnega cikla lahko razširja po populaciji.

==Posredniki prenosa genov==

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo vršijo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga vršijo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

===Življenjski cikel PPG===

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

Nastanek PPG se začne s transkripcijo in translacijo PPG genov. Nastali deli morajo dozoreti, torej proteini se morajo ustrezno sestaviti v določen del PPG. Sledi polnjenje glav PPG, kar regulira poseben terminazni encimski kompleks. Ta zapolni vsako glavo do maksimalne dolžine DNA, ki se lahko vstavi in se nato premakne naprej do naslednje glave. Maksimalna dolžina je 4 – 14 kb, kar je odvisno od bakterije, v splošnem pa velja, da lahko glave istega organizma sprejmejo enako količino DNA. Fagi lahko za razliko od PPG sprejmejo večjo količino DNA in prenašajo gene, ki kodirajo za nastanek več fagov. Po pakiranju pride do sestavljanja glav in repov ter končne lize celice.

===Prenos dednega materiala===

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le eno verigo DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

==Voda kot glavni problem onesnaženosti==

Odpadna voda in rastline, ki jih obdelujejo z odpadno vodo, so lahko pravi rezervoar naravnih ponudnikov rezistence na antibiotike. So žarišče horizontalne transferacije genov, kar omogoča razširjanje genov za rezistenco na antibiotike (ARG) med bakterijami. Odpadna voda namreč vsebuje antibiotike, razkužila in kovine, ki lahko pripomorejo k antibiotični rezistenci že v nizkih koncentracijah. Bolnišnice predstavljajo zelo majhen del med viri antibiotikov, na antibiotike rezistentnih bakterij (ARB) in ARG. Zelo veliko jih vsebujejo tudi reke, na katerih poteka več raziskav in primerjav različnih ARG na večih delih reke. Občutljive bakterije lahko pridobijo gen za rezistenco preko transformacije, transdukcije ali konjugacije. Med pridobivanjem enega gena za rezistenco pa lahko v teh procesih bakterija sočasno pridobi tudi številne druge gene za rezistenco na druge antibiotike. Trenutno se za raziskave na tem področju najpogosteje uporabljajo metode, kot so kvantitativna PCR, metagenomika in funkcionalna metagenomika, razvoj novih metod pa konstantno prinaša nove možnosti za analizo ARG.
Pridobitev rezistence je lahko naraven prilagoditveni proces, do nje pride preko spontanih mutacij ali pa se razvije preko horizontalne transferacije gena, ki ga pridobi od donorja, npr. druga bakterija, fagi, ali prosta DNA. Torej lahko tudi nepatogene bakterije, ki vsebujejo ARG, služijo kot rezervoar za patogene bakterije. Predvsem, ko gre za patogene bakterije, pa predstavlja rezistenca globalen problem. Več kot ena miljarda ljudi živi v pomanjkanju pitne vode. Čiščenje vode poteka preko filtracije in kloriranja, a za vse bolj onesnaženo vodo v sedanjem času, to ni zadovoljivo, saj ostane mnogo ARG v vodi. Pitje onesnažene vode je tako zelo ogrožajoče za javno zdravje. Predvsem ostanki neporabljenih antibiotikov v vodi verjetno spodbujajo ARB in ARG. Poleg tega lahko določeni mikrobi preživijo zdravljenje z antibiotiki, ter tako razvijejo rezistenco v odsotnosti genetske mutacije. Del populacije namreč ob velikem številu prisotnih bakterij, lahko preživi sicer letalno koncentracijo. Uporaba antibiotikov pod to koncentracijo tako lahko pripomore k razvoju rezistence tako v klinični medicini, kot v pridelavi rastlin in vzrejanju živali.

===Načini preprečevanja===

Obstaja več možnih sodobnih načinov za razkuževanje vode, ki pa zaenkrat še niso dobro raziskani. Ti vključujejo klor, ozon in železov reagent in lahko inaktivirajo ARB in ARG. Radikal ·OH je glavni oksidant v železovem reagentu. V reakciji radikala s proteinom, se ta razcepi na fragmente, njegova visoka reaktivnost s komponentami DNA in RNA pa povzroči njihovo poškodbo. Inaktivacija bakterij med razkuževanjem ne pomeni nujno uničenja ARG. Da deaktiviramo ARG, potrebujemo tako dezinfekcijsko sredstvo, ki čim hitreje prodre celično membrano in pride do DNA, ne da bi se vmes vezal kam drugam. Nekatere študije so preučevale tudi pomen ultravijoličnega (UV) obsevanja in ga primerjala s kloriranjem. Odkrili so, da tako kloriranje, kot UV obsevanje ne uničita veliko ARG, medtem ko v kombinaciji skupaj lahko zelo učinkovito inaktivirata ARG. Primerjava med obema metodama je pokazala, da UV obsevanje direktno uniči plazmid, ki vsebuje ARG, celična membrana pa ostane nespremenjena. Klor pa skupaj z amonijevim ionom, ki je prisoten v vodi, tvori kloramin, ki poveča permeabilnost celične membrane. Kloriranje vode lahko tako celo prispeva k transferaciji ARG, UV obsevanje je tako lahko primernejša oblika dezinfekcije za kontrolo ARG transferacije.

==Viri==

Redfield, R. J., Beatty, J. T., 2019, “Gene Transfer Agents.” Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition): 370 – 377.

Fogg, P.C.M., 2019, “Identification and characterization of a direct activator of a gene transfer agent.”Nature Communications 10. Article number: 595.

Sharma, V.K. et al. (2016) A review of the influence of treatment strategies on antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes. Chemosphere 150, 702–714

Karkman, A. et al. (2018) Antibiotic-resistance genes in waste water. Trends Microbiol. 26, 220–228

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-12T19:20:56Z

Tevz Levstek:

==Pritisk na odpornost proti antibiotikom==

Leta 1928 je Alexander Fleming odkril penicilin, izredno učinkovit antibiotik, ki je v prvi polovici dvajsetega stoletja rešil mnogo življenj in bil masovno uporabljan. Toda hkrati z uporabo antibiotikov, se je začela tekma, saj so začeli nastajati na antibiotike odporni sevi bakterij. Več kot se je nekega antibiotika uporabljalo, več vrst bakterij je nanj razvilo odpornost. Dandanes se antibiotiki uporabljajo predvsem v zdravstvu ter živinoreji. Ker pa je uporaba mnogokrat nepreudarna in pretirana, se poraja skrb, ali bo razvoj na antibiotike odpornih bakterij prehitel razvoj novih antibiotikov. Strah ni neracionalen, saj se vlaganje v razvoj povsem inovativnih antibiotikov zmanjšuje.
Antibiotiki se v ogromnih količinah porabljajo pri masovni živinoreji za prehranjevalne potrebe človeške populacije. Tako se v iztrebkih, ki seveda vsebujejo ostanke antibiotikov, začne selektivni pritisk na bakterije, kjer se favorizirajo tiste z antibiotsko odpornostjo, oziroma geni zanjo. V veliki meri se živalski iztrebki uporabljajo kot gnojila pri pridelovanju rastlinske hrane, kjer obstaja možnost prenosa na antibiotike odpornih bakterij na hrano, kar poraja vprašanja o nevarnostih za javno zdravje.

