https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Tina+Lekan 2026-04-04T02:53:57Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13876 2018-01-23T07:21:01Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_in_razširljiva_platforma_na_osnovi_regulacije_izražanja_genov_z_RNA_za_inženiring_celičnih_funkcij Modularna in razširljiva platforma na osnovi regulacije izražanja genov z RNA za inženiring celičnih funkcij] - Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> # [http://www.pnas.org/content/97/5/2075.full Uporaba šuma v dizajnu genskih stikal in amplifikaciji transkripcije] - Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aflatoxout Aflatoxout] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Super_tobak Super tobak] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Enkabcillus_-_to_je_past%21 Enkabcillus - to je past!] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Solni_trezor Solni trezor] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/H2ydroGEM_-_%C4%8Cista_energija_za_prihodnost H2ydroGEM - Čista energija za prihodnost] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shramba_fosfata Shramba fosfata] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynORI_–_ogrodje_za_večplazmidne_sisteme SynORI – ogrodje za večplazmidne sisteme] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PowerLeaf_%E2%80%93_bakterijska_solarna_baterija PowerLeaf – bakterijska solarna baterija] &lt;br&gt;<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija] &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Super_tobak Super tobak] &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak - [[Enkabcillus - to je past!]]&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aflatoxout Aflatoxout] &lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynORI_–_ogrodje_za_večplazmidne_sisteme SynORI – ogrodje za večplazmidne sisteme] &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Solni_trezor Solni trezor] &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shramba_fosfata Shramba fosfata] &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/H2ydroGEM_-_%C4%8Cista_energija_za_prihodnost H2ydroGEM - Čista energija za prihodnost] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_in_razširljiva_platforma_na_osnovi_regulacije_izražanja_genov_z_RNA_za_inženiring_celičnih_funkcij Modularna in razširljiva platforma na osnovi regulacije izražanja genov z RNA za inženiring celičnih funkcij] &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Talk:Seminarji_SB_2017/18 - Uporaba šuma v dizajnu genskih stikal in amplifikaciji transkripcije] &lt;br&gt;<br /> 3 Barbara Lipovšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PowerLeaf_%E2%80%93_bakterijska_solarna_baterija PowerLeaf – bakterijska solarna baterija] &lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Seminarji_SB_2017/18&diff=13875 2018-01-23T07:19:50Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>UPORABA ŠUMA V DIZAJNU GENSKIH STIKAL IN AMPLIFIKACIJI TRANKRIPCIJE<br /> <br /> Uvod<br /> <br /> Regulirana ekspresija genov je process, s katerim celica nadzira proizvodnjo encimov in strukturnih proteinov v času. Velik delež regulacije poteka na ravni transkripcije. Regulacija poteka tako znotraj sistema kot tudi od zunaj – vpliv okolja.<br /> Najbolj splošen teoretični model za prikaz genske regulacije so regulacijske mreže biokemijskih reakcij. V eni izmed takih mrež so najdemo posamezne reakcije kot tudi njihove interakcije preko sistema. Prednost mrež je njihova celovitost (prikaz nihanja koncentracij reaktivnih spojin kot posledica interakcij med biokemijskimi reakcijami – notranja nihanja), čeprav jim primanjkuje analitične sledljivosti. <br /> Kvalitativna analiza je z napredkom tehnologije močno napredovala, kvalitativna analiza pa je po drugi strani zahtevna predvsem zaradi kompleksnosti sistemov. Zato moramo za analizo izbirati majne sisteme z majhnim številom faktorjev.<br /> Za razlago nihanj koncentracij spojin znotraj sistema se uporabljajo enačbe kemijske kinetike (zunanja nihanja pri tem zanemarimo). Te diferencialne enačbe podajajo spreminjanje koncentracije reakcijske spojine s časom v setu biokemijskih reakcij. Splošno prisotni so sistemi povratnih zank, ki povzročijo odklon kinetičnih reakcij od linearnosti.<br /> Šum v obliki naključnih nihanj v koncentracijskih vrednostih se pojavi v eni od dveh oblik. Prvi je notranji šum in njegova velikost je sorazmerna velikosti sistema. Ponavadi je termičnega izvora. Drugi je zunanji šum in izvira iz naključnih speminjanj enega ali več zunanjih kontrolnih parametrov (npr. kinetične konstante ločenega seta biokemijskih reakcij).<br /> Če je šum majhen, ga lahko v kinetičnih enačbah upoštevamo post hoc. Notranji šum upoštevamo, da izboljšamo približke naših enačb, medtem ko želimo pri zunanjem šumu predstaviti fenomen, pri katerem ne poznamo točnih detajlov.<br /> Šum podajamo aditivno, ko ga lahko uporabimo za proteinsko stikalo, ali multiplikativno, kjer majhne razlike v hitrosti transkripcije močno vplivajo na produkcijo proteina (poskus amplifikacije). <br /> <br /> Model za ekspresijo represorja<br /> <br /> V kontekstu cikla lize-lizogenosti bakteriofaga λ je avtoregulacija represorja λ dobro karakterizirana. Kot modelni sistem za določitev kinetike transkripcije uporabimo plazmid bakteriofaga λ s promotorjem Pr-Pm in komponentami, potrebnimi za transkripcijo, translacijo in degradacijo.<br /> V divjem tipu je promotor sestavljen iz treh operatorjev, medtem ko za določitev kinetike transkripcije zaradi manjše kompleksnosti uporabimo mutanto z le dvema operatorjema (OR2 in OR3, OR1 izpustimo).<br /> Gen cl izrazi represor CI, ki dimerizira in z vezavo na DNA deluje kot transkripcijski faktor. V mutiranem sevu se veže na OR2 in OR3. Vezava na OR2 poveča hitrost transkripcije, medtem ko jo vezava na OR3 zmanjša. Nespecifično vezavo zanemarimo. <br />  <br /> Kemijska kinetika<br /> <br /> Kemijske reakcije razdelimo na hitre (reda sekund) in počasne (reda minut).<br /> Med hitre prištevamo reakcije dimerizacije in vezave dimera na DNA. Hitrostne konstante so glede na zaporedno številko reakcije K1, K2, K3 in K4. K3 in K4 zaradi prikladnosti zapišemo relativno na K2 kot K3 = δ1K2 in K4 = δ2K2.<br /> Med počasni reakciji se štejeta transkripcija in degradacija. Obravnava se ju kot ireverzibilni reakciji. Hitrostni konstanti sta Kt in Kd.<br /> V in vitro sistemu z veliko stopnjo pretvorbe lahko zapišemo koncentracije reaktivnihi spojin kot dinamične spremenljivke, tako da je x = [X], y = [X2] D = [D], u = [DX2], v = [DX2*], z = [DX2X2]<br /> Izrazimo povprečni x (ob predpostavki, da je koncentracija RNA polimeraze (p0) konstantna) in se z izpostavljanjem znebimo znebimo y, u in d. Konstantno je tudi število promotorskih mest. Uvedemo dve novi spremenljivki, α in γ.<br /> α = nktp0dT/r in je pokazatelj relativnega povišanja transkripcije zaradi vezave represorja<br /> γ = kd/(r(K1K2)1/2) in je proporcionalen relativni močem razgradnje X in osnovnih vrednosti transkripcije.<br /> <br /> Grafični prikaz<br /> <br /> Za mutiranega faga velja: δ1 ~ 1, δ2 ~ 5. Opazimo, da se enačba obnaša na dva načina. En set začetnih parametrov privede v monostabilnost – vse začetne koncentracije se razvijejo v enako vrednost – medtem ko drugi set parametrov privede do bistabilnosti – glede na začetne koncentracije pridemo do treh različnih vrednosti, vendar srednja vrednost ni stabilna. Do pojava bistabilnosti pride zaradi tekmovalnostjo med nastajanjem X in njegovo dimerizacijo ter razgradnjo.<br /> Bistabilnost se da prikazati grafično pri različnih vrednostih γ in ko je povprečni x = 0, α pa je konstantna (konstantna stopnja translacije in konstantno število vezavnih mest).<br /> Vidimo, da pri majhnih γ (ko je razgradnja v primerjavi z nastajanjem majhna) obstaja le ena možna vrednost x (in CI). Ko γ povečamo nad neko kritično vrednost γL, se pojavijo tri možne vrednosti. Ob še večjem povečanju γ nad γU, ko koncentracija x spet močno pade, pa se sistemu spet povrne monostabilnost. Parameter γ je torej kontrola, ki jo lahko v sistemu reguliramo.<br /> Potrditev dobimo tudi z risanjem grafa koncentracije CI v odvisnosti od γ). Če začnemo pri nizki vrednosti γ (npr. 5) in jo višamo, vidimo, da CI počasi pada. Ko γ preseže γU, koncentracija nemudoma skoči na močno nižjo vrednost. Če začnemo z visoko vrednostjo γ in jo postopoma znižujemo, se dogaja ravno obratno, ko pa se spoustimo pod vrednost γL, koncentracija nemudoma močno naraste, seveda pa se to zgodi ob drugačni vrednosti γ.<br /> <br />  <br /> Aditivni šum<br /> <br /> Kinetične enačbe so po izvoru kinetične, zato vpliv šuma obravnavamo statistično. Vpliv je majhen in ga lahko obravnavamo kot naključna motnja. Imel bo vpliv na hitrost bazne transkripcije, majhna nihanja v hitrosti bazne transkripcije pa se prevedejo v velika nihanja v hitrosti transkripcije represorja. Aditivni šum v enačbo vključimo linearno. Osnovne enačbe popravimo na nivoju hitrostnih konstant oz δ.<br /> Če narišemo graf Φ (integral desne strani osnovne enačbe) v odvisnosti od koncentracije CI, dobimo tako imenovani energijski teren (graf 2), ki je dobil svoje ime, saj ga lahko interpretiramo tudi kot spreminjanje potencialne energije nekega delca, ki potuje po tem terenu (miselni konstrukt, ključen za razvoj verjetnostnih enačb). <br /> Stabilna vrednost koncentracije represorja se nahaja v obeh minimumu grafa. Aditivni šum povzroči naključne poraste energije delca. Serija porastov energije lahko povzroči preskok delca iz enega v drug lokalni minimum.<br /> Da rešimo enačbo zazdnjo diferencialno enačbo, uvedemo porazdelitev verjetnosti – verjetnost, da najdemo sistem ob času t s koncentracijo x. Enačbo tako preoblikujemo v Fokker-Planckovo enačbo (parcialna diferencialna enačba, ki opisuje spreminjanje gostote verjetnostne funkcije hitrosti delca pod vplivom naključnih sil s časom – zato smo potrebovali energijski teren in miselni konstrukt v obliki delca). Zanima nas ssm koncentracija (vsota kvadratov koncentracij modela), zato enačbo rešimo pri distribuciji v stabilni fazi.<br /> Opazimo, da manjši šum povzroči porazdelitev verjetnosti okoli nižje koncentracije represorja, medtem ko večji šum povzroči porazdelitev verjetnosti okoli obeh koncentracij represorja. Rezultat se ujema s konceptualno obliko pokrajine. Majhen šum lahko povzroči le prehod iz višjega v nižje stanje, medtem ko velik šum pričakovano povzroči širšo porazdelitev in omogoči prehod v katerokoli smer.<br /> Model stikala<br /> Aditivni šum lahko uporabimo pri dizajnu proteinskih stikal. Če začnemo na ‘’OFF’’, ko je šum zelo majhen, imamo veliko populacijo verjetnosti pri nizkih koncentracijah. Ko skozi sistem spustimo kratek pulz močnega šuma, bo sistem zavzel konformacijo ‘’ON’’. Na ‘’OFF’’ se ne bo vrnil, saj bo povrnjen začetni majhen šum., prenizek, da bi sistem prešel kakršnokoli bariero. Da sistem povrnemo nazaj na ‘’OFF’’, bo potreben pulz srednje močnega šuma, dovolj velikega, za povrnitev v prvotno stanje, vendar dovolj majhen, da se sistem ne more vrniti v ‘’ON’’ stanje.<br /> <br /> Multiplikativen šum<br /> <br /> Tokrat predpostavljamo, da α ni konstantna. Prek serij enačb, kjer predpostavimo, da parameter α niha naključno, ponovno vidimo, da izbrani parametri privedejo do monostabilnosti ali bistabilnosti. S podobnimi predpostavkami kot pri snovanju enačb za aditivni šum lahko ponovno zapišemo Fokker-Planckovo enačbo, ki jo lahko rešimo in narišemo ‘’terenski’’ graf.<br /> <br />  <br /> Zaključek<br /> <br /> Čeprav je delo osnovano na lastnostih bakteriofaga λ in represorja λ, lahko rezultate posplošimo na vse pozitivne regulatorne elemente. Ključna pri takšnem modelu je bistabilnost. Ugotavljajo, da se jo lahko doseže tudi pri sistemih, ki niso bistabilni, in sicer z električnim poljem, pa tudi s pH koontrolo, DNA titracijo ali z uporabo represorskih proteinov, odvisnih od temperature. Predvsem ima tehnologija potencial v genskih terapijah za kreiranje učinkovin, ki bi delovala periodično ali šele, ko dosežejo želeno mesto.<br /> <br /> Vir<br /> <br /> Jeff Hasty, Joel Pradines, Milos Dolnik, and J. J. Collins. ‘’Noise-based switches and amplifiers for gene expression.’’ PNAS 2000. 97, 5. 2075-2080.</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Seminarji_SB_2017/18&diff=13874 2018-01-23T07:18:20Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>UPORABA ŠUMA V DIZAJNU GENSKIH STIKAL IN AMPLIFIKACIJI TRANKRIPCIJE<br /> <br /> Uvod<br /> Regulirana ekspresija genov je process, s katerim celica nadzira proizvodnjo encimov in strukturnih proteinov v času. Velik delež regulacije poteka na ravni transkripcije. Regulacija poteka tako znotraj sistema kot tudi od zunaj – vpliv okolja.<br /> Najbolj splošen teoretični model za prikaz genske regulacije so regulacijske mreže biokemijskih reakcij. V eni izmed takih mrež so najdemo posamezne reakcije kot tudi njihove interakcije preko sistema. Prednost mrež je njihova celovitost (prikaz nihanja koncentracij reaktivnih spojin kot posledica interakcij med biokemijskimi reakcijami – notranja nihanja), čeprav jim primanjkuje analitične sledljivosti. <br /> Kvalitativna analiza je z napredkom tehnologije močno napredovala, kvalitativna analiza pa je po drugi strani zahtevna predvsem zaradi kompleksnosti sistemov. Zato moramo za analizo izbirati majne sisteme z majhnim številom faktorjev.<br /> Za razlago nihanj koncentracij spojin znotraj sistema se uporabljajo enačbe kemijske kinetike (zunanja nihanja pri tem zanemarimo). Te diferencialne enačbe podajajo spreminjanje koncentracije reakcijske spojine s časom v setu biokemijskih reakcij. Splošno prisotni so sistemi povratnih zank, ki povzročijo odklon kinetičnih reakcij od linearnosti.