https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Tinasimunovic 2026-04-05T18:19:57Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13771 2018-01-15T19:27:07Z

<p>Tinasimunovic: /* Reaktor za vezavo kovin */</p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo z IPTG inducirajočega promotorja T7, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tri-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski stopničasto obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterij, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni, da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13769 2018-01-15T18:53:25Z

<p>Tinasimunovic: /* Sestavljanje konstruktov */</p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo z IPTG inducirajočega promotorja T7, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tri-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterij, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni, da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13768 2018-01-15T18:49:22Z

<p>Tinasimunovic: /* Sestavljanje konstruktov */</p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tri-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterij, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni, da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13710 2018-01-14T18:19:33Z

<p>Tinasimunovic: /* Mehanizem za biovarnost */</p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tri-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterij, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni, da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13709 2018-01-14T14:28:12Z

<p>Tinasimunovic: /* Uporaba konstruktov */</p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tri-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13708 2018-01-14T13:50:50Z

<p>Tinasimunovic: /* Biološki deli */</p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13707 2018-01-14T12:27:42Z

<p>Tinasimunovic: /* Biološki deli */</p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13706 2018-01-14T11:33:40Z

<p>Tinasimunovic: /* Sestavljanje konstruktov */</p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13705 2018-01-14T11:29:10Z

<p>Tinasimunovic: /* Sestavljanje konstruktov */</p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13704 2018-01-14T11:08:00Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, nahajane na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13703 2018-01-14T11:07:30Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> <br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, nahajane na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> <br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13702 2018-01-14T11:06:56Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Veliko genov ''fim'' je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (''angl. Chaperone–usher pathway''), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> <br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, nahajane na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> A. Busch in G. Waksman [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297437/ Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism]<br /> [http://2013.igem.org/Team:BostonU/MoCloChara BostonU iGEM 2013]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13701 2018-01-14T10:59:56Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> <br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, nahajane na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> <br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13695 2018-01-11T17:19:01Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>[http://2017.igem.org/Team:Exeter iGEM ekipa Exeter 2017] je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> <br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip [http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0016765#pone.0016765-Engler1 modularnega kloniranja]. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, nahajane na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> <br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13694 2018-01-11T17:17:03Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+]<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija] &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar - Super tobak &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> 3 Barbara Lipovšek &lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13693 2018-01-11T17:15:23Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> <br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip [http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0016765#pone.0016765-Engler1 modularnega kloniranja]. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, nahajane na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.<br /> <br /> <br /> <br /> povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13692 2018-01-11T17:14:56Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>povzeto po delu ekipe [http://2017.igem.org/Team:Exeter Exeter iGEM 2017] (povzela Tina Šimunović)<br /> <br /> <br /> iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> <br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip [http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0016765#pone.0016765-Engler1 modularnega kloniranja]. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, nahajane na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13691 2018-01-11T17:12:02Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>== Uvod ==<br /> <br /> <br /> iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> <br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip [http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0016765#pone.0016765-Engler1 modularnega kloniranja]. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, nahajane na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa (http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016, http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017, http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018).<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pilus%2B&diff=13690 2018-01-11T17:08:17Z