==Vloga bakteriofagov pri širjenju rezistence==

Bakteriofagi, bakterijski virusi, imajo dva poznana načina razmnoževanja oziroma delovanja. Prvi, najenostavnejši, je litični, kjer fag vbrizga svojo dednino v bakterijo, ta pa nato po vneseni informaciji izdela nove viruse, ki jih sprosti v okolje. Drugi, kompleksnejši način, je lizogen, kjer se virusna dednina vstavi v bakterijsko dednino. Ob aktivatorju (na primer stres) se virusna DNA prepisuje in prevaja, virus pa vstopi v litični cikel. Virusna dednina vsebuje informacije za beljakovinske komponente faga, replikaze, v posebnih in za to temo pomembnih primerih pa tudi bakterijske gene. Omenjeni bakterijski geni, ki se pojavljajo v dednini lizogenih fagov lahko kodirajo toksine, superantigene, T3SS (strukture, ki patogenim bakterijam omogočijo prenos škodljivih proteinov iz bakterijskega citosola direktno v gostiteljsko celico), proteine za pritrjanje na podlago (gostitelja) in gene, ki omogočajo odpornost na antibiotike. Iz napisanega je razvidno, da imajo sami fagi pomemben vpliv na širjenje patogenih in drugih človeku nevarnih lastnosti po bakterijski populaciji.
V resnici so fagi zelo pomembni za kontrolo bakterijskih populacij, pri biogeokemijskih procesih in pri samem evolucijskem razvoju bakterij. Kar 20 % genov vseh bakterij naj bi bilo pridobljenih na omenjen način lizogenega cikla, a vpliv fagov na razvoj bakterij sploh še ni dobro raziskan. Ko virus prenese svojo dednino, ki vključuje bakterijske gene, v bakterijski kromosom, lahko to ne pomeni za gostiteljsko bakterijo nobenih sprememb, lahko so te negativne ali pozitivne. Prek evolucijskih mehanizmov se pozitivne lastnosti pri podvojevanjih, prek plazmidov, pa tudi prek litičnega cikla hitro razširijo po populaciji. V primeru živinoreje se torej ob prisotnosti fagov, ki vsebujejo bakterijske gene za antibiotsko odpornost, število odpornih bakterij v živalskem gnoju hitro razširi zaradi antibiotskega pritiska na bakterije. Na antibiotike odporne bakterije lahko nato preko gnojenja in rastlinske hrane konzumirajo ljudje, kar predstavlja tveganje za javno zdravje, saj je tovrstne okužbe težko zdraviti (pomanjkanje delujočih antibiotikov). Iz napisanega je torej razvidno, da je za celovito borbo proti razširjanju antibiotske odpornosti med bakterijami ključnega pomena, da se razišče vloga fagov v evoluciji bakterij, v odnosih z bakterijskimi kulturami in bolj usmerjeno, pri prenašanju in razširjanju genov antibiotske odpornosti po bakterijskih populacijah.
Nadalje bo v seminarski nalogi opisan mehanizem in regulacija prenosa določenih bakterijskih genov (npr. nosijo gene za antibiotsko odpornost) v virusno dednino, ki se nato preko litičnega cikla lahko razširja po populaciji.

==Posredniki prenosa genov==

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo vršijo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga vršijo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

===Življenjski cikel PPG===

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

Nastanek PPG se začne s transkripcijo in translacijo PPG genov. Nastali deli morajo dozoreti, torej proteini se morajo ustrezno sestaviti v določen del PPG. Sledi polnjenje glav PPG, kar regulira poseben terminazni encimski kompleks. Ta zapolni vsako glavo do maksimalne dolžine DNA, ki se lahko vstavi in se nato premakne naprej do naslednje glave. Maksimalna dolžina je 4 – 14 kb, kar je odvisno od bakterije, v splošnem pa velja, da lahko glave istega organizma sprejmejo enako količino DNA. Fagi lahko za razliko od PPG sprejmejo večjo količino DNA in prenašajo gene, ki kodirajo za nastanek več fagov. Po pakiranju pride do sestavljanja glav in repov ter končne lize celice.

===Prenos dednega materiala===

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le eno verigo DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

==Voda kot glavni problem onesnaženosti==

Odpadna voda in rastline, ki jih obdelujejo z odpadno vodo, so lahko pravi rezervoar naravnih ponudnikov rezistence na antibiotike. So žarišče horizontalne transferacije genov, kar omogoča razširjanje genov za rezistenco na antibiotike (ARG) med bakterijami. Odpadna voda namreč vsebuje antibiotike, razkužila in kovine, ki lahko pripomorejo k antibiotični rezistenci že v nizkih koncentracijah. Bolnišnice predstavljajo zelo majhen del med viri antibiotikov, na antibiotike rezistentnih bakterij (ARB) in ARG. Zelo veliko jih vsebujejo tudi reke, na katerih poteka več raziskav in primerjav različnih ARG na večih delih reke. Občutljive bakterije lahko pridobijo gen za rezistenco preko transformacije, transdukcije ali konjugacije. Med pridobivanjem enega gena za rezistenco pa lahko v teh procesih bakterija sočasno pridobi tudi številne druge gene za rezistenco na druge antibiotike. Trenutno se za raziskave na tem področju najpogosteje uporabljajo metode, kot so kvantitativna PCR, metagenomika in funkcionalna metagenomika, razvoj novih metod pa konstantno prinaša nove možnosti za analizo ARG.
Pridobitev rezistence je lahko naraven prilagoditveni proces, do nje pride preko spontanih mutacij ali pa se razvije preko horizontalne transferacije gena, ki ga pridobi od donorja, npr. druga bakterija, fagi, ali prosta DNA. Torej lahko tudi nepatogene bakterije, ki vsebujejo ARG, služijo kot rezervoar za patogene bakterije. Predvsem, ko gre za patogene bakterije, pa predstavlja rezistenca globalen problem. Več kot ena miljarda ljudi živi v pomanjkanju pitne vode. Čiščenje vode poteka preko filtracije in kloriranja, a za vse bolj onesnaženo vodo v sedanjem času, to ni zadovoljivo, saj ostane mnogo ARG v vodi. Pitje onesnažene vode je tako zelo ogrožajoče za javno zdravje. Predvsem ostanki neporabljenih antibiotikov v vodi verjetno spodbujajo ARB in ARG. Poleg tega lahko določeni mikrobi preživijo zdravljenje z antibiotiki, ter tako razvijejo rezistenco v odsotnosti genetske mutacije. Del populacije namreč ob velikem številu prisotnih bakterij, lahko preživi sicer letalno koncentracijo. Uporaba antibiotikov pod to koncentracijo tako lahko pripomore k razvoju rezistence tako v klinični medicini, kot v pridelavi rastlin in vzrejanju živali.

===Načini preprečevanja===

Obstaja več možnih sodobnih načinov za razkuževanje vode, ki pa zaenkrat še niso dobro raziskani. Ti vključujejo klor, ozon in železov reagent in lahko inaktivirajo ARB in ARG. Radikal ·OH je glavni oksidant v železovem reagentu. V reakciji radikala s proteinom, se ta razcepi na fragmente, njegova visoka reaktivnost s komponentami DNA in RNA pa povzroči njihovo poškodbo. Inaktivacija bakterij med razkuževanjem ne pomeni nujno uničenja ARG. Da deaktiviramo ARG, potrebujemo tako dezinfekcijsko sredstvo, ki čim hitreje prodre celično membrano in pride do DNA, ne da bi se vmes vezal kam drugam. Nekatere študije so preučevale tudi pomen ultravijoličnega (UV) obsevanja in ga primerjala s kloriranjem. Odkrili so, da tako kloriranje, kot UV obsevanje ne uničita veliko ARG, medtem ko v kombinaciji skupaj lahko zelo učinkovito inaktivirata ARG. Primerjava med obema metodama je pokazala, da UV obsevanje direktno uniči plazmid, ki vsebuje ARG, celična membrana pa ostane nespremenjena. Klor pa skupaj z amonijevim ionom, ki je prisoten v vodi, tvori kloramin, ki poveča permeabilnost celične membrane. Kloriranje vode lahko tako celo prispeva k transferaciji ARG, UV obsevanje je tako lahko primernejša oblika dezinfekcije za kontrolo ARG transferacije.

==Viri==

Redfield, R. J., Beatty, J. T., 2019, “Gene Transfer Agents.” Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition): 370 – 377.

Fogg, P.C.M., 2019, “Identification and characterization of a direct activator of a gene transfer agent.”Nature Communications 10. Article number: 595.