<br /> Šum v obliki naključnih nihanj v koncentracijskih vrednostih se pojavi v eni od dveh oblik. Prvi je notranji šum in njegova velikost je sorazmerna velikosti sistema. Ponavadi je termičnega izvora. Drugi je zunanji šum in izvira iz naključnih speminjanj enega ali več zunanjih kontrolnih parametrov (npr. kinetične konstante ločenega seta biokemijskih reakcij).<br /> Če je šum majhen, ga lahko v kinetičnih enačbah upoštevamo post hoc. Notranji šum upoštevamo, da izboljšamo približke naših enačb, medtem ko želimo pri zunanjem šumu predstaviti fenomen, pri katerem ne poznamo točnih detajlov.<br /> Šum podajamo aditivno, ko ga lahko uporabimo za proteinsko stikalo, ali multiplikativno, kjer majhne razlike v hitrosti transkripcije močno vplivajo na produkcijo proteina (poskus amplifikacije). <br /> <br /> Model za ekspresijo represorja<br /> V kontekstu cikla lize-lizogenosti bakteriofaga λ je avtoregulacija represorja λ dobro karakterizirana. Kot modelni sistem za določitev kinetike transkripcije uporabimo plazmid bakteriofaga λ s promotorjem Pr-Pm in komponentami, potrebnimi za transkripcijo, translacijo in degradacijo.<br /> V divjem tipu je promotor sestavljen iz treh operatorjev, medtem ko za določitev kinetike transkripcije zaradi manjše kompleksnosti uporabimo mutanto z le dvema operatorjema (OR2 in OR3, OR1 izpustimo).<br /> Gen cl izrazi represor CI, ki dimerizira in z vezavo na DNA deluje kot transkripcijski faktor. V mutiranem sevu se veže na OR2 in OR3. Vezava na OR2 poveča hitrost transkripcije, medtem ko jo vezava na OR3 zmanjša. Nespecifično vezavo zanemarimo. <br />  <br /> Kemijska kinetika<br /> Kemijske reakcije razdelimo na hitre (reda sekund) in počasne (reda minut).<br /> Med hitre prištevamo reakcije dimerizacije in vezave dimera na DNA. Hitrostne konstante so glede na zaporedno številko reakcije K1, K2, K3 in K4. K3 in K4 zaradi prikladnosti zapišemo relativno na K2 kot K3 = δ1K2 in K4 = δ2K2.<br /> Med počasni reakciji se štejeta transkripcija in degradacija. Obravnava se ju kot ireverzibilni reakciji. Hitrostni konstanti sta Kt in Kd.<br /> V in vitro sistemu z veliko stopnjo pretvorbe lahko zapišemo koncentracije reaktivnihi spojin kot dinamične spremenljivke, tako da je x = [X], y = [X2] D = [D], u = [DX2], v = [DX2*], z = [DX2X2]<br /> Izrazimo povprečni x (ob predpostavki, da je koncentracija RNA polimeraze (p0) konstantna) in se z izpostavljanjem znebimo znebimo y, u in d. Konstantno je tudi število promotorskih mest. Uvedemo dve novi spremenljivki, α in γ.<br /> α = nktp0dT/r in je pokazatelj relativnega povišanja transkripcije zaradi vezave represorja<br /> γ = kd/(r(K1K2)1/2) in je proporcionalen relativni močem razgradnje X in osnovnih vrednosti transkripcije.<br /> <br /> Grafični prikaz<br /> Za mutiranega faga velja: δ1 ~ 1, δ2 ~ 5. Opazimo, da se enačba obnaša na dva načina. En set začetnih parametrov privede v monostabilnost – vse začetne koncentracije se razvijejo v enako vrednost – medtem ko drugi set parametrov privede do bistabilnosti – glede na začetne koncentracije pridemo do treh različnih vrednosti, vendar srednja vrednost ni stabilna. Do pojava bistabilnosti pride zaradi tekmovalnostjo med nastajanjem X in njegovo dimerizacijo ter razgradnjo.<br /> Bistabilnost se da prikazati grafično pri različnih vrednostih γ in ko je povprečni x = 0, α pa je konstantna (konstantna stopnja translacije in konstantno število vezavnih mest).<br /> Vidimo, da pri majhnih γ (ko je razgradnja v primerjavi z nastajanjem majhna) obstaja le ena možna vrednost x (in CI). Ko γ povečamo nad neko kritično vrednost γL, se pojavijo tri možne vrednosti. Ob še večjem povečanju γ nad γU, ko koncentracija x spet močno pade, pa se sistemu spet povrne monostabilnost. Parameter γ je torej kontrola, ki jo lahko v sistemu reguliramo.<br /> Potrditev dobimo tudi z risanjem grafa koncentracije CI v odvisnosti od γ). Če začnemo pri nizki vrednosti γ (npr. 5) in jo višamo, vidimo, da CI počasi pada. Ko γ preseže γU, koncentracija nemudoma skoči na močno nižjo vrednost. Če začnemo z visoko vrednostjo γ in jo postopoma znižujemo, se dogaja ravno obratno, ko pa se spoustimo pod vrednost γL, koncentracija nemudoma močno naraste, seveda pa se to zgodi ob drugačni vrednosti γ.<br /> <br />  <br /> Aditivni šum<br /> Kinetične enačbe so po izvoru kinetične, zato vpliv šuma obravnavamo statistično. Vpliv je majhen in ga lahko obravnavamo kot naključna motnja. Imel bo vpliv na hitrost bazne transkripcije, majhna nihanja v hitrosti bazne transkripcije pa se prevedejo v velika nihanja v hitrosti transkripcije represorja. Aditivni šum v enačbo vključimo linearno. Osnovne enačbe popravimo na nivoju hitrostnih konstant oz δ.<br /> Če narišemo graf Φ (integral desne strani osnovne enačbe) v odvisnosti od koncentracije CI, dobimo tako imenovani energijski teren (graf 2), ki je dobil svoje ime, saj ga lahko interpretiramo tudi kot spreminjanje potencialne energije nekega delca, ki potuje po tem terenu (miselni konstrukt, ključen za razvoj verjetnostnih enačb). <br /> Stabilna vrednost koncentracije represorja se nahaja v obeh minimumu grafa. Aditivni šum povzroči naključne poraste energije delca. Serija porastov energije lahko povzroči preskok delca iz enega v drug lokalni minimum.<br /> Da rešimo enačbo zazdnjo diferencialno enačbo, uvedemo porazdelitev verjetnosti – verjetnost, da najdemo sistem ob času t s koncentracijo x. Enačbo tako preoblikujemo v Fokker-Planckovo enačbo (parcialna diferencialna enačba, ki opisuje spreminjanje gostote verjetnostne funkcije hitrosti delca pod vplivom naključnih sil s časom – zato smo potrebovali energijski teren in miselni konstrukt v obliki delca). Zanima nas ssm koncentracija (vsota kvadratov koncentracij modela), zato enačbo rešimo pri distribuciji v stabilni fazi.<br /> Opazimo, da manjši šum povzroči porazdelitev verjetnosti okoli nižje koncentracije represorja, medtem ko večji šum povzroči porazdelitev verjetnosti okoli obeh koncentracij represorja. Rezultat se ujema s konceptualno obliko pokrajine. Majhen šum lahko povzroči le prehod iz višjega v nižje stanje, medtem ko velik šum pričakovano povzroči širšo porazdelitev in omogoči prehod v katerokoli smer.<br /> Model stikala<br /> Aditivni šum lahko uporabimo pri dizajnu proteinskih stikal. Če začnemo na ‘’OFF’’, ko je šum zelo majhen, imamo veliko populacijo verjetnosti pri nizkih koncentracijah. Ko skozi sistem spustimo kratek pulz močnega šuma, bo sistem zavzel konformacijo ‘’ON’’. Na ‘’OFF’’ se ne bo vrnil, saj bo povrnjen začetni majhen šum., prenizek, da bi sistem prešel kakršnokoli bariero. Da sistem povrnemo nazaj na ‘’OFF’’, bo potreben pulz srednje močnega šuma, dovolj velikega, za povrnitev v prvotno stanje, vendar dovolj majhen, da se sistem ne more vrniti v ‘’ON’’ stanje.<br /> <br /> Multiplikativen šum<br /> Tokrat predpostavljamo, da α ni konstantna. Prek serij enačb, kjer predpostavimo, da parameter α niha naključno, ponovno vidimo, da izbrani parametri privedejo do monostabilnosti ali bistabilnosti. S podobnimi predpostavkami kot pri snovanju enačb za aditivni šum lahko ponovno zapišemo Fokker-Planckovo enačbo, ki jo lahko rešimo in narišemo ‘’terenski’’ graf.<br /> <br />  <br /> Zaključek<br /> Čeprav je delo osnovano na lastnostih bakteriofaga λ in represorja λ, lahko rezultate posplošimo na vse pozitivne regulatorne elemente. Ključna pri takšnem modelu je bistabilnost. Ugotavljajo, da se jo lahko doseže tudi pri sistemih, ki niso bistabilni, in sicer z električnim poljem, pa tudi s pH koontrolo, DNA titracijo ali z uporabo represorskih proteinov, odvisnih od temperature. Predvsem ima tehnologija potencial v genskih terapijah za kreiranje učinkovin, ki bi delovala periodično ali šele, ko dosežejo želeno mesto.<br /> <br /> Vir:<br /> Jeff Hasty, Joel Pradines, Milos Dolnik, and J. J. Collins. ‘’Noise-based switches and amplifiers for gene expression.’’ PNAS 2000. 97, 5. 2075-2080.</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13873 2018-01-23T06:59:47Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_in_razširljiva_platforma_na_osnovi_regulacije_izražanja_genov_z_RNA_za_inženiring_celičnih_funkcij Modularna in razširljiva platforma na osnovi regulacije izražanja genov z RNA za inženiring celičnih funkcij] - Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> # [http://www.pnas.org/content/97/5/2075.full Uporaba šuma v dizajnu genskih stikal in amplifikaciji transkripcije] - Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aflatoxout Aflatoxout] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Super_tobak Super tobak] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Enkabcillus_-_to_je_past%21 Enkabcillus - to je past!] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Solni_trezor Solni trezor] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/H2ydroGEM_-_%C4%8Cista_energija_za_prihodnost H2ydroGEM - Čista energija za prihodnost] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shramba_fosfata Shramba fosfata] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynORI_–_ogrodje_za_večplazmidne_sisteme SynORI – ogrodje za večplazmidne sisteme] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PowerLeaf_%E2%80%93_bakterijska_solarna_baterija PowerLeaf – bakterijska solarna baterija] &lt;br&gt;<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija] &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Super_tobak Super tobak] &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak - [[Enkabcillus - to je past!]]&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aflatoxout Aflatoxout] &lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynORI_–_ogrodje_za_večplazmidne_sisteme SynORI – ogrodje za večplazmidne sisteme] &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Solni_trezor Solni trezor] &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shramba_fosfata Shramba fosfata] &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/H2ydroGEM_-_%C4%8Cista_energija_za_prihodnost H2ydroGEM - Čista energija za prihodnost] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_in_razširljiva_platforma_na_osnovi_regulacije_izražanja_genov_z_RNA_za_inženiring_celičnih_funkcij Modularna in razširljiva platforma na osnovi regulacije izražanja genov z RNA za inženiring celičnih funkcij] &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc [- Uporaba šuma v dizajnu genskih stikal in amplifikaciji transkripcije] &lt;br&gt;<br /> 3 Barbara Lipovšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PowerLeaf_%E2%80%93_bakterijska_solarna_baterija PowerLeaf – bakterijska solarna baterija] &lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13537 2017-12-04T06:39:15Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj &lt;br&gt;<br /> 2 Vanna Imširović &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov&diff=13517 2017-12-03T10:42:49Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/<br /> <br /> == UVOD ==<br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organizmih, saj inducirajo prelome dvojnih verig DNA, popravljalni mehanizmi le-teh pa lahko potečejo preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). Pri popravljanju z NHEJ ne potrebujemo dodatne homologne regije, posledično pogosto prihaja do nastanka delecij ali insercij ter do izgube funkcije gena. Nasprotno pa HR zahteva prisotnost donorske DNA-matrice, le-to pa vodi do nastanka specifičnih substitucij in insercij. Priprava TALEN-ov je draga in zamudna, poleg tega pa večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev.<br /> <br /> == ZGRADBA IN DELOVANJE TALEN-ov ==<br /> TALEN-i so sestavljeni iz DNA-vezavne domene in nukleazne domene. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna ter posledično odgovorna za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- terminalni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI ter ima aktivacijsko vlogo. TALEN-i imajo višjo specifičnost pri urejanju genomov ter so manj toksični od nukleaz s cinkovimi prsti. Pred kratkim in vivo analizirali specifičnost TALEN-ov, rezultati pa so pokazali, da TALE ponovitve neodvisno prepoznajo komplementarne nukleotidne baze, obenem pa prikazujejo dovolj veliko specifičnost za uporabo na človeških celicah. <br /> Sosledje in število TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določajo zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi, od tega vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Do cepitve DNA pride na odseku med obema nukleaznima domenama, vsaka pa omogočata cepitev le ene verige DNA. Posledično je potrebno pri uvajanju dvojnih prelomov uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. <br /> <br /> == METODE ==<br /> TALEN-e so pridobili z GoldenGate metodo, s katero lahko učinkovito načrtujemo in sestavljamo TALE nukleaze in druge TAL efektorske konstrukte, z namenom ciljanja DNA. Ponavljajoča zaporedja TALE nukleaz so klonirali v pT3TS destinacijski vektor z ustreznim TALEN ogrodjem, mRNA pa so injicirali v enocelične ribje zarodke, ki so bili molekularno testirani ali pa vzgojeni za analizo mutacij zarodnih celic. Somatske in zarodne mutacije, povzročene s TALE nukleazami, so ovrednotili s metodama PCR in RFLP. Za povzročitev nastanka HR, so zasnovali enoverižne DNA oligonukleotide z EcoRV ali mloxP mestom s kratkimi homolognimi ročicami okoli TALEN tarčnih mest ter jih nato injicirali v enocelične ribje zarodke. S PCR metodo so analizirali modificirane lokuse ter tako skušali odkriti posledice somatskih in zarodnih HR dogodkov.