Wiki FKKT - User contributions [en]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T10:12:36Z

Tina.kosovel: /* DNA giraza */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014 Slika 1]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr) [https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765%2818%2930358-7 Slika 2].

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8653906/pdf/mmbr.00222-20.pdf Slika 3]

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).

Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 4].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 5 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 6].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 7]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 8].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T10:12:26Z

Tina.kosovel: /* PcrA helikaza */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014 Slika 1]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr) [https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765%2818%2930358-7 Slika 2].

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8653906/pdf/mmbr.00222-20.pdf Slika 3]

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).

Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 4].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 5 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 6].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 7]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T10:12:14Z

Tina.kosovel: /* Transkripcijski represorski protein CopG */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014 Slika 1]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr) [https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765%2818%2930358-7 Slika 2].

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8653906/pdf/mmbr.00222-20.pdf Slika 3]

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).

Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 4].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 5 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 6].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T10:12:03Z

Tina.kosovel: /* Protismerna RNA II */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014 Slika 1]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr) [https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765%2818%2930358-7 Slika 2].

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8653906/pdf/mmbr.00222-20.pdf Slika 3]

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).

Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 4].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 5 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T10:11:44Z

Tina.kosovel: /* Relaksazna funkcija MobM */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014 Slika 1]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr) [https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765%2818%2930358-7 Slika 2].

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8653906/pdf/mmbr.00222-20.pdf Slika 3]

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).

Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 4].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T10:11:29Z

Tina.kosovel: /* Začetki zastajajoče verige */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014 Slika 1]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr) [https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765%2818%2930358-7 Slika 2].

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8653906/pdf/mmbr.00222-20.pdf Slika 3]

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).

Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 2].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T10:11:05Z

Tina.kosovel: /* Skupne značilnosti RCR plazmidov */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014 Slika 1]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr) [https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765%2818%2930358-7 Slika 2].

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8653906/pdf/mmbr.00222-20.pdf]

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).

Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 2].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T10:10:20Z

Tina.kosovel: /* Geni za odpornost na antibiotike (Abr) */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr) [https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765%2818%2930358-7 Slika 2].

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8653906/pdf/mmbr.00222-20.pdf]

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).

Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 2].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:19:57Z

Tina.kosovel: /* Relaksazna funkcija MobM */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).

Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:19:22Z

Tina.kosovel: /* Skupne značilnosti RCR plazmidov */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.

Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:18:47Z

Tina.kosovel: /* Protismerna RNA II */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.

RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:18:39Z

Tina.kosovel: /* Transkripcijski represorski protein CopG */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.

Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].

Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:18:19Z

Tina.kosovel: /* PcrA helikaza */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.

Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).

Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:18:08Z

Tina.kosovel: /* DNA giraza */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].

Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:17:56Z

Tina.kosovel: /* DNA giraza */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje [https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1054358908605505-gr2.gif Slika 5].
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:16:35Z

Tina.kosovel: /* PcrA helikaza */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata) [https://d3i71xaburhd42.cloudfront.net/6a7099c736c72e3f89a0c0b98b411c3a68409561/10-Figure6-1.png Slika 4]. Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:14:57Z

Tina.kosovel: /* Transkripcijski represorski protein CopG */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/27b68211-3bb6-49be-b6b4-e48a2c132c77/assets/images/large/mmbr.00222-20-f015.jpg Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:14:18Z

Tina.kosovel: /* Protismerna RNA II */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho. copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mmbr.00222-20 Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:13:40Z

Tina.kosovel: /* Protismerna RNA II */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' Slika 2 (b)] ). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mmbr.00222-20 Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:12:20Z

Tina.kosovel: /* Protismerna RNA II */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mmbr.00222-20 Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:10:37Z

Tina.kosovel: /* Protismerna RNA II */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mmbr.00222-20 Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mmbr.00222-20 Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:10:10Z

Tina.kosovel: /* Transkripcijski represorski protein CopG */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mmbr.00222-20 Slika 3].
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:08:59Z

Tina.kosovel: /* Protismerna RNA II */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg Slika 2 (b)]. Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:08:34Z

Tina.kosovel: /* Protismerna RNA II */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep) [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/f7b4f107-d14e-4bcd-97b5-ca0bafaa6235/assets/images/large/mmbr.00222-20-f014.jpg Slika 2 (b). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T08:07:26Z

Tina.kosovel: /* Relaksazna funkcija MobM */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (''Antibiotic Resistance Traits'') in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodirajo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT, kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije.
Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (''double-strand origin'') dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke. Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoU.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu [https://journals.asm.org/cms/10.1128/MMBR.00222-20/asset/542709ee-1db7-413a-b1ae-d9e94090971f/assets/images/large/mmbr.00222-20-f012.jpg Slika 1].

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T07:12:52Z

Tina.kosovel: /* Viri */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso (single-strand origin) za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (Antibiotic Resistance Traits) in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodiranjo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT (origin of transfer), kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije. [10.1007/978-3-319-75241-9_4] Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo (združijo) z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

=='''Družine RCR plazmidov'''==
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi RCR se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (double-strand origin) dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke.Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ta zaporedja vodijo ribosome, da se le-ti vežejo na mRNA in se pravilno poravnajo za pričetek translacije. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoL.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Garcillán-Barcia, M. Pilar, idr. „The Facts and Family Secrets of Plasmids That Replicate via the Rolling-Circle Mechanism“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 86, št. 1, marec 2022, str. e00222-20. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00222-20.

2. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

3. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T07:10:49Z

Tina.kosovel: /* VIRI */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso (single-strand origin) za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (Antibiotic Resistance Traits) in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodiranjo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT (origin of transfer), kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije. [10.1007/978-3-319-75241-9_4] Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo (združijo) z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

=='''Družine RCR plazmidov'''==
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi RCR se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (double-strand origin) dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke.Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ta zaporedja vodijo ribosome, da se le-ti vežejo na mRNA in se pravilno poravnajo za pričetek translacije. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoL.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''Zaključek'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

=='''Viri'''==
1. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.
2. Wang, Pengxia, idr. „The Resolution and Regeneration of a Cointegrate Plasmid Reveals a Model for Plasmid Evolution Mediated by Conjugation and oriT Site‐specific Recombination“. Environmental Microbiology, let. 15, št. 12, december 2013, str. 3305–18. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/1462-2920.12177.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-23T07:09:45Z

Tina.kosovel: /* VIRI */

=='''Uvod'''==
Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

=='''Skupne značilnosti RCR plazmidov'''==
RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso (single-strand origin) za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (Antibiotic Resistance Traits) in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodiranjo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT (origin of transfer), kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije. [10.1007/978-3-319-75241-9_4] Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo (združijo) z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

=='''Družine RCR plazmidov'''==
Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi RCR se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0035-2014]

=='''Replikacijski mehanizem'''==
Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (double-strand origin) dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke.Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ta zaporedja vodijo ribosome, da se le-ti vežejo na mRNA in se pravilno poravnajo za pričetek translacije. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoL.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

=='''Represorji'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''Gostiteljeve funkcije'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''ZAKLJUČEK'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

==VIRI==
1. Bikard, David, idr. „Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes“. Microbiology and Molecular Biology Reviews, let. 74, št. 4, december 2010, str. 570–88. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1128/MMBR.00026-10.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T18:20:17Z

Tina.kosovel: /* ZAKLJUČEK */

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ta zaporedja vodijo ribosome, da se le-ti vežejo na mRNA in se pravilno poravnajo za pričetek translacije. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoL.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

=='''REPRESORJI'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''GOSTITELJEVE FUNKCIJE'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''ZAKLJUČEK'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

==VIRI==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T18:19:55Z

Tina.kosovel: /* ZAKLJUČEK */

=='''Geni za odpornost na antibiotike (Abr)'''==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ta zaporedja vodijo ribosome, da se le-ti vežejo na mRNA in se pravilno poravnajo za pričetek translacije. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

=='''Začetki zastajajoče verige'''==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoL.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

=='''Iniciatorski in terminalni proteini'''==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

=='''REPRESORJI'''==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

=='''GOSTITELJEVE FUNKCIJE'''==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

=='''ZAKLJUČEK'''==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami, ob enem pa jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.

==VIRI==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T12:12:44Z

Tina.kosovel:

==Geni za odpornost na antibiotike (Abr)==
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ta zaporedja vodijo ribosome, da se le-ti vežejo na mRNA in se pravilno poravnajo za pričetek translacije. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2 (Slika 6A). Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

==Začetki zastajajoče verige:==
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoL.

===ssoA===
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA (Slika 8A). Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

===ssoU===
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

==Iniciatorski in terminalni proteini==
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

===Delovanje Rep proteinov===
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

==REPRESORJI==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

==GOSTITELJEVE FUNKCIJE==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

==ZAKLJUČEK==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in majhne genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami. Ob enem pa predstaljajo nudijo bakterijam ključne gene odgovorne za njihovo preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike.

==VIRI==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T12:10:42Z

Tina.kosovel:

Tinkara Robek:

Lara Pajnhart:

Tina Kosovel: Relaksazna funkcija MobM, Represorji, Gostiteljeve funkcije, Zaključek

Talk:Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T12:10:23Z

Tina.kosovel: Created page with "Tinkara Robek: Lara Pajnhart: Tina Kosovel: Relaksazna funkcija MobM, Represorji, Gostiteljeve funkcije, Zaključek"

Tinkara Robek:
Lara Pajnhart:
Tina Kosovel: Relaksazna funkcija MobM, Represorji, Gostiteljeve funkcije, Zaključek

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T12:04:45Z

Tina.kosovel:

===Relaksazna funkcija MobM===
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

==REPRESORJI==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

==GOSTITELJEVE FUNKCIJE==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

==ZAKLJUČEK==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in majhne genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami. Ob enem pa predstaljajo nudijo bakterijam ključne gene odgovorne za njihovo preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike.

==VIRI==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T12:04:07Z

Tina.kosovel:

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T12:03:38Z

Tina.kosovel:

Relaksazna funkcija MobM
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

==REPRESORJI==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

===Protismerna RNA II===
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

===Transkripcijski represorski protein CopG===
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

==GOSTITELJEVE FUNKCIJE==
===PcrA helikaza===
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

===DNA giraza===
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

==ZAKLJUČEK==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in majhne genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami. Ob enem pa predstaljajo nudijo bakterijam ključne gene odgovorne za njihovo preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike.

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T12:02:33Z

Tina.kosovel:

Relaksazna funkcija MobM
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

==REPRESORJI==
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.
Protismerna RNA II
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.
Transkripcijski represorski protein CopG
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

==GOSTITELJEVE FUNKCIJE==
PcrA helikaza
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.
DNA giraza
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

==ZAKLJUČEK==
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in majhne genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami. Ob enem pa predstaljajo nudijo bakterijam ključne gene odgovorne za njihovo preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike.

Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

2024-04-22T12:01:12Z

Tina.kosovel: Created page with "Relaksazna funkcija MobM MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen). Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu prote..."

Relaksazna funkcija MobM
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen).
Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

REPRESORJI
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.
Protismerna RNA II
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija).
copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta.
RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.
Transkripcijski represorski protein CopG
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno.
Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°.
CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige.
Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

GOSTITELJEVE FUNKCIJE
PcrA helikaza
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja.
Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori).
Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.
DNA giraza
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje.
Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

ZAKLJUČEK
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in majhne genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami. Ob enem pa predstaljajo nudijo bakterijam ključne gene odgovorne za njihovo preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike.

