==Problem==
Industrija je ena med večjimi onesnaževalci okolja. Tekstilna industrija je drugi največji porabnik vode in je odgovorna za 10% CO2 emisij v atmosferi [1]. Proteini pa so neprecenljiv resurs v industriji (tako tekstilni kot ostali) in proizvodnji. Encimi se uporabljajo za razne namene zato ker znatno zmanjšajo negativen vpliv številnih procesov na okolje, hkrati pa izboljšujejo donos, varnost in kakovost izdelkov. Zaradi vse večji potrebi po proteinov je podiplomska skupina iz Pariza na iGEM tekmovanju 2021 predstavila inovativen pristop k proizvodnji proteinov [2].

==Cilj==
Cilj te skupine je razviti v celoti novega načina za proizvodnjo proteinov s pomočjo tehnologijo minicelic. Projekt uporablja sistemski pristop k izboljšanju proizvodnje proteinov. Tako bi omogočili trajnostno in lokalno proizvodnjo, povečano odpornost proti sprememb v dobavni verigi, socialne blaginje ter varnost. Problem in cilj sta demonstrirana na primeru sinteze najpogostejšega barvila indigo [2].

==Izvedba==
Ideja je, da se zapis za željeni protein vstavi v plazmid, ta plazmid se pa transformira v sev E.coli, ki proizvaja minicelice. Minicelice lahko same sintetizirajo protein, potem se ta protein nato očisti.

===Podvojevanje E.coli je zagotovljeno s proteini Min in ftsZ===
Proteini Min so inhibitorji polimerizacije proteinov ftsZ. ftsZ so proteini podobni tubulinom in sodelujejo pri celični delitvi tako, da najprej polimerizirajo okrog celice, potem s kontraktilnimi gibi preščipajo celico, da se ta razdeli na dve novi celici. Proteini Min se nahajajo v večini na polih bakterijske celice in vzpostavljajo koncentracijski gradient, ki ima najnižjo koncentracijo na sredini celice. Tako je inhibicija sestavljanja proteinov ftsZ najšibkejša v sredici bakterijske celice, kar pomeni, da bo na tem območju polimerizacija ftsZ največja. ftsZ proteini formirajo prstan okrog celice - prstan Z - ki manjša svoj premer tekom delitve, tako da na koncu delitve celico razdeli na dve novi. Polarna lokalizacija Min proteinov in polimerizacija ftsZ proteinov na sredini bakterijske celice sta dva ključna procesa, ki uravnavata podvojevanje bakterijske celice [3].
===Minicelice===
Min proteini omejujejo območje kje se lahko formira prstan Z (proteini ftsZ). Mutacija v zapisu za Min proteine (Min operon) pomeni odsotnost koncentracijskega gradienta in odsotnost signala za natančno lokalizacijo prstana Z. Posledično se ta prstan formira naključno vzdolž bakterijske celice kar privede do nesimetrično delitev celice. Ko celična delitev poteče bolj proti polih se odcepijo t.i. minicelice, ki vsebujejo ATP, ribozome in RNA polimeraze in druge stvari, vendar ne vsebujejo vedno kromosomsko DNA, ki je nujna za podvojevanje naprej. Obstajajo bakterijski sevi, ki proizvajajo minicielice, tako da imajo izbrisanega operona Min, nadomesti ga pa plazmid. Minicelice lahko vsebujejo enega ali več plazmidov ter lahko sintetizirajo proteine. Prednosti minicelic so, da ne rastejo in se ne podvojujejo, se ne štejejo kot živi organizmi, lahko odpravimo kontaminacijo (bakterijska celica se ne podvojuje, konstantno pa zgublja svoje resurse), zmanjšajo porabo energije [4].

==Rezultati==

===Protizvodnja minicelic===
Minicelice lahko proizvedemo na dva načina: z delecijo operona Min in z povečano ekspresijo ftsZ gena. So poiskusili oba pristopa, da ugotovijo kateri je boljši (v smislu dovolj dobre kontrole proizvodstva minicelic in donos proteina) ter seveda je tudi bil preiskan pristop s kombinacijo obeh omenjenih pristopov. Primerjali so mutante min (bakterije z delecijo operona min) in divji tip E.coli (K-12 MG1655). Naredili so dva seta konstruktov, katera na različna načina sprožijo proizvodstvo minicelic: eden induciran z IPTG, drugi induciran s povečanjem temperature. Povečanje temperature je problematično iz vidika čiščenja proteina, ki naj bi ga minicelice sintetizirale, saj korak čiščenje (kasneje omenjen) tudi vsebuje dvig temperature. Zato so se odločili da pri koraku proizvodnje izpustijo konstrukte inducirane s temperaturo in so uporabili samo tiste inducirane s IPTG.

Poiskusili so kombinacijo konstruktov z delecijo operona Min in povečane ekspresije gena ftsZ. V konstrukte so uporabili promotorja plac in represorja LacI (LacI se veže na plac operator in preprečuje izražanje; z dodatkom IPTG se sproži izražanje). V konstrukte so uporabili še promotorja ptet in represorja TetR (TetR se veže na ptet operator in preprečuje izražanja). Ta dva konstrukta (en z proteini Min, drug z protein ftsZ) naj bi dali v sevu z izbrisanega Min operona (že na voljo - TB43 sev posojen od iGEM Marburg 2015). V odsotnosti IPTG, Lacl se veže na plac in preprečuje izražanje tetR - takrat ni proizvodnje minicelic. Ko dodamo IPTG, se izraža TetR in preprečuje izražanje Min operona - minicelice se proizvajajo [5]. Karakterizacija je dala pozitivne rezultate.

===Čiščenje minicelic===
Ko imamo minicelice, naslednja stopnja je čiščenje oz. ločevanje minicelic od starševskih celic. To so naredili s pomočjo bakteriofagov. Profag je zapisan v genomu bakterije, zato se bodo lizirali samo bakterije, ki vsebujejo profag (ne minicelice). Sprememba iz lizogenega v litičnega cikla (s strani temperature ali reagenta) pomeni smrt za bakterijsko celico, se pravi, ostanejo samo minicelice, ki so metabolno aktivni (proizvajajo želeni protein). Zaradi podobnosti sestave membrane med bakterije in minicelice, nove fage lahko okužijo tudi minicelice (kar je slabo) - zato fagom so onemogočili nadaljno infekcijo z delecijo gena za terminazo A (gen za pakiranje DNA v kapsido). So uporabili seva E.coli z lambda profagom z izbrisanega gena za terminazo A - litični cikelj se sproži z dvigom temperature (saj se nahaja pod promotorjem cl857 občutljiv na temperaturo). Genom profaga so prestavili v svojega seva, ki proizvaja minicelice z tehnologijo P1 transdukcija. Karakterizacija je pokazala visoko učinkovitost.

===Proizvodnja proteinov===
Končni cilj tega projekta je proizvodnja želenega proteina - to so naredili z vključitvijo zapisa za želeni protein v plazmid, ki ga nato trasficiramo v E.coli, ki proizvaja minicelice, z namenom, da te minicelice naprej proizvajajo končen protein. Zapis za željeni protein se vstavi v pUC19 plazmid pod kontrolo pBad promotorja in araC proteina, indukcija pa poteka z arabinozo. V odsotnosti arabinoye se araC veže na pBad operator in preprečuje izražanje proteina. Ko dodamo arabinozo se aktivira promotor in se sproži prepisovanje željenega gena. Za dodatno robustnost, gen za araC se tudi nahaja na plazmidu pod kontrolo pC promotorja. Karakterizacija je pokazala da je Golden Gate assembly najbiljši pristop.

==Uporaba v industriji==
Projekt je usmerjen v industrijo in poskuša predstaviti nov način proizvodnje. Kot primer, da koncept dejansko deluje, so izbrali sintezo barvila indigo, ki se v tekstilni industriji veliko uporablja. Za proizvodnjo tega barvila so potrebni številne kemijske spojine in zapletena organska sinteza. Skupina je poskusila barvilo sintetizirati na sintezno-biološki način.
Najprej so uporabili plazmid, ki vsebuje plazmid za encim trimetilamin monooksigenaza (tmm). Ta plazmid so transformirali v divji tip E.coli. Encim katalizira pretvorbo indola v indoksila. Indol je naraven produkt metabolizma triptofana v E.coli (Vir: http://parts.igem.org/Part:BBa_K1403015). Indoksil se oksidira v zraku do barvila indigo. Barvilo je nato očiščeno. Za dokaz da koncept deluje so pripravili dva plazmida. S pomočjo metode CPEC so klonirali gen tmm v dveh plazmidih (pBAD-pR in pST000). pBAD-pR plazmid vsebuje celega arabinoznega operona (AraC, pC in pBAD promotor). pTS000 vsebuje samo arabinoznega promotorja. Ob dodatku L-arabinoze, naj bi se sprožila sinteza indiga. Na gojišču kjer so gojili transformirane E.coli so zaznali temnejšo barvo kolonij. Verjeli so, da se gre za prisotnost indoksila.

==Viri==
[1] Niinimäki, K., Peters, G., Dahlbo, H. et al. The environmental price of fast fashion. Nat Rev Earth Environ 1, 189–200 (2020). https://doi.org/10.1038/s43017-020-0039-9

[2] https://2021.igem.org/Team:Paris_Bettencourt/Description)

[3] Rowlett VW, Margolin W. The bacterial Min system. Curr Biol. 2013;23(13):R553-R556. doi:10.1016/j.cub.2013.05.024

[4] Farley, M. M., Hu, B., Margolin, W., & Liu, J. (2016). Minicells, Back in Fashion. Journal of Bacteriology, 198(8), 1186–1195. https://doi.org/10.1128/jb.00901-15

[5] Bi, E., & Lutkenhaus, J. (1990). Interaction between the min locus and ftsZ. Journal of Bacteriology, 172(10), 5610–5616. https://doi.org/10.1128/jb.172.10.5610-5616.1990

2022-05-01T21:57:57Z

Tina Zavodnik:

Izhodni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega substrata [1].

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic ''Oplophagus gracilirostis'', katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1].

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2].

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza:'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β-trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1].

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije ''Escherichia coli'', vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL ''E. Coli'', ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Testi luminescence===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1].

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima.
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET tehnika:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1].