<br /> <br /> == DIZAJN TALEN-ov ==<br /> Pri načrtovanju TALEN-ov so bili upoštevani trije kriteriji. Najprej so izbrali TALEN vezavna mesta, ki so bila dolga 15-25 baznih parov, dolžina vmesnika pa je merila 15-16 baznih parov. Kadar je bilo to le mogoče, so bile TALEN rezalne sekvence izbrane okoli restrikcijskega encima, lokaliziranega centralno znotraj vmesnika. Za poenostavitev postopka izdelave TALEN-ov, so na spletu ustvarili brezplačno programsko opremo z odprtim dostopom.<br /> <br /> == UPORABA ZEBRAFISH-A ==<br /> Zebrafish je tropska riba iz JV Azije, katere ime izvira iz pasov, potekajočih vzdolž telesa. Vse pogosteje se uporablja za preučevanje osnovnih bolezni človeka, s pomočjo bogate palete genetskih in molekularnih orodij in vivo. Prednosti uporabe zebrafish-a so nizki stroški vzdrževanja, rastejo izjemno hitro, saj se v enem dnevu razvijejo toliko, kot se človeški zarodek v enem mesecu. Ribji zarodki so transparentni, kar raziskovalcem omogoča vpogled v razvoj notranjih struktur, poleg tega pa imajo podobno genetsko strukturo kot ljudje. <br /> Izboljšave v TALEN-ih zagotavljajo nov močan pristop za tarčno urejanje zebrafish genomov in funkcionalnih genomskih aplikacij. Z uporabo zebrafish-a kot dostavnega sistema in GoldyTALEN modificiranega ogrodja, imenovanega pKT3Ts-goldyTALEN (pKT3TsgT), ki bi preprečil rekombinacijo in s tem povečano število lažno pozitivnih kolonij pri sestavljanju TALEN-ov, dokazujejo, da ima izboljšan komplet TALEN orodij visoko specifičnost pri induciranju lokus specifičnih prelomov dvoverižne DNA v somatskih in tkivnih zarodnih linijah. S posodobljenim TALEN sistemom so uspešno uporabili enoverižne DNA oligonukleotide, s katerimi so natančno spreminjali sekvence na vnaprej določenih lokacijah zebrafish genoma, le-to pa so izvedli s pomočjo homologne rekombinacije in uvedbe EcoRV mesta ter modificirane loxP sekvence v somatsko tkivo. <br /> <br /> == RAZISKAVE NA ZEBRAFISH-U ==<br /> S pomočjo TALEN-ov so uvedli lokus specifične prelome dvojnih verig v zebrafish genomih, posledica katerih je nastanek velikega števila mutiranih alelov. Za izboljšanje in vivo učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja, so ga testirali z mRNA ekspresijskim vektorjem (pT3TS17), sledila je analiza DNA, s katero so določili nezmožnost restrikcijskega encima za prepoznavanje zaporedij TALEN mesta. Z uporabo prepoznavnih domen na GoldyTALEN ogrodju so ugotovili prisotnost šestkrat večjega števila genetskih mutacij na ponzr1 lokusu. Za nadaljnje testiranje učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja so ustvarili TALEN-e proti trem dodatnim lokusom, in sicer moesina, ppp1cabb in cdh5, na vsakem lokusu pa so opazili prisotnost mutageneze oziroma spreminjanja genov. Za določitev časovnega poteka sprememb, ki jih povzroča GoldyTALEN, so preučevali aktivnost restrikcijskega encima pri 256 celicah, 28 ur po oploditvi ter v 50 stopnjah oploditve. Rezultati prikazujejo zgodnje in učinkovito ciljanje genov v somatskih tkivih, vključno z bialelno pretvorbo pri nekaterih živalih. V odgovor na povečano aktivnost GoldyTALEN-ov so se spraševali, ali lahko injiciranje TALEN-ov vodi do izgube fenotipa funkcionalnega tarčnega moezinskega (MO) gena v zebrafish-u. Naredili so krivuljo odziva na odmerek zdravila pri moezinu, ppp1cab in cdh5 GoldyTALEN parih, koncentracijo GoldyTALEN parov so optimizirali na število zarodkov z bialelnimi spremembami ter določili kolikšen odstotek le-teh je mrtvih ali deformiranih. Zarodki, ki so bili vbrizgani s cdh5 GoldyTALEN-om ali pa z moezinom so pokazali podobne vaskularne fenotipe, in sicer izrazit srčni edem, izgubo patentnih lumnov v vaskulaturi in izgubo cirkulirajočih rdečih krvnih celic. Zbrani rezultati prikazujejo, da lahko z GoldyTALEN ogrodjem dosežemo učinkovito bialelno ciljanje znanih fenotipov, ki nakazujejo na izgubo funkcije, poleg tega pa podatki prikazujejo dopolnilno vlogo GoldyTALEN-ov pri oceni somatskih moezinskih fenotipov.<br /> <br /> == RAZISKAVE NA GoldyTALEN OGRODJU ==<br /> Za oceno prenosa mutacij na zarodne celice so vzgojili bialelno zebrafish ribo, ki so ji predhodno injicirali GoldyTALEN. Pregledali so 10 združenih F1 zarodkov ter tako prikazali frekvenco mutacij v lokusih, ki je znašala med 9 in 55 %. V dveh od treh lokusih zarodnih linij so odkrili mozaicizem, podatki pa obenem prikazujejo, da somatsko TALEN ciljanje uspešno prehaja skozi zarodne linije. Z uspešno modifikacijo genoma z GoldyTALEN-i domnevajo, da bi v prihodnje lahko zasnovali sintetične oligonukleotide tako, da bi le-ti lahko rezali na predvidenem TALEN mestu ter s tem služili kot osnova za homologno rekombinacijo in vivo. S ko-iniciacijo ponzr1 GoldyTALEN-a kot testnega lokusa in enoverižnega DNA oligonukleotida, so uvedli EcoRV restrikcijsko mesto. V poskusih je več kot polovica injiciranih zarodkov pokazala prisotnost kromosomov, ki so vsebovali EcoRV zaporedje, z analizo zaporedja pa so dokazali uspešno homologno rekombinacijo na ponzr1 lokusu. Da bi preverili, ali je bila homologna rekombinacija v somatskem tkivu stabilna, so izvedli analizo biopsij dveh mesecev starih zebrafish-ev ter nato dodali EcoRV sekvenco v ponzr1 lokus. Uspešno vključitev EcoRV je pokazalo le 8 od 186 rib. Da bi ugotovili, ali je pomanjkanje somatske EcoRV vključitve povezano s pomanjkanjem prenosa skozi zarodne linije, so z EcoRV negativnimi biopsijami naključno izbrali 13 rib, pri potomcih le-teh pa je bila vključitev EcoRV v ponzr1 lokus negativna. Posledično so bile z biopsijo pri določitvi prenosa skozi zarodne linije izbrane le ribe s pozitivno vključitvijo EcoRV v ponzr1 lokus. Nadaljnje so se spraševali, ali bi lahko s ko-injiciranjem TALEN-ov in oligonukleotidov uvedli večje sekvence, kot je loxP mesto, le-to pa bi bil bistven korak pri izdelavi pogojnih genskih alelov. Za uspešno dodajanje spremenjenega loxP (mloxP) so uporabili TALEN-e v genu Crhr2 ter enoverižne DNA oligonukleotide, analiza PCR pa je pokazala somatsko vključitev mloxP sekvence na Crhr2 TALEN restrikcijskem mestu. <br /> <br /> == ZAKLJUČEK ==<br /> Za oceno morebitnih zunajtarčnih učinkov TALEN-ov ali homologne rekombinacije enoverižne DNA, bi bilo v prihodnje potrebno izvesti bolj celovite analize genomov. Potrebno bi bilo določiti zaporedje celotnega genoma rib iz različnih starševskih linij, ki prenašajo zarodne celice. Če bi analiza pokazala zunajtarčne mutacije, bi kot alternativen pristop lahko uporabili TALEN-e, ki temeljijo na fuziji nukleaz na osnovi heterodimerov. Rezultati raziskav prikazujejo prve uspešne homologne rekombinacije v zebrafish-u in vivo ter na osnovi enoverižne DNA kot matrice. Uporaba ssDNA olajša vrsto genomskih sprememb, vključno z uvedbo enojnih nukleotidnih polimorfizmov za genetske aplikacije na vretenčarjih. Na primer, donorska ssDNA lahko služi kot začetno mesto sinteze nove verige na TALEN prelomu. Podaljšanje 3´ konca oligonukleotida bi lahko ustvarila dolge homologne regije za začetek rekombinacije, vendar pa 5´ konec oligonukleotida omejuje podaljšanje nove verige in s tem možnost za homologno rekombinacijo. Z uporabo zebrafish-a je nastal posodobljen in visoko učinkovit TALEN sistem za uporabo pri genomskih modifikacijah in funkcionalnih genomskih aplikacijah. Poleg tega dokazujejo, da lahko za urejanje genomov uporabimo sintetične ssDNA oligonukleotide, vključno z natančnim vnosom eksogenega DNA zaporedja na specifičen lokus.<br /> <br /> == VIRI == <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/ (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ (1.12.2017)<br /> https://www.yourgenome.org/facts/why-use-the-zebrafish-in-research (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931354/ (1.12.2017)<br /> http://www.genetherapynet.com/gene-editing-tools/talen.html (1.12.2017)</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov&diff=13516 2017-12-03T10:40:12Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/<br /> <br /> == UVOD ==<br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organizmih, saj inducirajo prelome dvojnih verig DNA, popravljalni mehanizmi le-teh pa lahko potečejo preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). Pri popravljanju z NHEJ ne potrebujemo dodatne homologne regije, posledično pogosto prihaja do nastanka delecij ali insercij ter do izgube funkcije gena. Nasprotno pa HR zahteva prisotnost donorske DNA-matrice, le-to pa vodi do nastanka specifičnih substitucij in insercij. Priprava TALEN-ov je draga in zamudna, poleg tega pa večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev.<br /> <br /> == ZGRADBA IN DELOVANJE TALEN-ov ==<br /> TALEN-i so sestavljeni iz DNA-vezavne domene in nukleazne domene. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna ter posledično odgovorna za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- terminalni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI ter ima aktivacijsko vlogo. TALEN-i imajo višjo specifičnost pri urejanju genomov ter so manj toksični od nukleaz s cinkovimi prsti. Pred kratkim in vivo analizirali specifičnost TALEN-ov, rezultati pa so pokazali, da TALE ponovitve neodvisno prepoznajo komplementarne nukleotidne baze, obenem pa prikazujejo dovolj veliko specifičnost za uporabo na človeških celicah. <br /> Sosledje in število TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določajo zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi, od tega vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Do cepitve DNA pride na odseku med obema nukleaznima domenama, vsaka pa omogočata cepitev le ene verige DNA. Posledično je potrebno pri uvajanju dvojnih prelomov uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. <br /> <br /> == METODE ==<br /> TALEN-e so pridobili z GoldenGate metodo, s katero lahko učinkovito načrtujemo in sestavljamo TALE nukleaze in druge TAL efektorske konstrukte, z namenom ciljanja DNA. Ponavljajoča zaporedja TALE nukleaz so klonirali v pT3TS destinacijski vektor z ustreznim TALEN ogrodjem, mRNA pa so injicirali v enocelične ribje zarodke, ki so bili molekularno testirani ali pa vzgojeni za analizo mutacij zarodnih celic. Somatske in zarodne mutacije, povzročene s TALE nukleazami, so ovrednotili s metodama PCR in RFLP. Za povzročitev nastanka HR, so zasnovali enoverižne DNA oligonukleotide z EcoRV ali mloxP mestom s kratkimi homolognimi ročicami okoli TALEN tarčnih mest ter jih nato injicirali v enocelične ribje zarodke. S PCR metodo so analizirali modificirane lokuse ter tako skušali odkriti posledice somatskih in zarodnih HR dogodkov.<br /> <br /> == DIZAJN TALEN-ov ==<br /> Pri načrtovanju TALEN-ov so bili upoštevani trije kriteriji. Najprej so izbrali TALEN vezavna mesta, ki so bila dolga 15-25 baznih parov, dolžina vmesnika pa je merila 15-16 baznih parov. Kadar je bilo to le mogoče, so bile TALEN rezalne sekvence izbrane okoli restrikcijskega encima, lokaliziranega centralno znotraj distančnika. Za poenostavitev postopka izdelave TALEN-ov, so na spletu ustvarili brezplačno programsko opremo z odprtim dostopom.<br /> <br /> == UPORABA ZEBRAFISH-A ==<br /> Zebrafish je tropska riba iz JV Azije, katere ime izvira iz pasov, potekajočih vzdolž telesa. Vse pogosteje se uporablja za preučevanje osnovnih bolezni človeka, s pomočjo bogate palete genetskih in molekularnih orodij in vivo. Prednosti uporabe zebrafish-a so nizki stroški vzdrževanja, rastejo izjemno hitro, saj se v enem dnevu razvijejo toliko, kot se človeški zarodek v enem mesecu. Ribji zarodki so transparentni, kar raziskovalcem omogoča vpogled v razvoj notranjih struktur, poleg tega pa imajo podobno genetsko strukturo kot ljudje. <br /> Izboljšave v TALEN-ih zagotavljajo nov močan pristop za tarčno urejanje zebrafish genomov in funkcionalnih genomskih aplikacij. Z uporabo zebrafish-a kot dostavnega sistema in GoldyTALEN modificiranega ogrodja, imenovanega pKT3Ts-goldyTALEN (pKT3TsgT), ki bi preprečil rekombinacijo in s tem povečano število lažno pozitivnih kolonij pri sestavljanju TALEN-ov, dokazujejo, da ima izboljšan komplet TALEN orodij visoko specifičnost pri induciranju lokus specifičnih prelomov dvoverižne DNA v somatskih in tkivnih zarodnih linijah. S posodobljenim TALEN sistemom so uspešno uporabili enoverižne DNA oligonukleotide, s katerimi so natančno spreminjali sekvence na vnaprej določenih lokacijah zebrafish genoma, le-to pa so izvedli s pomočjo homologne rekombinacije in uvedbe EcoRV mesta ter modificirane loxP sekvence v somatsko tkivo. <br /> <br /> == RAZISKAVE NA ZEBRAFISH-U ==<br /> S pomočjo TALEN-ov so uvedli lokus specifične prelome dvojnih verig v zebrafish genomih, posledica katerih je nastanek velikega števila mutiranih alelov. Za izboljšanje in vivo učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja, so ga testirali z mRNA ekspresijskim vektorjem (pT3TS17), sledila je analiza DNA, s katero so določili nezmožnost restrikcijskega encima za prepoznavanje zaporedij TALEN mesta. Z uporabo prepoznavnih domen na GoldyTALEN ogrodju so ugotovili prisotnost šestkrat večjega števila genetskih mutacij na ponzr1 lokusu. Za nadaljnje testiranje učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja so ustvarili TALEN-e proti trem dodatnim lokusom, in sicer moesina, ppp1cabb in cdh5, na vsakem lokusu pa so opazili prisotnost mutageneze oziroma spreminjanja genov. Za določitev časovnega poteka sprememb, ki jih povzroča GoldyTALEN, so preučevali aktivnost restrikcijskega encima pri 256 celicah, 28 ur po oploditvi ter v 50 stopnjah oploditve. Rezultati prikazujejo zgodnje in učinkovito ciljanje genov v somatskih tkivih, vključno z bialelno pretvorbo pri nekaterih živalih. V odgovor na povečano aktivnost GoldyTALEN-ov so se spraševali, ali lahko injiciranje TALEN-ov vodi do izgube fenotipa funkcionalnega tarčnega moezinskega (MO) gena v zebrafish-u. Naredili so krivuljo odziva na odmerek zdravila pri moezinu, ppp1cab in cdh5 GoldyTALEN parih, koncentracijo GoldyTALEN parov so optimizirali na število zarodkov z bialelnimi spremembami ter določili kolikšen odstotek le-teh je mrtvih ali deformiranih. Zarodki, ki so bili vbrizgani s cdh5 GoldyTALEN-om ali pa z moezinom so pokazali podobne vaskularne fenotipe, in sicer izrazit srčni edem, izgubo patentnih lumnov v vaskulaturi in izgubo cirkulirajočih rdečih krvnih celic. Zbrani rezultati prikazujejo, da lahko z GoldyTALEN ogrodjem dosežemo učinkovito bialelno ciljanje znanih fenotipov, ki nakazujejo na izgubo funkcije, poleg tega pa podatki prikazujejo dopolnilno vlogo GoldyTALEN-ov pri oceni somatskih moezinskih fenotipov.