BIO2 Seminar 2023

2023-11-26T11:11:23Z

Tina.kosovel: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
| Veler, Jakob Urh || 12 || || Ferjančič, Lara || Kolenc, Klara || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Majerle, Nina || 12 || || Perc, Anže || Škarabot, Anja || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Kokol, Anja || 12 || || Bernik, Miha || Čerenak, Blaž || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Trontelj, Domen || 12 || || Janc, Nika || Puhov, Špela || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Kozel, Vid || 12 || || Oman Sušnik, Tonja || Boštjančič, Ava || 24/10/2023 || 25/10/2023 || 25/10/2023
|-
| Kunstelj, Karin || 14-15 || || Veler, Jakob Urh || Ferjančič, Lara || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Jordan Ferbežar, Uma || 14-15 || || Majerle, Nina || Perc, Anže || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Hvalec, Jan || 14-15 || || Kokol, Anja || Bernik, Miha || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Oman Sušnik, Tonja || 14-15 || || Trontelj, Domen || Janc, Nika || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Frantar, Mark || 14-15 || || Kozel, Vid || Oman Sušnik, Tonja || 06/11/2023 || 07/11/2023 || 08/11/2023
|-
| Kostanjšek, Žan || 16 || || Kunstelj, Karin || Veler, Jakob Urh || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Makuc, Nika || 16 || || Jordan Ferbežar, Uma || Majerle, Nina || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Robek, Tinkara || 16 || || Hvalec, Jan || Kokol, Anja || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Klinar, Brina || 16 || || Bervar, Amber || Trontelj, Domen || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Bajec, Lana || 16 || || Frantar, Mark || Kozel, Vid || 13/11/2023 || 14/11/2023 || 15/11/2023
|-
| Kociper, Debora || 17 || || Kostanjšek, Žan || Kunstelj, Karin || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Cankar, Nina || 17 || || Makuc, Nika || Jordan Ferbežar, Uma || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Žulič, Jošt || 17 || || Robek, Tinkara || Hvalec, Jan || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Bartol, Mojca || 17 || || Klinar, Brina || Bervar, Amber || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Ciglar, Nika || 17 || || Bajec, Lana || Frantar, Mark || 20/11/2023 || 21/11/2023 || 22/11/2023
|-
| Bregar, Jana || 18 || || Kociper, Debora || Kostanjšek, Žan || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Kosovel, Tina || 18 || [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2023#Tina_Kosovel_-_Kako_aminokisline_podpirajo_na%C5%A1_imunski_sistem Kako aminokisline podpirajo naš imunski sistem] || Cankar, Nina || Makuc, Nika || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Dular, Maj || 18 || || Žulič, Jošt || Robek, Tinkara || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Matek, Nik || 18 || || Bartol, Mojca || Klinar, Brina || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Trobiš, Veronika || 18 || || Ciglar, Nika || Bajec, Lana || 27/11/2023 || 28/11/2023 || 29/11/2023
|-
| Osterc, Igor || 19 || || Bregar, Jana || Kociper, Debora || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Kramar, Zala || 19 || || Kosovel, Tina || Cankar, Nina || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Kolnik, Dan || 19 || || Dular, Maj || Žulič, Jošt || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Lešnik, Tjaša || 19 || || Matek, Nik || Bregar, Jana || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Habot, Hanna || 19 || || Trobiš, Veronika || Ciglar, Nika || 04/12/2023 || 05/12/2023 || 06/12/2023
|-
| Mulalić, Anita || 20 || || Osterc, Igor || Bartol, Mojca || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Gričar Vintar, Peter || 20 || || Kramar, Zala || Kosovel, Tina || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Pajnhart, Lara || 20 || || Kolnik, Dan || Dular, Maj || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Hudobivnik, Laura || 20 || || Lešnik, Tjaša || Matek, Nik || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Vogrič, Vanja || 20 || || Habot, Hanna || Trobiš, Veronika || 11/12/2023 || 12/12/2023 || 13/12/2023
|-
| Pšeničnik, Tiara || 21 || || Mulalić, Anita || Osterc, Igor || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Snedec, Andraž || 21 || || Gričar Vintar, Peter || Kramar, Zala || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Polutnik, Patricija || 21 || || Pajnhart, Lara || Kolnik, Dan || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Longar, Špela || 21 || || Hudobivnik, Laura || Lešnik, Tjaša || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Kristl, Simon || 21 || || Vogrič, Vanja || Habot, Hanna || 18/12/2023 || 19/12/2023 || 20/12/2023
|-
| Čarman, Jasna || 22 || || Pšeničnik, Tiara || Mulalić, Anita || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Kolenc, Klara || 22 || || Snedec, Andraž || Gričar Vintar, Peter || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Škarabot, Anja || 22 || || Polutnik, Patricija || Pajnhart, Lara || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Čerenak, Blaž || 22 || || Longar, Špela || Hudobivnik, Laura || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Puhov, Špela || 22 || || Kristl, Simon || Vogrič, Vanja || 21/12/2023 || 22/12/2023 || 03/01/2024
|-
| Boštjančič, Ava || 23 || || Čarman, Jasna || Pšeničnik, Tiara || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Ferjančič, Lara || 23 || || Kolenc, Klara || Snedec, Andraž || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Perc, Anže || 23 || || Škarabot, Anja || Polutnik, Patricija || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Bernik, Miha || 23 || || Čerenak, Blaž || Longar, Špela || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Janc, Nika || 23 || || Puhov, Špela || Kristl, Simon || 08/01/2024 || 09/01/2024 || 10/01/2024
|-
| Bervar, Amber || 23 || || Boštjančič, Ava || Čarman, Jasna || 15/01/2024 || 16/01/2024 || 17/01/2024
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim, da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo, in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [https://libgen.is/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2023|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom. Pvzetek je tudi del pisnega izdelka.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5–12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli, v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva, določenega v tabeli, določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji. Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili, vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate, poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.docx za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.docx za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.docx za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.pptx za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje ... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2023