Sharma, V.K. et al. (2016) A review of the influence of treatment strategies on antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes. Chemosphere 150, 702–714

Karkman, A. et al. (2018) Antibiotic-resistance genes in waste water. Trends Microbiol. 26, 220–228

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-12T19:17:47Z

Tevz Levstek:

==Pritisk na odpornost proti antibiotikom==

Leta 1928 je Alexander Fleming odkril penicilin, izredno učinkovit antibiotik, ki je v prvi polovici dvajsetega stoletja rešil mnogo življenj in bil masovno uporabljan. Toda hkrati z uporabo antibiotikov, se je začela tekma, saj so začeli nastajati na antibiotike odporni sevi bakterij. Več kot se je nekega antibiotika uporabljalo, več vrst bakterij je nanj razvilo odpornost. Dandanes se antibiotiki uporabljajo predvsem v zdravstvu ter živinoreji. Ker pa je uporaba mnogokrat nepreudarna in pretirana, se poraja skrb, ali bo razvoj na antibiotike odpornih bakterij prehitel razvoj novih antibiotikov. Strah ni neracionalen, saj se vlaganje v razvoj povsem inovativnih antibiotikov zmanjšuje.
Antibiotiki se v ogromnih količinah porabljajo pri masovni živinoreji za prehranjevalne potrebe človeške populacije. Tako se v iztrebkih, ki seveda vsebujejo ostanke antibiotikov, začne selektivni pritisk na bakterije, kjer se favorizirajo tiste z antibiotsko odpornostjo, oziroma geni zanjo. V veliki meri se živalski iztrebki uporabljajo kot gnojila pri pridelovanju rastlinske hrane, kjer obstaja možnost prenosa na antibiotike odpornih bakterij na hrano, kar poraja vprašanja o nevarnostih za javno zdravje.

==Vloga bakteriofagov pri širjenju rezistence==

Bakteriofagi, bakterijski virusi, imajo dva poznana načina razmnoževanja oziroma delovanja. Prvi, najenostavnejši, je litični, kjer fag vbrizga svojo dednino v bakterijo, ta pa nato po vneseni informaciji izdela nove viruse, ki jih sprosti v okolje. Drugi, kompleksnejši način, je lizogen, kjer se virusna dednina vstavi v bakterijsko dednino. Ob aktivatorju (na primer stres) se virusna DNA prepisuje in prevaja, virus pa vstopi v litični cikel. Virusna dednina vsebuje informacije za beljakovinske komponente faga, replikaze, v posebnih in za to temo pomembnih primerih pa tudi bakterijske gene. Omenjeni bakterijski geni, ki se pojavljajo v dednini lizogenih fagov lahko kodirajo toksine, superantigene, T3SS (strukture, ki patogenim bakterijam omogočijo prenos škodljivih proteinov iz bakterijskega citosola direktno v gostiteljsko celico), proteine za pritrjanje na podlago (gostitelja) in gene, ki omogočajo rezistenco na antibiotike. Iz napisanega je razvidno, da imajo sami fagi pomemben vpliv na širjenje patogenih in drugih človeku nevarnih lastnosti po bakterijski populaciji.
V resnici so fagi zelo pomembni za kontrolo bakterijskih populacij, pri biogeokemijskih procesih in pri samem evolucijskem razvoju bakterij. Kar 20 % genov vseh bakterij naj bi bilo pridobljenih na omenjen način lizogenega cikla, a vpliv fagov na razvoj bakterij sploh še ni dobro raziskan. Ko virus prenese svojo dednino, ki vključuje bakterijske gene, v bakterijski kromosom, lahko to ne pomeni za gostiteljsko bakterijo nobenih sprememb, lahko so te negativne ali pozitivne. Prek evolucijskih mehanizmov se pozitivne lastnosti pri podvojevanjih, prek plazmidov, pa tudi prek litičnega cikla hitro razširijo po populaciji. V primeru živinoreje se torej ob prisotnosti fagov, ki vsebujejo rezistentne bakterijske gene, rezistentnost bakterij v živalskem gnoju hitro razširi zaradi antibiotskega pritiska na bakterije. Rezistentne bakterije lahko nato preko gnojenja in rastlinske hrane konzumirajo ljudje, kar predstavlja tveganje za javno zdravje, saj je tovrstne okužbe težko zdraviti (pomanjkanje delujočih antibiotikov). Iz napisanega je torej razvidno, da je za celovito borbo proti razširjanju antibiotske rezistence med bakterijami ključnega pomena, da se razišče vloga fagov v evoluciji bakterij, v odnosih z bakterijskimi kulturami in bolj usmerjeno, pri prenašanju in razširjanju genov rezistence po bakterijskih populacijah.
Nadalje bo v seminarski nalogi opisan mehanizem in regulacija prenosa določenih bakterijskih genov (npr. nosijo gene za rezistentnost) v virusno dednino, ki se nato preko litičnega cikla lahko razširja po populaciji.

==Posredniki prenosa genov==

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo vršijo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga vršijo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

===Življenjski cikel PPG===

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

Nastanek PPG se začne s transkripcijo in translacijo PPG genov. Nastali deli morajo dozoreti, torej proteini se morajo ustrezno sestaviti v določen del PPG. Sledi polnjenje glav PPG, kar regulira poseben terminazni encimski kompleks. Ta zapolni vsako glavo do maksimalne dolžine DNA, ki se lahko vstavi in se nato premakne naprej do naslednje glave. Maksimalna dolžina je 4 – 14 kb, kar je odvisno od bakterije, v splošnem pa velja, da lahko glave istega organizma sprejmejo enako količino DNA. Fagi lahko za razliko od PPG sprejmejo večjo količino DNA in prenašajo gene, ki kodirajo za nastanek več fagov. Po pakiranju pride do sestavljanja glav in repov ter končne lize celice.

===Prenos dednega materiala===

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le eno verigo DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

==Voda kot glavni problem onesnaženosti==

Odpadna voda in rastline, ki jih obdelujejo z odpadno vodo, so lahko pravi rezervoar naravnih ponudnikov rezistence na antibiotike. So žarišče horizontalne transferacije genov, kar omogoča razširjanje genov za rezistenco na antibiotike (ARG) med bakterijami. Odpadna voda namreč vsebuje antibiotike, razkužila in kovine, ki lahko pripomorejo k antibiotični rezistenci že v nizkih koncentracijah. Bolnišnice predstavljajo zelo majhen del med viri antibiotikov, na antibiotike rezistentnih bakterij (ARB) in ARG. Zelo veliko jih vsebujejo tudi reke, na katerih poteka več raziskav in primerjav različnih ARG na večih delih reke. Občutljive bakterije lahko pridobijo gen za rezistenco preko transformacije, transdukcije ali konjugacije. Med pridobivanjem enega gena za rezistenco pa lahko v teh procesih bakterija sočasno pridobi tudi številne druge gene za rezistenco na druge antibiotike. Trenutno se za raziskave na tem področju najpogosteje uporabljajo metode, kot so kvantitativna PCR, metagenomika in funkcionalna metagenomika, razvoj novih metod pa konstantno prinaša nove možnosti za analizo ARG.
Pridobitev rezistence je lahko naraven prilagoditveni proces, do nje pride preko spontanih mutacij ali pa se razvije preko horizontalne transferacije gena, ki ga pridobi od donorja, npr. druga bakterija, fagi, ali prosta DNA. Torej lahko tudi nepatogene bakterije, ki vsebujejo ARG, služijo kot rezervoar za patogene bakterije. Predvsem, ko gre za patogene bakterije, pa predstavlja rezistenca globalen problem. Več kot ena miljarda ljudi živi v pomanjkanju pitne vode. Čiščenje vode poteka preko filtracije in kloriranja, a za vse bolj onesnaženo vodo v sedanjem času, to ni zadovoljivo, saj ostane mnogo ARG v vodi. Pitje onesnažene vode je tako zelo ogrožajoče za javno zdravje. Predvsem ostanki neporabljenih antibiotikov v vodi verjetno spodbujajo ARB in ARG. Poleg tega lahko določeni mikrobi preživijo zdravljenje z antibiotiki, ter tako razvijejo rezistenco v odsotnosti genetske mutacije. Del populacije namreč ob velikem številu prisotnih bakterij, lahko preživi sicer letalno koncentracijo. Uporaba antibiotikov pod to koncentracijo tako lahko pripomore k razvoju rezistence tako v klinični medicini, kot v pridelavi rastlin in vzrejanju živali.