<p>Tinasimunovic: New page: == Uvod == iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwa...</p> <hr /> <div>== Uvod ==<br /> <br /> <br /> iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.<br /> <br /> <br /> == Pilusi tipa I ==<br /> <br /> <br /> To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu ''fim''. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. <br /> Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov ''E. coli''. <br /> <br /> <br /> == Biološko konstruiranje ==<br /> <br /> <br /> Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj<br /> <br /> S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).<br /> <br /> <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> <br /> <br /> Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.<br /> <br /> === Sestavljanje konstruktov ===<br /> <br /> Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip [http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0016765#pone.0016765-Engler1 modularnega kloniranja]. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.<br /> <br /> Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, nahajane na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.<br /> <br /> Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.<br /> <br /> === Biološki deli ===<br /> <br /> Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa.<br /> <br /> Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator. <br /> <br /> Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.<br /> <br /> <br /> == Dvoplazmidni sistem ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo ''E. coli''.<br /> <br /> Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).<br /> <br /> Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa ''fimH'') potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu. <br /> <br /> <br /> == Uporaba konstruktov==<br /> <br /> <br /> Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. <br /> Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tro-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.<br /> <br /> === Hidrociklon === <br /> <br /> Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov. <br /> <br /> === Reaktor za vezavo kovin ===<br /> <br /> Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.<br /> <br /> === Mehanizem za biovarnost ===<br /> <br /> Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. <br /> Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon<br /> <br /> <br /> == Model ==<br /> <br /> <br /> Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. <br /> Filtracijski sistem vsebuje GS ''E.coli'', ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13404 2017-11-17T08:53:15Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> #<br /> #<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko &lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum &lt;br&gt;<br /> 2 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod &lt;br&gt;<br /> 4 Urška Černe &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar&lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj &lt;br&gt;<br /> 2 Vanna Imširović &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1&lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1&lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2015&diff=10808 2015-11-04T22:45:38Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>= Biokemijski seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime Priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''poglavje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15<br /> |-<br /> | Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15<br /> |-<br /> | Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15<br /> |-<br /> | Rok Miklavčič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Rok_Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni]||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15<br /> |-<br /> | Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15<br /> |-<br /> | Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15<br /> |-<br /> | Tina Šimunović||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tina_Simunovic: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom]||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15<br /> |-<br /> | Maja Zupanc||14-15||Kako lncRNA regulira metabolizem||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15<br /> |-<br /> | Tilen Tršelič||14-15||PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15<br /> |-<br /> | Lara Jerman||16||||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15<br /> |-<br /> | Eva Rajh||16||Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na posttranslacijske modifikacije in DNA metilacijo ||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15<br /> |-<br /> | Sara Tekavec||16||Mutacije encimov Krebsovega cikla in nastanek tumorja||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15<br /> |-<br /> | Fran Krstanović||17||||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15<br /> |-<br /> | Elvira Boršić||17||||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15<br /> |-<br /> | Janja Krapež||17||||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15<br /> |-<br /> | Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15<br /> |-<br /> | Miha Koprivnikar Krajnc||18||||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15<br /> |-<br /> | Špela Malenšek||18|| Aminokislinska regulacija mTORC1||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15<br /> |-<br /> | Urša Kopač||19||||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15<br /> |-<br /> | Neža Koritnik||19||||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15<br /> |-<br /> | Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15<br /> |-<br /> | Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15<br /> |-<br /> | Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15<br /> |-<br /> | Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15<br /> |-<br /> | Urša Čerček||21||||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15<br /> |-<br /> | Katja Brezovar||21||Vloga sfingolipidov pri fagocitozi ''Candide albicans''||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15<br /> |-<br /> | Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15<br /> |-<br /> | Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16<br /> |-<br /> | Aleksandra Uzar||22||||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16<br /> |-<br /> | Petra Hruševar||22||||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16<br /> |-<br /> | Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16<br /> |-<br /> | Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16<br /> |-<br /> | Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16<br /> |-<br /> | Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||14/01/16<br /> |-<br /> | Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16<br /> |-<br /> | Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16<br /> |-<br /> | Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! <br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od &lt;font color=red&gt;2700 do 3000 besed &lt;/font&gt;, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt;Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> * &lt;font color=green&gt;312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši<br /> * 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%&lt;/font&gt;<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/19bnx0Yh4RIuC2Kzkdaa8t8WqRTBgXYNTV_IWfjrO0W4/viewform?usp=send_form mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Povzetki_seminarjev_2015&diff=10807 2015-11-04T22:36:37Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>== Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 ==<br /> Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2015 stran]<br /> <br /> === Kristjan Stibilj: PI3K kaskada in njihova vloga pri rakavih obolenjih ===<br /> Dandanes je zdravljenje rakavih obolenj poglavitna točka v razvoju farmacevtskih