2023-11-26T10:55:00Z

Tina.kosovel: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 =
==Anja Kokol - Pomen kompertmentalizirane signalizacije v membranskih raftih pri razvoju raka==
Raziskovanje lipidnih raftov, membranskih domen, bogatih s holesterolom in sfingolipidi, je izboljšalo razumevanje celične membrane pri signalni transdukciji. Te sortirne platforme igrajo ključno vlogo pri kompartmentalizaciji signalnih poti in s tem spodbujajo ali zavirajo preživetje, smrt in metastazo tumorskih celic. Transformirane celice vsebujejo višjo raven znotrajceličnega holesterola in s tem posledično več membranskih raftov. Rafti so, zraven prenosa signalov, pomembni za aktivacijo receptorjev, endocitozo, znotrajcelični promet in organizacijo z lipidi in proteini. V obliki lipidnih lupin zagotavljajo proteinom, ki so jih tako ločili od ostalih, primerno mikrookolje in s pomočjo takšnega mehanizma vklopijo ali izklopijo določene poti prenosa signala. Na celične procese pomembno vpliva asimetrija holesterola v plazemski membrani, ki se vzdržuje z aktivnim transportom holesterola iz notranjega v zunanji del. Zaradi prenosa signala po lipidnih raftih lahko pride do prekomerne ekspresije in aktivacije številnih poti in sistemov rastnih faktorjev, kar pripomore k razvoju tumorja. Eden od njih je tudi aktivator signalne poti PI3K/AKT, ki je pomemben udeleženec pri nastanku raka. Značilnost sesalskih celic je prisotnost receptorjev smrti na njihovi površini. Ti zagotavljajo sposobnost apoptoze. Ligandi receptorjev smrti sprožijo značilno signalizacijo preko oligomerizacije receptorjev, kar posledično povzroči rekrutiranje specializiranih adapterskih proteinov znotraj lipidnih raftov. S preučevanjem membranskih raftov se je rodil tudi koncept CASMER, s pomočjo katerega se je razvila nova ideja zdravljenja raka.

==Vid Kozel - Vloga onkogenov in tumor zavirajočih genov pri razvoju raka==
Onkogeni kodirajo okvarjene proteine ter s tem povzročajo tumorje. Nastanejo iz spremenjenih proto-onkogenov. Za naše zdravje so zelo nevarni, saj spodbujajo delovanje procesov, ki vodijo do raka. Aktivirajo se zaradi genetske spremembe proto-onkogenov, najpogosteje do tega pride zaradi točkovnih mutacij; mutacije z večjo funkcionalnostjo, kromosomske translokacije, virusna integracija, epigenetske spremembe, spremembe regulatornih proteinov. Tumor zavirajoči geni ali tumorski supresorji tvorijo regulatorne proteine, ki preprečujejo delitev rakavih celic ter spodbujajo popravljanje DNA. Aktivirajo se s transkripcijsko aktivacijo, posttranslacijskimi modifikacijami ali interakcijami med proteini. Njihova glavna naloga je vzdrževanje genoma, prav tako pa preprečujejo nenadzorovano rast celic.
Pot RAS-RAF-MEK-ERK je signalna pot onkogenov, ki ima vlogo pri rasti, delitvi, preživetju in diferenciaciji celic. Njena nenormalna aktivacija lahko povzroči nastanek tumorjev. Pot se začne z aktivacijo RAS, do katere pride zaradi zunajceličnih signalov. RAS potem aktivira še RAF in sproži kaskado fosforilacije. Nato se aktivira MEK, ki sproži dvojno fosforilacijo in aktivira ERK, aktivacija le-te pa vodi do razmnoževanja, preživetja ali diferenciacije celic.
TP53 je gen, ki kodira tumor supresorski protein p53, ta pa zatira tumorje. Na poškodbe DNA odgovarja tako, da ustavi celični cikel ter nato popravi DNA, sproži apoptozo ali pa senescenco. Njegovo delovanje inhibira MDM2, ki ga lahko dodatno stabilizira MDM4. Ob mutacijah na TP53, ter posledično na P53, ta izgubi sposobnost obrambe proti tumorjem.
Z ugotavljanjem mutacij onkogenov/tumorskih supresorjev, ali s tem da ti služijo kot biomarkerji, lahko zdravniki napovejo verjetno napredovanje raka ter izberejo ustrezno zdravljenje.

==Nina Majerle - Z G-proteini sklopljeni vzorčno prepoznavni receptorji izraženi v nevtrofilcih==
Nevtrofilci so najpogostejši levkociti v človeški krvi in so ključnega pomena za pravilno delovanje imunskega sistema. Na površini izražajo različne receptorje, ki prepoznavajo molekulske vzorce tipične za patogene organizme in za poškodovane gostiteljske celice. Ti receptorji so ključnega pomena za delovanje nevtrofilcev, saj jim omogočajo regulacijo vnetnega odziva, diferenciacijo, priklic drugih celic imunskega sistema in fagocitozo. Mnogi od teh receptorjev pripadajo družini z G-proteini sklopljenih receptorjev. GPCR-ji imajo značilno strukturo sedmih α-vijačnic, prenos signala prek GPCR-jev pa največkrat poteka preko heterotrimernih G-proteinov. Seminarska naloga obravnava tako splošne značilnosti GPCR-jev, kot tudi podrobneje opiše mehanizme delovanja in funkcije nekaterih bolj znanih GPCR-jev izraženih na membranah nevtrofilcev, ki delujejo po principu vzorčnega prepoznavanja: družina formil peptidnih receptorjev (FPRs), purinergični receptor P2Y2R in dva člana družine receptorjev prostih maščobnih kislin FFA2R in GPR84. Poleg tega prek relevantnih primerov razlaga nekatere ključne pojme in koncepte v biokemiji kot so ortosterično vezavno mesto, alosterični receptorski modulatorji, vzorčno prepoznavanje, homologna in heterologna desenzibilizacija, receptorska transaktivacija, funkcionalna selektivnost in pa tudi pojme, ki se nanašajo na same nevtrofilce kot sta kemotaksija in primiranje. Na koncu se seminarska naloga naveže še na uporabnost poznavanja strukture in delovanja GPCR-jev izraženih v nevtrofilcih pri zdravljenju različnih imunskih obolenj.