<br /> <br /> == RAZISKAVE NA GoldyTALEN OGRODJU ==<br /> Za oceno prenosa mutacij na zarodne celice so vzgojili bialelno zebrafish ribo, ki so ji predhodno injicirali GoldyTALEN. Pregledali so 10 združenih F1 zarodkov ter tako prikazali frekvenco mutacij v lokusih, ki je znašala med 9 in 55 %. V dveh od treh lokusih zarodnih linij so odkrili mozaicizem, podatki pa obenem prikazujejo, da somatsko TALEN ciljanje uspešno prehaja skozi zarodne linije. Z uspešno modifikacijo genoma z GoldyTALEN-i domnevajo, da bi v prihodnje lahko zasnovali sintetične oligonukleotide tako, da bi le-ti lahko rezali na predvidenem TALEN mestu ter s tem služili kot osnova za homologno rekombinacijo in vivo. S ko-iniciacijo ponzr1 GoldyTALEN-a kot testnega lokusa in enoverižnega DNA oligonukleotida, so uvedli EcoRV restrikcijsko mesto. V poskusih je več kot polovica injiciranih zarodkov pokazala prisotnost kromosomov, ki so vsebovali EcoRV zaporedje, z analizo zaporedja pa so dokazali uspešno homologno rekombinacijo na ponzr1 lokusu. Da bi preverili, ali je bila homologna rekombinacija v somatskem tkivu stabilna, so izvedli analizo biopsij dveh mesecev starih zebrafish-ev ter nato dodali EcoRV sekvenco v ponzr1 lokus. Uspešno vključitev EcoRV je pokazalo le 8 od 186 rib. Da bi ugotovili, ali je pomanjkanje somatske EcoRV vključitve povezano s pomanjkanjem prenosa skozi zarodne linije, so z EcoRV negativnimi biopsijami naključno izbrali 13 rib, pri potomcih le-teh pa je bila vključitev EcoRV v ponzr1 lokus negativna. Posledično so bile z biopsijo pri določitvi prenosa skozi zarodne linije izbrane le ribe s pozitivno vključitvijo EcoRV v ponzr1 lokus. Nadaljnje so se spraševali, ali bi lahko s ko-injiciranjem TALEN-ov in oligonukleotidov uvedli večje sekvence, kot je loxP mesto, le-to pa bi bil bistven korak pri izdelavi pogojnih genskih alelov. Za uspešno dodajanje spremenjenega loxP (mloxP) so uporabili TALEN-e v genu Crhr2 ter enoverižne DNA oligonukleotide, analiza PCR pa je pokazala somatsko vključitev mloxP sekvence na Crhr2 TALEN restrikcijskem mestu. <br /> <br /> == ZAKLJUČEK ==<br /> Za oceno morebitnih zunajtarčnih učinkov TALEN-ov ali homologne rekombinacije enoverižne DNA, bi bilo v prihodnje potrebno izvesti bolj celovite analize genomov. Potrebno bi bilo določiti zaporedje celotnega genoma rib iz različnih starševskih linij, ki prenašajo zarodne celice. Če bi analiza pokazala zunajtarčne mutacije, bi kot alternativen pristop lahko uporabili TALEN-e, ki temeljijo na fuziji nukleaz na osnovi heterodimerov. Rezultati raziskav prikazujejo prve uspešne homologne rekombinacije v zebrafish-u in vivo ter na osnovi enoverižne DNA kot matrice. Uporaba ssDNA olajša vrsto genomskih sprememb, vključno z uvedbo enojnih nukleotidnih polimorfizmov za genetske aplikacije na vretenčarjih. Na primer, donorska ssDNA lahko služi kot začetno mesto sinteze nove verige na TALEN prelomu. Podaljšanje 3´ konca oligonukleotida bi lahko ustvarila dolge homologne regije za začetek rekombinacije, vendar pa 5´ konec oligonukleotida omejuje podaljšanje nove verige in s tem možnost za homologno rekombinacijo. Z uporabo zebrafish-a je nastal posodobljen in visoko učinkovit TALEN sistem za uporabo pri genomskih modifikacijah in funkcionalnih genomskih aplikacijah. Poleg tega dokazujejo, da lahko za urejanje genomov uporabimo sintetične ssDNA oligonukleotide, vključno z natančnim vnosom eksogenega DNA zaporedja na specifičen lokus.<br /> <br /> == VIRI == <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/ (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ (1.12.2017)<br /> https://www.yourgenome.org/facts/why-use-the-zebrafish-in-research (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931354/ (1.12.2017)<br /> http://www.genetherapynet.com/gene-editing-tools/talen.html (1.12.2017)</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov&diff=13515 2017-12-03T10:12:39Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/<br /> <br /> == UVOD ==<br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organizmih, saj inducirajo prelome dvojnih verig DNA, popravljalni mehanizmi le-teh pa lahko potečejo preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). Pri popravljanju z NHEJ ne potrebujemo dodatne homologne regije, posledično pogosto prihaja do nastanka delecij ali insercij ter do izgube funkcije gena. Nasprotno pa HR zahteva prisotnost donorske DNA-matrice, le-to pa vodi do nastanka specifičnih substitucij in insercij. Priprava TALEN-ov je draga in zamudna, poleg tega pa večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev.<br /> <br /> == ZGRADBA IN DELOVANJE TALEN-ov ==<br /> TALEN-i so sestavljeni iz DNA-vezavne domene in nukleazne domene. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna ter posledično odgovorna za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- terminalni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI ter ima aktivacijsko vlogo. TALEN-i imajo višjo specifičnost pri urejanju genomov ter so manj toksični od nukleaz s cinkovimi prsti. Pred kratkim in vivo analizirali specifičnost TALEN-ov, rezultati pa so pokazali, da TALE ponovitve neodvisno prepoznajo komplementarne nukleotidne baze, obenem pa prikazujejo dovolj veliko specifičnost za uporabo na človeških celicah. <br /> Sosledje in število TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določajo zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi, od tega vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Do cepitve DNA pride na odseku med obema nukleaznima domenama, vsaka pa omogočata cepitev le ene verige DNA. Posledično je potrebno pri uvajanju dvojnih prelomov uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. <br /> <br /> == METODE ==<br /> TALEN-e so pridobili z GoldenGate metodo, s katero lahko učinkovito načrtujemo in sestavljamo TALE nukleaze in druge TAL efektorske konstrukte, z namenom ciljanja DNA. Ponavljajoča zaporedja TALE nukleaz so klonirali v pT3TS destinacijski vektor z ustreznim TALEN ogrodjem, mRNA pa so injicirali v enocelične ribje zarodke, ki so bili molekularno testirani ali pa vzgojeni za analizo mutacij zarodnih celic. Somatske in zarodne mutacije, povzročene s TALE nukleazami, so ovrednotili s metodama PCR in RFLP. Za povzročitev nastanka HR, so zasnovali enoverižne DNA oligonukleotide z EcoRV ali mloxP mestom s kratkimi homolognimi ročicami okoli TALEN tarčnih mest ter jih nato injicirali v enocelične ribje zarodke. S PCR metodo so analizirali modificirane lokuse ter tako skušali odkriti posledice somatskih in zarodnih HR dogodkov.<br /> <br /> == DIZAJN TALEN-ov ==<br /> Pri načrtovanju TALEN-ov so bili upoštevani trije kriteriji. Najprej so izbrali TALEN vezavna mesta, ki so bila dolga 15-25 baznih parov, dolžina distančnika pa je merila 15-16 baznih parov. Kadar je bilo to le mogoče, so bile TALEN rezalne sekvence izbrane okoli restrikcijskega encima, lokaliziranega centralno znotraj distančnika. Za poenostavitev postopka izdelave TALEN-ov, so na spletu ustvarili brezplačno programsko opremo z odprtim dostopom.<br /> <br /> == UPORABA ZEBRAFISH-A ==<br /> Zebrafish je tropska riba iz JV Azije, katere ime izvira iz pasov, potekajočih vzdolž telesa. Vse pogosteje se uporablja za preučevanje osnovnih bolezni človeka, s pomočjo bogate palete genetskih in molekularnih orodij in vivo. Prednosti uporabe zebrafish-a so nizki stroški vzdrževanja, rastejo izjemno hitro, saj se v enem dnevu razvijejo toliko, kot se človeški zarodek v enem mesecu. Ribji zarodki so transparentni, kar raziskovalcem omogoča vpogled v razvoj notranjih struktur, poleg tega pa imajo podobno genetsko strukturo kot ljudje. <br /> Izboljšave v TALEN-ih zagotavljajo nov močan pristop za tarčno urejanje zebrafish genomov in funkcionalnih genomskih aplikacij. Z uporabo zebrafish-a kot dostavnega sistema in GoldyTALEN modificiranega ogrodja, imenovanega pKT3Ts-goldyTALEN (pKT3TsgT), ki bi preprečil rekombinacijo in s tem povečano število lažno pozitivnih kolonij pri sestavljanju TALEN-ov, dokazujejo, da ima izboljšan komplet TALEN orodij visoko specifičnost pri induciranju lokus specifičnih prelomov dvoverižne DNA v somatskih in tkivnih zarodnih linijah. S posodobljenim TALEN sistemom so uspešno uporabili enoverižne DNA oligonukleotide, s katerimi so natančno spreminjali sekvence na vnaprej določenih lokacijah zebrafish genoma, le-to pa so izvedli s pomočjo homologne rekombinacije in uvedbe EcoRV mesta ter modificirane loxP sekvence v somatsko tkivo. <br /> <br /> == RAZISKAVE NA ZEBRAFISH-U ==<br /> S pomočjo TALEN-ov so uvedli lokus specifične prelome dvojnih verig v zebrafish genomih, posledica katerih je nastanek velikega števila mutiranih alelov. Za izboljšanje in vivo učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja, so ga testirali z mRNA ekspresijskim vektorjem (pT3TS17), sledila je analiza DNA, s katero so določili nezmožnost restrikcijskega encima za prepoznavanje zaporedij TALEN mesta. Z uporabo prepoznavnih domen na GoldyTALEN ogrodju so ugotovili prisotnost šestkrat večjega števila genetskih mutacij na ponzr1 lokusu. Za nadaljnje testiranje učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja so ustvarili TALEN-e proti trem dodatnim lokusom, in sicer moesina, ppp1cabb in cdh5, na vsakem lokusu pa so opazili prisotnost mutageneze oziroma spreminjanja genov. Za določitev časovnega poteka sprememb, ki jih povzroča GoldyTALEN, so preučevali aktivnost restrikcijskega encima pri 256 celicah, 28 ur po oploditvi ter v 50 stopnjah oploditve. Rezultati prikazujejo zgodnje in učinkovito ciljanje genov v somatskih tkivih, vključno z bialelno pretvorbo pri nekaterih živalih. V odgovor na povečano aktivnost GoldyTALEN-ov so se spraševali, ali lahko injiciranje TALEN-ov vodi do izgube fenotipa funkcionalnega tarčnega moezinskega (MO) gena v zebrafish-u. Naredili so krivuljo odziva na odmerek zdravila pri moezinu, ppp1cab in cdh5 GoldyTALEN parih, koncentracijo GoldyTALEN parov so optimizirali na število zarodkov z bialelnimi spremembami ter določili kolikšen odstotek le-teh je mrtvih ali deformiranih. Zarodki, ki so bili vbrizgani s cdh5 GoldyTALEN-om ali pa z moezinom so pokazali podobne vaskularne fenotipe, in sicer izrazit srčni edem, izgubo patentnih lumnov v vaskulaturi in izgubo cirkulirajočih rdečih krvnih celic. Zbrani rezultati prikazujejo, da lahko z GoldyTALEN ogrodjem dosežemo učinkovito bialelno ciljanje znanih fenotipov, ki nakazujejo na izgubo funkcije, poleg tega pa podatki prikazujejo dopolnilno vlogo GoldyTALEN-ov pri oceni somatskih moezinskih fenotipov.<br /> <br /> == RAZISKAVE NA GoldyTALEN OGRODJU ==<br /> Za oceno prenosa mutacij na zarodne celice so vzgojili bialelno zebrafish ribo, ki so ji predhodno injicirali GoldyTALEN. Pregledali so 10 združenih F1 zarodkov ter tako prikazali frekvenco mutacij v lokusih, ki je znašala med 9 in 55 %. V dveh od treh lokusih zarodnih linij so odkrili mozaicizem, podatki pa obenem prikazujejo, da somatsko TALEN ciljanje uspešno prehaja skozi zarodne linije. Z uspešno modifikacijo genoma z GoldyTALEN-i domnevajo, da bi v prihodnje lahko zasnovali sintetične oligonukleotide tako, da bi le-ti lahko rezali na predvidenem TALEN mestu ter s tem služili kot osnova za homologno rekombinacijo in vivo. S ko-iniciacijo ponzr1 GoldyTALEN-a kot testnega lokusa in enoverižnega DNA oligonukleotida, so uvedli EcoRV restrikcijsko mesto. V poskusih je več kot polovica injiciranih zarodkov pokazala prisotnost kromosomov, ki so vsebovali EcoRV zaporedje, z analizo zaporedja pa so dokazali uspešno homologno rekombinacijo na ponzr1 lokusu. Da bi preverili, ali je bila homologna rekombinacija v somatskem tkivu stabilna, so izvedli analizo biopsij dveh mesecev starih zebrafish-ev ter nato dodali EcoRV sekvenco v ponzr1 lokus. Uspešno vključitev EcoRV je pokazalo le 8 od 186 rib. Da bi ugotovili, ali je pomanjkanje somatske EcoRV vključitve povezano s pomanjkanjem prenosa skozi zarodne linije, so z EcoRV negativnimi biopsijami naključno izbrali 13 rib, pri potomcih le-teh pa je bila vključitev EcoRV v ponzr1 lokus negativna. Posledično so bile z biopsijo pri določitvi prenosa skozi zarodne linije izbrane le ribe s pozitivno vključitvijo EcoRV v ponzr1 lokus. Nadaljnje so se spraševali, ali bi lahko s ko-injiciranjem TALEN-ov in oligonukleotidov uvedli večje sekvence, kot je loxP mesto, le-to pa bi bil bistven korak pri izdelavi pogojnih genskih alelov. Za uspešno dodajanje spremenjenega loxP (mloxP) so uporabili TALEN-e v genu Crhr2 ter enoverižne DNA oligonukleotide, analiza PCR pa je pokazala somatsko vključitev mloxP sekvence na Crhr2 TALEN restrikcijskem mestu. <br /> <br /> == ZAKLJUČEK ==<br /> Za oceno morebitnih zunajtarčnih učinkov TALEN-ov ali homologne rekombinacije enoverižne DNA, bi bilo v prihodnje potrebno izvesti bolj celovite analize genomov. Potrebno bi bilo določiti zaporedje celotnega genoma rib iz različnih starševskih linij, ki prenašajo zarodne celice. Če bi analiza pokazala zunajtarčne mutacije, bi kot alternativen pristop lahko uporabili TALEN-e, ki temeljijo na fuziji nukleaz na osnovi heterodimerov. Rezultati raziskav prikazujejo prve uspešne homologne rekombinacije v zebrafish-u in vivo ter na osnovi enoverižne DNA kot matrice. Uporaba ssDNA olajša vrsto genomskih sprememb, vključno z uvedbo enojnih nukleotidnih polimorfizmov za genetske aplikacije na vretenčarjih. Na primer, donorska ssDNA lahko služi kot začetno mesto sinteze nove verige na TALEN prelomu. Podaljšanje 3´ konca oligonukleotida bi lahko ustvarila dolge homologne regije za začetek rekombinacije, vendar pa 5´ konec oligonukleotida omejuje podaljšanje nove verige in s tem možnost za homologno rekombinacijo. Z uporabo zebrafish-a je nastal posodobljen in visoko učinkovit TALEN sistem za uporabo pri genomskih modifikacijah in funkcionalnih genomskih aplikacijah. Poleg tega dokazujejo, da lahko za urejanje genomov uporabimo sintetične ssDNA oligonukleotide, vključno z natančnim vnosom eksogenega DNA zaporedja na specifičen lokus.