zdravil. Velike multinacionalke vlagajo ogromno denarja v razvoj zdravila, ki bi ozdravil tumorje oz. omilil njihovo delovanje. Za nastanek rakavih obolenj so v veliki meri krivi receptorji tirozin kinaze (RTK) in njihova PI3K/AKT/mTOR signalna pot. Ta namreč nadzoruje celično proliferacijo, metabolizem, premikanje in preživetje. Mutacije ključnih proteinov v PI3K kaskadi vodijo do nenadzorovane rasti in delitve celic, kar privede do nastanka tumorjev. Glavni princip zdravljenja oz. iskanje zdravila za rakava obolenja je torej poiskati takšno molekulo, ki bi uspešno inhibirala mutiran protein in s tem ustavila njegovo hiperaktivacjo. Znanstveniki so v zadnjih letih odkrili precej inhibitorjev, ki so bolj ali majn specifični in so sedaj v preiskavah kot morebitno zdravilo. Za inhibiranje PI3K molekule sta se v predkličninih študijah pokazala kot uspešna pictilisib in buparlisib, ki se vežeta na ATP-vezavno mesto. Na enak način deluje tudi večina AKT inhibitorjev, kamor spada tudi dobro raziskan Inhibitor VIII. mTOR, zadnja molekula v PI3K kaskadi, pa ima prav tako kar nekaj sintetičnih inhibitorjev, ki so analogni naravni molekuli rapamcin. Vsi našteti inhibitorji pa žal še niso zdravila za raka, saj so interakcije z ostalimi encimi v celici še vedno nepoznane.<br /> <br /> === Klara Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv ===<br /> Patogene bakterije uporabljajo efektorje za zatiranje imunskega odziva gostitelja. Tarča mnogih efektorskih proteinov je celični ubikvitinacijski sistem (UBS), ki je pomemben regulator imunskega odgovora. Ubikvitinska signalizacija poteka preko treh encimskih kompleksov, ki na proteinske substrate vežejo molekule ubikvitina. Dolžina in oblika ubikvitinske verige narekujeta, kakšen bo biološki odgovor celice na ubikvitinacijo oz. kaj se bo s substratom zgodilo. Ker prokarionti nimajo lastnega ubikvitinacijskega sistema, so morali razviti drugačne mehanizme, ki jim omogočajo interakcijo z evkariontskimi proteini, kateri nastopajo pri ubikvitinaciji. Efektorji lahko gostiteljski UBS izkoriščajo tako, da strukturno ali funkcijsko posnemajo evkariontske komponente UBS, ali pa so homologi evkariontskih proteinov. Lahko tudi pospešujejo ali inhibirajo delovanje 26S proteasoma. Efektorski proteini torej izkoriščajo evkariontske strategije za nadzor in manipulacijo gostiteljevih celičnih procesov, v smeri, ki patogenu omogoča čim boljšo možnost razvoja in množitve. Efektorji AvrPtoB, HopM1 ter VirF so nastali z različnim evolucijskim razvojem, zato se tudi mehanizmi njihovega delovanja na UBS razlikujejo. Patogeni efektorji lahko preko ubikvitinacije pomembnih signalnih proteinov v imunskih kaskadah povzročijo nezmožnost celice, da aktivira PAMP ter ETI imunost. Razgradnja gostiteljevih proteinov vodi lahko do motenj v izražanju genov, motenj v vezikularnem transportu in številnih drugih nepravilnosti v celičnih procesih, ki pripeljejo do večje dovzetnosti celice za okužbo.<br /> <br /> === Tjaša Lukšič: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini ===<br /> Alternativno izrezovanje GPCR-jev je pogost pojav, še posebej pri sekretinski in nekaterih sorodnih družinah. Receptorji sekretinske družine se pojavljajo v zanimivih izooblikah, ki odstirajo nove poglede na regulacijo celične signalizacije. V sedmi transmembranski vijačnici sekretinskih GPCR-jev je dobro ohranjen ekson 12 oz. zaporedje 14 aminokislin, ki je tarča izrezovalno-povezovalnega kompleksa pri nekaterih receptorjih. Delecija eksona 12 nima izrazitega vpliva na vezavo primarnih sporočevalcev, ima pa zato toliko večje posledice pri prenosu signalov. Povezovanje z G-proteini je onemogočeno, ker skrajšana TMD7 ne omogoča normalne konformacijske spremembe. Le-ta se v običajnih izooblikah zgodi zaradi premika TMD6 in TMD7 proti statični TMD3, kar razkrije intracelularno vezavno domeno za navzdolnje efektorje. Poleg omenjene funkcije lažnega receptorja, se oslabi tudi membranska ekspresija kratkih-TMD7 receptorjev, saj je izbrisan transportni motiv v eksonu 12 in zmanjšana hidrofobnost C konca. Najbolj fascinantna posledica je zagotovo dominantno negativna regulacija membranske ekspresije ostalih izooblik. Za transport GPCR-jev iz kontrolnega sistema endoplazmatskega retikuluma je potrebna oligomerizacija. Hetero-oligomeri določenih kombinacij s kratkim-TMD7 receptorjem ne uspejo zapustiti ER, število delujočih receptorjev v membrani se zmanjšuje in celica je slabše odzivna na njihove primarne sporočevalce. Med tem pa nekateri receptorji nimajo težav pri transportu skupaj s skrajšanimi izooblikami. Številna bolezenska stanja so povezana s patološkimi izooblikami ali z neuspešnim transportom proteinov iz ER, za kar obstaja potencialna rešitev v farmakoloških šaperonih.<br /> <br /> === Rok Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni ===<br /> Celice so se skozi čas prilagodile na življenje v okolju, polnem potencialno škodljivih patogenov. Razvilo se je mnogo mehanizmov celičnega odgovora, ki so prilagojeni tako, da lahko ustrezen odgovor na patogene pripravijo v različnih situacijah. En takih mehanizmov predstavlja tudi signalna kaskada preko TNFR1, receptorja za citokin TNFα. TNFα sprostijo celice imunskega sistema, ko zaznajo prisotnost patogena. Osnovni celični odgovor pri stimulaciji TNFR1 je kaskada, ki preko zaporedja ubikvitinacij sodelujočih proteinov, privede do translokacije transkripcijskega faktorja NF-κB v jedro. NF-κB tam sproži prepisovanje genov za vnetne citokine, ki ob kasnejšem sproščanju v okolico celice povzročijo vnetni odziv sosednjih celic ter s tem omejitev okužbe. Nekateri patogeni pa so na ta odziv prilagojeni tako, da inhibirajo ključne proteine v začetni kaskadi in s tem zmanjšajo vnetje, vendar pa imajo na to prilagoditev odgovor tudi gostiteljske celice. Pri taki inhibiciji pride do prenosa signala po drugi poti, ki privede do apoptoze napadene celice, kar ubije tudi patogene v njej, in tako omeji okužbo. Patogeni lahko inhibirajo tudi samo apoptozo, zaradi česar obstaja tudi zasilni celični mehanizem odgovora nanje. V primeru inhibicije apoptoze se kaskada konča z aktivacijo psevdokinaze MLKL, ki je glavni efektor za mehanizem programirane nekroze z imenom nekroptoza. Pri nekroptozi pride kot pri nekrozi do celične lize, pri čemer se v okolico sprostijo DAMP-i, ki sprožijo vnetni odziv okoliškega tkiva.<br /> <br /> === Ema Gašperšič: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen ===<br /> Protein kinaze C (PKC) so družina encimov, ki sodelujejo v številnih signalnih poteh v celici. S fosforilacijo serina ali treonina nekega drugega proteina regulira njegovo aktivnost. Vplivajo na proliferacijo in diferenciacijo celice, apoptozo, oblikovanje sinaps, učenje ter shranjevanje spominov, nevrološke motnje in mnogo drugih procesov v celici. Za aktivacijo PKC sta ključni povečani koncentraciji diacilglicerola (DAG) in kalcijevih ionov Ca2+, ki z vezavo na PKC povzročita prehod iz neaktivne v aktivno obliko. Aktivacija PKC vpliva na spodbujanje oziroma inhibiranje razvoja raznih bolezni, kot so rak, ishemična možganska kap ali Alzheimerjeva bolezen in druge nevrodegenerativne bolezni. Problem je v tem, da je pri zdravljenju raka potrebno rast celic čim prej zaustaviti, med tem ko morajo pri nevrodegenerativnih boleznih nevroni ostajati živi. Poleg tega je zanimivo, da naj bi nekateri aktivatorji protein kinaz C rast rakavih celic spodbujali, drugi pa zavirali. Običajen mehanizem delovanja PKC je težko opisati, saj obstaja več oblik PKC izoencimov, ki so po različnih tkivih različno razporejeni, v celici imajo različne funkcije, poleg tega pa obstaja več signalnih poti, ki vodijo do aktivacije PKC. Vse to so razlogi za oteženo delo raziskovalcev, ki želijo odkriti načine zdravljenja prej omenjenih boleznih, zato torej to področje zahteva še precej raziskav, ki bi posledično lahko olajšale njihovo zdravljenje.