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen.

==Viri==
[1] Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2] S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4] M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.

Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc

2022-05-01T21:56:41Z

Tina Zavodnik:

Izhodni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega kromogenega substrata [1].

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic ''Oplophagus gracilirostis'', katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1].

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2].

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza:'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β-trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1].

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije ''Escherichia coli'', vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL ''E. Coli'', ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Testi luminescence===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1].

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima.
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET tehnika:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1].

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen.

==Viri==
[1] Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2] S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4] M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-01T21:51:32Z

Tina Zavodnik:

Seminarji SB 2021/22

2022-05-01T21:51:13Z

Tina Zavodnik:

Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc

2022-05-01T21:48:56Z

Tina Zavodnik:

Izhodni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega kromogenega substrata [1].

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic ''Oplophagus gracilirostis'', katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1].

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2].

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza:'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β-trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1].

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije ''Escherichia coli'', vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL ''E. Coli'', ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Testi luminescence===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1].

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima.
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET TEHNIKA:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1].

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen.

==Viri==
[1] Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2] S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4] M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.

Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc

2022-05-01T20:02:36Z

Tina Zavodnik: /* Priprava fuzijskih proteinov */

izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega kromogenega substrata [1].

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic ''Oplophagus gracilirostis'', katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1].

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2].

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza:'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β-trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1].

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije ''Escherichia coli'', vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL ''E. Coli'', ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Testi luminescence===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1].

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima.
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET TEHNIKA:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1].

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen.

==Viri==
[1] Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2] S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4] M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.

Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc

2022-05-01T20:02:04Z

Tina Zavodnik: /* Rezultati */

izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega kromogenega substrata [1].

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic ''Oplophagus gracilirostis'', katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1].

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2].

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza:'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β-trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1].

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije Escherichia coli, vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL E. Coli, ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Testi luminescence===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1].

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima.
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET TEHNIKA:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1].

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen.

==Viri==
[1] Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2] S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4] M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.

Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc

2022-05-01T20:01:11Z

Tina Zavodnik: /* NanoLuc luciferaza */

izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega kromogenega substrata [1].

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic ''Oplophagus gracilirostis'', katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1].

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2].

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza:'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β-trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1].

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije Escherichia coli, vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL E. Coli, ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Rezultati===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1].

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima.
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET TEHNIKA:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1].

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen.

==Viri==
[1] Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2] S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4] M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.

Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc

2022-05-01T19:59:58Z

Tina Zavodnik: /* Krožna permutacija */

izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega kromogenega substrata [1].

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic Oplophagus gracilirostis, katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1].

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2].

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza:'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β-trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1].

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije Escherichia coli, vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL E. Coli, ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Rezultati===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1].

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima.
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET TEHNIKA:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1].

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen.

==Viri==
[1] Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2] S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4] M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.

Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc

2022-05-01T19:59:34Z

Tina Zavodnik:

izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega kromogenega substrata [1].

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic Oplophagus gracilirostis, katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1].

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2].

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza:'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1].

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije Escherichia coli, vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL E. Coli, ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Rezultati===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1].

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima.
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET TEHNIKA:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1].

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen.

==Viri==
[1] Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2] S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4] M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.

Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc

2022-05-01T19:58:23Z

Tina Zavodnik: New page: izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communi...

izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega kromogenega substrata [1].

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic Oplophagus gracilirostis, katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1].

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2].

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1].

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije Escherichia coli, vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL E. Coli, ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Rezultati===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1].

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima.
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET TEHNIKA:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1].

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen.

==Viri==
[1] Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2] S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4] M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-01T19:42:37Z

Tina Zavodnik:

Seminarji SB 2021/22

2022-05-01T19:39:37Z

Tina Zavodnik:

2022-04-10T21:50:35Z

Tina Zavodnik:

Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja

2022-04-10T21:48:25Z

Tina Zavodnik: New page: Izhodiščni članek: S. ping Han et al., “Programmable siRNA pro-drugs that activate RNAi activity in response to specific cellular RNA biomarkers,” Mol. Ther. - Nucleic Acids, vol. 2...

Izhodiščni članek: S. ping Han et al., “Programmable siRNA pro-drugs that activate RNAi activity in response to specific cellular RNA biomarkers,” Mol. Ther. - Nucleic Acids, vol. 27, no. March, pp. 797–809, 2022, doi: 10.1016/j.omtn.2021.12.039.

== Uvod ==

Načrtovanje novih zdravilnih učinkovin je usmerjeno v tarčne molekule, ki so ključne za razvoj in napredovanje določene bolezni. Največji problem pri načrtovanju teh pa je, da imajo lahko iste tarčne molekule ključno funkcijo tudi v zdravih celicah. Takšna učinkovina sicer tarčno molekulo uspešno inaktivira, vendar hkrati povzroči škodo tudi v zdravih celicah (ang. off-target effects). Že odkar je Paul Ehrlich leta 1908 predstavil koncept »magic bullet«, se raziskovalci usmerjajo v načine tarčnega delovanja zdravil samo na obolele celice oziroma celice povezane z razvojem določne bolezni, učinek na zdrave celice in tkiva pa bi bil minimalen.

Eden od načinov za tarčno dostavo zdravil v tarčne celice je konjugacija s protitelesi ali v kompleksih z nanodelci. Vendar pa takšen način dostave ni vedno izvedljiv, saj večina obolelih celice ne izraža specifičnih površinskih biomarkerjev, ki bi omogočili prepoznavanje in učinkovito dostavo zdravila v celico. Drug način so zdravila, ki so dostavljena v proobliki in se aktivirajo šele po encimskem procesiranju v tarčnem tkivu, s čimer lahko močno izboljšamo tkivno selektivnost, vendar še vedno ostajajo omejitve. V nasprotju pa si lahko zagotovimo visoko stopnjo selektivnosti, če uporabimo učinkovine, ki direktno interagirajo s procesi izražanja in regulacije genov, povezanih z določeno boleznijo. Pri dostavi takšnih zdravil pa moramo največkrat uporabiti velike DNA-vektorje ali molekule mRNA, konstrukti lahko trajno spremenijo celično DNA in zahtevajo kompleksne razvojne in proizvodnje postopke v primerjavi z molekularnimi zdravili, kar je tudi finančno gledano potratno.

Kot dobra rešitev se je izkazala uporaba majhne interferenčne RNA (siRNA) [1], ki ima v primerjavi s prej naštetimi možnostmi kar nekaj prednosti:
* z uporabo siRNA lahko preko aktivacije procesa interferenčne RNA (RNAi) utišamo specifičen transkript RNA
* siRNA je mnogo manjši konstrukt od večine DNA-vektorjev, uporabljenih pri genskih terapijah
* omogoča začasno delovanje, brez spreminjanja genoma gostitelja
* proizvodnja siRNA je efektivna in poceni (kemijska sinteza)
* s kemijsko sintezo lahko v konstrukt vstavimo kemične modifikacije, ki nam omogočijo bolj učinkovito dostavo siRNA v celice in povečajo stabilnost konstrukta

Sledili so poskusi izboljšanja tarčnega delovanja zdravil na osnovi siRNA tako, da bi ta delovala kot nekakšna »ribostikala«, ki bi sprostila aktivno molekulo siRNA samo v primeru, da »ribostikalo« interagira s specifičnim biomarkerjem v celici [2]. Zdravilo bi se torej nahajalo v proobliki, ki bi se aktiviralo na podlagi specifičnega transkripta v celici ter obdržalo aktivnost siRNA, ki bi lahko aktiviralo proces RNAi. Prvi poskusi tašnih »ribostikalnih« siRNA niso dovolj dobro zavrle RNAI v netarčnih celicah in dovolj učinkovito delovale v tarčnih celicah, poleg tega procesi niso bili optimizirani za načrtovanje konstruktov s katero koli željeno kombinacijo tarčne molekule in biomarkerja.
V tej raziskavi so predstavili protokol za načrtovanje t.i. pogojno aktivirane siRNA (Cond-siRNA; ang. conditionally activated siRNA), ki se lahko aktivira le ob prisotnosti RNA-biomarkerja (mRNA), specifičnega za določeno bolezensko stanje [3].

== Rezultati ==
=== Načrtovanje Cond-siRNA ===
Konstrukt Cond-siRNA je sestavljen iz treh verig RNA – iz senzorične, vodilne in notranje verige, ki predstavlja neke vrste ogrodje konstrukta. Senzorična veriga je komplementarna molekuli mRNA specifičnega biomarkerja in je ključna za tarčno aktivacijo mehanizma RNAi v točno določenem tipu celic. Vodilna veriga pa je komplementarna molekuli mRNA, katere izražanje želimo utišati. Vse tri verige se med seboj povežejo in se sestavijo v dva RNA-dupleksa, ki sta preko povezav na koncih povezana v rigidno paralelno konfiguracijo.
Konstrukt obstaja v dveh možnih stanjih – v neaktivnem stanju OFF in aktivnem stanju ON. V neaktivnem stanju OFF senzorični dupleks onemogoča vezavo encimov, ključnih za aktivacijo RNAi v celici. Senzorični dupleks in točno določne kemijske modifikacije na konstruktu namreč zakrivajo cepitveno mesto za encim Dicer, ki se zaradi steričnih ovir ne more vezati in s tem procesirati dvoverižne siRNA. Če pa se konstrukt nahaja v celicah, ki izražajo za bolezen specifičen biomarker, pa se RNA-biomarker preko komplementarnih baznih parov poveže s senzorično verigo in poruši strukturo senzoričnega heliksa. Zaradi tega pride do sprostitve dupleksa siRNA in preklopa v aktivno konformacijsko stanje ON. Previsne konce na siRNA razgradijo endogene nukleaze, izpostavi se vezavno mesto za Dicer, ki cepi dvoverižno molekulo RNA. V celici se sestavi kompleks RISC, ki razgradi tarčno molekulo mRNA in tako utiša izražanje tarčnega proteina.