==Jakob Urh Veler - Gvanilil ciklaze kot ključni receptorji in encimi pri celični biosignalizaciji==
Družina proteinov gvanilat ciklaze/gvanilil ciklaze (GC) v svoji katalitični domeni ciklizirajo GTP v cGMP. Ciklični GMP je sekundarni sporočevalec. Z nadaljno kaskado vpliva na protein kinaze (cGK), fosfodiesteraze (PDE) in ionske kanalčke (CNG). So pomembne za pravilno delovanje več organskih sistemov. Glede na strukturne, funkcionalne in regulatorne značilnosti GC delimo na membranske (mGC/pGC) in topne (sGC) oblike. Poznamo tipične in atipične sGC. Po priporočeni nomenklaturi poznamo 7 tipov mGC: MG-A, MG-B, MG-C, MG-D, MG-E, MG-F in MG-G. Vlogo encima in receptorja opravljajo topne gvanilil ciklaze v citosolu in membranske na celični membrani. Aktivirane so lahko tudi z endogenim NO, O2, HCO3-, natriuretskimi hormoni in s Ca2+-vezanimi proteini. V nadaljevanju podrobneje opisana aktivacija sGC z NO ter aktivacija GC-A z atrijskim natriuretskim hormonom (ANF). Z manipulacijo genov za zapis gvanilil ciklaz so odkrili njihove vloge v celicah in pomen specifičnih domen. Z različno stopnjo izražanja izoencimov je v celicah visoka diverziteta GC, zato je to mrežo signalizacije brez in vivo opazovanja zahtevno raziskovati. Približno 60 let že raziskujejo gvanilil ciklaze. Razumevanje te signalne poti je ključnega pomena za zdravljenje določenih bolezenskih stanj, saj imajo zdravila več tarčnih mest za delovanje.

==Domen Trontelj - G protein sklopljeni receptorji v fiziologiji okusa in farmakologiji==
G protein sklopljeni receptorji (GPCR), predstavljajo največjo družino receptorjev pri sesalcih in so ključni za uravnavanje večine fizioloških funkcij. Poleg posredovanja pri zaznavi vonja in vida, so prav tako prenašalci signala treh osnovnih okusov- sladko, umami in grenko, prav tako pa so ključnega pomena pri zaznavanju okusa kokumi. Nahajajo se v specializiranih okuševalnih celicah (TRC) znotraj brbončic. Tip I okuševalnih GPCR-jev (TAS1R) so heterodimerni kompleksi, ki skužijo kot receptorji za sladko (TAS1R2/TAS1R3) ali umami (TAS1R1/TAS1R3) okus, medtem ko Tip II obsega monomerne receptorje za grenak okus ali pa kokumi/kalcijeve receptorje.
Receptorji za sladko, umami in kokumi delijo strukturne podobnosti, saj vsebujejo več mest za vezavo agonistov z izrazito selektivnostjo, medtem ko večina grenkih receptorjev vsebuje le eno vezavno mesto, ki neselektivno sprejme veliko različnih ligandov. Vezava agonistov na receptor aktivira sekundarnih prenašalce, kar privede do vdora kalcija, to vodi do depolarizacije celice in na koncu sprostitve nevrotransmiterja.
Kljub nedavnim napredkom na področju raziskav konformacijskih sprememb, potrebnih za aktivacijo receptorja, ostaja še veliko nerešenih. V zadnjih letih so različni pristopi, ki združujejo heterologno izražanje, mutagenezo, homologno modeliranje in knockout študije na miših, skupaj ponudili vpogled v strukturo in pozicijo vezavnih mest za ligande in mehanizme ortosterične in alosterične modulacije.

==Karin Kunstelj - Potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije najdene prav v metabolizmu celic kostnega mozga in njegovega mikrookolja==
Izogibanje detekciji in odgovoru imunskega odziva sodi med glavne težave levkemije poleg neuspešne imunoterapije. Burne poti mikrookolja so v ozadju odgovora tako rakavih kot zdravil celic, problem pa se pojavi, ko rakave celice prevzamejo vodilno vlogo metabolizmov in nadzorujejo reakcije sebi v prid. Mednje spadata tudi produkcija energije in izogibanje detekciji in pa odgovoru imunskih celic. Novo možnost terapije bi potemtakem lahko predstavljalo ciljanje povezav med mikrookoljem kostnega mozga in levkemičnimi celicami. V seminarju je podrobno opisano mikrookolje kostnega mozga, pomembne metabolične poti ogljikovih hidratov, aminokislin in maščobnih kislin. Opisani so tudi procesi levkemičnih celic, ki zdravljenju povzročajo težave in neuspešnost. Prav tako opozori na nove potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije. Svoj fokus orientirajo in najdejo prav v mikrookolju kostnega mozga in problematičnih levkemičnih celic. Metabolizem levkemičnih celic, ki povzroča obolenja in preglavice tako obrne v svoj prid. Na koncu pa še poudari na pomembnost dodatnih raziskav in študij zaradi nedovršenih, premalo eksaktnih in pa preveč nasprotujočih-si rezultatov.

==Tonja Oman Sušnik - Metabolizem glukoze, senescenca živčnih celic in Alzheimerjeva bolezen==
Alzheimerjeva bolezen je nevrodegenerativna bolezen z visoko pojavnostjo predvsem med starejšimi. Pri njej sčasoma pride do upada miselnih sposobnosti in razvoja drugih psiholoških motenj. Njen razvoj je sicer že precej dobro raziskan, a zdravila, ki bi v celoti odpravil škodo storjeno na možganih, še ne poznamo. Tekom same bolezni se prepleta mnogo simptomov, ki so odvisni eden od drugega. To so med drugimi inzulinska rezistenca, celična senescenca, nevroinflamacija, nalaganje proteinskih plakov in oslabljen metabolizem glukoze. Najpomembnejša pri tem je celična senescenca, ki je v močni povezavi s staranjem. Ta napade tako živčne celice kot tudi glialne celice in povzroči nalaganje proteinov ter oslabljeno energijsko proizvodnjo celice. Slabša energetska preskrbljenost, kar je za nevrone izredno nevarno in se odraža v njihovem slabšem delovanju ter zmanjšani sinaptični plastičnosti, pa je tudi posledica zmanjšanega prevzema glukoze. Z boleznijo se število glukoznih transporterjev zmanjšuje, veča pa se inzulinska rezistenca. Nevroni zato ne sprejmejo dovolj glukoze za proizvodnjo ATP. Kako bi samo znanje o teh fizioloških okvarah prenesli na zdravljenje, še ni znano, a na to temo poteka mnogo tekočih raziskav. Najbolj ugodno bi bilo odstranjevanje senescentih celic, neposredno targetiranje glukoznega metabolizma ali razbijanje proteinskih plakov. Pozitivne rezultate dajejo tudi raziskave, kjer so opazovali odzivnost metabolizma glukoze na srednje intenzivno vadbo. Ta se je že pri enkrat tedenski vadbi močno izboljšal, napredovanje bolezni pa skoraj popolnoma zaustavilo.