<br /> <br /> == VIRI == <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/ (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ (1.12.2017)<br /> https://www.yourgenome.org/facts/why-use-the-zebrafish-in-research (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931354/ (1.12.2017)<br /> http://www.genetherapynet.com/gene-editing-tools/talen.html (1.12.2017)</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov&diff=13514 2017-12-03T08:30:00Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/<br /> <br /> == UVOD ==<br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organizmih, saj inducirajo prelome dvojnih verig DNA, popravljalni mehanizmi le-teh pa lahko potečejo preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). Pri popravljanju z NHEJ ne potrebujemo dodatne homologne regije, posledično pogosto prihaja do nastanka delecij ali insercij ter do izgube funkcije gena. Nasprotno pa HR zahteva prisotnost donorske DNA-matrice, le-to pa vodi do nastanka specifičnih substitucij in insercij. Priprava TALEN-ov je draga in zamudna, poleg tega pa večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev.<br /> <br /> == ZGRADBA IN DELOVANJE TALEN-ov ==<br /> TALEN-i so sestavljeni iz DNA-vezavne domene in nukleazne domene. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna ter posledično odgovorna za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- terminalni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI ter ima aktivacijsko vlogo. TALEN-i imajo višjo specifičnost pri urejanju genomov ter so manj toksični od nukleaz s cinkovimi prsti. Pred kratkim in vivo analizirali specifičnost TALEN-ov, rezultati pa so pokazali, da TALE ponovitve neodvisno prepoznajo komplementarne nukleotidne baze, obenem pa prikazujejo dovolj veliko specifičnost za uporabo na človeških celicah. <br /> Sosledje in število TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določajo zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi, od tega vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Do cepitve DNA pride na odseku med obema nukleaznima domenama, vsaka pa omogočata cepitev le ene verige DNA. Posledično je potrebno pri uvajanju dvojnim prelomov uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. <br /> <br /> == METODE ==<br /> TALEN-e so pridobili z GoldenGate metodo, s katero lahko učinkovito načrtujemo in sestavljamo TALE nukleaze in druge TAL efektorske konstrukte, z namenom ciljanja DNA. Ponavljajoča zaporedja TALE nukleaz so klonirali v pT3TS destinacijski vektor z ustreznim TALEN ogrodjem, mRNA pa so injicirali v enocelične ribje zarodke, ki so bili molekularno testirani ali pa vzgojeni za analizo mutacij zarodnih celic. Somatske in zarodne mutacije, povzročene s TALE nukleazami, so ovrednotili s metodama PCR in RFLP. Za povzročitev nastanka HR, so zasnovali enoverižne DNA oligonukleotide z EcoRV ali mloxP mestom s kratkimi homolognimi ročicami okoli TALEN tarčnih mest ter jih nato injicirali v enocelične ribje zarodke. S PCR metodo so analizirali modificirane lokuse ter tako skušali odkriti posledice somatskih in zarodnih HR dogodkov.<br /> <br /> == DIZAJN TALEN-ov ==<br /> Pri načrtovanju TALEN-ov so bili upoštevani trije kriteriji. Najprej so izbrali TALEN vezavna mesta, ki so bila dolga 15-25 baznih parov, dolžina distančnika pa je merila 15-16 baznih parov. Kadar je bilo to le mogoče, so bile TALEN rezalne sekvence izbrane okoli restrikcijskega encima, lokaliziranega centralno znotraj distančnika. Za poenostavitev postopka izdelave TALEN-ov, so na spletu ustvarili brezplačno programsko opremo z odprtim dostopom.<br /> <br /> == UPORABA ZEBRAFISH-A ==<br /> Zebrafish je tropska riba iz JV Azije, katere ime izvira iz pasov, potekajočih vzdolž telesa. Vse pogosteje se uporablja za preučevanje osnovnih bolezni človeka, s pomočjo bogate palete genetskih in molekularnih orodij in vivo. Prednosti uporabe zebrafish-a so nizki stroški vzdrževanja, rastejo izjemno hitro, saj se v enem dnevu razvijejo toliko, kot se človeški zarodek v enem mesecu. Ribji zarodki so transparentni, kar raziskovalcem omogoča vpogled v razvoj notranjih struktur, poleg tega pa imajo podobno genetsko strukturo kot ljudje. <br /> Izboljšave v TALEN-ih zagotavljajo nov močan pristop za tarčno urejanje zebrafish genomov in funkcionalnih genomskih aplikacij. Z uporabo zebrafish-a kot dostavnega sistema in GoldyTALEN modificiranega ogrodja, imenovanega pKT3Ts-goldyTALEN (pKT3TsgT), ki bi preprečil rekombinacijo in s tem povečano število lažno pozitivnih kolonij pri sestavljanju TALEN-ov, dokazujejo, da ima izboljšan komplet TALEN orodij visoko specifičnost pri induciranju lokus specifičnih prelomov dvoverižne DNA v somatskih in tkivnih zarodnih linijah. S posodobljenim TALEN sistemom so uspešno uporabili enoverižne DNA oligonukleotide, s katerimi so natančno spreminjali sekvence na vnaprej določenih lokacijah zebrafish genoma, le-to pa so izvedli s pomočjo homologne rekombinacije in uvedbe EcoRV mesta ter modificirane loxP sekvence v somatsko tkivo. <br /> <br /> == RAZISKAVE NA ZEBRAFISH-U ==<br /> S pomočjo TALEN-ov so uvedli lokus specifične prelome dvojnih verig v zebrafish genomih, posledica katerih je nastanek velikega števila mutiranih alelov. Za izboljšanje in vivo učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja, so ga testirali z mRNA ekspresijskim vektorjem (pT3TS17), sledila je analiza DNA, s katero so določili nezmožnost restrikcijskega encima za prepoznavanje zaporedij TALEN mesta. Z uporabo prepoznavnih domen na GoldyTALEN ogrodju so ugotovili prisotnost šestkrat večjega števila genetskih mutacij na ponzr1 lokusu. Za nadaljnje testiranje učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja so ustvarili TALEN-e proti trem dodatnim lokusom, in sicer moesina, ppp1cabb in cdh5, na vsakem lokusu pa so opazili prisotnost mutageneze oziroma spreminjanja genov. Za določitev časovnega poteka sprememb, ki jih povzroča GoldyTALEN, so preučevali aktivnost restrikcijskega encima pri 256 celicah, 28 ur po oploditvi ter v 50 stopnjah oploditve. Rezultati prikazujejo zgodnje in učinkovito ciljanje genov v somatskih tkivih, vključno z bialelno pretvorbo pri nekaterih živalih. V odgovor na povečano aktivnost GoldyTALEN-ov so se spraševali, ali lahko injiciranje TALEN-ov vodi do izgube fenotipa funkcionalnega tarčnega moezinskega (MO) gena v zebrafish-u. Naredili so krivuljo odziva na odmerek zdravila pri moezinu, ppp1cab in cdh5 GoldyTALEN parih, koncentracijo GoldyTALEN parov so optimizirali na število zarodkov z bialelnimi spremembami ter določili kolikšen odstotek le-teh je mrtvih ali deformiranih. Zarodki, ki so bili vbrizgani s cdh5 GoldyTALEN-om ali pa z moezinom so pokazali podobne vaskularne fenotipe, in sicer izrazit srčni edem, izgubo patentnih lumnov v vaskulaturi in izgubo cirkulirajočih rdečih krvnih celic. Zbrani rezultati prikazujejo, da lahko z GoldyTALEN ogrodjem dosežemo učinkovito bialelno ciljanje znanih fenotipov, ki nakazujejo na izgubo funkcije, poleg tega pa podatki prikazujejo dopolnilno vlogo GoldyTALEN-ov pri oceni somatskih moezinskih fenotipov.<br /> <br /> == RAZISKAVE NA GoldyTALEN OGRODJU ==<br /> Za oceno prenosa mutacij na zarodne celice so vzgojili bialelno zebrafish ribo, ki so ji predhodno injicirali GoldyTALEN. Pregledali so 10 združenih F1 zarodkov ter tako prikazali frekvenco mutacij v lokusih, ki je znašala med 9 in 55 %. V dveh od treh lokusih zarodnih linij so odkrili mozaicizem, podatki pa obenem prikazujejo, da somatsko TALEN ciljanje uspešno prehaja skozi zarodne linije. Z uspešno modifikacijo genoma z GoldyTALEN-i domnevajo, da bi v prihodnje lahko zasnovali sintetične oligonukleotide tako, da bi le-ti lahko rezali na predvidenem TALEN mestu ter s tem služili kot osnova za homologno rekombinacijo in vivo. S ko-iniciacijo ponzr1 GoldyTALEN-a kot testnega lokusa in enoverižnega DNA oligonukleotida, so uvedli EcoRV restrikcijsko mesto. V poskusih je več kot polovica injiciranih zarodkov pokazala prisotnost kromosomov, ki so vsebovali EcoRV zaporedje, z analizo zaporedja pa so dokazali uspešno homologno rekombinacijo na ponzr1 lokusu. Da bi preverili, ali je bila homologna rekombinacija v somatskem tkivu stabilna, so izvedli analizo biopsij dveh mesecev starih zebrafish-ev ter nato dodali EcoRV sekvenco v ponzr1 lokus. Uspešno vključitev EcoRV je pokazalo le 8 od 186 rib. Da bi ugotovili, ali je pomanjkanje somatske EcoRV vključitve povezano s pomanjkanjem prenosa skozi zarodne linije, so z EcoRV negativnimi biopsijami naključno izbrali 13 rib, pri potomcih le-teh pa je bila vključitev EcoRV v ponzr1 lokus negativna. Posledično so bile z biopsijo pri določitvi prenosa skozi zarodne linije izbrane le ribe s pozitivno vključitvijo EcoRV v ponzr1 lokus. Nadaljnje so se spraševali, ali bi lahko s ko-injiciranjem TALEN-ov in oligonukleotidov uvedli večje sekvence, kot je loxP mesto, le-to pa bi bil bistven korak pri izdelavi pogojnih genskih alelov. Za uspešno dodajanje spremenjenega loxP (mloxP) so uporabili TALEN-e v genu Crhr2 ter enoverižne DNA oligonukleotide, analiza PCR pa je pokazala somatsko vključitev mloxP sekvence na Crhr2 TALEN restrikcijskem mestu. <br /> <br /> == ZAKLJUČEK ==<br /> Za oceno morebitnih zunajtarčnih učinkov TALEN-ov ali homologne rekombinacije enoverižne DNA, bi bilo v prihodnje potrebno izvesti bolj celovite analize genomov. Potrebno bi bilo določiti zaporedje celotnega genoma rib iz različnih starševskih linij, ki prenašajo zarodne celice. Če bi analiza pokazala zunajtarčne mutacije, bi kot alternativen pristop lahko uporabili TALEN-e, ki temeljijo na fuziji nukleaz na osnovi heterodimerov. Rezultati raziskav prikazujejo prve uspešne homologne rekombinacije v zebrafish-u in vivo ter na osnovi enoverižne DNA kot matrice. Uporaba ssDNA olajša vrsto genomskih sprememb, vključno z uvedbo enojnih nukleotidnih polimorfizmov za genetske aplikacije na vretenčarjih. Na primer, donorska ssDNA lahko služi kot začetno mesto sinteze nove verige na TALEN prelomu. Podaljšanje 3´ konca oligonukleotida bi lahko ustvarila dolge homologne regije za začetek rekombinacije, vendar pa 5´ konec oligonukleotida omejuje podaljšanje nove verige in s tem možnost za homologno rekombinacijo. Z uporabo zebrafish-a je nastal posodobljen in visoko učinkovit TALEN sistem za uporabo pri genomskih modifikacijah in funkcionalnih genomskih aplikacijah. Poleg tega dokazujejo, da lahko za urejanje genomov uporabimo sintetične ssDNA oligonukleotide, vključno z natančnim vnosom eksogenega DNA zaporedja na specifičen lokus.<br /> <br /> == VIRI == <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/ (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ (1.12.2017)<br /> https://www.yourgenome.org/facts/why-use-the-zebrafish-in-research (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931354/ (1.12.2017)<br /> http://www.genetherapynet.com/gene-editing-tools/talen.html (1.12.2017)</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov&diff=13513 2017-12-02T13:05:56Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organizmih, saj inducirajo prelome dvojnih verig DNA, popravljalni mehanizmi le-teh pa lahko potečejo preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). Pri popravljanju z NHEJ ne potrebujemo dodatne homologne regije, posledično pogosto prihaja do nastanka delecij ali insercij ter do izgube funkcije gena. Nasprotno pa HR zahteva prisotnost donorske DNA-matrice, le-to pa vodi do nastanka specifičnih substitucij in insercij. Priprava TALEN-ov je draga in zamudna, poleg tega pa večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev.<br /> <br /> == ZGRADBA IN DELOVANJE TALEN-ov ==<br /> TALEN-i so sestavljeni iz DNA-vezavne domene in nukleazne domene. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna ter posledično odgovorna za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- terminalni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI ter ima aktivacijsko vlogo. TALEN-i imajo višjo specifičnost pri urejanju genomov ter so manj toksični od nukleaz s cinkovimi prsti. Pred kratkim in vivo analizirali specifičnost TALEN-ov, rezultati pa so pokazali, da TALE ponovitve neodvisno prepoznajo komplementarne nukleotidne baze, obenem pa prikazujejo dovolj veliko specifičnost za uporabo na človeških celicah. <br /> Sosledje in število TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določajo zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi, od tega vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Do cepitve DNA pride na odseku med obema nukleaznima domenama, vsaka pa omogočata cepitev le ene verige DNA. Posledično je potrebno pri uvajanju dvojnim prelomov uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. <br /> <br /> == METODE ==<br /> TALEN-e so pridobili z GoldenGate metodo, s katero lahko učinkovito načrtujemo in sestavljamo TALE nukleaze in druge TAL efektorske konstrukte, z namenom ciljanja DNA. Ponavljajoča zaporedja TALE nukleaz so klonirali v pT3TS destinacijski vektor z ustreznim TALEN ogrodjem, mRNA pa so injicirali v enocelične ribje zarodke, ki so bili molekularno testirani ali pa vzgojeni za analizo mutacij zarodnih celic. Somatske in zarodne mutacije, povzročene s TALE nukleazami, so ovrednotili s metodama PCR in RFLP. Za povzročitev nastanka HR, so zasnovali enoverižne DNA oligonukleotide z EcoRV ali mloxP mestom s kratkimi homolognimi ročicami okoli TALEN tarčnih mest ter jih nato injicirali v enocelične ribje zarodke. S PCR metodo so analizirali modificirane lokuse ter tako skušali odkriti posledice somatskih in zarodnih HR dogodkov.<br /> <br /> == DIZAJN TALEN-ov ==<br /> Pri načrtovanju TALEN-ov so bili upoštevani trije kriteriji. Najprej so izbrali TALEN vezavna mesta, ki so bila dolga 15-25 baznih parov, dolžina distančnika pa je merila 15-16 baznih parov. Kadar je bilo to le mogoče, so bile TALEN rezalne sekvence izbrane okoli restrikcijskega encima, lokaliziranega centralno znotraj distančnika. Za poenostavitev postopka izdelave TALEN-ov, so na spletu ustvarili brezplačno programsko opremo z odprtim dostopom.<br /> <br /> == UPORABA ZEBRAFISH-A ==<br /> Zebrafish je tropska riba iz JV Azije, katere ime izvira iz pasov, potekajočih vzdolž telesa. Vse pogosteje se uporablja za preučevanje osnovnih bolezni človeka, s pomočjo bogate palete genetskih in molekularnih orodij in vivo. Prednosti uporabe zebrafish-a so nizki stroški vzdrževanja, rastejo izjemno hitro, saj se v enem dnevu razvijejo toliko, kot se človeški zarodek v enem mesecu. Ribji zarodki so transparentni, kar raziskovalcem omogoča vpogled v razvoj notranjih struktur, poleg tega pa imajo podobno genetsko strukturo kot ljudje. <br /> Izboljšave v TALEN-ih zagotavljajo nov močan pristop za tarčno urejanje zebrafish genomov in funkcionalnih genomskih aplikacij. Z uporabo zebrafish-a kot dostavnega sistema in GoldyTALEN modificiranega ogrodja, imenovanega pKT3Ts-goldyTALEN (pKT3TsgT), ki bi preprečil rekombinacijo in s tem povečano število lažno pozitivnih kolonij pri sestavljanju TALEN-ov, dokazujejo, da ima izboljšan komplet TALEN orodij visoko specifičnost pri induciranju lokus specifičnih prelomov dvoverižne DNA v somatskih in tkivnih zarodnih linijah. S posodobljenim TALEN sistemom so uspešno uporabili enoverižne DNA oligonukleotide, s katerimi so natančno spreminjali sekvence na vnaprej določenih lokacijah zebrafish genoma, le-to pa so izvedli s pomočjo homologne rekombinacije in uvedbe EcoRV mesta ter modificirane loxP sekvence v somatsko tkivo. <br /> <br /> == RAZISKAVE NA ZEBRAFISH-U ==<br /> S pomočjo TALEN-ov so uvedli lokus specifične prelome dvojnih verig v zebrafish genomih, posledica katerih je nastanek velikega števila mutiranih alelov. Za izboljšanje in vivo učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja, so ga testirali z mRNA ekspresijskim vektorjem (pT3TS17), sledila je analiza DNA, s katero so določili nezmožnost restrikcijskega encima za prepoznavanje zaporedij TALEN mesta. Z uporabo prepoznavnih domen na GoldyTALEN ogrodju so ugotovili prisotnost šestkrat večjega števila genetskih mutacij na ponzr1 lokusu. Za nadaljnje testiranje učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja so ustvarili TALEN-e proti trem dodatnim lokusom, in sicer moesina, ppp1cabb in cdh5, na vsakem lokusu pa so opazili prisotnost mutageneze oziroma spreminjanja genov. Za določitev časovnega poteka sprememb, ki jih povzroča GoldyTALEN, so preučevali aktivnost restrikcijskega encima pri 256 celicah, 28 ur po oploditvi ter v 50 stopnjah oploditve. Rezultati prikazujejo zgodnje in učinkovito ciljanje genov v somatskih tkivih, vključno z bialelno pretvorbo pri nekaterih živalih. V odgovor na povečano aktivnost GoldyTALEN-ov so se spraševali, ali lahko injiciranje TALEN-ov vodi do izgube fenotipa funkcionalnega tarčnega moezinskega (MO) gena v zebrafish-u. Naredili so krivuljo odziva na odmerek zdravila pri moezinu, ppp1cab in cdh5 GoldyTALEN parih, koncentracijo GoldyTALEN parov so optimizirali na število zarodkov z bialelnimi spremembami ter določili kolikšen odstotek le-teh je mrtvih ali deformiranih. Zarodki, ki so bili vbrizgani s cdh5 GoldyTALEN-om ali pa z moezinom so pokazali podobne vaskularne fenotipe, in sicer izrazit srčni edem, izgubo patentnih lumnov v vaskulaturi in izgubo cirkulirajočih rdečih krvnih celic. Zbrani rezultati prikazujejo, da lahko z GoldyTALEN ogrodjem dosežemo učinkovito bialelno ciljanje znanih fenotipov, ki nakazujejo na izgubo funkcije, poleg tega pa podatki prikazujejo dopolnilno vlogo GoldyTALEN-ov pri oceni somatskih moezinskih fenotipov.<br /> <br /> == RAZISKAVE NA GoldyTALEN OGRODJU ==<br /> Za oceno prenosa mutacij na zarodne celice so vzgojili bialelno zebrafish ribo, ki so ji predhodno injicirali GoldyTALEN. Pregledali so 10 združenih F1 zarodkov ter tako prikazali frekvenco mutacij v lokusih, ki je znašala med 9 in 55 %. V dveh od treh lokusih zarodnih linij so odkrili mozaicizem, podatki pa obenem prikazujejo, da somatsko TALEN ciljanje uspešno prehaja skozi zarodne linije. Z uspešno modifikacijo genoma z GoldyTALEN-i domnevajo, da bi v prihodnje lahko zasnovali sintetične oligonukleotide tako, da bi le-ti lahko rezali na predvidenem TALEN mestu ter s tem služili kot osnova za homologno rekombinacijo in vivo. S ko-iniciacijo ponzr1 GoldyTALEN-a kot testnega lokusa in enoverižnega DNA oligonukleotida, so uvedli EcoRV restrikcijsko mesto. V poskusih je več kot polovica injiciranih zarodkov pokazala prisotnost kromosomov, ki so vsebovali EcoRV zaporedje, z analizo zaporedja pa so dokazali uspešno homologno rekombinacijo na ponzr1 lokusu. Da bi preverili, ali je bila homologna rekombinacija v somatskem tkivu stabilna, so izvedli analizo biopsij dveh mesecev starih zebrafish-ev ter nato dodali EcoRV sekvenco v ponzr1 lokus. Uspešno vključitev EcoRV je pokazalo le 8 od 186 rib. Da bi ugotovili, ali je pomanjkanje somatske EcoRV vključitve povezano s pomanjkanjem prenosa skozi zarodne linije, so z EcoRV negativnimi biopsijami naključno izbrali 13 rib, pri potomcih le-teh pa je bila vključitev EcoRV v ponzr1 lokus negativna. Posledično so bile z biopsijo pri določitvi prenosa skozi zarodne linije izbrane le ribe s pozitivno vključitvijo EcoRV v ponzr1 lokus. Nadaljnje so se spraševali, ali bi lahko s ko-injiciranjem TALEN-ov in oligonukleotidov uvedli večje sekvence, kot je loxP mesto, le-to pa bi bil bistven korak pri izdelavi pogojnih genskih alelov. Za uspešno dodajanje spremenjenega loxP (mloxP) so uporabili TALEN-e v genu Crhr2 ter enoverižne DNA oligonukleotide, analiza PCR pa je pokazala somatsko vključitev mloxP sekvence na Crhr2 TALEN restrikcijskem mestu. <br /> <br /> == ZAKLJUČEK ==<br /> Za oceno morebitnih zunajtarčnih učinkov TALEN-ov ali homologne rekombinacije enoverižne DNA, bi bilo v prihodnje potrebno izvesti bolj celovite analize genomov. Potrebno bi bilo določiti zaporedje celotnega genoma rib iz različnih starševskih linij, ki prenašajo zarodne celice. Če bi analiza pokazala zunajtarčne mutacije, bi kot alternativen pristop lahko uporabili TALEN-e, ki temeljijo na fuziji nukleaz na osnovi heterodimerov. Rezultati raziskav prikazujejo prve uspešne homologne rekombinacije v zebrafish-u in vivo ter na osnovi enoverižne DNA kot matrice. Uporaba ssDNA olajša vrsto genomskih sprememb, vključno z uvedbo enojnih nukleotidnih polimorfizmov za genetske aplikacije na vretenčarjih. Na primer, donorska ssDNA lahko služi kot začetno mesto sinteze nove verige na TALEN prelomu. Podaljšanje 3´ konca oligonukleotida bi lahko ustvarila dolge homologne regije za začetek rekombinacije, vendar pa 5´ konec oligonukleotida omejuje podaljšanje nove verige in s tem možnost za homologno rekombinacijo. Z uporabo zebrafish-a je nastal posodobljen in visoko učinkovit TALEN sistem za uporabo pri genomskih modifikacijah in funkcionalnih genomskih aplikacijah. Poleg tega dokazujejo, da lahko za urejanje genomov uporabimo sintetične ssDNA oligonukleotide, vključno z natančnim vnosom eksogenega DNA zaporedja na specifičen lokus.<br /> <br /> == VIRI == <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/ (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ (1.12.2017)<br /> https://www.yourgenome.org/facts/why-use-the-zebrafish-in-research (1.12.2017)<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931354/ (1.12.2017)<br /> http://www.genetherapynet.com/gene-editing-tools/talen.html (1.12.2017)</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov&diff=13512 2017-12-02T13:05:22Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organizmih, saj inducirajo prelome dvojnih verig DNA, popravljalni mehanizmi le-teh pa lahko potečejo preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). Pri popravljanju z NHEJ ne potrebujemo dodatne homologne regije, posledično pogosto prihaja do nastanka delecij ali insercij ter do izgube funkcije gena. Nasprotno pa HR zahteva prisotnost donorske DNA-matrice, le-to pa vodi do nastanka specifičnih substitucij in insercij. Priprava TALEN-ov je draga in zamudna, poleg tega pa večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev.<br /> <br /> == ZGRADBA IN DELOVANJE TALEN-ov ==<br /> TALEN-i so sestavljeni iz DNA-vezavne domene in nukleazne domene. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna ter posledično odgovorna za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- terminalni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI ter ima aktivacijsko vlogo. TALEN-i imajo višjo specifičnost pri urejanju genomov ter so manj toksični od nukleaz s cinkovimi prsti. Pred kratkim in vivo analizirali specifičnost TALEN-ov, rezultati pa so pokazali, da TALE ponovitve neodvisno prepoznajo komplementarne nukleotidne baze, obenem pa prikazujejo dovolj veliko specifičnost za uporabo na človeških celicah. <br /> Sosledje in število TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določajo zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi, od tega vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Do cepitve DNA pride na odseku med obema nukleaznima domenama, vsaka pa omogočata cepitev le ene verige DNA. Posledično je potrebno pri uvajanju dvojnim prelomov uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. <br /> <br /> == METODE ==<br /> TALEN-e so pridobili z GoldenGate metodo, s katero lahko učinkovito načrtujemo in sestavljamo TALE nukleaze in druge TAL efektorske konstrukte, z namenom ciljanja DNA. Ponavljajoča zaporedja TALE nukleaz so klonirali v pT3TS destinacijski vektor z ustreznim TALEN ogrodjem, mRNA pa so injicirali v enocelične ribje zarodke, ki so bili molekularno testirani ali pa vzgojeni za analizo mutacij zarodnih celic. Somatske in zarodne mutacije, povzročene s TALE nukleazami, so ovrednotili s metodama PCR in RFLP. Za povzročitev nastanka HR, so zasnovali enoverižne DNA oligonukleotide z EcoRV ali mloxP mestom s kratkimi homolognimi ročicami okoli TALEN tarčnih mest ter jih nato injicirali v enocelične ribje zarodke. S PCR metodo so analizirali modificirane lokuse ter tako skušali odkriti posledice somatskih in zarodnih HR dogodkov.<br /> <br /> == DIZAJN TALEN-ov ==<br /> Pri načrtovanju TALEN-ov so bili upoštevani trije kriteriji. Najprej so izbrali TALEN vezavna mesta, ki so bila dolga 15-25 baznih parov, dolžina distančnika pa je merila 15-16 baznih parov. Kadar je bilo to le mogoče, so bile TALEN rezalne sekvence izbrane okoli restrikcijskega encima, lokaliziranega centralno znotraj distančnika. Za poenostavitev postopka izdelave TALEN-ov, so na spletu ustvarili brezplačno programsko opremo z odprtim dostopom.