Sesalske celice imajo kompleksne poti regulacije in degradacije molekul RNA. Na točno določena mesta v konstruktu so zato uvedli različne kemijske modifikacije: fosforotioatno ogrodje (PS; ang. phosphorothioate backbone linkages), 2'-O-metilacijo baz (2'OMe) in »zaklenjene« (LNA; ang. locked nucleic acid) oziroma »mostovne« nukleinske kisline (BNA; ang. bridged nucleic acid), ki so povečale termodinamsko stabilnost konstrukta in ga zaščitile pred neželjeno ribonukleazno aktivnostjo oziroma razgradnjo.

=== 3D-struktura konstruktov Cond-siRNA ===
Za napoved 3-dimenzionalne strukture dveh konstruktov Cond-siRNA z različnimi kombinacijami kemijskih modifikacij so uporabili metodo molekulske dinamike (MD). S simulacijo so pokazali, da se oba dupleksa sestavita, tako kot so predpostavili – cepitveno mesto za Dicer je bilo orientirano v notranjost strukture. Simulacija MD pa je podala ključno informacijo o nadaljnem načrtovanju senzorične verige – odvijanje senzoričnega dupleksa naleti na manj steričnih ovir, če se molekula mRNA biomarkerja najprej veže na 3'-konec senzorične verige.

=== Funkcionalnost konstrukta Cond-siRNA ===
Naslednja stopnja je bilo testiranje konstruktov na sesalskih celičnih linijah s specifičnimi kombinacijami biomarkerjev in tarčnih molekul in različnimi kombinacijami kemijskih modifikacij na različnih delih konstrukta. Eksperiment so izvedli na celični liniji HCT116. Celice so najprej transficirali z dvema različnima DNA-plazmidoma:
* PsiCheck-2 dual-luciferase reporter (Promega), ki je imel na 3'-koncu zapisa za luciferazo zapis za tarčno molekulo
* pBlueScript, ki je nosil različne zapise biomarkerskih molekul pod kontrolo promotorja polimeraze III
Po 8 urah so izvedli še transfekcijo s konstruktom Cond-siRNA in po 48 urah analizirali izražanje luciferaze.

Ugotovili so, da konstrukt učinkovito zmanjša ekspresijo luciferaze oziroma utiša tarčni protein v primeru, ko celica izraža pravilni biomarker, medtem ko v celicah, ki so izražale napačen biomarker, do utišanja ni prišlo. Poleg tega je bilo utišanje sorazmerno s koncentracijo transficiranega konstrukta Cond-siRNA. Pri konstruktih, ki so vsebovali neidealne kemijske modifikacije, so opazili, da je utišanje neodvisno od prisotnosti pravilnega biomarkerja, kar nakazuje na vpliv pravilnih kemijskih modifikacij na senzorično aktivnosti konstrukta. Konstrukti, ki so imeli podaljške na 3'-koncu senzorične verige, so izkazovali boljšo aktivnost RNAi, kar je potrdilo predpostavke, podane na podlagi simulacij MD.

=== Uporaba Cond-siRNA na in vitro modelu hipertrofije srčne mišice ===
Da bi preverili, ali Cond-siRNA pravilno deluje tudi v realnih bioloških oziroma patoloških stanjih, so v podganji kardiomiocitni celični liniji (H9C2) testirali Cond-siRNA, ki zaznava prisotnost biomarkerja APN oziroma mRNA gena NPPA (ang. natriuretic peptide A) in utiša izražanje kalcinevrina (PPP3CA; protein fosfataza 3 katalitična podenota alfa), ključnega regulatorja hipertrofije. Celice H9C2, izpostavljene fenilefrinu, predstavljajo uveljavljen in vitro model hiperftrofije srčne mišice, ki izražajo biomarker APN (ang. atrial natriuretic peptide), razvoj hipertrofije pa je povezan s povišano koncentracijo PPP3CA [4].

Celice H9C2 so izpostavili 50 µl fenilefrina in jih transficirali z ANP-kalcinevrin Cond-siRNA, torej s konstruktom, ki je imel senzorično verigo komplementarno mRNA za APN in vodilno verigo komplementarno mRNA za PPP3CA oziroma proti katalitični podenoti alfa kalcinevrina. Dokazali so, da prisotnost Cond-siRNA zmanjša izražanje PPP3CA samo v celicah, ki izražajo NPPA, utišanje pa je bilo sorazmerno s koncentracijo prisotne Cond-siRNA. Učinek utišanja PPP3CA je bil primerljiv s komercialno dostopnimi siRNA proti PPP3CA. Podobnega učinka pa ni bilo moč opaziti v kontrolnih celicah, ki NPPA niso izražale, s čimer so dokazali, da se konstrukt Cond-siRNA aktivira le ob prisotnosti točno določenega biomarkerja oziroma v točno določenih in vnaprej načrtovanih celicah, v drugih pa ne.

== Zaključek ==
V raziskavi je predstavljena strategija za razvoj konstruktov Cond-siRNA, ki se aktivirajo le ob prisotnosti specifičnih biomarkerjev bolezenskih stanj. Prozdravila na osnovi Cond-siRNA lahko torej sama regulirajo aktivnost RNAi v sesalskih celicah na osnovi RNA-biomarkerjev, ki jih transficirana celica izraža. Cond-siRNA ima za razliko od konvencionalnih siRNA nizko stopnjo aktivacije v netarčnih celicah in aktivnost, primerljivo s konvencionalnimi siRNA, v tarčnih celicah.. Senzorična veriga je popolnoma neodvisna od zaporedja vodilne verige oziroma siRNA, kar nam omogoča, da lahko z isto siRNA utišamo gene samo v določenem tipu celic ali pa v celicah, ki izražajo enak biomarker, utišamo kateri koli gen. Poleg tega lahko stabilnost in dostopnost zdravila reguliramo z različnimi kemijskimi modifikacijami konstrukta. Konstrukt Cond-siRNA se je torej izkazal kot perspektivna možnost za tarčno zdravljenje, vendar je v nadaljevanju potrebno učinkovitost konstrukta preveriti tudi na živalskih modelih in vivo.

== Viri in literatura ==

[1] R. L. Setten, J. J. Rossi in S. ping Han, “The current state and future directions of RNAi-based therapeutics,” Nat. Rev. Drug Discov., vol. 18, no. 6, pp. 421–446, 2019, doi: 10.1038/s41573-019-0017-4.

[2] E. Bindewald, K. A. Afonin, M. Viard, P. Zakrevsky, T. Kim in B. A. Shapiro, “Multistrand Structure Prediction of Nucleic Acid Assemblies and Design of RNA Switches,” Nano Lett., vol. 16, no. 3, pp. 1726–1735, 2016, doi: 10.1021/acs.nanolett.5b04651.

[3] S. ping Han et al., “Programmable siRNA pro-drugs that activate RNAi activity in response to specific cellular RNA biomarkers,” Mol. Ther. - Nucleic Acids, vol. 27, no. March, pp. 797–809, 2022, doi: 10.1016/j.omtn.2021.12.039.

[4] P. Banerjee and A. Bandyopadhyay, “Cytosolic dynamics of annexin a6 trigger feedback regulation of hypertrophy via atrial natriuretic peptide in cardiomyocytes,” J. Biol. Chem., vol. 289, no. 9, pp. 5371–5385, 2014, doi: 10.1074/jbc.M113.514810.

Seminarji SB 2021/22

2022-04-10T17:59:17Z

Tina Zavodnik:

Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali

2022-04-10T17:56:43Z

Tina Zavodnik:

Izhodiščni članek: [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8863173/X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10(February), str. 1–7.]

== Medproteinske interakcije ==

Medproteinske interakcije, med katere spadajo tudi dvokomponentni dimerizacijski sistemi, so ena ključnih točk za regulacijo celične signalizacije, izražanja genov in metabolizma. Interakcije med proteini lahko kontroliramo s pomočjo kemikalij (''CID – chemically-induced dimerization'') ali svetlobe (''LID -light induced dimerization''). Nekatere učinkovine so lahko toksične za celice ali pa jih je potrebno v celice vnesti s pomočjo kompleksnih transportnih sistemov. V tem oziru je indukcija s svetlobo enostavnejša [1].
Naravni dimerizacijski sistemi so pogosto kompleksni in se na aktivacijski signal ne odzivajo dovolj specifično. Pogosto imajo rezidualno aktivnost tudi v neaktivni obliki, po indukciji pa se ne odzovejo z dovoljšno intenzivnostjo. Primernejše je ''de novo'' načrtovanje dimerizacijskih sistemov, pri katerem poiščemo par fotoreceptorja in vezavnega partnerja, ki v naravi sicer ne interagirata. Učinkovita je metoda COMBINES-LID, pri kateri iz kombinatorične knjižnice izberemo protein, ki bo ustrezal potrebam našega dimerizacijskega sistema. Dimerizacijski partner mora prepoznati s svetlobo inducirano konformacijsko spremembo na fotoreceptorju. Konformacija fotoreceptorjev je pogosto funkcijsko pogojena in nestabilna, zato na primer ne moremo z aktivirano obliko receptorja enostavno imunizirati živali in dobiti ustreznih protiteles. V ta namen sintetiziramo kombinatorično knjižnico, v kateri so proteini z imunoglobulinskim, neimunoglobulinskim ali ''de novo'' ustvarjenim proteinskim ogrodjem in naključno spremenjenimi vezavnimi mesti ali površinami. Knjižnico nato izrazimo, ''in vitro'' predstavimo na fagih ali ribosomih ter selekcioniramo. Poznamo več tipov medproteinskih interakcij, na osnovi katerih lahko delujejo svetlobna stikala [1, 2].