==Jan Hvalec - Uravnavanje metabolizma endotelijskih in imunskih celic==
Endotelijske celice gradijo notranjo površino žil. Njihova funkcija je tesno povezana z ohranjanjem homeostaze tkiv, regulacijo krvnega pretoka in angiogeneze. Za opravljanje svoje naloge imajo prilagojen metabolizem z znižano stopnjo oksidativne fosforilacije in pospešeno glikolizo. Angiogeneza temelji na kolektivni migraciji endotelijskih celic, pri čemer konične celice usmerjajo poganjek, medtem ko ga stebelne celice podaljšujejo s proliferacijo. Rast žil se začne z razgradnjo bazalne membrane in izbiro konične celice pod vplivom vaskularnega endotelijskega faktorja (VEGF) in inducibilnega faktorja hipoksije (HIF), ki ju sproščajo telesne celice v hipoksičnih pogojih. Vlogo konične celice prevzame celica s hitrejšo energetsko proizvodnjo. Ker VEGF in HIF pospešita izražanje encima PFKFB3, ki pospešuje glikolizo, so ravni PFKFB3 višje v konici kot v steblu poganjka. Druga vrsta celic, ki glede na diferenciacijo prilagodi svoj metabolizem, so celice imunskega sistema. T-celice pomagalke in citotoksične celice se zanašajo na glikolizo in presnovo glutamina za tvorbo potrebne količine energije. Medtem ko se M1 makrofagi tudi zanašajo na glikolizo, je vloga metabolne poti drugačna, saj jo prednostno uporabljajo za vzdrževanje polnega stanja delovanja (razgradnjo fagocitiranih delcev). Nasprotno se spominske in regulatorne T-celice zanašajo na oksidacijo maščobnih kislin za učinkovitejšo proizvodnjo ATP, oksidativno fosforilacijo pa uporabljajo za vzdrževanje učinkovitega dolgoročnega delovanja.

==Mark Frantar - Energetika možganov in nevrodegenerativne bolezni==
Možgani so zaradi številnih funkcij, kot so vzdrževanje membranskega potenciala, recikliranje živčnih prenašalcev ter prenašanje signalov, energijsko izjemno zahteven organ. Za delovanje stalno potrebujejo energijo v obliki ATP, ki jo večinoma dobijo iz glukoze z oksidativno fosforilacijo, nekaj pa iz aerobne glikolize v citoplazmi. Za dostavljanje virov energije do nevronov skrbi nevrovaskularna enota, sestavljena iz endotelijskih celic kapilar, astrocitov ter nevronov. Nevroni lahko za vir energije uporabijo tudi ketone ali laktat, ki se proizvede v astrocitih s pretvorbo piruvata z laktat dehidrogenazo, nato pa je transportiran v nevrone skozi monokarboksilatne transporterje (MCT). Pri nevrodegenerativnih boleznih (NDB) pride do okvare metabolizma v možganih, najpogosteje do hipometabolizma glukoze. To vodi v stalno pomanjkanje energije, ki povzroči propad nevronskih celic, nabiranje agregatov nevrotoksičnih proteinov in disfunkcijo mitohondrijev, to pa še nadaljnje okvari metabolizem. Za upočasnjevanje napredovanja NDB obstaha več terapij in zdravil, a jih večina še ni dovolj testirana. Zdravila podpirajo mitohondrijske funkcije, izboljšujejo inzulinsko senzitivnost, zmanjšujejo inflamacijo, ipd. Uporabljajo se tudi ketonski prehranski dodatki ali ketogena dieta, saj gre pri NDB lahko le za okvaro metabolizma glukoze, medtem ko je metabolizem ketonov normalen. Optimizacija energetike možganov je torej temeljnega pomena pri NDB in bi morala biti prvi korak pri poskusih zakasnitve pojava in napredovanja NDB.

==Uma Jordan Ferbežar - Mnogi obrazi piruvat kinaze M2: Poudarek na vlogi pri vnetnih procesih==
Piruvat kinaza je encim, ki katalizira zadnji korak glikolize, v katerem nastaneta ATP in piruvat. Obstaja v štirih različnih izoformih, ki se nahajajo v različnih tkivih, vsi pa imajo katalitično vlogo. Izoform PKM2 je edini, ki se pojavlja v različnih konformacijah, in sicer dveh tetramernih (aktivna R-oblika in neaktivna T-oblika) ter dimerni in monomerni. Prehod med tetramerno in dimerno obliko je izjemno dinamičen in odvisen od okoliščin ter potreb celice, nadzorujejo pa ga številni regulatorji. Aktivna tetramerna oblika sodeluje v glikolizi, medtem ko ima dimerna oblika drugačne vloge - lahko se, na primer, premakne v jedro, kjer nadzoruje izražanje genov ter regulacijo različnih prepisovalnih faktorjev. Dimerno obliko opazimo tudi pri rakavih in imunskih celicah, kjer sodeluje pri spremembi metabolizma iz oksidativne fosforilacije v aerobno glikolizo, kar celicam ob povečani porabi glukoze omogoča zadostno količino ATP ter prekurzorjev za sintezo potrebnih makromolekul, kot so lipidi in proteini. PKM2 v povečanih količinah najdemo pri bolnikih z različnimi vnetnimi obolenji, kot je na primer revmatoidni artritis. Deluje tako na celice prirojenega in pridobljenega imunskega sistema, in sicer predvsem s povečevanjem količine proinflamatornih citokinov preko uravnavanja njihovega izražanja, sodeluje pa tudi pri diferenciaciji T celic in njihovi komunikaciji. Zaradi številnih načinov regulacije predstavlja dobro tarčo za zdravljenje vnetnih obolenj.