<br /> <br /> === Tadej Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic ===<br /> Melanom je najnevarnejša oblika kožnega raka in znanstveniki že desetletja borijo izboljšali rezultate zdravljenja. Vzpodbuditi želijo proti-tumorski odziv imunskega sistema, vendar so zaradi kontrolnih točk neuspešni. Kontrolne točke so ključne za ohranjanje imunske homeostaze, saj bi brez njih bili žrtev številnim avtoimunskim boleznim in poškodbam tkiva ob prevelikem odzivu sistema na patogene vnetje. Med imunske kontrolne točke spada tudi receptor PD-1. Je monomer sestavljen iz imunoglobulinske in citoplazemske domene. Zanj sta značilna tudi dva liganda (PD-L1 in PD-L2), ki sta potrebna za njegovo aktivacijo. Najdemo ga predvsem pri limfocitih T in nekaterih melanomskih celicah. Izražanje PD-1 je raziskano predvsem pri limfocitih T, kjer ob interakciji z ligandoma inhibira delovanje in funkcije limfocitov ter povzroča njihovo apoptozo. To doseže s pomočjo zaviranja številnih ključnih procesov znotraj celice, ki so potrebni za njeno normalno delovanje. Pri melanomskih celicah je pa delovanje PD-1 še dokaj neraziskano. Do zdaj njegova prisotnost ni bila znana, vendar so nedavne raziskave pokazale njegovo izražanje na nekaterih celicah limfocitov. Obnašanje PD-1 melanomskih celic je drugačno kot pa pri limfocitih, saj njegovo izražanje spodbuja rast tumorja. S pomočjo boljšega poznavanja delovanja PD-1 v limfocitih T in melanomskih celicah, bo lažje razviti učinkovitejše metode boja proti raku.<br /> <br /> === Tilen Tršelič: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic ===<br /> Piruvat kinaza (PK) je pomemben glikolitski encim, ki se pojavlja v štirih različnih oblikah. Oblika M2 je posebno zanimiva, saj poleg svoje glikolitske funkcije opravlja še mnoge druge, nemetabolične funkcije. Poleg tega je PKM2 prevladujoča oblika encima v rakavih celicah. Razlog za povečano izražanje le-tega verjeno izhaja iz dejstva, da lahko PKM2 zavzema aktivno tetramerno obliko ali skoraj neaktivno dimerno obliko. Možnost menjavanja svojih oblik celicam, bodisi zdravim ali rakavim, omogoča prilagajanje delovanja njihovim potrebam. Če celici primanjkuje energije, lahko encim zavzema pretežno aktivno tetramerno obliko in tako spodbuja proizvodnjo ATP. Če celica potrebuje nove makromolekule za proliferacijo, tu encim lahko zavzame pretežno neaktivno dimerno obliko in spodbuja kopičenje intermediatov glikolize. Te so ključni za sintezo novih snovi, saj služijo kot njihovi prekurzorji. <br /> Aktivnost encima PKM2 se regulira na več načinov. Vlogo regulatorjev po navadi opravljajo post-translacijske modifikacije encima, lahko pa tudi nekatere druge spremembe v celičnem okolju. <br /> PKM2 v svoji manj aktivni dimerni obliki prav tako lahko regulira druge procese. Predvsem pospešuje celično rast in razvoj prek reakcij z pomembnimi transkripcijskimi faktorji v jedru. Izkazalo se je, da delovanje encima PKM2 močno koristi rakavim celicam.<br /> Ker je encim PKM2 zelo pomemben za razvoj takšnih celic, predstavlja dobro potencialno tarčo za zdravljenje. Raziskave potrjujejo, da bi bilo slednje možno, ne ponujajo pa konkretnega odgovora na vprašanje, kako bi takšno zdravljenje potekalo.<br /> <br /> === Tina Šimunović: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom ===<br /> Pod imenom rak razumemo bolezen, za katero je značilna nenadzorovana rast in celična delitev. Rakave celice imajo tako večjo potrebo po biosintezi pomembnih makromolekul, ki jo zadostijo s prilagoditvijo in spremembo svojih metaboličnih poti. Ena izmed prilagoditev je lahko sprememba pentoza-fosfatne poti (PPP). To je ena izmed metaboličnih poti glukoze, katere glavna produkta sta riboza-5-fosfat in NADPH. Prva se naprej uporablja pri sintezi nukleinskih kislin, NADPH pa je pomemben za sintezo makromolekul in za detoksikacijo. Regulacija PPP poteka preko njenih metabolnih encimov. V rakavih celicah je predvsem izražena povišana aktivnost glukoza-6-fosfat dehidrogenaze in s tem aktivnost PPP. Pri tem encimu sta, poleg mnogih drugih, najpomembnejša regulatorja NADPH in tumorski supresor p53. Aktivnost PPP lahko poveča tudi acetilacija 6-fosfoglukonat dehidrogenaze ali pa povečano izražanje transketolaze. Na pospešeno proliferacijo rakavih celic vplivajo tudi inaktivirani tumorski supresorji in aktivirani onkoproteini, npr. p53, TIGAR, ATM, Ras, mTORC1 in Nrf2. Največji pomen PPP pri rakavih celicah, je v zaščiti pred celično smrtjo, saj se s povečano aktivnostjo PPP pospeši tvorba njenih produktov, ki so ključni pri preživetju celice. Z inhibicijo te poti, bi lahko tudi inhibirali rast tumorjev. PPP je tako postala potenciala tarča za zdravljenje raka, vendar je za to potrebnih še veliko raziskav in boljše razumevanje metabolizma rakavih celic. <br /> <br /> === Ime Priimek: Naslov mojega seminarja ===<br /> Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Aliquam id lorem nulla. Nam malesuada venenatis velit imperdiet finibus. Aenean dignissim fermentum nisl, eget suscipit nibh ultrices quis. Aliquam scelerisque pharetra nisl non dignissim. Duis ac eros tristique, venenatis ante sit amet, tristique neque. Suspendisse maximus metus posuere nisi auctor, ac vulputate leo ultrices. Duis bibendum sollicitudin neque, ac tristique dolor ornare et. Mauris tristique consequat varius. Proin finibus orci urna, in ultrices justo efficitur dictum. Cras eget finibus justo. Morbi feugiat erat nec metus luctus, eu fermentum libero vestibulum. Proin lobortis ligula et quam ultricies pharetra. Proin et tellus ut nulla pellentesque fringilla interdum eget lorem. Suspendisse potenti. Curabitur quis sem eu purus blandit euismod. Fusce convallis rutrum lorem, quis feugiat sapien porta et. Nulla facilisi. Pellentesque imperdiet, elit vel euismod hendrerit, metus mauris feugiat nulla, vel pellentesque sapien ligula vel sapien. Donec nibh odio, facilisis ut orci ut, feugiat dictum orci. Aliquam aliquet lacus et dapibus faucibus. Mauris ac ipsum pulvinar, auctor enim in, mollis libero. Curabitur porttitor, velit vel pretium ullamcorper, nulla arcu blandit orci, vel fermentum metus est et nisl. Cras et nunc lacus. Suspendisse tempus sagittis libero, quis rutrum ante faucibus nec. Sed ac eros eget.</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2015&diff=10789 2015-10-27T21:14:45Z