== Tipi svetlobnih stikal ==

===Heterodimerizacijska svetlobna stikala===
Najenostavnejši princip delovanja svetlobnega stikala za dimerizacijo je heterodimerizacija fotoreceptorja in dimerizacijskega partnerja, ki se s tem aktivira in deluje na tarčni protein. Pogosti fotoreceptorji so fitokromi, kriptokromi in sistemi za zaznavanje napetosti LOV (''light-oxygen-voltage''). Po obsevanju s svetlobo se spremeni konformacija fotoreceptorja, kar omogoči vezavo dimerizacijskega partnerja. Fotoreceptorju lahko spreminjamo parametre kot so intenzivnost in valovna dolžina aktivacijske svetlobe, specifičnost in afiniteta do dimerizacijskega partnerja ter kinetika in reverzibilnost vezave. Običajno absorbirajo svetlobo nekje med bližnjim infrardečim in ultravijoličnim delom spektra. Naravni fotosistemi imajo pogosto dodatne domene, ki ne sodelujejo pri signaliziranju s svetlobo, lahko pa povzročajo neželene interference. Velikost gena za večdomenski protein je lahko problematična pri vnosu zapisa v celice, sploh v sesalskih celicah pa se pogosto takšen konstrukt težje izraža. Rešitev je lahko odstranitev celotnih proteinskih domen, kar pa lahko vpliva na stabilnost in funkcionalnost fotoreceptorja. Pri ''de novo'' načrtovanju heterodimerizacijskega sistema iz kombinatorične knjižnice s pozitivno in negativno selekcijo izberemo proteine, ki se vežejo bodisi na aktivno bodisi na neaktivno obliko fotoreceptorja. Izbrane proteine lahko nato tudi dodatno optimiziramo. Načrtovanja kombinatoričnih knjižnic fotoreceptorjev se poslužujemo redkeje, saj mutacije pogosto negativno vplivajo na funkcionalnost receptorjev.

===Proteini z izbirno vezavo (''opto-binders'')===
Drug primer svetlobnih stikal so t. i. proteini z izbirno vezavo (''opto-binders''), ki se običajno vežejo na nemodificirane endogene proteine. Izhajajo iz naravnih vezavnih partnerjev tarčnih proteinov (npr. protiteles). Aktivirajo se lahko s komplementacijo proteinskih fragmentov, pri kateri se fragmenta vezavnega proteina po obsevanju s svetlobo sestavita v funkcionalno enoto. Druga možnost je, da svetloba povzroči konformacijsko spremembo, ki alosterično vpliva na vezavno mesto. Alosterično regulirani proteini z izbirno vezavo so sestavljeni le iz ene podenote, zato je potrebno uvesti le en genski zapis, kar pomeni enostavnejše uravnavanje izražanja. Problem je načrtovanje takšnih proteinov za poljubne tarče v celici. Postopki so dolgotrajni, dragi in pogosto manj uspešni, saj moramo fotoreceptor in vezavnega partnerja povezati v funkcionalen alosterično reguliran himerni protein. Pri načrtovanju proteinov z izbirno vezavo običajno v ogrodje vezavnega proteina vstavimo fotosenzorično domeno. To pogosto privede do napak, saj nova domena moti ali spremeni vezavo na tarčo. Tudi za selekcijo proteinov z izbirno vezavo bi lahko uporabili metodo COMBINES-LID, vendar se poraja vprašanje, ali tovrstni sistemi pri predstavitvi na površini ohranijo funkcionalnost [1].

===Kemično inducirana dimerizacija, uravnavana s svetlobnim stikalom===
To je sistem, pri katerem namesto fotoreceptorja svetloba sprosti ali aktivira učinkovino, ki se nato veže na t. i. proteinsko sidro in omogoči njegovo dimerizacijo s funkcijskim proteinom. Sistem lahko temelji na nemodificiranih endogenih sidrnih proteinih in vezavnih partnerjih. Učinkovine so običajno male molekule z na svetlobo občutljivo funkcionalno skupino. Na tem delu male molekule lahko svetloba povzroči cepitev (npr. v derivatih kumarina in 2-nitrobenzena) ali fotoizomerizacijo (npr. v derivatih azobenzena). Regulacija takih sistemov lahko poteka na treh stopnjah: pri aktivaciji učinkovine s svetlobo, vezavi učinkovine na proteinsko sidro in pri dimerizaciji sidra s svojim partnerjem. Selekcija ustreznih komponent dimerizacijskega sistema poteka v dveh korakih. Najprej se iz knjižnice malih molekul izbere ligand, ki se po aktivaciji s svetlobo ustrezno veže na proteinsko sidro. Sledi iskanje dimerizacijskega partnerja, ki se lahko veže na z ligandom aktivirano proteinsko sidro. V obeh stopnjah izvedemo pozitivno in negativno selekcijo. V tem primeru se uporablja metoda COMBINES-CID [1, 2].

== Primer: sistem nanoReD ==

Sistem nanoReD omogoča specifično in reverzibilno dimerizacijo, inducirano z rdečo svetlobo. Deluje na osnovi heterodimerizacije. Fotoreceptor v tem sistemu je bakterijski fitokrom ''Dr''BphP, nanj pa se veže specifično protitelo. Aktivacijska svetloba ima valovno dolžino 654 nm, inaktivacijska svetloba pa 775 nm. Tkivo prepušča svetlobo z valovno dolžino od 650 nm do 900 nm, zato lahko sistem ''in vivo'' uporabimo za kontrolo celičnih procesov v globlje ležečih tkivih. Sistem je bil načrtovan ''de novo'', ustrezni komponenti pa sta bili izbrani s pomočjo metode COMBINES-LID [3].

'''1. Izbira fotoreceptorja:'''
DrBphP je bakterijski fitokrom, ki kot kromofor uporablja biliverdin. Ta je prisoten tudi v sesalskih celicah, zato eksogena administracija ni potrebna. V sistemu so uporabili skrajšano obliko fotoreceptorja, kar pa ni vplivalo na njegovo aktivnost. Dodatno so proteinu dodali tudi biotinsko oznako, ki je omogočila pritrjevanje prek avidina.

'''2. Selekcija nanoprotiteles:'''
Nanoprotitelesa so enodomenska protitelesa, velika 12 do 15 kDa, ki imajo enotno ogrodje in tri variabilne komplementarnost določujoče regije. Uporabili so kombinatorično knjižnico nanoprotiteles, ustvarjeno s pomočjo tehnologije trinukleotidne mutageneze [4]. Nanoprotitelesa so predstavili na površini fagov in jih selekcionirali. Prvo stopnjo je predstavljala negativna selekcija, pri kateri so na kolono so prek biotina imobilizirali temotno obliko ''Dr''BphP (obsevano z inaktivacijsko svetlobo). Protitelesa, ki so se vezala na to obliko so izločili, ostala so le tista z nizko ali ničelno afiniteto do temotne oblike. V drugi stopnji so izvedli pozitivno selekcijo, kjer so se nenoprotitelesa vezala na kolono s svetlobno obliko ''Dr''BphP (obsevano z aktivacijsko svetlobo). Ta protitelesa so iz kolone eluirali z obsevanjem z inaktivacijsko svetlobo. Po štirih ciklih tovrstne selekcije so dobili podknjižnico specifičnih nanoprotiteles, ki so sposobna reverzibilne vezave.

'''3. Dvohibridni sistem kvasovk:'''
Z dvohibridnim sistemom kvasovk so ugotovili, katera nanoprotitelesa iz podknjižnice se lahko izražajo v citoplazmi in ohranijo specifičnost vezave. Sev kvasovk Y2HGold so kotransficirali z dvema plazmidoma, na enem je bil zapis za fotoreceptor ''Dr''BphP, na drugem pa zapis za nanoprotitelo. Ta sev kvasovk ima zapise za 4 encime, ki komplementirajo okvarjene poti biosinteze aminokislin, izražajo pa se le pod pogojem, da preiskovana proteina dimerizirata. Proteina dimerizirata le, ko ju obsevamo s svetlobo, zato so za nadaljnje študije izbrali kolonije kvasovk, ki so zrastle na ustreznem selekcijskem gojišču po obsevanju z aktivacijsko svetlobo. Na tak način so določili 5 variant nanoprotiteles, katerih specifičnost in reverzibilnost vezave so dodatno potrdili še z ELISO.

'''4. Validacija v sesalskih celicah:'''
Za določanje aktivnosti ''in vivo'' so dimerizacijski sistem vnesli v dvohibridni sistem sesalskih celic. V celično linijo HEK 293T so vnesli zapisa za fuzijo ''Dr''BphP in N-končne DNA-vezavne domene GAL4 ter nanoprotitelesa s C-končno domeno transkripcijskega aktivatorja p65. Tak sistem je omogočil s svetlobo regulirano izražanje luciferaze. V celicah, ki so jih gojili v temi ali pa obsevali z inaktivacijsko svetlobo, aktivnosti reporterskega proteina niso zaznali, v celicah, obsevanih z aktivatorno svetlobo, pa se je luciferaza izražala. Pozitiven rezultat so dobili pri dveh od petih variant nanoprotiteles, z naknadnimi analizami pa so ugotovili, da se ostale tri variante fragmentirajo in očitno niso primerne za izražanje v tem tipu gostiteljskih celic. Največjo vrednost je signal reporterskega proteina dosegel po 24 urah in je bil približno 19-krat višji kot signal negativne kontrole in temotne oblike sistema.

'''5. Validacija v živih organizmih:'''
Preverjanje delovanja sistema so izvedli v golih miših, ki so jim transformirane celice HEK 293T subkutano injicirali ali pa jih transplantirali v jetra. Po obsevanju z aktivatorno svetlobo se je po 24 urah bioluminiscenca celic v obeh primerih povečala 25- do 30-krat. S tem so dokazali, da sistem deluje tudi v živih organizmih, svetloba pri valovni dolžini 654 nm pa lahko prodre tudi v globlje plasti tkiva [3].

== Zaključek ==

Načrtovanje sistemov iz poljubnih kombinacij stikal in aktuatorjev predstavlja širok nabor funkcij, ki jih taki sistemi lahko opravljajo. Kombinatorične metode nam omogočajo učinkovito in relativno enostavno določanje interakcijskih partnerjev s primerno občutljivostjo in specifičnostjo. Neinvazivna regulacija medproteinskih interakcij s svetlobo ima velik aplikativni potencial v biomedicini, na primer časovno in prostorsko specifična aktivacija imunskih celic za zdravljenje tumorjev.

== Viri ==

[1] X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10(February), str. 1–7.

[2] S. Kang, K. Davidsen, L. Gomez-castillo, H. Jiang, X. Fu, Z. Li, Y. Liang, M. Jahn, M. Moussa, … L. Gu: COMBINES-CID: An Efficient Method for De Novo Engineering of Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, str. 10948–10952.

[3] Z. Huang, Z. Li, X. Zhang, S. Kang, R. Dong, L. Sun, X. Fu, D. Vaisar, K. Watanabe, L. Gu: Creating Red Light-Switchable Protein Dimerization Systems as Genetically Encoded Actuators with High Specificity. ACS Synth. Biol. 2020, 9(12), str. 3322–3333.