==Tinkara Robek - Signalizacija cikla: Intermediati cikla citronske kisline v vlogi miometabokinov==
Cikel citronske kisline predstavlja temelj katabolnih procesov za pridobivanje energetsko bogatih molekul v sklopu metabolizma v živih bitjih. Je ključen korak pri predelavi z ogljikom bogatih spojin pri pridobivanju ATP-molekul. Intermediati cikla so poleg členov cikla in izhodnih spojin za sintezo drugih biološko pomembnih molekul tudi pomembne signalne molekule. Med drugim spadajo med miometabokine; majhne molekule iz skupine citokinov, ki jih izločajo miocite in regulirajo komunikacijo med različnimi tipi tkiv. V večji meri se iz mišičnh celic izločajo v krvni obtok v akutni fazi intenzivnejše fizične aktivnosti in nato opravljajo specifične signalne funkcije v različnih tkivih in s tem vplivajo na potek vnetnih procesov v organizmu in izražanje proteinov. Njihovo funkcionalnost se lahko opredeli kot avtokrino, endokrino in parakrino. Delujejo s pomočjo njim specifičnim transporterjev in se po opravljeni nalogi v večini transportirajo po krvnem obtoku do jeter, kjer se razgradijo. Do sedaj je bilo odkritih in raziskanih največ funkcij citrata in sukcinata, v ospredje pa stopa tudi alfa ketoglutarat, predvsem s svojimi antioksidativnimi učinki. Obsegajo relativno novo področje fiziologije, zaradi česar je potrebno nadaljevati z raziskovanjem značilnosti in vplivov teh molekul za potrditev domnev.

==Nika Makuc - Glutamat-oksaloacetat transaminaza kot terapevtska tarča za zdravljenje ishemične možganske kapi==
Ishemična možganska kap predstavlja večino primerov možganske kapi, do katere pride zaradi zapore krvnih žil. Metode zdravljenja ishemične možganske kapi vključujejo trombolitično zdravljenje, ki pa se uporablja v omejenem obsegu in le pri manj kot 10 % vseh bolnikov z možgansko kapjo. Glutamat je aminokislina, ki ima v osrednjem živčevju funkcijo najpogostejšega vzdražnega nevrotransmiterja, v patoloških razmerah pa deluje kot močan nevrotoksin. Povišan zunajcelični glutamat ima osrednjo vlogo pri poškodbah možganov, do katerih pride zaradi ishemične možganske kapi. Novo terapevtsko tarčo pri zaščiti pred to vrsto poškodb pa predstavlja encim glutamat-oksaloacetat transaminaza (GOT), ki med ishemično možgansko kapjo zniža raven glutamata na mestu kapi. Pri presnovi glutamata s pomočjo GOT v možganskem tkivu nastajajo tudi vmesni produkti cikla citronske kisline. GOT torej lahko med ishemično možgansko kapjo omogoči, da se sicer ekscitotoksični glutamat pretvori v življenjsko pomembne vmesne produkte cikla citronske kisline. Opravljenih je bilo že več študij, ki so se osredotočale na zaščito nevronov z zmanjšanjem glutamata pri ishemični kapi, a so bile v praksi neuspešne. Sistemsko dajanje oksaloacetata predstavlja novo strategijo za zmanjšanje škodljivega učinka glutamata v možganskem tkivu po ishemični kapi. Učinek oksaloacetata namreč temelji predvsem na sposobnosti te molekule, da zmanjša raven glutamata v možganih in krvi zaradi aktivacije encima GOT.

==Brina Klinar - Vloga citrat transportnega proteina in citrata v celičnih procesih==
Citrat transportni protein (CTP) je transportni protein družine transmembranskih prenašalcev SCL25, ki se nahaja v notranji membrani mitohondrija. Njegova primarna vloga je import citrata v mitohondij ali eksport v citosol. Ustrezna aktivnost in pravilno CTP je ključnega pomena za optimalno delovanje celice. Ustrezne količine citrata v citosolu in mitohondriju so namreč pomembne za produkcijo energije, sintezo acetil-CoA kot prekurzorja biosinteze horesterola in maščobnih kislin in kot donorja acetilne skupine za actilacijske reakcije posttranslacijskih in epigenetskih modifikacij, vnetne procese in celično regulacijo. Za ohranjanje homeostaze citrata v citosolu obstajajo tudi alternativne poti, neodvisne od CTP, npr. prevzem ekstracelularnega citrata v celico prek plazmalemskih citratnih transporterjev. Kljub temu, se izguba CTP z mutacijami kaže v hudih napakah zgodnjega možganskega razvoja, kot sta npr. DiGeorgejev sindrom in L-2/D-2-hidroksiglutarna aciduria, kar nakazuje na velik pomen tega transportnega proteina. Po drugi strani pa ima inhibicija CTP inducirana s sintetičnimi inhibitorji CTP obetavno prihodnost na področju zdravljenja raka in presnovnega sindroma.

==Lana Bajec - Metabolni inženiring cikla citronske kisline za produkcijo kemikalij==
Izčrpanost fosilnih virov energije na zemlji, ki jo spremlja njihov vpliv na okolje, dviguje povpraševanje po zamenjavi kemikalij na osnovi nafte z boljšimi alternativami, prijaznejšimi do okolja. Skozi leta so se razvile različne strategije pridobivanja teh kemikalij s pomočjo fermentacijskih produktov različnih mikroorganizmov. Krebsov cikel ali cikel citronske kisline je eden pomembnejših procesov v celici in se že desetletja uporablja v metabolnem inženiringu, največ v produkciji spojin kot so L-glutamat, citrat in sukcinat. Žal je izkoristek pridobivanja teh produktov skozi Krebsov cikel slab, zato se je razvil nov način, ki privede do boljšega izkoristka. Uporaba povratnega Krebsovega cikla, ki ga določeni organizmi vršijo v anaerobnih pogojih. Za ta proces je značilna proizvodnja ogljikovih spojin iz ogljikovega dioksida in vode. Kemijske reakcije, ki se vršijo, pa so obtratne tistim, ki jih vidimo v Krebsovem ciklu. Ker se pri tem procesu porablja CO2, pa to poleg še vpliva na zmanjševanje CO2 emisij. Pri proizvodnji sukcinata pa so z določenimi pogoji mikroorganizme pripravili do tega, da poleg povratnega Krebsovega cikla, vršijo še glikosilatni cikel. Ta je sklop anaplerotičnih reakcij, ki vir ogljika, s porabo CO2, spreminja v sukcinat.