<p>Tinasimunovic: </p> <hr /> <div>= Biokemijski seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime Priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''poglavje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15<br /> |-<br /> | Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15<br /> |-<br /> | Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15<br /> |-<br /> | Rok Miklavčič||12||||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15<br /> |-<br /> | Ema Gašperšič||12||||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15<br /> |-<br /> | Tadej Satler||12||PD-1 limfocitov in melanomskih celic ||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15<br /> |-<br /> | Tina Šimunović||14-15||Pentoza-fosfatna pot in rak||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15<br /> |-<br /> | Maja Zupanc||14-15||||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15<br /> |-<br /> | Tilen Tršelič||14-15||||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15<br /> |-<br /> | Lara Jerman||16||||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15<br /> |-<br /> | Eva Rajh||16||Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na posttranslacijske modifikacije in DNA metilacijo ||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15<br /> |-<br /> | Sara Tekavec||16||||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15<br /> |-<br /> | Fran Krstanović||17||||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15<br /> |-<br /> | Elvira Boršić||17||||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15<br /> |-<br /> | Janja Krapež||17||||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15<br /> |-<br /> | Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15<br /> |-<br /> | Miha Koprivnikar Krajnc||18||||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15<br /> |-<br /> | Špela Malenšek||18||||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15<br /> |-<br /> | Urša Kopač||19||||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15<br /> |-<br /> | Neža Koritnik||19||||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15<br /> |-<br /> | Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15<br /> |-<br /> | Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15<br /> |-<br /> | Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15<br /> |-<br /> | Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15<br /> |-<br /> | Urša Čerček||21||||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15<br /> |-<br /> | Katja Brezovar||21||||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15<br /> |-<br /> | Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15<br /> |-<br /> | Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16<br /> |-<br /> | Aleksandra Uzar||22||||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16<br /> |-<br /> | Petra Hruševar||22||||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16<br /> |-<br /> | Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16<br /> |-<br /> | Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16<br /> |-<br /> | Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16<br /> |-<br /> | Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||14/01/16<br /> |-<br /> | Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16<br /> |-<br /> | Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16<br /> |-<br /> | Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! <br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od &lt;font color=red&gt;2700 do 3000 besed &lt;/font&gt;, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt;Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> * &lt;font color=green&gt;312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši<br /> * 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%&lt;/font&gt;<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/19bnx0Yh4RIuC2Kzkdaa8t8WqRTBgXYNTV_IWfjrO0W4/viewform?usp=send_form mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Zna%C4%8Dilnosti_s_kromosomom_X_povezanih_genov&diff=10428 2015-05-04T19:50:00Z

<p>Tinasimunovic: /* Geni značilni za samce */</p> <hr /> <div>Geni na kromosomu X sesalcev so pri samcih prisotni v eni kopiji, pri samicah pa v dveh. Živali, ki imajo XX samice in XY ali X0 samce, imajo pri vsakem spolu različne količine genov, ki so povezani s kromosomom X. Regulacija kromosoma X vključuje več mehanizmov, eden od teh pa je tudi inaktivacija X kromosoma (to je, utišanje enega X kromosoma pri samicah sesalcev v somatskih celicah). Inaktivacija kromosoma je naključna, zato so samice finozrnat mozaik celic, ki izražajo alel zapisan na enem od kromosomov. Vsi mehanizmi izenačijo izražanje genov, ki so povezani s kromosomom X, neuspešno izenačenje pa običajno vodi v smrt že v začetku razvoja.<br /> <br /> Zahtevni mehanizmi vodijo v evolucijske in fizične razlike v izražanju genov med vrstami, spoloma, posamezniki, razvojnimi stopnjami, tkivi in tipi celic. X inaktivacija lahko odstrani spolne razlike zaradi izražanja genov povezanih s kromosomom X, ki jih povzročijo razlike v številu kopij gena. Pri nekaterih vrstah pa je v zgodnjem razvoju zakasnjena in nepopolna inaktivacija X kromosoma povzročila razlike v izražanju genov.<br /> <br /> Da bi razumeli regulacijo in funkcijo kromosoma X, moramo najprej definirati gensko sestavo tega kromosoma.<br /> <br /> == Različni tipi s kromosomom X povezanih genov == <br /> <br /> S kromosomom X povezane gene lahko kategoriziramo na podlagi števila kopij gena, zgodovine evolucije, način zvišanja ravni X izražanja in status inaktivacije X kromosoma (XCI).<br /> <br /> === Število kopij ===<br /> S kromosomom X povezani geni se delijo na gene z eno kopijo, z več kopijami (z najmanj dvema kopijama, ki nista prisotni na amplikonski regiji) in amplikonske gene (to so geni, ki so prisotni v segmentnih podvojitvah z več kot 10 kb po dolžini in si delijo več kot 99% enakih nukleotidov). Podobno kot avtosomni geni, tudi s kromosomom X povezani geni z eno kopijo in z več kopijami ne kažejo posebnega vzorca izražanja v testisih. Amplikonski s kromosomom X povezani geni pa se izražajo pretežno pri zarodnih celicah mod.<br /> <br /> === Zgodovina evolucije ===<br /> »Stari« s kromosomom X povezani geni so tisti, ki jih najdemo na ortolognih avtosomih 1 in 4 piščanca, medtem ko so »novi« tisti, ki so bili pridobljeni med evolucijo kromosoma X sesalca. Genska sestava X kromosoma višjih sesalcev je visoko ohranjena. Kartiranje genov na X kromosomu pri sesalcih v daljnem sorodstvu je pokazalo, da je le del kromosoma ohranjenega med višjimi sesalci in vrečarji (zadnji so se od višjih sesalcev »odcepili« 180 milijonov let nazaj). Daljša ročica in osrednja regija X kromosoma je ekvivalentna X kromosomu vrečarjev, kar pomeni da je ta del star vsaj 180 milijonov let. Ta regija je znana tudi kot ohranjena regija X kromosoma – XCR. Geni na kratki ročici pa so avtosomni pri vrečarjih, kar pomeni da se je ta regija dodala na spolne kromosome nekje od 130 do 80 milijonov let nazaj. Ta regija se imenuje dodana regija – XAR. Večino s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo in več kopijami imamo ljudje in miši enake, medtem ko je bila večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljena neodvisno pri teh vrstah sesalcev.