[4] B. Virnekas, L. Ge, A. Plukthun, K. C. Schneider, G. Wellnhofer, S. E. Moroney: Trinucleotide phosphoramidites: Ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 1994, 22(25), str. 5600–5607.

Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali

2022-04-10T17:51:33Z

Tina Zavodnik: /* Medproteinske interakcije */

Izhodiščni članek: [X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10(February), str. 1–7.]

== Medproteinske interakcije ==

Medproteinske interakcije, med katere spadajo tudi dvokomponentni dimerizacijski sistemi, so ena ključnih točk za regulacijo celične signalizacije, izražanja genov in metabolizma. Interakcije med proteini lahko kontroliramo s pomočjo kemikalij (''CID – chemically-induced dimerization'') ali svetlobe (''LID -light induced dimerization''). Nekatere učinkovine so lahko toksične za celice ali pa jih je potrebno v celice vnesti s pomočjo kompleksnih transportnih sistemov. V tem oziru je indukcija s svetlobo enostavnejša [1].
Naravni dimerizacijski sistemi so pogosto kompleksni in se na aktivacijski signal ne odzivajo dovolj specifično. Pogosto imajo rezidualno aktivnost tudi v neaktivni obliki, po indukciji pa se ne odzovejo z dovoljšno intenzivnostjo. Primernejše je de novo načrtovanje dimerizacijskih sistemov, pri katerem poiščemo par fotoreceptorja in vezavnega partnerja, ki v naravi sicer ne interagirata. Učinkovita je metoda COMBINES-LID, pri kateri iz kombinatorične knjižnice izberemo protein, ki bo ustrezal potrebam našega dimerizacijskega sistema. Dimerizacijski partner mora prepoznati s svetlobo inducirano konformacijsko spremembo na fotoreceptorju. Konformacija fotoreceptorjev je pogosto funkcijsko pogojena in nestabilna, zato na primer ne moremo z aktivirano obliko receptorja enostavno imunizirati živali in dobiti ustreznih protiteles. V ta namen sintetiziramo kombinatorično knjižnico, v kateri so proteini z imunoglobulinskim, neimunoglobulinskim ali de novo ustvarjenim proteinskim ogrodjem in naključno spremenjenimi vezavnimi mesti ali površinami. Knjižnico nato izrazimo, in vitro predstavimo na fagih ali ribosomih ter selekcioniramo. Poznamo več tipov medproteinskih interakcij, na osnovi katerih lahko delujejo svetlobna stikala [1,2].

== Tipi svetlobnih stikal ==

===Heterodimerizacijska svetlobna stikala===
Najenostavnejši princip delovanja svetlobnega stikala za dimerizacijo je heterodimerizacija fotoreceptorja in dimerizacijskega partnerja, ki se s tem aktivira in deluje na tarčni protein. Pogosti fotoreceptorji so fitokromi, kriptokromi in sistemi za zaznavanje napetosti LOV (light-oxygen-voltage). Po obsevanju s svetlobo se spremeni konformacija fotoreceptorja, kar omogoči vezavo dimerizacijskega partnerja. Fotoreceptorju lahko spreminjamo parametre kot so intenzivnost in valovna dolžina aktivacijske svetlobe, specifičnost in afiniteta do dimerizacijskega partnerja ter kinetika in reverzibilnost vezave. Običajno absorbirajo svetlobo nekje med bližnjim infrardečim in ultravijoličnim delom spektra. Naravni fotosistemi imajo pogosto dodatne domene, ki ne sodelujejo pri signaliziranju s svetlobo, lahko pa povzročajo neželene interference. Velikost gena za večdomenski protein je lahko problematična pri vnosu zapisa v celice, sploh v sesalskih celicah pa se pogosto takšen konstrukt težje izraža. Rešitev je lahko odstranitev celotnih proteinskih domen, kar pa lahko vpliva na stabilnost in funkcionalnost fotoreceptorja. Pri de novo načrtovanju heterodimerizacijskega sistema iz kombinatorične knjižnice s pozitivno in negativno selekcijo izberemo proteine, ki se vežejo bodisi na aktivno bodisi na neaktivno obliko fotoreceptorja. Izbrane proteine lahko nato tudi dodatno optimiziramo. Načrtovanja kombinatoričnih knjižnic fotoreceptorjev se poslužujemo redkeje, saj mutacije pogosto negativno vplivajo na funkcionalnost receptorjev.

===Proteini z izbirno vezavo (''opto-binders'')===
Drug primer svetlobnih stikal so t. i. proteini z izbirno vezavo (opto-binders), ki se običajno vežejo na nemodificirane endogene proteine. Izhajajo iz naravnih vezavnih partnerjev tarčnih proteinov (npr. protiteles). Aktivirajo se lahko s komplementacijo proteinskih fragmentov, pri kateri se fragmenta vezavnega proteina po obsevanju s svetlobo sestavita v funkcionalno enoto. Druga možnost je, da svetloba povzroči konformacijsko spremembo, ki alosterično vpliva na vezavno mesto. Alosterično regulirani proteini z izbirno vezavo so sestavljeni le iz ene podenote, zato je potrebno uvesti le en genski zapis, kar pomeni enostavnejše uravnavanje izražanja. Problem je načrtovanje takšnih proteinov za poljubne tarče v celici. Postopki so dolgotrajni, dragi in pogosto manj uspešni, saj moramo fotoreceptor in vezavnega partnerja povezati v funkcionalen alosterično reguliran himerni protein. Pri načrtovanju proteinov z izbirno vezavo običajno v ogrodje vezavnega proteina vstavimo fotosenzorično domeno. To pogosto privede do napak, saj nova domena moti ali spremeni vezavo na tarčo. Tudi za selekcijo proteinov z izbirno vezavo bi lahko uporabili metodo COMBINES-LID, vendar se poraja vprašanje, ali tovrstni sistemi pri predstavitvi na površini ohranijo funkcionalnost [1].

===Kemično inducirana dimerizacija, uravnavana s svetlobnim stikalom===
To je sistem, pri katerem namesto fotoreceptorja svetloba sprosti ali aktivira učinkovino, ki se nato veže na t. i. proteinsko sidro in omogoči njegovo dimerizacijo s funkcijskim proteinom. Sistem lahko temelji na nemodificiranih endogenih sidrnih proteinih in vezavnih partnerjih. Učinkovine so običajno male molekule z na svetlobo občutljivo funkcionalno skupino. Na tem delu male molekule lahko svetloba povzroči cepitev (npr. v derivatih kumarina in 2-nitrobenzena) ali fotoizomerizacijo (npr. v derivatih azobenzena). Regulacija takih sistemov lahko poteka na treh stopnjah: pri aktivaciji učinkovine s svetlobo, vezavi učinkovine na proteinsko sidro in pri dimerizaciji sidra s svojim partnerjem. Selekcija ustreznih komponent dimerizacijskega sistema poteka v dveh korakih. Najprej se iz knjižnice malih molekul izbere ligand, ki se po aktivaciji s svetlobo ustrezno veže na proteinsko sidro. Sledi iskanje dimerizacijskega partnerja, ki se lahko veže na z ligandom aktivirano proteinsko sidro. V obeh stopnjah izvedemo pozitivno in negativno selekcijo. V tem primeru se uporablja metoda COMBINES-CID [1, 2].

== Primer: sistem nanoReD ==

Sistem nanoReD omogoča specifično in reverzibilno dimerizacijo, inducirano z rdečo svetlobo. Deluje na osnovi heterodimerizacije. Fotoreceptor v tem sistemu je bakterijski fitokrom ''Dr''BphP, nanj pa se veže specifično protitelo. Aktivacijska svetloba ima valovno dolžino 654 nm, inaktivacijska svetloba pa 775 nm. Tkivo prepušča svetlobo z valovno dolžino od 650 nm do 900 nm, zato lahko sistem in vivo uporabimo za kontrolo celičnih procesov v globlje ležečih tkivih. Sistem je bil načrtovan de novo, ustrezni komponenti pa sta bili izbrani s pomočjo metode COMBINES-LID [3].

'''1. Izbira fotoreceptorja:'''
DrBphP je bakterijski fitokrom, ki kot kromofor uporablja biliverdin. Ta je prisoten tudi v sesalskih celicah, zato eksogena administracija ni potrebna. V sistemu so uporabili skrajšano obliko fotoreceptorja, kar pa ni vplivalo na njegovo aktivnost. Dodatno so proteinu dodali tudi biotinsko oznako, ki je omogočila pritrjevanje prek avidina.

'''2. Selekcija nanoprotiteles:'''
Nanoprotitelesa so enodomenska protitelesa, velika 12 do 15 kDa, ki imajo enotno ogrodje in tri variabilne komplementarnost določujoče regije. Uporabili so kombinatorično knjižnico nanoprotiteles, ustvarjeno s pomočjo tehnologije trinukleotidne mutageneze [4]. Nanoprotitelesa so predstavili na površini fagov in jih selekcionirali. Prvo stopnjo je predstavljala negativna selekcija, pri kateri so na kolono so prek biotina imobilizirali temotno obliko ''Dr''BphP (obsevano z inaktivacijsko svetlobo). Protitelesa, ki so se vezala na to obliko so izločili, ostala so le tista z nizko ali ničelno afiniteto do temotne oblike. V drugi stopnji so izvedli pozitivno selekcijo, kjer so se nenoprotitelesa vezala na kolono s svetlobno obliko ''Dr''BphP (obsevano z aktivacijsko svetlobo). Ta protitelesa so iz kolone eluirali z obsevanjem z inaktivacijsko svetlobo. Po štirih ciklih tovrstne selekcije so dobili podknjižnico specifičnih nanoprotiteles, ki so sposobna reverzibilne vezave.