===Načini preprečevanja===

Obstaja več možnih sodobnih načinov za razkuževanje vode, ki pa zaenkrat še niso dobro raziskani. Ti vključujejo klor, ozon in železov reagent in lahko inaktivirajo ARB in ARG. Radikal ·OH je glavni oksidant v železovem reagentu. V reakciji radikala s proteinom, se ta razcepi na fragmente, njegova visoka reaktivnost s komponentami DNA in RNA pa povzroči njihovo poškodbo. Inaktivacija bakterij med razkuževanjem ne pomeni nujno uničenja ARG. Da deaktiviramo ARG, potrebujemo tako dezinfekcijsko sredstvo, ki čim hitreje prodre celično membrano in pride do DNA, ne da bi se vmes vezal kam drugam. Nekatere študije so preučevale tudi pomen ultravijoličnega (UV) obsevanja in ga primerjala s kloriranjem. Odkrili so, da tako kloriranje, kot UV obsevanje ne uničita veliko ARG, medtem ko v kombinaciji skupaj lahko zelo učinkovito inaktivirata ARG. Primerjava med obema metodama je pokazala, da UV obsevanje direktno uniči plazmid, ki vsebuje ARG, celična membrana pa ostane nespremenjena. Klor pa skupaj z amonijevim ionom, ki je prisoten v vodi, tvori kloramin, ki poveča permeabilnost celične membrane. Kloriranje vode lahko tako celo prispeva k transferaciji ARG, UV obsevanje je tako lahko primernejša oblika dezinfekcije za kontrolo ARG transferacije.

==Viri==

Redfield, R. J., Beatty, J. T., 2019, “Gene Transfer Agents.” Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition): 370 – 377.

Fogg, P.C.M., 2019, “Identification and characterization of a direct activator of a gene transfer agent.”Nature Communications 10. Article number: 595.

Sharma, V.K. et al. (2016) A review of the influence of treatment strategies on antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes. Chemosphere 150, 702–714

Karkman, A. et al. (2018) Antibiotic-resistance genes in waste water. Trends Microbiol. 26, 220–228

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-11T20:48:17Z

Tevz Levstek:

'''Tevž Levstek''': Pritisk na antibiotsko rezistenco in vloga bakteriofagov pri širjenju rezistence

'''Žan Fortuna''': Posredniki prenosa genov, njihov življenjski cikel in vnos dednega materiala

Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

2020-05-11T20:46:48Z

Tevz Levstek:

==Pritisk na antibiotsko rezistenco==

Leta 1928 je Alexander Fleming odkril penicilin, izredno učinkovit antibiotik, ki je v prvi polovici dvajsetega stoletja rešil mnogo življenj in bil masovno uporabljan. Toda hkrati z uporabo antibiotikov, se je začela tekma, saj so začeli nastajati na antibiotike rezistentni sevi bakterij. Več kot se je nekega antibiotika uporabljalo, več vrst bakterij je nanj razvilo rezistentnost. Dandanes se antibiotiki uporabljajo predvsem v zdravstvu ter živinoreji. Ker pa je uporaba mnogokrat nepreudarna in pretirana se poraja skrb, ali bo razvoj rezistentnih bakterij prehitel razvoj novih antibiotikov. Strah ni neracionalen, saj se vlaganje v razvoj povsem inovativnih antibiotikov zmanjšuje.
Antibiotiki se v ogromnih količinah porabljajo pri masovni živinoreji za prehranjevalne potrebe človeške populacije. Tako se v iztrebkih, ki seveda vsebujejo ostanke antibiotikov, začne selektivni pritisk na bakterije, kjer se favorizirajo tiste z rezistenco, oziroma geni za rezistenco. V veliki meri se živalski iztrebki uporabljajo kot gnojila pri pridelovanju rastlinske hrane, kjer obstaja možnost prenosa rezistentnih bakterij na hrano, kar poraja vprašanja o nevarnostih za javno zdravje.

==Vloga bakteriofagov pri širjenju rezistence==

Bakteriofagi, bakterijski virusi, imajo dva poznana načina razmnoževanja oziroma delovanja. Prvi, najenostavnejši, je litični, kjer fag vbrizga svojo dednino v bakterijo, ta pa nato po vneseni informaciji izdela nove viruse, ki jih sprosti v okolje. Drugi, kompleksnejši način, je lizogen, kjer se virusna dednina vstavi v bakterijsko dednino. Ob aktivatorju (na primer stres) se virusna DNA prepisuje in prevaja, virus pa vstopi v litični cikel. Virusna dednina vsebuje informacije za beljakovinske komponente faga, replikaze, v posebnih in za to temo pomembnih primerih pa tudi bakterijske gene. Omenjeni bakterijski geni, ki se pojavljajo v dednini lizogenih fagov lahko kodirajo toksine, superantigene, T3SS (strukture, ki patogenim bakterijam omogočijo prenos škodljivih proteinov iz bakterijskega citosola direktno v gostiteljsko celico), proteine za pritrjanje na podlago (gostitelja) in gene, ki omogočajo rezistenco na antibiotike. Iz napisanega je razvidno, da imajo sami fagi pomemben vpliv na širjenje patogenih in drugih človeku nevarnih lastnosti po bakterijski populaciji.
V resnici so fagi zelo pomembni za kontrolo bakterijskih populacij, pri biogeokemijskih procesih in pri samem evolucijskem razvoju bakterij. Kar 20 % genov vseh bakterij naj bi bilo pridobljenih na omenjen način lizogenega cikla, a vpliv fagov na razvoj bakterij sploh še ni dobro raziskan. Ko virus prenese svojo dednino, ki vključuje bakterijske gene, v bakterijski kromosom, lahko to ne pomeni za gostiteljsko bakterijo nobenih sprememb, lahko so te negativne ali pozitivne. Prek evolucijskih mehanizmov se pozitivne lastnosti pri podvojevanjih, prek plazmidov, pa tudi prek litičnega cikla hitro razširijo po populaciji. V primeru živinoreje se torej ob prisotnosti fagov, ki vsebujejo rezistentne bakterijske gene, rezistentnost bakterij v živalskem gnoju hitro razširi zaradi antibiotskega pritiska na bakterije. Rezistentne bakterije lahko nato preko gnojenja in rastlinske hrane konzumirajo ljudje, kar predstavlja tveganje za javno zdravje, saj je tovrstne okužbe težko zdraviti (pomanjkanje delujočih antibiotikov). Iz napisanega je torej razvidno, da je za celovito borbo proti razširjanju antibiotske rezistence med bakterijami ključnega pomena, da se razišče vloga fagov v evoluciji bakterij, v odnosih z bakterijskimi kulturami in bolj usmerjeno, pri prenašanju in razširjanju genov rezistence po bakterijskih populacijah.
Nadalje bo v seminarski nalogi opisan mehanizem in regulacija prenosa določenih bakterijskih genov (npr. nosijo gene za rezistentnost) v virusno dednino, ki se nato preko litičnega cikla lahko razširja po populaciji.

==Posredniki prenosa genov==

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo vršijo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga vršijo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

===Življenjski cikel PPG===

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

Nastanek PPG se začne s transkripcijo in translacijo PPG genov. Nastali deli morajo dozoreti, torej proteini se morajo ustrezno sestaviti v določen del PPG. Sledi polnjenje glav PPG, kar regulira poseben terminazni encimski kompleks. Ta zapolni vsako glavo do maksimalne dolžine DNA, ki se lahko vstavi in se nato premakne naprej do naslednje glave. Maksimalna dolžina je 4 – 14 kb, kar je odvisno od bakterije, v splošnem pa velja, da lahko glave istega organizma sprejmejo enako količino DNA. Fagi lahko za razliko od PPG sprejmejo večjo količino DNA in prenašajo gene, ki kodirajo za nastanek več fagov. Po pakiranju pride do sestavljanja glav in repov ter končne lize celice.