<br /> <br /> Leta 2012 je bila objavljena analiza izražanja genov na kromosomu X v 6 različnih somatskih tkivih miši na podlagi spolov. Rezultati kažejo, da je X kromosom miši obogaten z geni, ki so pri samicah drugače izraženi, osiromašen pa z geni, ki so drugače izraženi pri samcih. Iz tega sklepamo, da se feminizacija, prav tako kot tudi de-maskulinizacija X kromosoma pojavi ob pogojih genskega izražanja v ne-razmnoževalnih tkivih. Pobeg X inaktivaciji je eden izmed glavnih mehanizmov, ki naj bi bili odgovorni za nadzor izražanja genov, ki so pri ženskah drugače izraženi. Pobeg je bil potrjen v primeru Tmem29, v katerem je bila uporabljena RNA-FISH analiza. Prav tako so odkrili, da že znani pobegli geni le delno obrazložijo preveliko zastopanje s kromosomom X povezanih genov, ki so pri samicah drugače izraženi, predvsem za tkivno-specifične gene.<br /> <br /> Analiza starosti genov je pokazala, da so evolucijsko stari geni, ki so povezani s kromosomom X, pogosteje geni, ki se drugače izražajo pri samicah, kot pa mlajši geni. Kot zaključek analize pa je podano, da imajo njihovi rezultati vpliv na razumevanje regulacije in evolucije genov kromosoma X sesalcev.<br /> <br /> === Način zvišanja ravni X izražanja ===<br /> Do sedaj sta bila opisana dva mehanizma zvišanja kromosoma X: s histon-acetiltransferaza KAT8 posredovan mehanizem za izboljšano iniciacijo transkripcije in mehanizem, ki poviša razpolovni čas RNA. Nekateri geni so bolj občutljivi na regulacijo KAT8, nekateri pa na regulacijo stabilnosti RNA. Geni, ki so povezani v mreže in velike proteinske komplekse so občutljivi za dozo.<br /> <br /> === XCI status ===<br /> S kromosomom X povezani geni se ali izognejo ali pa doživijo XCI do različne stopnje. Geni, ki se izognejo XCI, so definirani kot tisti, ki kažejo več kot 10 % izražanja iz neaktivnega X alela v primerjavi z aktivnim. Pobegli geni se lahko izražajo izključno iz neaktivnega kromosoma X, na primer X inaktiven specifičen transkript (XIST). Nekateri pobegli geni so pripadniki X-Y genskega para s paralogom na Y kromosomu, ki ima lahko isto funkcijo kot X paralog. Drugi pobegli geni so svoj Y paralog izgubili ali pa se je ta razvil ločeno, večinoma za testise specifično funkcijo. <br /> <br /> == Geni značilni za samce ==<br /> <br /> Kopičenje genov na X kromosomu sesalcev, ki so koristni za samce, razloži veliko teorij, vključno s spolnim antagonizmom (to je, evolucija alelov, ki so koristni enemu spolu in škodljivi drugemu), X hemizigotnostjo pri samcih in X prenosom, ki je drugačen pri samicah(to je, dvojen prenašalni čas pri samicah glede na samce). Kromosom X je obogaten s kodirajočimi geni za proteine in miRNA, ki se izražajo v testisih. Večina s kromosomom X povezanih genov specifičnih za samce je pretežno ali izključno izražena v testisih v stopnjah pred in po mejozi, kar podpira hipotezo o spolnem antagonizmu. Med tema stopnjama inaktivacija mejoznih spolnih kromosomov (MSCI) utiša s kromosomom X povezane gene – popolno utišanje genov na XY bivalentu v profazi mejoze.<br /> <br /> Poleg genov, ki se izražajo v testisih, obstaja tudi veliko amplikonskih genov, ki predstavljajo 13 % s kromosomom X povezanih genov pri človeku in 17 % pri miših. Po razhodu skupnega prednika človeka in miši, je večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljenih neodvisno pri obeh vrstah. Nasprotno pa je več kot 94 % s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo ohranjenih med temi vrstami.<br /> <br /> Ker imata razvoj zarodne celice in funkcija mod podobne značilnosti pri človeku in miših, so si funkcije amplikonskih s kromosomom X povezanih genov verjetno podobne in se prekrivajo, ne glede na njihov različen izvor. Nasprotno pa so fenotipske razlike v funkciji mod med vrstami lahko delno določene z neodvisno pridobitvijo iz različnih družin genov.<br /> <br /> == Geni značilni za samice ==<br /> <br /> Pri človeku so stara skupina s kromosomom X povezani geni pogosto taki, da so pri samicah drugače izraženi in imajo visoke stopnje izražanja v jajčnikih v primerjavi s kontrolno skupino starih avtosomnih genov.S kromosomom X povezani geni preživijo dvakrat več svojega razvojnega časa pri samicah kot pri samcih. Zato so lahko aleli, ki so dobri za samice privilegirani na X kromosomu, če niso slabi za samce. Geni, ki so dobri za samce in slabi za samice, pa težje preživijo na X kromosomu.Povečano izražanje s kromosomom X povezanih genov je nujno za normalno delovanje jajčnikov. To podpira dejstvo, da posamezniki s Turnerjevim sindromom, ki imajo samo en X kromosom, kažejo na motnje v razvoju jajčnikov.V genski sestavi je X kromosom različen po spolu, vendar v določenih primerih lahko ta različnost favorizira gene, ki koristijo obema spoloma.<br /> <br /> == Geni značilni za možgane ==<br /> <br /> Poleg genov, ki so pomembni za razmnoževanje, je X kromosom sesalcev obogaten tudi z geni povezanimi z nevrološkimi funkcijami. Veliko istih genov, ki se izraža v modih, se izraža tudi v možganih. Ti s kromosomom X povezani geni so pomembni pri razvoju možganov in njihovem delovanju, zato lahko mozaicizem polimorfnih X alelov prispeva h spolnim razlikam pri delovanju možganov - vplivajo na spolno dimorfen razvoj možganov. Lahko imajo vlogo pri spolni diferenciaciji, če so bolj izraženi pri ženskah kot pri moških, zaradi nepopolne X inaktivacije.<br /> <br /> X kromosom sesalcev vsebuje okoli 1800 genov, med katerimi so geni pomembni pri delovanju možganov in pri razmnoževanju zastopani nesorazmerno. Delež teh genov je znatno višji kot pri drugih somatskih tkivih. Da ima X kromosom pomembno vlogo pri razvoju možganov in njihovem delovanju, dokazuje visoka vsebnost genov, katerih mutacija povzroča umsko prizadetost. S kromosomom X povezane oblike umske prizadetosti so 3,5-krat bolj pogoste kot avtosomske oblike. Pri takem prizadetem posamezniku ima skoraj 100 človeških s kromosomom X povezanih genov mutacije. Učinki teh mutacij se razlikujejo pri ženskah, zaradi nenaključne inaktivacije X kromosoma ali pobega pri XCI. Občutljivost moških na mutacije s kromosomom X povezanih genov pa je očiten vir spolnih razlik pri boleznih. Že več kot stoletje je znano da je umska prizadetost bolj pogosta pri moških kot pri ženskah.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> * Deng, X. D., Berletch, J.B., Nguyen, D.K., Disteche, C. M.: X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease, Nat Rev Genet., [online] 6, (10), 2014, 367-378<br /> * Reinius, B., Johansson M. M., Radomska1 K.J., Morrow, E.H., Pandey, G.K, Kanduri, C. , Sandberg, R., Williams, W.R., Jazin, E. : Abundance of female-biased and paucity of male-biased somatically expressed genes on the mouse X-chromosome, Reinius et al. BMC Genomics, [online] 2012, 13-607<br /> * Mueller, J., L., Mahadevaiah, S., K., Park, P., J., Warburton, P., E., Page, D., C., Turner, J., M., A.: The mouse X chromosome is enriched for multicpy testis genes showing postmeiotic expression, Nature Genetics., [online] 6, (40), 2008, 794-799<br /> * Xu, J., Disteche, C., M.: Sex differences in brain expression of X- and Y-linked genes, Brain Research., [online] 1126, 2006, 50-55<br /> * Meller, V., H.: Dosage compensation: making 1x equal 2X, Cell Biology., [online] 10, 2000, 54-59<br /> * Delbridge, M., L., McMillan, D., A., Doherty, R., J., Deakin, J., E., Graves, J., A., G.: Origin and evolution of candidate mental retardation genes on the human X chromosome (MRX), BMC Genomics., [online] 9, (65), 2008, 1-10<br /> * Zheng, K., Yang, F., Wang, P., J.: Regulation of Male Fertility by X-Linked Genes, Journal of andrology., [online] 1, (31), 2010, 79-85<br /> * Arnold, A., P.: Sex chromosomes and brain gender, Nature Reviews, Neuroscience., [online] (5), 2004, 1-8<br /> <br /> [[Category:SEM]][[Category:BMB]]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Zna%C4%8Dilnosti_s_kromosomom_X_povezanih_genov&diff=10427 2015-05-04T19:45:29Z