'''3. Dvohibridni sistem kvasovk:'''
Z dvohibridnim sistemom kvasovk so ugotovili, katera nanoprotitelesa iz podknjižnice se lahko izražajo v citoplazmi in ohranijo specifičnost vezave. Sev kvasovk Y2HGold so kotransficirali z dvema plazmidoma, na enem je bil zapis za fotoreceptor ''Dr''BphP, na drugem pa zapis za nanoprotitelo. Ta sev kvasovk ima zapise za 4 encime, ki komplementirajo okvarjene poti biosinteze aminokislin, izražajo pa se le pod pogojem, da preiskovana proteina dimerizirata. Proteina dimerizirata le, ko ju obsevamo s svetlobo, zato so za nadaljnje študije izbrali kolonije kvasovk, ki so zrastle na ustreznem selekcijskem gojišču po obsevanju z aktivacijsko svetlobo. Na tak način so določili 5 variant nanoprotiteles, katerih specifičnost in reverzibilnost vezave so dodatno potrdili še z ELISO.

'''4. Validacija v sesalskih celicah:'''
Za določanje aktivnosti in vivo so dimerizacijski sistem vnesli v dvohibridni sistem sesalskih celic. V celično linijo HEK 293T so vnesli zapisa za fuzijo ''Dr''BphP in N-končne DNA-vezavne domene GAL4 ter nanoprotitelesa s C-končno domeno transkripcijskega aktivatorja p65. Tak sistem je omogočil s svetlobo regulirano izražanje luciferaze. V celicah, ki so jih gojili v temi ali pa obsevali z inaktivacijsko svetlobo, aktivnosti reporterskega proteina niso zaznali, v celicah, obsevanih z aktivatorno svetlobo, pa se je luciferaza izražala. Pozitiven rezultat so dobili pri dveh od petih variant nanoprotiteles, z naknadnimi analizami pa so ugotovili, da se ostale tri variante fragmentirajo in očitno niso primerne za izražanje v tem tipu gostiteljskih celic. Največjo vrednost je signal reporterskega proteina dosegel po 24 urah in je bil približno 19-krat višji kot signal negativne kontrole in temotne oblike sistema.

'''5. Validacija v živih organizmih:'''
Preverjanje delovanja sistema so izvedli v golih miših, ki so jim transformirane celice HEK 293T subkutano injicirali ali pa jih transplantirali v jetra. Po obsevanju z aktivatorno svetlobo se je po 24 urah bioluminiscenca celic v obeh primerih povečala 25- do 30-krat. S tem so dokazali, da sistem deluje tudi v živih organizmih, svetloba pri valovni dolžini 654 nm pa lahko prodre tudi v globlje plasti tkiva [3].

== Zaključek ==

Načrtovanje sistemov iz poljubnih kombinacij stikal in aktuatorjev predstavlja širok nabor funkcij, ki jih taki sistemi lahko opravljajo. Kombinatorične metode nam omogočajo učinkovito in relativno enostavno določanje interakcijskih partnerjev s primerno občutljivostjo in specifičnostjo. Neinvazivna regulacija medproteinskih interakcij s svetlobo ima velik aplikativni potencial v biomedicini, na primer časovno in prostorsko specifična aktivacija imunskih celic za zdravljenje tumorjev.

== Viri ==

[1] X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10(February), str. 1–7.

[2] S. Kang, K. Davidsen, L. Gomez-castillo, H. Jiang, X. Fu, Z. Li, Y. Liang, M. Jahn, M. Moussa, … L. Gu: COMBINES-CID: An Efficient Method for De Novo Engineering of Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, str. 10948–10952.

[3] Z. Huang, Z. Li, X. Zhang, S. Kang, R. Dong, L. Sun, X. Fu, D. Vaisar, K. Watanabe, L. Gu: Creating Red Light-Switchable Protein Dimerization Systems as Genetically Encoded Actuators with High Specificity. ACS Synth. Biol. 2020, 9(12), str. 3322–3333.

[4] B. Virnekas, L. Ge, A. Plukthun, K. C. Schneider, G. Wellnhofer, S. E. Moroney: Trinucleotide phosphoramidites: Ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 1994, 22(25), str. 5600–5607.

Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali

2022-04-10T17:50:38Z

Tina Zavodnik: /* Primer: sistem nanoReD */

Izhodiščni članek: [X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10(February), str. 1–7.]

== Medproteinske interakcije ==

Medproteinske interakcije, med katere spadajo tudi dvokomponentni dimerizacijski sistemi, so ena ključnih točk za regulacijo celične signalizacije, izražanja genov in metabolizma. Interakcije med proteini lahko kontroliramo s pomočjo kemikalij (''CID – chemically-induced dimerization'') ali svetlobe (''LID -light induced dimerization''). Nekatere učinkovine so lahko toksične za celice ali pa jih je potrebno v celice vnesti s pomočjo kompleksnih transportnih sistemov. V tem oziru je indukcija s svetlobo enostavnejša [1].
Naravni dimerizacijski sistemi so pogosto kompleksni in se na aktivacijski signal ne odzivajo dovolj specifično. Pogosto imajo rezidualno aktivnost tudi v neaktivni obliki, po indukciji pa se ne odzovejo z dovoljšno intenzivnostjo. Primernejše je de novo načrtovanje dimerizacijskih sistemov, pri katerem poiščemo par fotoreceptorja in vezavnega partnerja, ki v naravi sicer ne interagirata. Učinkovita je metoda COMBINES-LID, pri kateri iz kombinatorične knjižnice izberemo protein, ki bo ustrezal potrebam našega dimerizacijskega sistema. Dimerizacijski partner mora prepoznati s svetlobo inducirano konformacijsko spremembo na fotoreceptorju. Konformacija fotoreceptorjev je pogosto funkcijsko pogojena in nestabilna, zato na primer ne moremo z aktivirano obliko receptorja enostavno imunizirati živali in dobiti ustreznih protiteles. V ta namen sintetiziramo kombinatorično knjižnico, v kateri so proteini z imunoglobulinskim, neimunoglobulinskim ali de novo ustvarjenim proteinskim ogrodjem in naključno spremenjenimi vezavnimi mesti ali površinami. Knjižnico nato izrazimo, in vitro predstavimo na fagih ali ribosomih ter selekcioniramo. Poznamo več tipov medproteinskih interakcij, na osnovi katerih lahko delujejo svetlobna stikala [ , ].

== Tipi svetlobnih stikal ==

===Heterodimerizacijska svetlobna stikala===
Najenostavnejši princip delovanja svetlobnega stikala za dimerizacijo je heterodimerizacija fotoreceptorja in dimerizacijskega partnerja, ki se s tem aktivira in deluje na tarčni protein. Pogosti fotoreceptorji so fitokromi, kriptokromi in sistemi za zaznavanje napetosti LOV (light-oxygen-voltage). Po obsevanju s svetlobo se spremeni konformacija fotoreceptorja, kar omogoči vezavo dimerizacijskega partnerja. Fotoreceptorju lahko spreminjamo parametre kot so intenzivnost in valovna dolžina aktivacijske svetlobe, specifičnost in afiniteta do dimerizacijskega partnerja ter kinetika in reverzibilnost vezave. Običajno absorbirajo svetlobo nekje med bližnjim infrardečim in ultravijoličnim delom spektra. Naravni fotosistemi imajo pogosto dodatne domene, ki ne sodelujejo pri signaliziranju s svetlobo, lahko pa povzročajo neželene interference. Velikost gena za večdomenski protein je lahko problematična pri vnosu zapisa v celice, sploh v sesalskih celicah pa se pogosto takšen konstrukt težje izraža. Rešitev je lahko odstranitev celotnih proteinskih domen, kar pa lahko vpliva na stabilnost in funkcionalnost fotoreceptorja. Pri de novo načrtovanju heterodimerizacijskega sistema iz kombinatorične knjižnice s pozitivno in negativno selekcijo izberemo proteine, ki se vežejo bodisi na aktivno bodisi na neaktivno obliko fotoreceptorja. Izbrane proteine lahko nato tudi dodatno optimiziramo. Načrtovanja kombinatoričnih knjižnic fotoreceptorjev se poslužujemo redkeje, saj mutacije pogosto negativno vplivajo na funkcionalnost receptorjev.

===Proteini z izbirno vezavo (''opto-binders'')===
Drug primer svetlobnih stikal so t. i. proteini z izbirno vezavo (opto-binders), ki se običajno vežejo na nemodificirane endogene proteine. Izhajajo iz naravnih vezavnih partnerjev tarčnih proteinov (npr. protiteles). Aktivirajo se lahko s komplementacijo proteinskih fragmentov, pri kateri se fragmenta vezavnega proteina po obsevanju s svetlobo sestavita v funkcionalno enoto. Druga možnost je, da svetloba povzroči konformacijsko spremembo, ki alosterično vpliva na vezavno mesto. Alosterično regulirani proteini z izbirno vezavo so sestavljeni le iz ene podenote, zato je potrebno uvesti le en genski zapis, kar pomeni enostavnejše uravnavanje izražanja. Problem je načrtovanje takšnih proteinov za poljubne tarče v celici. Postopki so dolgotrajni, dragi in pogosto manj uspešni, saj moramo fotoreceptor in vezavnega partnerja povezati v funkcionalen alosterično reguliran himerni protein. Pri načrtovanju proteinov z izbirno vezavo običajno v ogrodje vezavnega proteina vstavimo fotosenzorično domeno. To pogosto privede do napak, saj nova domena moti ali spremeni vezavo na tarčo. Tudi za selekcijo proteinov z izbirno vezavo bi lahko uporabili metodo COMBINES-LID, vendar se poraja vprašanje, ali tovrstni sistemi pri predstavitvi na površini ohranijo funkcionalnost [1].

===Kemično inducirana dimerizacija, uravnavana s svetlobnim stikalom===
To je sistem, pri katerem namesto fotoreceptorja svetloba sprosti ali aktivira učinkovino, ki se nato veže na t. i. proteinsko sidro in omogoči njegovo dimerizacijo s funkcijskim proteinom. Sistem lahko temelji na nemodificiranih endogenih sidrnih proteinih in vezavnih partnerjih. Učinkovine so običajno male molekule z na svetlobo občutljivo funkcionalno skupino. Na tem delu male molekule lahko svetloba povzroči cepitev (npr. v derivatih kumarina in 2-nitrobenzena) ali fotoizomerizacijo (npr. v derivatih azobenzena). Regulacija takih sistemov lahko poteka na treh stopnjah: pri aktivaciji učinkovine s svetlobo, vezavi učinkovine na proteinsko sidro in pri dimerizaciji sidra s svojim partnerjem. Selekcija ustreznih komponent dimerizacijskega sistema poteka v dveh korakih. Najprej se iz knjižnice malih molekul izbere ligand, ki se po aktivaciji s svetlobo ustrezno veže na proteinsko sidro. Sledi iskanje dimerizacijskega partnerja, ki se lahko veže na z ligandom aktivirano proteinsko sidro. V obeh stopnjah izvedemo pozitivno in negativno selekcijo. V tem primeru se uporablja metoda COMBINES-CID [1, 2].