<br /> <br /> == UPORABA ZEBRAFISH-A ==<br /> Zebrafish je tropska riba iz JV Azije, katere ime izvira iz pasov, potekajočih vzdolž telesa. Vse pogosteje se uporablja za preučevanje osnovnih bolezni človeka, s pomočjo bogate palete genetskih in molekularnih orodij in vivo. Prednosti uporabe zebrafish-a so nizki stroški vzdrževanja, rastejo izjemno hitro, saj se v enem dnevu razvijejo toliko, kot se človeški zarodek v enem mesecu. Ribji zarodki so transparentni, kar raziskovalcem omogoča vpogled v razvoj notranjih struktur, poleg tega pa imajo podobno genetsko strukturo kot ljudje. <br /> Izboljšave v TALEN-ih zagotavljajo nov močan pristop za tarčno urejanje zebrafish genomov in funkcionalnih genomskih aplikacij. Z uporabo zebrafish-a kot dostavnega sistema in GoldyTALEN modificiranega ogrodja, imenovanega pKT3Ts-goldyTALEN (pKT3TsgT), ki bi preprečil rekombinacijo in s tem povečano število lažno pozitivnih kolonij pri sestavljanju TALEN-ov, dokazujejo, da ima izboljšan komplet TALEN orodij visoko specifičnost pri induciranju lokus specifičnih prelomov dvoverižne DNA v somatskih in tkivnih zarodnih linijah. S posodobljenim TALEN sistemom so uspešno uporabili enoverižne DNA oligonukleotide, s katerimi so natančno spreminjali sekvence na vnaprej določenih lokacijah zebrafish genoma, le-to pa so izvedli s pomočjo homologne rekombinacije in uvedbe EcoRV mesta ter modificirane loxP sekvence v somatsko tkivo. <br /> <br /> == RAZISKAVE NA ZEBRAFISH-U ==<br /> S pomočjo TALEN-ov so uvedli lokus specifične prelome dvojnih verig v zebrafish genomih, posledica katerih je nastanek velikega števila mutiranih alelov. Za izboljšanje in vivo učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja, so ga testirali z mRNA ekspresijskim vektorjem (pT3TS17), sledila je analiza DNA, s katero so določili nezmožnost restrikcijskega encima za prepoznavanje zaporedij TALEN mesta. Z uporabo prepoznavnih domen na GoldyTALEN ogrodju so ugotovili prisotnost šestkrat večjega števila genetskih mutacij na ponzr1 lokusu. Za nadaljnje testiranje učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja so ustvarili TALEN-e proti trem dodatnim lokusom, in sicer moesina, ppp1cabb in cdh5, na vsakem lokusu pa so opazili prisotnost mutageneze oziroma spreminjanja genov. Za določitev časovnega poteka sprememb, ki jih povzroča GoldyTALEN, so preučevali aktivnost restrikcijskega encima pri 256 celicah, 28 ur po oploditvi ter v 50 stopnjah oploditve. Rezultati prikazujejo zgodnje in učinkovito ciljanje genov v somatskih tkivih, vključno z bialelno pretvorbo pri nekaterih živalih. V odgovor na povečano aktivnost GoldyTALEN-ov so se spraševali, ali lahko injiciranje TALEN-ov vodi do izgube fenotipa funkcionalnega tarčnega moezinskega (MO) gena v zebrafish-u. Naredili so krivuljo odziva na odmerek zdravila pri moezinu, ppp1cab in cdh5 GoldyTALEN parih, koncentracijo GoldyTALEN parov so optimizirali na število zarodkov z bialelnimi spremembami ter določili kolikšen odstotek le-teh je mrtvih ali deformiranih. Zarodki, ki so bili vbrizgani s cdh5 GoldyTALEN-om ali pa z moezinom so pokazali podobne vaskularne fenotipe, in sicer izrazit srčni edem, izgubo patentnih lumnov v vaskulaturi in izgubo cirkulirajočih rdečih krvnih celic. Zbrani rezultati prikazujejo, da lahko z GoldyTALEN ogrodjem dosežemo učinkovito bialelno ciljanje znanih fenotipov, ki nakazujejo na izgubo funkcije, poleg tega pa podatki prikazujejo dopolnilno vlogo GoldyTALEN-ov pri oceni somatskih moezinskih fenotipov.<br /> <br /> == RAZISKAVE NA GoldyTALEN OGRODJU ==<br /> Za oceno prenosa mutacij na zarodne celice so vzgojili bialelno zebrafish ribo, ki so ji predhodno injicirali GoldyTALEN. Pregledali so 10 združenih F1 zarodkov ter tako prikazali frekvenco mutacij v lokusih, ki je znašala med 9 in 55 %. V dveh od treh lokusih zarodnih linij so odkrili mozaicizem, podatki pa obenem prikazujejo, da somatsko TALEN ciljanje uspešno prehaja skozi zarodne linije. Z uspešno modifikacijo genoma z GoldyTALEN-i domnevajo, da bi v prihodnje lahko zasnovali sintetične oligonukleotide tako, da bi le-ti lahko rezali na predvidenem TALEN mestu ter s tem služili kot osnova za homologno rekombinacijo in vivo. S ko-iniciacijo ponzr1 GoldyTALEN-a kot testnega lokusa in enoverižnega DNA oligonukleotida, so uvedli EcoRV restrikcijsko mesto. V poskusih je več kot polovica injiciranih zarodkov pokazala prisotnost kromosomov, ki so vsebovali EcoRV zaporedje, z analizo zaporedja pa so dokazali uspešno homologno rekombinacijo na ponzr1 lokusu. Da bi preverili, ali je bila homologna rekombinacija v somatskem tkivu stabilna, so izvedli analizo biopsij dveh mesecev starih zebrafish-ev ter nato dodali EcoRV sekvenco v ponzr1 lokus. Uspešno vključitev EcoRV je pokazalo le 8 od 186 rib. Da bi ugotovili, ali je pomanjkanje somatske EcoRV vključitve povezano s pomanjkanjem prenosa skozi zarodne linije, so z EcoRV negativnimi biopsijami naključno izbrali 13 rib, pri potomcih le-teh pa je bila vključitev EcoRV v ponzr1 lokus negativna. Posledično so bile z biopsijo pri določitvi prenosa skozi zarodne linije izbrane le ribe s pozitivno vključitvijo EcoRV v ponzr1 lokus. Nadaljnje so se spraševali, ali bi lahko s ko-injiciranjem TALEN-ov in oligonukleotidov uvedli večje sekvence, kot je loxP mesto, le-to pa bi bil bistven korak pri izdelavi pogojnih genskih alelov. Za uspešno dodajanje spremenjenega loxP (mloxP) so uporabili TALEN-e v genu Crhr2 ter enoverižne DNA oligonukleotide, analiza PCR pa je pokazala somatsko vključitev mloxP sekvence na Crhr2 TALEN restrikcijskem mestu. <br /> <br /> == ZAKLJUČEK ==<br /> Za oceno morebitnih zunajtarčnih učinkov TALEN-ov ali homologne rekombinacije enoverižne DNA, bi bilo v prihodnje potrebno izvesti bolj celovite analize genomov. Potrebno bi bilo določiti zaporedje celotnega genoma rib iz različnih starševskih linij, ki prenašajo zarodne celice. Če bi analiza pokazala zunajtarčne mutacije, bi kot alternativen pristop lahko uporabili TALEN-e, ki temeljijo na fuziji nukleaz na osnovi heterodimerov. Rezultati raziskav prikazujejo prve uspešne homologne rekombinacije v zebrafish-u in vivo ter na osnovi enoverižne DNA kot matrice. Uporaba ssDNA olajša vrsto genomskih sprememb, vključno z uvedbo enojnih nukleotidnih polimorfizmov za genetske aplikacije na vretenčarjih. Na primer, donorska ssDNA lahko služi kot začetno mesto sinteze nove verige na TALEN prelomu. Podaljšanje 3´ konca oligonukleotida bi lahko ustvarila dolge homologne regije za začetek rekombinacije, vendar pa 5´ konec oligonukleotida omejuje podaljšanje nove verige in s tem možnost za homologno rekombinacijo. Z uporabo zebrafish-a je nastal posodobljen in visoko učinkovit TALEN sistem za uporabo pri genomskih modifikacijah in funkcionalnih genomskih aplikacijah. Poleg tega dokazujejo, da lahko za urejanje genomov uporabimo sintetične ssDNA oligonukleotide, vključno z natančnim vnosom eksogenega DNA zaporedja na specifičen lokus.<br /> <br /> == VIRI == <br /> 1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/ (1.12.2017)<br /> 2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ (1.12.2017)<br /> 3. https://www.yourgenome.org/facts/why-use-the-zebrafish-in-research (1.12.2017)<br /> 4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931354/ (1.12.2017)<br /> 5. http://www.genetherapynet.com/gene-editing-tools/talen.html (1.12.2017)</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov&diff=13511 2017-12-02T13:04:04Z

<p>Tina Lekan: </p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organizmih, saj inducirajo prelome dvojnih verig DNA, popravljalni mehanizmi le-teh pa lahko potečejo preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). Pri popravljanju z NHEJ ne potrebujemo dodatne homologne regije, posledično pogosto prihaja do nastanka delecij ali insercij ter do izgube funkcije gena. Nasprotno pa HR zahteva prisotnost donorske DNA-matrice, le-to pa vodi do nastanka specifičnih substitucij in insercij. Priprava TALEN-ov je draga in zamudna, poleg tega pa večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev.<br /> <br /> == ZGRADBA IN DELOVANJE TALEN-ov ==<br /> TALEN-i so sestavljeni iz DNA-vezavne domene in nukleazne domene. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna ter posledično odgovorna za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- terminalni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI ter ima aktivacijsko vlogo. TALEN-i imajo višjo specifičnost pri urejanju genomov ter so manj toksični od nukleaz s cinkovimi prsti. Pred kratkim in vivo analizirali specifičnost TALEN-ov, rezultati pa so pokazali, da TALE ponovitve neodvisno prepoznajo komplementarne nukleotidne baze, obenem pa prikazujejo dovolj veliko specifičnost za uporabo na človeških celicah. <br /> Sosledje in število TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določajo zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi, od tega vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Do cepitve DNA pride na odseku med obema nukleaznima domenama, vsaka pa omogočata cepitev le ene verige DNA. Posledično je potrebno pri uvajanju dvojnim prelomov uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. <br /> <br /> <br /> == METODE ==<br /> TALEN-e so pridobili z GoldenGate metodo, s katero lahko učinkovito načrtujemo in sestavljamo TALE nukleaze in druge TAL efektorske konstrukte, z namenom ciljanja DNA. Ponavljajoča zaporedja TALE nukleaz so klonirali v pT3TS destinacijski vektor z ustreznim TALEN ogrodjem, mRNA pa so injicirali v enocelične ribje zarodke, ki so bili molekularno testirani ali pa vzgojeni za analizo mutacij zarodnih celic. Somatske in zarodne mutacije, povzročene s TALE nukleazami, so ovrednotili s metodama PCR in RFLP. Za povzročitev nastanka HR, so zasnovali enoverižne DNA oligonukleotide z EcoRV ali mloxP mestom s kratkimi homolognimi ročicami okoli TALEN tarčnih mest ter jih nato injicirali v enocelične ribje zarodke. S PCR metodo so analizirali modificirane lokuse ter tako skušali odkriti posledice somatskih in zarodnih HR dogodkov.<br /> <br /> == DIZAJN TALEN-ov ==<br /> Pri načrtovanju TALEN-ov so bili upoštevani trije kriteriji. Najprej so izbrali TALEN vezavna mesta, ki so bila dolga 15-25 baznih parov, dolžina distančnika pa je merila 15-16 baznih parov. Kadar je bilo to le mogoče, so bile TALEN rezalne sekvence izbrane okoli restrikcijskega encima, lokaliziranega centralno znotraj distančnika. Za poenostavitev postopka izdelave TALEN-ov, so na spletu ustvarili brezplačno programsko opremo z odprtim dostopom.<br /> <br /> <br /> == UPORABA ZEBRAFISH-A ==<br /> Zebrafish je tropska riba iz JV Azije, katere ime izvira iz pasov, potekajočih vzdolž telesa. Vse pogosteje se uporablja za preučevanje osnovnih bolezni človeka, s pomočjo bogate palete genetskih in molekularnih orodij in vivo. Prednosti uporabe zebrafish-a so nizki stroški vzdrževanja, rastejo izjemno hitro, saj se v enem dnevu razvijejo toliko, kot se človeški zarodek v enem mesecu. Ribji zarodki so transparentni, kar raziskovalcem omogoča vpogled v razvoj notranjih struktur, poleg tega pa imajo podobno genetsko strukturo kot ljudje. <br /> Izboljšave v TALEN-ih zagotavljajo nov močan pristop za tarčno urejanje zebrafish genomov in funkcionalnih genomskih aplikacij. Z uporabo zebrafish-a kot dostavnega sistema in GoldyTALEN modificiranega ogrodja, imenovanega pKT3Ts-goldyTALEN (pKT3TsgT), ki bi preprečil rekombinacijo in s tem povečano število lažno pozitivnih kolonij pri sestavljanju TALEN-ov, dokazujejo, da ima izboljšan komplet TALEN orodij visoko specifičnost pri induciranju lokus specifičnih prelomov dvoverižne DNA v somatskih in tkivnih zarodnih linijah. S posodobljenim TALEN sistemom so uspešno uporabili enoverižne DNA oligonukleotide, s katerimi so natančno spreminjali sekvence na vnaprej določenih lokacijah zebrafish genoma, le-to pa so izvedli s pomočjo homologne rekombinacije in uvedbe EcoRV mesta ter modificirane loxP sekvence v somatsko tkivo. <br /> <br /> <br /> == RAZISKAVE NA ZEBRAFISH-U ==<br /> S pomočjo TALEN-ov so uvedli lokus specifične prelome dvojnih verig v zebrafish genomih, posledica katerih je nastanek velikega števila mutiranih alelov. Za izboljšanje in vivo učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja, so ga testirali z mRNA ekspresijskim vektorjem (pT3TS17), sledila je analiza DNA, s katero so določili nezmožnost restrikcijskega encima za prepoznavanje zaporedij TALEN mesta. Z uporabo prepoznavnih domen na GoldyTALEN ogrodju so ugotovili prisotnost šestkrat večjega števila genetskih mutacij na ponzr1 lokusu. Za nadaljnje testiranje učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja so ustvarili TALEN-e proti trem dodatnim lokusom, in sicer moesina, ppp1cabb in cdh5, na vsakem lokusu pa so opazili prisotnost mutageneze oziroma spreminjanja genov. Za določitev časovnega poteka sprememb, ki jih povzroča GoldyTALEN, so preučevali aktivnost restrikcijskega encima pri 256 celicah, 28 ur po oploditvi ter v 50 stopnjah oploditve. Rezultati prikazujejo zgodnje in učinkovito ciljanje genov v somatskih tkivih, vključno z bialelno pretvorbo pri nekaterih živalih. V odgovor na povečano aktivnost GoldyTALEN-ov so se spraševali, ali lahko injiciranje TALEN-ov vodi do izgube fenotipa funkcionalnega tarčnega moezinskega (MO) gena v zebrafish-u. Naredili so krivuljo odziva na odmerek zdravila pri moezinu, ppp1cab in cdh5 GoldyTALEN parih, koncentracijo GoldyTALEN parov so optimizirali na število zarodkov z bialelnimi spremembami ter določili kolikšen odstotek le-teh je mrtvih ali deformiranih. Zarodki, ki so bili vbrizgani s cdh5 GoldyTALEN-om ali pa z moezinom so pokazali podobne vaskularne fenotipe, in sicer izrazit srčni edem, izgubo patentnih lumnov v vaskulaturi in izgubo cirkulirajočih rdečih krvnih celic. Zbrani rezultati prikazujejo, da lahko z GoldyTALEN ogrodjem dosežemo učinkovito bialelno ciljanje znanih fenotipov, ki nakazujejo na izgubo funkcije, poleg tega pa podatki prikazujejo dopolnilno vlogo GoldyTALEN-ov pri oceni somatskih moezinskih fenotipov.