<p>Tinasimunovic: /* Geni značilni za samce */</p> <hr /> <div>Geni na kromosomu X sesalcev so pri samcih prisotni v eni kopiji, pri samicah pa v dveh. Živali, ki imajo XX samice in XY ali X0 samce, imajo pri vsakem spolu različne količine genov, ki so povezani s kromosomom X. Regulacija kromosoma X vključuje več mehanizmov, eden od teh pa je tudi inaktivacija X kromosoma (to je, utišanje enega X kromosoma pri samicah sesalcev v somatskih celicah). Inaktivacija kromosoma je naključna, zato so samice finozrnat mozaik celic, ki izražajo alel zapisan na enem od kromosomov. Vsi mehanizmi izenačijo izražanje genov, ki so povezani s kromosomom X, neuspešno izenačenje pa običajno vodi v smrt že v začetku razvoja.<br /> <br /> Zahtevni mehanizmi vodijo v evolucijske in fizične razlike v izražanju genov med vrstami, spoloma, posamezniki, razvojnimi stopnjami, tkivi in tipi celic. X inaktivacija lahko odstrani spolne razlike zaradi izražanja genov povezanih s kromosomom X, ki jih povzročijo razlike v številu kopij gena. Pri nekaterih vrstah pa je v zgodnjem razvoju zakasnjena in nepopolna inaktivacija X kromosoma povzročila razlike v izražanju genov.<br /> <br /> Da bi razumeli regulacijo in funkcijo kromosoma X, moramo najprej definirati gensko sestavo tega kromosoma.<br /> <br /> == Različni tipi s kromosomom X povezanih genov == <br /> <br /> S kromosomom X povezane gene lahko kategoriziramo na podlagi števila kopij gena, zgodovine evolucije, način zvišanja ravni X izražanja in status inaktivacije X kromosoma (XCI).<br /> <br /> === Število kopij ===<br /> S kromosomom X povezani geni se delijo na gene z eno kopijo, z več kopijami (z najmanj dvema kopijama, ki nista prisotni na amplikonski regiji) in amplikonske gene (to so geni, ki so prisotni v segmentnih podvojitvah z več kot 10 kb po dolžini in si delijo več kot 99% enakih nukleotidov). Podobno kot avtosomni geni, tudi s kromosomom X povezani geni z eno kopijo in z več kopijami ne kažejo posebnega vzorca izražanja v testisih. Amplikonski s kromosomom X povezani geni pa se izražajo pretežno pri zarodnih celicah mod.<br /> <br /> === Zgodovina evolucije ===<br /> »Stari« s kromosomom X povezani geni so tisti, ki jih najdemo na ortolognih avtosomih 1 in 4 piščanca, medtem ko so »novi« tisti, ki so bili pridobljeni med evolucijo kromosoma X sesalca. Genska sestava X kromosoma višjih sesalcev je visoko ohranjena. Kartiranje genov na X kromosomu pri sesalcih v daljnem sorodstvu je pokazalo, da je le del kromosoma ohranjenega med višjimi sesalci in vrečarji (zadnji so se od višjih sesalcev »odcepili« 180 milijonov let nazaj). Daljša ročica in osrednja regija X kromosoma je ekvivalentna X kromosomu vrečarjev, kar pomeni da je ta del star vsaj 180 milijonov let. Ta regija je znana tudi kot ohranjena regija X kromosoma – XCR. Geni na kratki ročici pa so avtosomni pri vrečarjih, kar pomeni da se je ta regija dodala na spolne kromosome nekje od 130 do 80 milijonov let nazaj. Ta regija se imenuje dodana regija – XAR. Večino s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo in več kopijami imamo ljudje in miši enake, medtem ko je bila večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljena neodvisno pri teh vrstah sesalcev.<br /> <br /> Leta 2012 je bila objavljena analiza izražanja genov na kromosomu X v 6 različnih somatskih tkivih miši na podlagi spolov. Rezultati kažejo, da je X kromosom miši obogaten z geni, ki so pri samicah drugače izraženi, osiromašen pa z geni, ki so drugače izraženi pri samcih. Iz tega sklepamo, da se feminizacija, prav tako kot tudi de-maskulinizacija X kromosoma pojavi ob pogojih genskega izražanja v ne-razmnoževalnih tkivih. Pobeg X inaktivaciji je eden izmed glavnih mehanizmov, ki naj bi bili odgovorni za nadzor izražanja genov, ki so pri ženskah drugače izraženi. Pobeg je bil potrjen v primeru Tmem29, v katerem je bila uporabljena RNA-FISH analiza. Prav tako so odkrili, da že znani pobegli geni le delno obrazložijo preveliko zastopanje s kromosomom X povezanih genov, ki so pri samicah drugače izraženi, predvsem za tkivno-specifične gene.<br /> <br /> Analiza starosti genov je pokazala, da so evolucijsko stari geni, ki so povezani s kromosomom X, pogosteje geni, ki se drugače izražajo pri samicah, kot pa mlajši geni. Kot zaključek analize pa je podano, da imajo njihovi rezultati vpliv na razumevanje regulacije in evolucije genov kromosoma X sesalcev.<br /> <br /> === Način zvišanja ravni X izražanja ===<br /> Do sedaj sta bila opisana dva mehanizma zvišanja kromosoma X: s histon-acetiltransferaza KAT8 posredovan mehanizem za izboljšano iniciacijo transkripcije in mehanizem, ki poviša razpolovni čas RNA. Nekateri geni so bolj občutljivi na regulacijo KAT8, nekateri pa na regulacijo stabilnosti RNA. Geni, ki so povezani v mreže in velike proteinske komplekse so občutljivi za dozo.<br /> <br /> === XCI status ===<br /> S kromosomom X povezani geni se ali izognejo ali pa doživijo XCI do različne stopnje. Geni, ki se izognejo XCI, so definirani kot tisti, ki kažejo več kot 10 % izražanja iz neaktivnega X alela v primerjavi z aktivnim. Pobegli geni se lahko izražajo izključno iz neaktivnega kromosoma X, na primer X inaktiven specifičen transkript (XIST). Nekateri pobegli geni so pripadniki X-Y genskega para s paralogom na Y kromosomu, ki ima lahko isto funkcijo kot X paralog. Drugi pobegli geni so svoj Y paralog izgubili ali pa se je ta razvil ločeno, večinoma za testise specifično funkcijo. <br /> <br /> == Geni značilni za samce ==<br /> <br /> Kopičenje genov na X kromosomu sesalcev, ki so koristni za samce, razloži veliko teorij, vključno s spolnim antagonizmom (to je, evolucija alelov, ki so koristni enemu spolu in škodljivi drugemu), X hemizigotnostjo pri moških in X prenosom, ki je drugačen pri samicah(to je, dvojen prenašalni čas pri samicah glede na samce). Kromosom X je obogaten s kodirajočimi geni za proteine in miRNA, ki se izražajo v testisih. Večina s kromosomom X povezanih genov specifičnih za samce je pretežno ali izključno izražena v testisih v stopnjah pred in po mejozi, kar podpira hipotezo o spolnem antagonizmu. Med tema stopnjama inaktivacija mejoznih spolnih kromosomov (MSCI) utiša s kromosomom X povezane gene – popolno utišanje genov na XY bivalentu v profazi mejoze.