== Primer: sistem nanoReD ==

Sistem nanoReD omogoča specifično in reverzibilno dimerizacijo, inducirano z rdečo svetlobo. Deluje na osnovi heterodimerizacije. Fotoreceptor v tem sistemu je bakterijski fitokrom ''Dr''BphP, nanj pa se veže specifično protitelo. Aktivacijska svetloba ima valovno dolžino 654 nm, inaktivacijska svetloba pa 775 nm. Tkivo prepušča svetlobo z valovno dolžino od 650 nm do 900 nm, zato lahko sistem in vivo uporabimo za kontrolo celičnih procesov v globlje ležečih tkivih. Sistem je bil načrtovan de novo, ustrezni komponenti pa sta bili izbrani s pomočjo metode COMBINES-LID [3].

'''1. Izbira fotoreceptorja:'''
DrBphP je bakterijski fitokrom, ki kot kromofor uporablja biliverdin. Ta je prisoten tudi v sesalskih celicah, zato eksogena administracija ni potrebna. V sistemu so uporabili skrajšano obliko fotoreceptorja, kar pa ni vplivalo na njegovo aktivnost. Dodatno so proteinu dodali tudi biotinsko oznako, ki je omogočila pritrjevanje prek avidina.

'''2. Selekcija nanoprotiteles:'''
Nanoprotitelesa so enodomenska protitelesa, velika 12 do 15 kDa, ki imajo enotno ogrodje in tri variabilne komplementarnost določujoče regije. Uporabili so kombinatorično knjižnico nanoprotiteles, ustvarjeno s pomočjo tehnologije trinukleotidne mutageneze [4]. Nanoprotitelesa so predstavili na površini fagov in jih selekcionirali. Prvo stopnjo je predstavljala negativna selekcija, pri kateri so na kolono so prek biotina imobilizirali temotno obliko ''Dr''BphP (obsevano z inaktivacijsko svetlobo). Protitelesa, ki so se vezala na to obliko so izločili, ostala so le tista z nizko ali ničelno afiniteto do temotne oblike. V drugi stopnji so izvedli pozitivno selekcijo, kjer so se nenoprotitelesa vezala na kolono s svetlobno obliko ''Dr''BphP (obsevano z aktivacijsko svetlobo). Ta protitelesa so iz kolone eluirali z obsevanjem z inaktivacijsko svetlobo. Po štirih ciklih tovrstne selekcije so dobili podknjižnico specifičnih nanoprotiteles, ki so sposobna reverzibilne vezave.

'''3. Dvohibridni sistem kvasovk:'''
Z dvohibridnim sistemom kvasovk so ugotovili, katera nanoprotitelesa iz podknjižnice se lahko izražajo v citoplazmi in ohranijo specifičnost vezave. Sev kvasovk Y2HGold so kotransficirali z dvema plazmidoma, na enem je bil zapis za fotoreceptor ''Dr''BphP, na drugem pa zapis za nanoprotitelo. Ta sev kvasovk ima zapise za 4 encime, ki komplementirajo okvarjene poti biosinteze aminokislin, izražajo pa se le pod pogojem, da preiskovana proteina dimerizirata. Proteina dimerizirata le, ko ju obsevamo s svetlobo, zato so za nadaljnje študije izbrali kolonije kvasovk, ki so zrastle na ustreznem selekcijskem gojišču po obsevanju z aktivacijsko svetlobo. Na tak način so določili 5 variant nanoprotiteles, katerih specifičnost in reverzibilnost vezave so dodatno potrdili še z ELISO.

'''4. Validacija v sesalskih celicah:'''
Za določanje aktivnosti in vivo so dimerizacijski sistem vnesli v dvohibridni sistem sesalskih celic. V celično linijo HEK 293T so vnesli zapisa za fuzijo ''Dr''BphP in N-končne DNA-vezavne domene GAL4 ter nanoprotitelesa s C-končno domeno transkripcijskega aktivatorja p65. Tak sistem je omogočil s svetlobo regulirano izražanje luciferaze. V celicah, ki so jih gojili v temi ali pa obsevali z inaktivacijsko svetlobo, aktivnosti reporterskega proteina niso zaznali, v celicah, obsevanih z aktivatorno svetlobo, pa se je luciferaza izražala. Pozitiven rezultat so dobili pri dveh od petih variant nanoprotiteles, z naknadnimi analizami pa so ugotovili, da se ostale tri variante fragmentirajo in očitno niso primerne za izražanje v tem tipu gostiteljskih celic. Največjo vrednost je signal reporterskega proteina dosegel po 24 urah in je bil približno 19-krat višji kot signal negativne kontrole in temotne oblike sistema.

'''5. Validacija v živih organizmih:'''
Preverjanje delovanja sistema so izvedli v golih miših, ki so jim transformirane celice HEK 293T subkutano injicirali ali pa jih transplantirali v jetra. Po obsevanju z aktivatorno svetlobo se je po 24 urah bioluminiscenca celic v obeh primerih povečala 25- do 30-krat. S tem so dokazali, da sistem deluje tudi v živih organizmih, svetloba pri valovni dolžini 654 nm pa lahko prodre tudi v globlje plasti tkiva [3].

== Zaključek ==

Načrtovanje sistemov iz poljubnih kombinacij stikal in aktuatorjev predstavlja širok nabor funkcij, ki jih taki sistemi lahko opravljajo. Kombinatorične metode nam omogočajo učinkovito in relativno enostavno določanje interakcijskih partnerjev s primerno občutljivostjo in specifičnostjo. Neinvazivna regulacija medproteinskih interakcij s svetlobo ima velik aplikativni potencial v biomedicini, na primer časovno in prostorsko specifična aktivacija imunskih celic za zdravljenje tumorjev.

== Viri ==

[1] X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10(February), str. 1–7.

[2] S. Kang, K. Davidsen, L. Gomez-castillo, H. Jiang, X. Fu, Z. Li, Y. Liang, M. Jahn, M. Moussa, … L. Gu: COMBINES-CID: An Efficient Method for De Novo Engineering of Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, str. 10948–10952.

[3] Z. Huang, Z. Li, X. Zhang, S. Kang, R. Dong, L. Sun, X. Fu, D. Vaisar, K. Watanabe, L. Gu: Creating Red Light-Switchable Protein Dimerization Systems as Genetically Encoded Actuators with High Specificity. ACS Synth. Biol. 2020, 9(12), str. 3322–3333.

[4] B. Virnekas, L. Ge, A. Plukthun, K. C. Schneider, G. Wellnhofer, S. E. Moroney: Trinucleotide phosphoramidites: Ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 1994, 22(25), str. 5600–5607.

Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali

2022-04-10T17:44:47Z

Tina Zavodnik: New page: Izhodiščni članek: [X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. ...

Izhodiščni članek: [X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10(February), str. 1–7.]

== Medproteinske interakcije ==

Medproteinske interakcije, med katere spadajo tudi dvokomponentni dimerizacijski sistemi, so ena ključnih točk za regulacijo celične signalizacije, izražanja genov in metabolizma. Interakcije med proteini lahko kontroliramo s pomočjo kemikalij (''CID – chemically-induced dimerization'') ali svetlobe (''LID -light induced dimerization''). Nekatere učinkovine so lahko toksične za celice ali pa jih je potrebno v celice vnesti s pomočjo kompleksnih transportnih sistemov. V tem oziru je indukcija s svetlobo enostavnejša [1].
Naravni dimerizacijski sistemi so pogosto kompleksni in se na aktivacijski signal ne odzivajo dovolj specifično. Pogosto imajo rezidualno aktivnost tudi v neaktivni obliki, po indukciji pa se ne odzovejo z dovoljšno intenzivnostjo. Primernejše je de novo načrtovanje dimerizacijskih sistemov, pri katerem poiščemo par fotoreceptorja in vezavnega partnerja, ki v naravi sicer ne interagirata. Učinkovita je metoda COMBINES-LID, pri kateri iz kombinatorične knjižnice izberemo protein, ki bo ustrezal potrebam našega dimerizacijskega sistema. Dimerizacijski partner mora prepoznati s svetlobo inducirano konformacijsko spremembo na fotoreceptorju. Konformacija fotoreceptorjev je pogosto funkcijsko pogojena in nestabilna, zato na primer ne moremo z aktivirano obliko receptorja enostavno imunizirati živali in dobiti ustreznih protiteles. V ta namen sintetiziramo kombinatorično knjižnico, v kateri so proteini z imunoglobulinskim, neimunoglobulinskim ali de novo ustvarjenim proteinskim ogrodjem in naključno spremenjenimi vezavnimi mesti ali površinami. Knjižnico nato izrazimo, in vitro predstavimo na fagih ali ribosomih ter selekcioniramo. Poznamo več tipov medproteinskih interakcij, na osnovi katerih lahko delujejo svetlobna stikala [ , ].

== Tipi svetlobnih stikal ==

===Heterodimerizacijska svetlobna stikala===
Najenostavnejši princip delovanja svetlobnega stikala za dimerizacijo je heterodimerizacija fotoreceptorja in dimerizacijskega partnerja, ki se s tem aktivira in deluje na tarčni protein. Pogosti fotoreceptorji so fitokromi, kriptokromi in sistemi za zaznavanje napetosti LOV (light-oxygen-voltage). Po obsevanju s svetlobo se spremeni konformacija fotoreceptorja, kar omogoči vezavo dimerizacijskega partnerja. Fotoreceptorju lahko spreminjamo parametre kot so intenzivnost in valovna dolžina aktivacijske svetlobe, specifičnost in afiniteta do dimerizacijskega partnerja ter kinetika in reverzibilnost vezave. Običajno absorbirajo svetlobo nekje med bližnjim infrardečim in ultravijoličnim delom spektra. Naravni fotosistemi imajo pogosto dodatne domene, ki ne sodelujejo pri signaliziranju s svetlobo, lahko pa povzročajo neželene interference. Velikost gena za večdomenski protein je lahko problematična pri vnosu zapisa v celice, sploh v sesalskih celicah pa se pogosto takšen konstrukt težje izraža. Rešitev je lahko odstranitev celotnih proteinskih domen, kar pa lahko vpliva na stabilnost in funkcionalnost fotoreceptorja. Pri de novo načrtovanju heterodimerizacijskega sistema iz kombinatorične knjižnice s pozitivno in negativno selekcijo izberemo proteine, ki se vežejo bodisi na aktivno bodisi na neaktivno obliko fotoreceptorja. Izbrane proteine lahko nato tudi dodatno optimiziramo. Načrtovanja kombinatoričnih knjižnic fotoreceptorjev se poslužujemo redkeje, saj mutacije pogosto negativno vplivajo na funkcionalnost receptorjev.