===Prenos dednega materiala===

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le eno verigo DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

===Voda kot glavni problem onesnaženosti===

Odpadna voda in rastline, ki jih obdelujejo z odpadno vodo, so lahko pravi rezervoar naravnih ponudnikov rezistence na antibiotike. So žarišče horizontalne transferacije genov, kar omogoča razširjanje genov za rezistenco na antibiotike (ARG) med bakterijami. Odpadna voda namreč vsebuje antibiotike, razkužila in kovine, ki lahko pripomorejo k antibiotični rezistenci že v nizkih koncentracijah. Bolnišnice predstavljajo zelo majhen del med viri antibiotikov, na antibiotike rezistentnih bakterij (ARB) in ARG. Zelo veliko jih vsebujejo tudi reke, na katerih poteka več raziskav in primerjav različnih ARG na večih delih reke. Občutljive bakterije lahko pridobijo gen za rezistenco preko transformacije, transdukcije ali konjugacije. Med pridobivanjem enega gena za rezistenco pa lahko v teh procesih bakterija sočasno pridobi tudi številne druge gene za rezistenco na druge antibiotike. Trenutno se za raziskave na tem področju najpogosteje uporabljajo metode, kot so kvantitativna PCR, metagenomika in funkcionalna metagenomika, razvoj novih metod pa konstantno prinaša nove možnosti za analizo ARG.
Pridobitev rezistence je lahko naraven prilagoditveni proces, do nje pride preko spontanih mutacij ali pa se razvije preko horizontalne transferacije gena, ki ga pridobi od donorja, npr. druga bakterija, fagi, ali prosta DNA. Torej lahko tudi nepatogene bakterije, ki vsebujejo ARG, služijo kot rezervoar za patogene bakterije. Predvsem, ko gre za patogene bakterije, pa predstavlja rezistenca globalen problem. Več kot ena miljarda ljudi živi v pomanjkanju pitne vode. Čiščenje vode poteka preko filtracije in kloriranja, a za vse bolj onesnaženo vodo v sedanjem času, to ni zadovoljivo, saj ostane mnogo ARG v vodi. Pitje onesnažene vode je tako zelo ogrožajoče za javno zdravje. Predvsem ostanki neporabljenih antibiotikov v vodi verjetno spodbujajo ARB in ARG. Poleg tega lahko določeni mikrobi preživijo zdravljenje z antibiotiki, ter tako razvijejo rezistenco v odsotnosti genetske mutacije. Del populacije namreč ob velikem številu prisotnih bakterij, lahko preživi sicer letalno koncentracijo. Uporaba antibiotikov pod to koncentracijo tako lahko pripomore k razvoju rezistence tako v klinični medicini, kot v pridelavi rastlin in vzrejanju živali.

===Načini preprečevanja===

Obstaja več možnih sodobnih načinov za razkuževanje vode, ki pa zaenkrat še niso dobro raziskani. Ti vključujejo klor, ozon in železov reagent in lahko inaktivirajo ARB in ARG. Radikal ·OH je glavni oksidant v železovem reagentu. V reakciji radikala s proteinom, se ta razcepi na fragmente, njegova visoka reaktivnost s komponentami DNA in RNA pa povzroči njihovo poškodbo. Inaktivacija bakterij med razkuževanjem ne pomeni nujno uničenja ARG. Da deaktiviramo ARG, potrebujemo tako dezinfekcijsko sredstvo, ki čim hitreje prodre celično membrano in pride do DNA, ne da bi se vmes vezal kam drugam. Nekatere študije so preučevale tudi pomen ultravijoličnega (UV) obsevanja in ga primerjala s kloriranjem. Odkrili so, da tako kloriranje, kot UV obsevanje ne uničita veliko ARG, medtem ko v kombinaciji skupaj lahko zelo učinkovito inaktivirata ARG. Primerjava med obema metodama je pokazala, da UV obsevanje direktno uniči plazmid, ki vsebuje ARG, celična membrana pa ostane nespremenjena. Klor pa skupaj z amonijevim ionom, ki je prisoten v vodi, tvori kloramin, ki poveča permeabilnost celične membrane. Kloriranje vode lahko tako celo prispeva k transferaciji ARG, UV obsevanje je tako lahko primernejša oblika dezinfekcije za kontrolo ARG transferacije.

==Viri==

Redfield, R. J., Beatty, J. T., 2019, “Gene Transfer Agents.” Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition): 370 – 377.

Fogg, P.C.M., 2019, “Identification and characterization of a direct activator of a gene transfer agent.”Nature Communications 10. Article number: 595.

Sharma, V.K. et al. (2016) A review of the influence of treatment strategies on antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes. Chemosphere 150, 702–714

Karkman, A. et al. (2018) Antibiotic-resistance genes in waste water. Trends Microbiol. 26, 220–228

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

BIO2 Seminar 2019

2019-10-18T20:13:57Z

Tevz Levstek:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Glicinski transporterji kot terapevtske tarče] || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Nika Vegelj
| 12 || || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 || || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2019

2019-10-18T20:08:05Z

Tevz Levstek:

== Kim Glavič: ATP KOT SIGNALNA MOLEKULA ŽIVALI IN RASTLIN ==

Molekula ATP ni le temeljni vir energije za mnoge procese v celici, temveč tudi signalna molekula v zunajceličnem matriksu živali in rastlin. ATP, kot velika polarna molekula, se iz celic rastlin izloči s pomočjo eksocitotskih veziklov ali ATP prenašalcev. Iz živalskih celic pa s pomočjo eksocitotskih veziklov, ATP prenašalcev ali koneksonskih hemikanalčkov. Ob povečanih koncentracijah molekul ATP v zunajceličnem matriksu se te vežejo na ustrezne P2- receptorje. Po sprostitvi nazaj v matriks pa njihovo koncentracijo uravnavajo ekto-nukleotidaze. Na splošno aktivacija P2- receptorjev povzroči povišanje koncentracije kalcijevih ionov in dušikovega monoksida v citosolu celice ter nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti v zunajceličnem matriksu. Kalcijevi ioni, dušikov monoksid in reaktivne kisikove zvrsti so sekundarni obveščevalci, ki so ključni za fiziološki odziv celice. Rastlinska ATP-signalizacija ima pomembno vlogo pri časovni regulaciji kalitve cvetnega prahu, rasti pelodne cevke, nastanku koreninskih gomoljev in zaznavanju ter posledično izogibanju oviram pri rasti korenin. Živalska ATP-signalizacija sodeluje pri nastanku imunskega odziva, prenosu živčnih signalov, celični smrti in regulaciji mnogih drugih procesov.

== Tevž Levstek: GLICINSKI TRANSPORTERJI KOT TERAPEVTSKE TARČE ==

Glicin je proteinogena aminokislina, ki opravlja tudi funkcijo signalne molekule, natančneje nevrotransmiterja. Najdemo ga v dveh vrstah sinaps: glicinergičnih, kjer je glavni nevrotransmiter in glutamatergičnih, kjer ima pomožno vlogo, saj pomaga glutamatu pri signaliziranju. Koncentracije glicina v medceličnini regulirajo glicinski transporterji, ki jih delimo na GlyT1 in GlyT2. Glicinergična sinapsa je inhibitorna, kar pomeni, da če glicin aktivira svoj receptor, posinaptično celico hiperpolarizira (še poveča raven kloridnih ionov v njej). V tej sinapsi GlyT1 zmanjšuje koncentracijo glicina, saj ga transportira v okoliške glia celice. GlyT2 po drugi strani pa zvišuje koncentracijo glicina, saj zbira razpršen glicin, ga reciklira in omogoči ponovno usmerjeno pošiljanje proti receptorjem. V glutamatergičnih sinapsah pa je glicin skupaj z glutamatom ekscitatorna signalna molekula. Če se glicin veže na protein NMDA, ki je na posinaptični membrani, mu s pozitivno alosterično modifikacijo olajša vezavo z glutamatom, ki odpre kationski kanalček in depolarizira celico. Tu regulira koncentracijo glicina le GlyT1, ki jo zmanjšuje, GlyT2 pa tu ne nastopa. Razumevanje delovanja obeh sinaps nam lahko omogoči sintezo novih zdravil, ki bi bolj učinkovito delovala proti nekaterim duševnim boleznim kot so shizofrenija, alkoholizem, obsesivno-kompulzivna motnja in še precej drugim. Ta zdravila najpogosteje inhibirajo delovanje GlyT1 in imajo veliko uspešnost pri glodalcih. Pri ljudeh pa na žalost še ni bilo dobrih rezultatov in na razvoj tovrstnega zdravila še čakamo.