<br /> <br /> <br /> == RAZISKAVE NA GoldyTALEN OGRODJU ==<br /> Za oceno prenosa mutacij na zarodne celice so vzgojili bialelno zebrafish ribo, ki so ji predhodno injicirali GoldyTALEN. Pregledali so 10 združenih F1 zarodkov ter tako prikazali frekvenco mutacij v lokusih, ki je znašala med 9 in 55 %. V dveh od treh lokusih zarodnih linij so odkrili mozaicizem, podatki pa obenem prikazujejo, da somatsko TALEN ciljanje uspešno prehaja skozi zarodne linije. Z uspešno modifikacijo genoma z GoldyTALEN-i domnevajo, da bi v prihodnje lahko zasnovali sintetične oligonukleotide tako, da bi le-ti lahko rezali na predvidenem TALEN mestu ter s tem služili kot osnova za homologno rekombinacijo in vivo. S ko-iniciacijo ponzr1 GoldyTALEN-a kot testnega lokusa in enoverižnega DNA oligonukleotida, so uvedli EcoRV restrikcijsko mesto. V poskusih je več kot polovica injiciranih zarodkov pokazala prisotnost kromosomov, ki so vsebovali EcoRV zaporedje, z analizo zaporedja pa so dokazali uspešno homologno rekombinacijo na ponzr1 lokusu. Da bi preverili, ali je bila homologna rekombinacija v somatskem tkivu stabilna, so izvedli analizo biopsij dveh mesecev starih zebrafish-ev ter nato dodali EcoRV sekvenco v ponzr1 lokus. Uspešno vključitev EcoRV je pokazalo le 8 od 186 rib. Da bi ugotovili, ali je pomanjkanje somatske EcoRV vključitve povezano s pomanjkanjem prenosa skozi zarodne linije, so z EcoRV negativnimi biopsijami naključno izbrali 13 rib, pri potomcih le-teh pa je bila vključitev EcoRV v ponzr1 lokus negativna. Posledično so bile z biopsijo pri določitvi prenosa skozi zarodne linije izbrane le ribe s pozitivno vključitvijo EcoRV v ponzr1 lokus. Nadaljnje so se spraševali, ali bi lahko s ko-injiciranjem TALEN-ov in oligonukleotidov uvedli večje sekvence, kot je loxP mesto, le-to pa bi bil bistven korak pri izdelavi pogojnih genskih alelov. Za uspešno dodajanje spremenjenega loxP (mloxP) so uporabili TALEN-e v genu Crhr2 ter enoverižne DNA oligonukleotide, analiza PCR pa je pokazala somatsko vključitev mloxP sekvence na Crhr2 TALEN restrikcijskem mestu. <br /> <br /> <br /> == ZAKLJUČEK ==<br /> Za oceno morebitnih zunajtarčnih učinkov TALEN-ov ali homologne rekombinacije enoverižne DNA, bi bilo v prihodnje potrebno izvesti bolj celovite analize genomov. Potrebno bi bilo določiti zaporedje celotnega genoma rib iz različnih starševskih linij, ki prenašajo zarodne celice. Če bi analiza pokazala zunajtarčne mutacije, bi kot alternativen pristop lahko uporabili TALEN-e, ki temeljijo na fuziji nukleaz na osnovi heterodimerov. Rezultati raziskav prikazujejo prve uspešne homologne rekombinacije v zebrafish-u in vivo ter na osnovi enoverižne DNA kot matrice. Uporaba ssDNA olajša vrsto genomskih sprememb, vključno z uvedbo enojnih nukleotidnih polimorfizmov za genetske aplikacije na vretenčarjih. Na primer, donorska ssDNA lahko služi kot začetno mesto sinteze nove verige na TALEN prelomu. Podaljšanje 3´ konca oligonukleotida bi lahko ustvarila dolge homologne regije za začetek rekombinacije, vendar pa 5´ konec oligonukleotida omejuje podaljšanje nove verige in s tem možnost za homologno rekombinacijo. Z uporabo zebrafish-a je nastal posodobljen in visoko učinkovit TALEN sistem za uporabo pri genomskih modifikacijah in funkcionalnih genomskih aplikacijah. Poleg tega dokazujejo, da lahko za urejanje genomov uporabimo sintetične ssDNA oligonukleotide, vključno z natančnim vnosom eksogenega DNA zaporedja na specifičen lokus.<br /> <br /> <br /> == VIRI == <br /> - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/ (1.12.2017)<br /> - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ (1.12.2017)<br /> - https://www.yourgenome.org/facts/why-use-the-zebrafish-in-research (1.12.2017)<br /> - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931354/ (1.12.2017)<br /> - http://www.genetherapynet.com/gene-editing-tools/talen.html (1.12.2017)</div>

Tina Lekan https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov&diff=13510 2017-12-02T12:59:24Z

<p>Tina Lekan: New page: 1. UVOD: Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organi...</p> <hr /> <div>1. UVOD: Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri organizmih, saj inducirajo prelome dvojnih verig DNA, popravljalni mehanizmi le-teh pa lahko potečejo preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). Pri popravljanju z NHEJ ne potrebujemo dodatne homologne regije, posledično pogosto prihaja do nastanka delecij ali insercij ter do izgube funkcije gena. Nasprotno pa HR zahteva prisotnost donorske DNA-matrice, le-to pa vodi do nastanka specifičnih substitucij in insercij. Priprava TALEN-ov je draga in zamudna, poleg tega pa večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev.<br /> <br /> 2. ZGRADBA IN DELOVANJE TALEN-ov: TALEN-i so sestavljeni iz DNA-vezavne domene in nukleazne domene. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna ter posledično odgovorna za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- terminalni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI ter ima aktivacijsko vlogo. TALEN-i imajo višjo specifičnost pri urejanju genomov ter so manj toksični od nukleaz s cinkovimi prsti. Pred kratkim in vivo analizirali specifičnost TALEN-ov, rezultati pa so pokazali, da TALE ponovitve neodvisno prepoznajo komplementarne nukleotidne baze, obenem pa prikazujejo dovolj veliko specifičnost za uporabo na človeških celicah. <br /> Sosledje in število TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določajo zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi, od tega vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Do cepitve DNA pride na odseku med obema nukleaznima domenama, vsaka pa omogočata cepitev le ene verige DNA. Posledično je potrebno pri uvajanju dvojnim prelomov uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. <br /> <br /> 3. METODE: TALEN-e so pridobili z GoldenGate metodo, s katero lahko učinkovito načrtujemo in sestavljamo TALE nukleaze in druge TAL efektorske konstrukte, z namenom ciljanja DNA. Ponavljajoča zaporedja TALE nukleaz so klonirali v pT3TS destinacijski vektor z ustreznim TALEN ogrodjem, mRNA pa so injicirali v enocelične ribje zarodke, ki so bili molekularno testirani ali pa vzgojeni za analizo mutacij zarodnih celic. Somatske in zarodne mutacije, povzročene s TALE nukleazami, so ovrednotili s metodama PCR in RFLP. Za povzročitev nastanka HR, so zasnovali enoverižne DNA oligonukleotide z EcoRV ali mloxP mestom s kratkimi homolognimi ročicami okoli TALEN tarčnih mest ter jih nato injicirali v enocelične ribje zarodke. S PCR metodo so analizirali modificirane lokuse ter tako skušali odkriti posledice somatskih in zarodnih HR dogodkov.<br /> <br /> 4. DIZAJN TALEN-ov: pri načrtovanju TALEN-ov so bili upoštevani trije kriteriji. Najprej so izbrali TALEN vezavna mesta, ki so bila dolga 15-25 baznih parov, dolžina distančnika pa je merila 15-16 baznih parov. Kadar je bilo to le mogoče, so bile TALEN rezalne sekvence izbrane okoli restrikcijskega encima, lokaliziranega centralno znotraj distančnika. Za poenostavitev postopka izdelave TALEN-ov, so na spletu ustvarili brezplačno programsko opremo z odprtim dostopom.<br /> <br /> 5. UPORABA ZEBRAFISH-A: zebrafish je tropska riba iz JV Azije, katere ime izvira iz pasov, potekajočih vzdolž telesa. Vse pogosteje se uporablja za preučevanje osnovnih bolezni človeka, s pomočjo bogate palete genetskih in molekularnih orodij in vivo. Prednosti uporabe zebrafish-a so nizki stroški vzdrževanja, rastejo izjemno hitro, saj se v enem dnevu razvijejo toliko, kot se človeški zarodek v enem mesecu. Ribji zarodki so transparentni, kar raziskovalcem omogoča vpogled v razvoj notranjih struktur, poleg tega pa imajo podobno genetsko strukturo kot ljudje. <br /> Izboljšave v TALEN-ih zagotavljajo nov močan pristop za tarčno urejanje zebrafish genomov in funkcionalnih genomskih aplikacij. Z uporabo zebrafish-a kot dostavnega sistema in GoldyTALEN modificiranega ogrodja, imenovanega pKT3Ts-goldyTALEN (pKT3TsgT), ki bi preprečil rekombinacijo in s tem povečano število lažno pozitivnih kolonij pri sestavljanju TALEN-ov, dokazujejo, da ima izboljšan komplet TALEN orodij visoko specifičnost pri induciranju lokus specifičnih prelomov dvoverižne DNA v somatskih in tkivnih zarodnih linijah. S posodobljenim TALEN sistemom so uspešno uporabili enoverižne DNA oligonukleotide, s katerimi so natančno spreminjali sekvence na vnaprej določenih lokacijah zebrafish genoma, le-to pa so izvedli s pomočjo homologne rekombinacije in uvedbe EcoRV mesta ter modificirane loxP sekvence v somatsko tkivo. <br /> <br /> 6. RAZISKAVE NA ZEBRAFISH-U: s pomočjo TALEN-ov so uvedli lokus specifične prelome dvojnih verig v zebrafish genomih, posledica katerih je nastanek velikega števila mutiranih alelov. Za izboljšanje in vivo učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja, so ga testirali z mRNA ekspresijskim vektorjem (pT3TS17), sledila je analiza DNA, s katero so določili nezmožnost restrikcijskega encima za prepoznavanje zaporedij TALEN mesta. Z uporabo prepoznavnih domen na GoldyTALEN ogrodju so ugotovili prisotnost šestkrat večjega števila genetskih mutacij na ponzr1 lokusu. Za nadaljnje testiranje učinkovitosti GoldyTALEN ogrodja so ustvarili TALEN-e proti trem dodatnim lokusom, in sicer moesina, ppp1cabb in cdh5, na vsakem lokusu pa so opazili prisotnost mutageneze oziroma spreminjanja genov. Za določitev časovnega poteka sprememb, ki jih povzroča GoldyTALEN, so preučevali aktivnost restrikcijskega encima pri 256 celicah, 28 ur po oploditvi ter v 50 stopnjah oploditve. Rezultati prikazujejo zgodnje in učinkovito ciljanje genov v somatskih tkivih, vključno z bialelno pretvorbo pri nekaterih živalih. V odgovor na povečano aktivnost GoldyTALEN-ov so se spraševali, ali lahko injiciranje TALEN-ov vodi do izgube fenotipa funkcionalnega tarčnega moezinskega (MO) gena v zebrafish-u. Naredili so krivuljo odziva na odmerek zdravila pri moezinu, ppp1cab in cdh5 GoldyTALEN parih, koncentracijo GoldyTALEN parov so optimizirali na število zarodkov z bialelnimi spremembami ter določili kolikšen odstotek le-teh je mrtvih ali deformiranih. Zarodki, ki so bili vbrizgani s cdh5 GoldyTALEN-om ali pa z moezinom so pokazali podobne vaskularne fenotipe, in sicer izrazit srčni edem, izgubo patentnih lumnov v vaskulaturi in izgubo cirkulirajočih rdečih krvnih celic. Zbrani rezultati prikazujejo, da lahko z GoldyTALEN ogrodjem dosežemo učinkovito bialelno ciljanje znanih fenotipov, ki nakazujejo na izgubo funkcije, poleg tega pa podatki prikazujejo dopolnilno vlogo GoldyTALEN-ov pri oceni somatskih moezinskih fenotipov.<br /> <br /> 7. RAZISKAVE na GoldyTALEN OGRODJU: za oceno prenosa mutacij na zarodne celice so vzgojili bialelno zebrafish ribo, ki so ji predhodno injicirali GoldyTALEN. Pregledali so 10 združenih F1 zarodkov ter tako prikazali frekvenco mutacij v lokusih, ki je znašala med 9 in 55 %. V dveh od treh lokusih zarodnih linij so odkrili mozaicizem, podatki pa obenem prikazujejo, da somatsko TALEN ciljanje uspešno prehaja skozi zarodne linije. Z uspešno modifikacijo genoma z GoldyTALEN-i domnevajo, da bi v prihodnje lahko zasnovali sintetične oligonukleotide tako, da bi le-ti lahko rezali na predvidenem TALEN mestu ter s tem služili kot osnova za homologno rekombinacijo in vivo. S ko-iniciacijo ponzr1 GoldyTALEN-a kot testnega lokusa in enoverižnega DNA oligonukleotida, so uvedli EcoRV restrikcijsko mesto. V poskusih je več kot polovica injiciranih zarodkov pokazala prisotnost kromosomov, ki so vsebovali EcoRV zaporedje, z analizo zaporedja pa so dokazali uspešno homologno rekombinacijo na ponzr1 lokusu. Da bi preverili, ali je bila homologna rekombinacija v somatskem tkivu stabilna, so izvedli analizo biopsij dveh mesecev starih zebrafish-ev ter nato dodali EcoRV sekvenco v ponzr1 lokus. Uspešno vključitev EcoRV je pokazalo le 8 od 186 rib. Da bi ugotovili, ali je pomanjkanje somatske EcoRV vključitve povezano s pomanjkanjem prenosa skozi zarodne linije, so z EcoRV negativnimi biopsijami naključno izbrali 13 rib, pri potomcih le-teh pa je bila vključitev EcoRV v ponzr1 lokus negativna. Posledično so bile z biopsijo pri določitvi prenosa skozi zarodne linije izbrane le ribe s pozitivno vključitvijo EcoRV v ponzr1 lokus. Nadaljnje so se spraševali, ali bi lahko s ko-injiciranjem TALEN-ov in oligonukleotidov uvedli večje sekvence, kot je loxP mesto, le-to pa bi bil bistven korak pri izdelavi pogojnih genskih alelov. Za uspešno dodajanje spremenjenega loxP (mloxP) so uporabili TALEN-e v genu Crhr2 ter enoverižne DNA oligonukleotide, analiza PCR pa je pokazala somatsko vključitev mloxP sekvence na Crhr2 TALEN restrikcijskem mestu. <br /> <br /> 8. ZAKLJUČEK: Za oceno morebitnih zunajtarčnih učinkov TALEN-ov ali homologne rekombinacije enoverižne DNA, bi bilo v prihodnje potrebno izvesti bolj celovite analize genomov. Potrebno bi bilo določiti zaporedje celotnega genoma rib iz različnih starševskih linij, ki prenašajo zarodne celice. Če bi analiza pokazala zunajtarčne mutacije, bi kot alternativen pristop lahko uporabili TALEN-e, ki temeljijo na fuziji nukleaz na osnovi heterodimerov. Rezultati raziskav prikazujejo prve uspešne homologne rekombinacije v zebrafish-u in vivo ter na osnovi enoverižne DNA kot matrice. Uporaba ssDNA olajša vrsto genomskih sprememb, vključno z uvedbo enojnih nukleotidnih polimorfizmov za genetske aplikacije na vretenčarjih. Na primer, donorska ssDNA lahko služi kot začetno mesto sinteze nove verige na TALEN prelomu. Podaljšanje 3´ konca oligonukleotida bi lahko ustvarila dolge homologne regije za začetek rekombinacije, vendar pa 5´ konec oligonukleotida omejuje podaljšanje nove verige in s tem možnost za homologno rekombinacijo. Z uporabo zebrafish-a je nastal posodobljen in visoko učinkovit TALEN sistem za uporabo pri genomskih modifikacijah in funkcionalnih genomskih aplikacijah. Poleg tega dokazujejo, da lahko za urejanje genomov uporabimo sintetične ssDNA oligonukleotide, vključno z natančnim vnosom eksogenega DNA zaporedja na specifičen lokus.<br /> <br /> 9. VIRI: <br /> - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/ (1.12.2017)<br /> - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3547402/ (1.12.2017)<br /> - https://www.yourgenome.org/facts/why-use-the-zebrafish-in-research (1.12.2017)<br /> - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931354/ (1.12.2017)<br /> - http://www.genetherapynet.com/gene-editing-tools/talen.html (1.12.2017)</div>

Tina Lekan