===Proteini z izbirno vezavo (''opto-binders'')===
Drug primer svetlobnih stikal so t. i. proteini z izbirno vezavo (opto-binders), ki se običajno vežejo na nemodificirane endogene proteine. Izhajajo iz naravnih vezavnih partnerjev tarčnih proteinov (npr. protiteles). Aktivirajo se lahko s komplementacijo proteinskih fragmentov, pri kateri se fragmenta vezavnega proteina po obsevanju s svetlobo sestavita v funkcionalno enoto. Druga možnost je, da svetloba povzroči konformacijsko spremembo, ki alosterično vpliva na vezavno mesto. Alosterično regulirani proteini z izbirno vezavo so sestavljeni le iz ene podenote, zato je potrebno uvesti le en genski zapis, kar pomeni enostavnejše uravnavanje izražanja. Problem je načrtovanje takšnih proteinov za poljubne tarče v celici. Postopki so dolgotrajni, dragi in pogosto manj uspešni, saj moramo fotoreceptor in vezavnega partnerja povezati v funkcionalen alosterično reguliran himerni protein. Pri načrtovanju proteinov z izbirno vezavo običajno v ogrodje vezavnega proteina vstavimo fotosenzorično domeno. To pogosto privede do napak, saj nova domena moti ali spremeni vezavo na tarčo. Tudi za selekcijo proteinov z izbirno vezavo bi lahko uporabili metodo COMBINES-LID, vendar se poraja vprašanje, ali tovrstni sistemi pri predstavitvi na površini ohranijo funkcionalnost [1].

===Kemično inducirana dimerizacija, uravnavana s svetlobnim stikalom===
To je sistem, pri katerem namesto fotoreceptorja svetloba sprosti ali aktivira učinkovino, ki se nato veže na t. i. proteinsko sidro in omogoči njegovo dimerizacijo s funkcijskim proteinom. Sistem lahko temelji na nemodificiranih endogenih sidrnih proteinih in vezavnih partnerjih. Učinkovine so običajno male molekule z na svetlobo občutljivo funkcionalno skupino. Na tem delu male molekule lahko svetloba povzroči cepitev (npr. v derivatih kumarina in 2-nitrobenzena) ali fotoizomerizacijo (npr. v derivatih azobenzena). Regulacija takih sistemov lahko poteka na treh stopnjah: pri aktivaciji učinkovine s svetlobo, vezavi učinkovine na proteinsko sidro in pri dimerizaciji sidra s svojim partnerjem. Selekcija ustreznih komponent dimerizacijskega sistema poteka v dveh korakih. Najprej se iz knjižnice malih molekul izbere ligand, ki se po aktivaciji s svetlobo ustrezno veže na proteinsko sidro. Sledi iskanje dimerizacijskega partnerja, ki se lahko veže na z ligandom aktivirano proteinsko sidro. V obeh stopnjah izvedemo pozitivno in negativno selekcijo. V tem primeru se uporablja metoda COMBINES-CID [1, 2].

== Primer: sistem nanoReD ==

Sistem nanoReD omogoča specifično in reverzibilno dimerizacijo, inducirano z rdečo svetlobo. Deluje na osnovi heterodimerizacije. Fotoreceptor v tem sistemu je bakterijski fitokrom DrBphP, nanj pa se veže specifično protitelo. Aktivacijska svetloba ima valovno dolžino 654 nm, inaktivacijska svetloba pa 775 nm. Tkivo prepušča svetlobo z valovno dolžino od 650 nm do 900 nm, zato lahko sistem in vivo uporabimo za kontrolo celičnih procesov v globlje ležečih tkivih. Sistem je bil načrtovan de novo, ustrezni komponenti pa sta bili izbrani s pomočjo metode COMBINES-LID [ ].
1. Izbira fotoreceptorja
DrBphP je bakterijski fitokrom, ki kot kromofor uporablja biliverdin. Ta je prisoten tudi v sesalskih celicah, zato eksogena administracija ni potrebna. V sistemu so uporabili skrajšano obliko fotoreceptorja, kar pa ni vplivalo na njegovo aktivnost. Dodatno so proteinu dodali tudi biotinsko oznako, ki je omogočila pritrjevanje prek avidina.

2. Selekcija nanoprotiteles
Nanoprotitelesa so enodomenska protitelesa, velika 12 do 15 kDa, ki imajo enotno ogrodje in tri variabilne komplementarnost določujoče regije. Uporabili so kombinatorično knjižnico nanoprotiteles, ustvarjeno s pomočjo tehnologije trinukleotidne mutageneze [ ]. Nanoprotitelesa so predstavili na površini fagov in jih selekcionirali. Prvo stopnjo je predstavljala negativna selekcija, pri kateri so na kolono so prek biotina imobilizirali temotno obliko ''Dr''BphP (obsevano z inaktivacijsko svetlobo). Protitelesa, ki so se vezala na to obliko so izločili, ostala so le tista z nizko ali ničelno afiniteto do temotne oblike. V drugi stopnji so izvedli pozitivno selekcijo, kjer so se nenoprotitelesa vezala na kolono s svetlobno obliko ''Dr''BphP (obsevano z aktivacijsko svetlobo). Ta protitelesa so iz kolone eluirali z obsevanjem z inaktivacijsko svetlobo. Po štirih ciklih tovrstne selekcije so dobili podknjižnico specifičnih nanoprotiteles, ki so sposobna reverzibilne vezave.

3. Dvohibridni sistem kvasovk
Z dvohibridnim sistemom kvasovk so ugotovili, katera nanoprotitelesa iz podknjižnice se lahko izražajo v citoplazmi in ohranijo specifičnost vezave. Sev kvasovk Y2HGold so kotransficirali z dvema plazmidoma, na enem je bil zapis za fotoreceptor ''Dr''BphP, na drugem pa zapis za nanoprotitelo. Ta sev kvasovk ima zapise za 4 encime, ki komplementirajo okvarjene poti biosinteze aminokislin, izražajo pa se le pod pogojem, da preiskovana proteina dimerizirata. Proteina dimerizirata le, ko ju obsevamo s svetlobo, zato so za nadaljnje študije izbrali kolonije kvasovk, ki so zrastle na ustreznem selekcijskem gojišču po obsevanju z aktivacijsko svetlobo. Na tak način so določili 5 variant nanoprotiteles, katerih specifičnost in reverzibilnost vezave so dodatno potrdili še z ELISO.

4. Validacija v sesalskih celicah
Za določanje aktivnosti in vivo so dimerizacijski sistem vnesli v dvohibridni sistem sesalskih celic. V celično linijo HEK 293T so vnesli zapisa za fuzijo ''Dr''BphP in N-končne DNA-vezavne domene GAL4 ter nanoprotitelesa s C-končno domeno transkripcijskega aktivatorja p65. Tak sistem je omogočil s svetlobo regulirano izražanje luciferaze. V celicah, ki so jih gojili v temi ali pa obsevali z inaktivacijsko svetlobo, aktivnosti reporterskega proteina niso zaznali, v celicah, obsevanih z aktivatorno svetlobo, pa se je luciferaza izražala. Pozitiven rezultat so dobili pri dveh od petih variant nanoprotiteles, z naknadnimi analizami pa so ugotovili, da se ostale tri variante fragmentirajo in očitno niso primerne za izražanje v tem tipu gostiteljskih celic. Največjo vrednost je signal reporterskega proteina dosegel po 24 urah in je bil približno 19-krat višji kot signal negativne kontrole in temotne oblike sistema.

5. Validacija v živih organizmih
Preverjanje delovanja sistema so izvedli v golih miših, ki so jim transformirane celice HEK 293T subkutano injicirali ali pa jih transplantirali v jetra. Po obsevanju z aktivatorno svetlobo se je po 24 urah bioluminiscenca celic v obeh primerih povečala 25- do 30-krat. S tem so dokazali, da sistem deluje tudi v živih organizmih, svetloba pri valovni dolžini 654 nm pa lahko prodre tudi v globlje plasti tkiva [3].

== Zaključek ==

Načrtovanje sistemov iz poljubnih kombinacij stikal in aktuatorjev predstavlja širok nabor funkcij, ki jih taki sistemi lahko opravljajo. Kombinatorične metode nam omogočajo učinkovito in relativno enostavno določanje interakcijskih partnerjev s primerno občutljivostjo in specifičnostjo. Neinvazivna regulacija medproteinskih interakcij s svetlobo ima velik aplikativni potencial v biomedicini, na primer časovno in prostorsko specifična aktivacija imunskih celic za zdravljenje tumorjev.

== Viri ==

[1] X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10(February), str. 1–7.

[2] S. Kang, K. Davidsen, L. Gomez-castillo, H. Jiang, X. Fu, Z. Li, Y. Liang, M. Jahn, M. Moussa, … L. Gu: COMBINES-CID: An Efficient Method for De Novo Engineering of Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, str. 10948–10952.

[3] Z. Huang, Z. Li, X. Zhang, S. Kang, R. Dong, L. Sun, X. Fu, D. Vaisar, K. Watanabe, L. Gu: Creating Red Light-Switchable Protein Dimerization Systems as Genetically Encoded Actuators with High Specificity. ACS Synth. Biol. 2020, 9(12), str. 3322–3333.

[4] B. Virnekas, L. Ge, A. Plukthun, K. C. Schneider, G. Wellnhofer, S. E. Moroney: Trinucleotide phosphoramidites: Ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 1994, 22(25), str. 5600–5607.