BIO2 Seminar 2019

2019-10-18T19:38:05Z

Tevz Levstek:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || Glicinski transporterji kot terapevtske tarče || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Nika Vegelj
| 12 || || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 || || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2019 Povzetki seminarjev

2019-03-19T18:07:52Z

Tevz Levstek:

=== Maja Kolar: Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih ===
Nevroni spadajo med najbolj polarizirane celice v naravi. To jim omogoča oblikovanje različnih lokaliziranih struktur, kot so akson in dendriti. Možgansko skorjo sestavljajo kortikalni nevroni, v katerih se oblike mitohondrijev razlikujejo glede na lokacijo; v dendritih in somi so dolge, cevaste oblike, medtem ko so v izrastkih aksona veliko krajši in kroglasti. Majhnost aksonskih mitohondrijev je povezana predvsem s fizijo oz. binarno cepitvijo, ki poteka prek oligomerizacije Drp1 proteina iz skupine dinaminov zunanji membrani. Ker je Drp1 citoplazemski protein, se z mitohondrijsko zunanjo membrano veže prek 4 različnih receptorjev, nevroznanstveniki Univerze v Columbiji, Lewis in sodelavci, pa so raziskovali predvsem receptor MFF (ang. mitochondrial fission factor), saj je v kortikalnih nevronih najpogostejši. Ekspresijo MFF gena so Lewis in sodelavci zavirali prek uporabe shRNA (ang. short hairpin RNA) ki je umetno izdelan RNA in se uporablja za RNA posege pri zaviranju ekspresije tarčnih genov. Z raziskavo so dokazali, da MFF nima znatnega vpliva na membranski potencial mitohondrijev in na njihovo skupno sposobnost pridelave ATP, je pa z zmanjšanim delovanjem izrazito vplival na povečanje presinaptičnih mitohondrijev. To je povečalo mitohondrijsko sposobnost absorpcije Ca2+ ionov med nevrotransmisijo, kar je vodilo do zmanjšanega presinaptičnega citoplazemskega kopičenja Ca2+. Posledično se je zmanjšalo sproščanje nevrotransmitorjev v sinaptično špranjo, zmanjšala aksonska razvejanost v možganih in oslabila medsebojna povezanost nevronov.

=== Timotej Zgonik: Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način ===
Že dolgo časa v biokemiji obstaja problem, kako so iz akiralnih molekul nastali kiralni komplesksi, saj je pri eksperimentih vedno bilo treba dodati kiralni center, da so se ostale molekule pravilno zvile. Raziskovalci Tehnološkega inštituta v Georgiji so izvedli tri eksperimente, ki so demonstrirali tvorbo homokiralnih struktur iz akiralnih komponent. V prvem eksperimentu so pripravili raztopino triaminopirimidina (TAP) in 6-(2,4,6-triokso-1,3,5-triazinan-1-il)heksanojske kisline (CyCo6). Spojini sta se povezali v heksamerne rozete, te pa so se nalagale v stolpiče tako leve in desne kiralnosti. Ko so v drugem eksperimentu v raztopini zamenjali CyCo6 z analogno, a kiralno spojino, je bila kiralnost vseh posledično nastalih struktur enaka. Tudi če je bila le vsaka tisoča molekula CyCo6 zamenjana s kiralnim analogom, so bile strukture še vedno homokiralne. Enako je veljalo tudi, če sta bila v raztopini prisotna enantiomera obeh kiralnosti, a je bil eden v rahlem presežku. Pri tretjem poskusu so rezultate uspeli ponoviti tudi za organske spojine, ki bi na Zemlji lahko bile prisotne pred nastankom življenja, čeprav je bil pri tem bil učinek ojačitve kiralnosti šibkejši, enantiomerski presežek, potreben za homokiralnost, pa večji. Vendarle gre pri tem za prvi primer, ko so spontano nastali analogi nukleotidov povzročili tvorbo homokiralnih struktur.

=== Nina Varda: Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano ===
Proteini in nukleinske kisline so ključne za delovanje živih organizmov. Zanje je značilno, da se zvijejo v posebne konformacije, ki določajo njihove funkcije. A načrt po katerem bi se makromolekule zvijale še ni bil odkrit. Tako se je razvilo področje raziskovanja foldamerov (sintetičnih oligomerov, ki se zvijajo v sekundarne in terciarne strukture npr. v vijačnice in plošče). Otto in sodelavci so v svoji raziskavi predstavili kompleksno molekulo, ki lahko nastane spontano. Iz gradnika, ki ga sestavljata aminokislinska in adeninska podenota, so pridobili makrocikel iz 15 gradnikov. 15mer se je tako v kristalni obliki, kot tudi v raztopini zvil, zaradi nekovalentnih interakcij med gradniki. Najbolj opazen strukturni motiv je nalaganje aromatskih obročev v kupe (sekundarne strukture). Ena molekula se zvije v 5 kupov, pri čemer je vsak sestavljen iz treh fenilnih obročev in dveh adeninskih obročev. Ker so kupi med sabo orientirani, je prisotna tudi terciarna struktura. Pri nekaterih foldamerih so že bile odkrite katalitske in inhibitorne lastnosti. Ker so foldameri, ki so zaradi svoje terciarne zgradbe relativno kompleksni, sposobni spontanega nastanka, je možno, da so se pojavili in imeli pomembno vlogo že v zgodnjih fazah nastanka življenja.

===Anja Konjc: Nanodelci v boju proti raku===

Nanodelci postajajo čedalje pomembnejši pri razvoju zdravil, saj imajo določene posebnosti, ki omogočajo tarčno usmerjanje zdravil in zmanjševanje njihovih stranskih učinkov (npr. pri kemoterapiji). Vendar so predhodne raziskave pokazale določene pomanjkljivosti. S sintezo posebnega ščita, imenovanega proteinski koronski ščit (PCS), so raziskovalci rešili te omejitve. Ugotovili so namreč, da PCS zmanjša interakcije nanodelcev s serumskimi proteini in omogoči, da makrofagi teh delcev ne fagocitirajo. Tako nanodelci ostanejo več časa v krvi in prenesejo zdravila na ciljno mesto (npr. v tumorje). Nanodelci so namreč sposobni prenašati sorazmerno velike količine molekul (npr. zdravil), ki jih vstavimo v njihove pore. Znanstveniki so PCS sintetizirali tako, da so nanodelce prevlekli s posebnimi proteini. Obnašanje tako prevlečenih nanodelcev so opazovali z različnimi poskusi. Ko so mišim vbrizgali različne nanodelce, so ugotovili, da so se v tumorjih najbolj nakopičili tisti s PCS. To je dokazalo hipotezo, da lahko ti nanodelci uspešno prinesejo zdravila v tumorje, ne da bi pri tem prišlo do imunskega odziva, torej fagocitoze delcev. Zato bodo tudi v prihodnje nanodelci s PCS imeli pomembno vlogo pri zdravljenju različnih obolenj, ne le rakavih, saj povečujejo učinkovitost zdravljenja.

=== Oskar Nemec: Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr ===
Ustanovi Johns Hopkins Medicine in Sheppard Pratt Health System sta izvedli raziskavo, ki je pokazala, da imajo ljudje s shizofrenijo povečano količino protiteles proti virusu Epstein-Barr (VEB). Gre za herpesvirus, ki lahko povzroči infekcijsko mononukleozo. Za povečan imunski odziv je morda krivo dejstvo, da shizofrenija spremeni imunski sistem pacientov in jih naredi bolj občutljive na virus ali pa okužba poveča tveganje za izoblikovanje shizofrenije. Študijo so izvedli na 743 osebah - 432 je bilo obolelih za shizofrenijo, 311 pa jih je bilo zdravih. Najprej so izmerili količino protiteles proti komponentam virusa in primerjali količino protiteles med zdravo skupino in shizofreniki. Ugotovili so, da imajo shizofreniki od 1.7 do 2.3-krat večjo verjetnost, da imajo povečano količino protiteles proti VEB. Merili so tudi količino protiteles proti ostalim podobnim virusom, ampak pri shizofrenikih niso ugotovili odstopanja od zdrave skupine. Nato so proučevali DNA udeležencev ter ugotovili, da če ima dana oseba povečano količino protiteles proti VEB in tudi genetsko dovzetnost za shizofrenijo, je verjetnost da je ta oseba v skupini shizofrenikov osemkrat večja kot pa verjetnost, da je oseba zdrava. Ker ni pravih zdravil proti virusu, je pomembno, da odkrijejo, kako preprečiti delitev virusa. Povečano razumevanje delovanja infekcije z virusom VEB nam lahko morda pomaga pri zdravljenju shizofrenije.