==Nina Cankar - Vpliv oksidacije maščobnih kislin na delovanje in diferenciacijo limfocitov T==
Limfociti T so celice imunskega sistema in so sposobni prehajati med visoko aktivnim anabolizmom in mirujočim katabolizmom, ki temelji na mitohondrijski oksidaciji maščobnih kislin. FAO je aktivna pri naivnih, regulatornih in spominskih limfocitih T ter močno zmanjšana pri efektorskih limfocitih T. Ob aktivaciji naivnih T celic pride do prehoda iz katabolizma z aktivno FAO na anabolizem in aerobno glikolizo, ki zadosti povečanim energijskim potrebam limfocitov T. Prehod regulirajo PI3K-Akt-mTOR signalna pot ter SREBP proteini. CD4+ efektorski limfociti T s pomočjo PPARγ ohranijo prevzem in oksidacijo maščobnih kislin, kar pa ne velja za CD8+ celice. Od obeh vej odstopajo regulatorni limfociti T, ki večino energije pridobijo s FAO. Ob koncu okužbe večina efektorskih limfocitov T preide v apoptozo, majhen delež pa se diferencira v spominske celice. Tem oksidacija maščobnih kislin, sklopljena z oksidativno fosforilacijo, omogoča dolgo življenjsko dobo in hkrati sposobnost hitrega odziva na ponovno okužbo z istim patogenom. Pri diferenciaciji v spominske limfocite T sodeluje TRAF6, spodbujajo pa jo tudi ostale signalne poti, ki aktivirajo katabolizem ter spodbujajo mitohondrije in izražanje CPT1A. Inhibicija oksidativne fosforilacije v spominskih limfocitih T ovira njihovo tvorbo, aktivacijo in proliferacijo. Poznavanje mehanizmov regulacije FAO v limfocitih T omogoča razvoj novih terapij za bolnike z avtoimunskimi in vnetnimi boleznimi.

==Nika Ciglar – Variabilnost izgube teže z zaviralci SGLT2 in agonisti receptorjev GLP-1 pri sladkorni bolezni tipa 2 in debelosti==
V današnjem času se vse več ljudi spopada z velikim problemom in to je debelost. Povišana telesna teža ni le problem premajhne fizične vadbe in prevelikih količin energetsko bogate hrane, temveč je lahko posledica ali pa tudi vzrok bolezni. Ena izmed teh bolezni je sladkorna bolezen tipa 2. Starejša zdravila za zniževanje ravni glukoze pri sladkornih bolnikih so povzročala povečanja telesne mase, novejša zdravila pa vplivajo na telo z ravno nasprotnim učinkom. To seveda ne velja za vse bolnike. Na podlagi teh podatkov so znanstveniki začeli ugotavljati ali bi lahko razvili zdravilo proti debelosti. Hoteli so ustvariti zdravilo, kjer ni izguba telesne teže le eden od stranskih učinkov temveč glavna tarča delovanja učinkovine. Med najnovejšimi razredi zdravil sta zaviralec natrijevega glukoznega koprenašalca 2 (SGLT2) in agonist glukagonu podobnih peptidnih receptorjev (GLP-1).

==Debora Kociper - FAT (CD36/SR-B2) v povezavi z metabolizmom maščobnih kislin v skeletnih mišicah==
Vnos maščobnih kislin v celico skeletnih mišic je skrbno reguliran proces, pri katerem sodelujejo tri glavne skupine proteinov – FABP, FATP in FAT (CD36/SR-B2). Vsi lajšajo prenos maščobnih kislin v celico, CD36/SR-B2 pa ima vlogo tudi v sami regulaciji transporta. Regulacija vstopa maščobnih kislin v celico s CD36/SR-B2 je regulirana kratkoročno in dolgoročno. Kratkoročno je regulirana z intracelularnim recikliranjem tega proteina. Glavna dejavnika, ki vplivata na kratkoročno regulacijo sta telesna aktivnost in inzulin. Pri dolgoročni regulaciji sodelujejo receptorji PPAR. Maščobne kisline delujejo kot naravni ligand teh receptorjev. Aktivacija receptorjev PPAR sproži prepisovanje določenih genov in proteinov, ki sodelujejo pri transportu maščobnih kislin čez celično membrano, med drugim CD36/SR-B2.
Pri povišani dostopnosti maščobnih kislin pride do razlik v odgovoru pri zdravih posameznikih in posameznikih z debelostjo. Raziskovanje delovanja CD36/SR-B2 predstavlja potencialne možnosti pri reševanju problema debelosti. CD36/SR-B2 igra pomembno vlogo tudi pri inzulinski rezistenci. Telesna aktivnost v vseh primerih pozitivno vpliva na zmožnost oksidacije maščobnih kislin.

==Tina Kosovel - Kako aminokisline podpirajo naš imunski sistem==
Aminokisline igrajo zelo pomembno vlogo v aktivaciji in samem delovanju naših imunskih celic. Njihov vnos in količina v celici strogo nadzorujeta delovanje celičnih presnovnih poti (TCA, glikoliza, oksidativna fosforilacija). Glutamin preko pretvorbe v glutamat priskrbi α-ketoglutarat, ki vstopi v TCA cikel. Razvejane aminokisline povečajo število glukoznih transporterjev in tako podpirajo glikolizo. Poleg tega za TCA zagotavljajo α-ketoglutarat ter derivate CoA. Serin alosterično aktivira encim, ki poskrbi za tvorbo piruvata in poveča translacijo proteinov v mitohondriju, vključno s tistimi, ki so del elektronske prenašalne verige. Poleg tega so aminokisline odgovorne za ohranjanje redoks homeostaze v celici in priskrbijo ključne snovi za njeno delovanje. Metionin in serin poskrbita za tvorbo cisteina, ki služi kot vir žvepla za tvorbo FeS klastrov. Te uporablja veliko encimov. Poleg tega je žveplo potrebno tudi za tiolacijo tRNA, kar pomaga pri translaciji. Cistein, glutamin in glicin tvorijo glutation, ki veže reaktivne kisikove radikale in tako skrbi za redoks homeostazo v celici. Te procese so mnogi virusi in tumorji sposobni izkoristiti, da imunske celice onesposobijo ali pa se izognejo njihovi detekciji. Hkrati pa nam ti aminokislinski mehanizmi nudijo veliko področje potencjalnih strategij za nova zdravila.