=== Vivian Nemanič: Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo ===
Zdravila, ki jih uporabljamo za kemoterapijo, imajo veliko stranskih učinkov na naše telo. Da pa da zdravila delovala, so potrebne zelo velike količine, ki pa ne morejo ostati samo na tumorju oz. na prizadetem organu. V tej študiji so skušali ugotoviti kako bi preprečili, da zdravila zakrožijo po celem telesu in rešitev bi lahko bila absorpcijska naprava, ki bi nase vezala zdravilo iz krvi in tako pravzaprav absorbirala do 70% zdravila, ki ni ostalo v tumorju. To napravo bi izdelali s 3D tiskalnikom, zato da bi bila optimalne oblike in velikosti in bi se popolnoma prilegala žili. Eksperiment so izvedli na prašičih za primer jetrnega raka in bil je zelo uspešen. Verjetno bi absorpcijska naprava delovala tudi pri drugih vrstah raka in pri različnih zdravilih za kemoterapijo, poleg tega pa je pomembno da naprava ne ovira krvnega obtoka ali povzroče tromboze. Torej je varna za naše telo, saj naj ne bi imela nobenih negativnih učinkov na delovanje našega telesa, saj jo po približno eni uri po začetku kemoterapije vzamemo iz telesa, saj hitro opravi svojo nalogo. Naprava bi lahko postala zelo pomembna tudi pri odstranjevanju toksinov pri bakterijskih okužbah, okoljskih toksinov, ali pa tudi samih celic, ki bi jih ujeli na podlagi specifičnih kemijskih, fizikalnih ali bioloških značilnosti.

=== Kim Glavič: Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva ===
Zaradi nenehnega nastajanja poškodb DNA, ki jih povzročajo okoljski dejavniki, stranski produkti celičnega metabolizma ali pa kemoterapevtiki (npr. alkilirajoče snovi), so se razvili različni popravljalni mehanizmi, ki te napake popravljajo in skrbijo za zaščito zdravih tkiv. Eden takih mehanizmov je tudi popravljanje z izcepom baze (BER), ki v večini celic učinkovito odstrani napake. V nekaterih celicah, ki vsebujejo večje količine DNA-glikozilaze (AAG) pa njegova prevelika aktivnost povzroči kaskado dogodkov, kateri vodijo do celične smrti. Raziskovalci so ugotovili, da je povzročena degeneracija celic odvisna tako od količine AAG kot tudi od spola organizma ter, da sta pri propadanju teh celic prisotni dve vrsti celičnih smrti in sicer apoptoza (genetsko kontrolirana programirana celična smrt) ter nekroza (poteče kadar celica propade zaradi poškodbe). Pri slednji se med procesom propadanja izloča protein, ki posredno vpliva na nastanek vnetne reakcije torej prodiranja makrofagov na mesto propadajočih celic. TI makrofagi pa vplivajo na nastanek zelo reaktivnih kisikovih spojin, katere povzročijo še več poškodb DNA. Zaradi tega se aktivnost AAG še poveča, kar pa povzroči še večjo količino propadlih celic.

=== Ela Sabadin: Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miših ===
Znanstveniki so uspeli obnoviti sluh v odrasli miši modela DFNB9 gluhosti – motnja sluha, ki predstavlja enega najbolj pogostih primerov genetsko prirojene gluhosti. Posamezniki z DFNB9 so popolnoma gluhi in imajo pomanjkanje gena za kodiranje otoferlina (pri ljudeh je kodiran z otof genom), proteina, ki je bistven za prenašanje zvočnih informacij v slušno-senzoričnih sinapsah. Z injeciranjem tega gena v bolne miši, so znanstveniki uspešno obnovili funkcijo slušne sinapse in povrnili sluh na skoraj normalno stopnjo. Genska terapija na podlagi AAV (adeno-associated virus) je obetajoča terapevtska možnost za zdravljenje gluhosti, vendar je njena vloga omejena s potencialno ozkim terapevtskim oknom. Kakorkoli, ker je AAV omejil kapaciteto paketa DNA (približno 4,7 kilobaz), je zahtevno uporabiti to tehniko za gene, katerih regija kodiranja (cDNA) presega 5 kb, kot je na primer gen za kodiranje otoferlina, ki ima regijo kodiranja dolgo 6 kb. Znanstveniki so premagali to oviro s prilagajanjem AAV pristopa, znanega kot dvojna AAV strategija. Rezultati, doseženi s strani znanstvenikov, kažejo na to, da ja terapevtsko okno za prenos lokalnih genov pri pacientih z DFNB9 prirojeno gluhostjo lahko širše kot zgolj ideja in ponuja upe za razširitev teh ugotovitev na ostale tipe gluhosti.

=== Aleksandra Rauter: Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo ===
Črevesna flora je kompleksni mikrobni ekosistem v gastrointestinalnem traktu sesalcev. Vpliva na mnoge pomembne funkcije gostitelja, vpliva pa tudi na živčni sistem. V sami raziskavi so se osredotočili na rastne faktorje, ki vplivajo na celično delitev, proliferacijo. Zaradi odsotnosti rastnih faktorjev v umetnih medijih, je večina bakterij še negojenih, kar ovira naše razumevanje njihovih bioloških vlog. V študiji so z uporabo kokulture izolirali bakterijo KLE1738, ki je za svojo rast potrebovala prisotnost bakterije Bacteroides fragilis. Analiza supernatanta B. fragilis je vodila v izolacijo rastnega faktorja. To je bila GABA (Gamma AminoButyric Acid), ki je glavni nevrotransmiterski inhibitor v centralnem živčnem sistemu. Na podlagi spremenjenih vrednosti GABA v odvisnosti od antibiotikov in prisotnosti mikroorganizmov, so prišli do zaključka, da je črevesna flora posredno povezana tudi z različnimi boleznimi. Raziskali so, kako ševilčnost B. fragilis vpliva na nevronsko mrežo in povezavo med posameznimi regijami v možganih. Rezultati so pokazali, da zmanjšano število bakterij obratno korelira s funkcionalno povezavo med posameznimi možganskimi regijami. Prekrivanje teh z regijami limbičnega sistema je vplivalo na čustvene odizve. Z izolirano bakterijo KLE1738 niso našli nobene povezave. Dejstvo, da številčnost bakterij Bacteroides (in posledično vrednosti GABA) vpliva na fiziologijo možganskih regij, so potrdile tudi ostale študije. Raziskovalci so mnenja, da je to prvi korak k razumevanju te povezave.

=== Ana Babnik: Kako nas okuži določena vrsta bakterij? ===
Znano je, da Gram negativne bakterije v veziklih zunanje membrane transportirajo toksine, zaradi katerih zbolimo. O mehanizmu nastanku veziklov zunanje membrane se do sedaj ni vedelo veliko, predlaganih pa je bilo nekaj teorij biogeneze teh veziklov. Raziskovalcem iz Binghamton University v New Yorku je uspelo odkriti mehanizem, kako bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'' komunicirajo med sabo preko majhnih molekul ''Pseudomonas quinolone signal'' (PQS). Ta bakterija je pomembna, saj je predmet mnogih raziskav in pri živalih, rastlinah in ljudeh povzroča hude okužbe. Molekula PQS se preko več korakov vgradi v vrhnji sloj zunanje membrane, s tem asimetrično poveča membrano in povzroči uvihanje. Li in sodelavci so s simulacijami, pri katerih so približali molekulo na 1 nm (trajanje 300 ns ali 500 ns), dokazali, da pri tem delujejo močne vodikove vezi med fosfatno skupino membrane in funkcionalnimi skupinami PQS, ki pomagajo pri spontani umestitvi v membrano. Z meritvami minimalne razdalje med vrhnjim slojem in PQS, ki je znašal 1,35 nm, so potrdili izjemno stabilnost faze vezave molekule na površino. Odkrili pa so tudi spremembo iz odprte v zaprto konformacijo PQS, ki zmanjša odbojne sile pri penetraciji vrhnjega dela membrane. Sklepajo, da bi tak model komunikacije bakterij lahko obstajal še pri drugih vrstah Gram negativnih bakterij. Spoznanja raziskave pa prinašajo boljše razumevanje mehanizmov biogeneze membranskih veziklov, ki raziskovalcem pomagajo razumeti interakcije med več vrstami ter tako posledično iskati rešitve za preprečitev potencialnih okužb.

=== Karmen Ferjan: Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico ===
Glavni problem pri kliničnem prenosu siRNA v zdravilih je dostava v citosol. Mnogi polimeri so bili razviti za ta prenos siRNA, ampak noben hkrati ni ustrezal, bili so premalo učinkoviti ali pa preveč toksični. Članek objavljen v reviji ACS central Science poroča o preprosti strategiji za izgradnjo nanodelcev v obliki jedra z lupino, ki je zelo učinkovita za dostavo siRNA. Nanodelec je pripravljen z entropijsko-gnanim kompleksom siRNA in sestavine zelenega čaja EGCG, ter je obložen z polimeri nizke molekulske mase. Poskusi so bili izvedeni z šestimi različno razvejanimi naravnimi in sintetičnimi polimeri. Izdelan nanodelec je imenovan GNP (Green Nanoparticle). Ta strategija lajša polimerom zgoščevanje siRNA v enoten nanodelec, ki lažje dostopa v celico kot siRNA brez catechina. Zgoščevanje dokažemo z drugačno barvo fluresciranj v prisotnosti EtBr. Namen uporabe GNP je lajšanje bolezenskih stanj kot je na primer kronično črevesno vnetje. Poskusi uporabe so bili izvedeni na HeLa celicah ter na miših. EGCG je z antioksidantskimi, proti-vnetnimi, antibakterijskimi in proti-rakotvornimi učinki navdihujoč za lokalno zdravljenje različnih bolezni.

=== Maša Andoljšek: Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo ===
Poznamo diferenciacijo zrelih celic pri rastlinah, nekaterih živalih, manj pa pri sesalcih. Splošno velja, da človeške odrasle matične celice ne morejo spremeniti svoje funkcije. Raziskava je bila na temo plastičnosti, to pomeni spreminjanje naloge zrele celice. Raziskovali so, ali lahko celice alfa (proizvajalke glukagona) ali celice gama (proizvajalke pankreatičnega polipeptida), ki se nahajajo v Langerhansovih otočkih trebušne slinavke, spremenijo svojo funkcijo in začnejo proizvajati inzulin, kot celice beta. Raziskava je potekala in vitro, nato pa še in vivo, saj so psevdootočke, spremenjenih celic z transkripcijskimi faktorji(Pdx1, Mafa in Nkx6-1), transplantirali v miši. Sprva so celicam alfa dodali zeleni fluorescenčni protein in zgodilo se ni nič, nato so ob dodatku Pdx1 in Mafa začele proizvajati največ inzulina, ter tudi nekatere gene celic beta. Čez nekaj tednov so proizvajale le še inzulin. Potrdili so diferenciacijo celic alfa in gama in vitro. Prilagajanje je bilo s časom čedalje bolj uspešno. Celice alfa in vivo so postale uspešne proizvajalke inzulina in ob transplantaciji psevdodotočkov celic alfa zdravih donorjev so ozdravili diabetes pri miši. Ugotovili so, da so se celice hitreje spremenile in vivo, kot in vitro. Da bi ugotovitve te raziskave postale del zdravljenja je potrebno še veliko, bi pa lahko bilo to zdravljenje uspešnejše od zdravljenja diabetesa danes.

=== Nika Vegelj: Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV ===
Virus HIV spada v družino retrovirusov, njegov genom pa je sestavljen iz dveh enojnih vijačnic RNA. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to so CD4+ T celice. Problem virusa HIV je ta, da se ga telo ne more znebiti zgolj s tvorbo protiteles, saj ostane integriran v genomu obolelega. Okužba z virusom HIV nato sproži odmiranje celic, ter apoptozo neokuženih celic, ki pridejo v stik z okuženimi. Zmanjšanje števila CD4+ T limfocitov pa vodi do nezadostnega celično posredovanega imunskega odziva. Funkcionalno zdravilo za virus HIV zahteva, da si organizem ponovno zgradi imunski sistem. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to pa so CD4+ T limfociti. Ko virus okuži CD4+ T limfocite, se lahko aktivno deli, da proizvede čim več novih virusov ali pa gre v stanje mirovanja. Znanstveniki so z raziskavo prikazali, da stimulacija CD4 T limfocitov z anti - α4 β7 antitelesi lahko modulirajo količino cofilina in popravijo defekt migracije T limfocitov, ki ga je povzročila hiperaktivacija cofilina. Znanstveniki so torej s to raziskavo odkrili nove možnosti za testiranje novih terapevtikov, ki bi obnovili sistem za migracijo T celic ter repopulacijo tkiv za rekonstrukcijo imunskega sistema in posledično nadzora nad virusom.

=== Tevž Levstek: Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ===
Osnovno razumevanje razmnoževanja virusov domneva, da določen virus okuži eno celico, ki pa naprej proizvede nove viruse in tako nadaljuje z okužbo sosednjih celic. Obstajajo pa tudi drugačni, večdelni virusi. Tovrstni virusi ne vsebujejo vsega dednega zapisa v le eni kapsidi, ampak so segmenti dednega materiala razporejeni po virusni populaciji. Omenjeni segmenti navadno zapisujejo različne, zaključene enote genskega zapisa, raziskovalci pa so v tem primeru uporabili virus, ki je imel 8 genskih segmentov. Ker je zelo majhna možnost, da bi vseh osem segmentov okužilo isto celico, so raziskovalci preverili, ali ti med sabo pri vstopanju v celice kakor koli vplivajo, da bi se ta možnost povečala. Ugotovili so, da se to ne dogaja in da dejansko skoraj nobena celica ne dobi vseh virusovih segmentov. Nadalje so raziskali, ali se sploh lahko razmnožujejo virusi iz celice, ki nima vseh genskih segmentov. Pokazali so, da v celicah, ki imajo določen virusni segment, nimajo pa segmenta z geni za replikacijo, ta vseeno poteka. Pojavijo se tudi proteini, ki jih ne zapisuje segment v celici, ampak segment v sosednji celici. Čeprav direktno niso dokazali, da bi virusovi proteini potovali iz ene celice v drugo, je dokazano, da se nekako pojavijo v celicah, ki zanje ne vsebujejo genskega zapisa, če katera od celic poleg ta zapis vsebuje. To pomeni, da najverjetneje med okuženimi celicami poteka transport ali dovršenih proteinov ali pa molekul mRNA, ki te beljakovine zapisujejo.

TBK2019-seminar

2019-03-12T19:52:40Z

Tevz Levstek: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević|| Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miši ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190212141409.htm||05.03||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090930.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||Bakterijski genotoksin kolibaktin človeškega črevesa alkilira DNA.||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214153159.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180919083446.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||Kako nas okuži določena vrsta bakterij?||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190225075613.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213124350.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||Finding clues to a functional HIV cure||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207173229.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||Naivni makrofagi||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181129142441.htm?fbclid=IwAR2x562KFLljGOmHD5T40KXBf6I2L72TpMpvVM0I3lNBckrVxXW3cXQG-vM||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190312123658.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||Snov, ki preprečuje malarijo pri komarjih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180918082059.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127092558.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak||Merjenje celične obremenjenosti s fluorescenčno molekulo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/08/180827110828.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||Kako virusi ukanejo gostiteljske celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190306125335.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||Spreminjanje odprtih ran v kožo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180905131831.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||New pill can deliver insulin through the stomach||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207142206.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||RNA-vezavni protein Pum2 je tarča v boju proti staranju||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190110141826.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||Vpogled v mehanizem, ki nadzira poškodbe DNA||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190226112344.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2019 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.