<br /> <br /> Poleg genov, ki se izražajo v testisih, obstaja tudi veliko amplikonskih genov, ki predstavljajo 13 % s kromosomom X povezanih genov pri človeku in 17 % pri miših. Po razhodu skupnega prednika človeka in miši, je večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljenih neodvisno pri obeh vrstah. Nasprotno pa je več kot 94 % s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo ohranjenih med temi vrstami.<br /> <br /> Ker imata razvoj zarodne celice in funkcija mod podobne značilnosti pri človeku in miših, so si funkcije amplikonskih s kromosomom X povezanih genov verjetno podobne in se prekrivajo, ne glede na njihov različen izvor. Nasprotno pa so fenotipske razlike v funkciji mod med vrstami lahko delno določene z neodvisno pridobitvijo iz različnih družin genov.<br /> <br /> == Geni značilni za samice ==<br /> <br /> Pri človeku so stara skupina s kromosomom X povezani geni pogosto taki, da so pri samicah drugače izraženi in imajo visoke stopnje izražanja v jajčnikih v primerjavi s kontrolno skupino starih avtosomnih genov.S kromosomom X povezani geni preživijo dvakrat več svojega razvojnega časa pri samicah kot pri samcih. Zato so lahko aleli, ki so dobri za samice privilegirani na X kromosomu, če niso slabi za samce. Geni, ki so dobri za samce in slabi za samice, pa težje preživijo na X kromosomu.Povečano izražanje s kromosomom X povezanih genov je nujno za normalno delovanje jajčnikov. To podpira dejstvo, da posamezniki s Turnerjevim sindromom, ki imajo samo en X kromosom, kažejo na motnje v razvoju jajčnikov.V genski sestavi je X kromosom različen po spolu, vendar v določenih primerih lahko ta različnost favorizira gene, ki koristijo obema spoloma.<br /> <br /> == Geni značilni za možgane ==<br /> <br /> Poleg genov, ki so pomembni za razmnoževanje, je X kromosom sesalcev obogaten tudi z geni povezanimi z nevrološkimi funkcijami. Veliko istih genov, ki se izraža v modih, se izraža tudi v možganih. Ti s kromosomom X povezani geni so pomembni pri razvoju možganov in njihovem delovanju, zato lahko mozaicizem polimorfnih X alelov prispeva h spolnim razlikam pri delovanju možganov - vplivajo na spolno dimorfen razvoj možganov. Lahko imajo vlogo pri spolni diferenciaciji, če so bolj izraženi pri ženskah kot pri moških, zaradi nepopolne X inaktivacije.<br /> <br /> X kromosom sesalcev vsebuje okoli 1800 genov, med katerimi so geni pomembni pri delovanju možganov in pri razmnoževanju zastopani nesorazmerno. Delež teh genov je znatno višji kot pri drugih somatskih tkivih. Da ima X kromosom pomembno vlogo pri razvoju možganov in njihovem delovanju, dokazuje visoka vsebnost genov, katerih mutacija povzroča umsko prizadetost. S kromosomom X povezane oblike umske prizadetosti so 3,5-krat bolj pogoste kot avtosomske oblike. Pri takem prizadetem posamezniku ima skoraj 100 človeških s kromosomom X povezanih genov mutacije. Učinki teh mutacij se razlikujejo pri ženskah, zaradi nenaključne inaktivacije X kromosoma ali pobega pri XCI. Občutljivost moških na mutacije s kromosomom X povezanih genov pa je očiten vir spolnih razlik pri boleznih. Že več kot stoletje je znano da je umska prizadetost bolj pogosta pri moških kot pri ženskah.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> * Deng, X. D., Berletch, J.B., Nguyen, D.K., Disteche, C. M.: X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease, Nat Rev Genet., [online] 6, (10), 2014, 367-378<br /> * Reinius, B., Johansson M. M., Radomska1 K.J., Morrow, E.H., Pandey, G.K, Kanduri, C. , Sandberg, R., Williams, W.R., Jazin, E. : Abundance of female-biased and paucity of male-biased somatically expressed genes on the mouse X-chromosome, Reinius et al. BMC Genomics, [online] 2012, 13-607<br /> * Mueller, J., L., Mahadevaiah, S., K., Park, P., J., Warburton, P., E., Page, D., C., Turner, J., M., A.: The mouse X chromosome is enriched for multicpy testis genes showing postmeiotic expression, Nature Genetics., [online] 6, (40), 2008, 794-799<br /> * Xu, J., Disteche, C., M.: Sex differences in brain expression of X- and Y-linked genes, Brain Research., [online] 1126, 2006, 50-55<br /> * Meller, V., H.: Dosage compensation: making 1x equal 2X, Cell Biology., [online] 10, 2000, 54-59<br /> * Delbridge, M., L., McMillan, D., A., Doherty, R., J., Deakin, J., E., Graves, J., A., G.: Origin and evolution of candidate mental retardation genes on the human X chromosome (MRX), BMC Genomics., [online] 9, (65), 2008, 1-10<br /> * Zheng, K., Yang, F., Wang, P., J.: Regulation of Male Fertility by X-Linked Genes, Journal of andrology., [online] 1, (31), 2010, 79-85<br /> * Arnold, A., P.: Sex chromosomes and brain gender, Nature Reviews, Neuroscience., [online] (5), 2004, 1-8<br /> <br /> [[Category:SEM]][[Category:BMB]]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Inaktivacija_kromosoma_X&diff=10426 2015-05-04T19:19:18Z

<p>Tinasimunovic: /* Skupine */</p> <hr /> <div>Seminarji pri predmetu Molekularna biologija so v študijskem letu 2014/15 namenjeni posebnemu fenomenu v genetiki, inaktivaciji kromosoma X. Pri samicah živali namreč praviloma obstajata dve kopiji kromosoma X, pri samcih pa samo ena kopija. Glede na prisotnost dvojnega števila genov pri samicah, bi teoretično pričakovali tudi dvakratno koncentracijo mRNA in proteinov, kar pa se v resnici ne zgodi. En kromosom se utiša po posebnem mehanizmu, ki ga na kratko imenujemo tudi X-inaktivacija. V zadnjih letih je postalo znanega marsikaj, o čemer smo prej le domnevali, še vedno pa mehanizma X-inaktivacije še ne poznamo v celoti.<br /> <br /> V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli v maju in začetku junija. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanj med referati naj bo čim manj. <br /> <br /> Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici. <br /> <br /> Letošnja tema je na stičišču več ved: genetike, embriologije, celične biologije, biokemije in molekularne biologije. Izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski in molekularnobiološki, nikakor pa ne opisujte na široko poteka raznih bolezni, ki so posledica napak pri inaktivaciji kromosoma X. Če se srečate z zanimivimi molekularnobiološkimi tehnikami, jih poskusite na kratko razložiti, predvsem če so ključne za spoznanja, ki jih boste predstavili.<br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje dva dni pred predstavitvijo (do polnoči). Predstavitve seminarjev 1 in 2 bodo 6. maja, 3 in 4 11. maja, 5 in 6 13. maja, 7 in 8 18. maja, 9 in 10 pa 20. maja 2015. Za vsak seminar imate na voljo 14-18 minut časa, da ga predstavite, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki strani uporabite zavihek 'discussion'). <br /> <br /> Seznam naslovov tem in izhodiščnih virov:<br /> <br /> # Evolucija spolnih kromosomov: http://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.0060080<br /> # Značilnosti s kromosomom X povezanih genov: poglavje Functional diversity of X-linked genes v preglednem članku http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4117651/<br /> # Dolge (in kratke) nekodirajoče RNA: http://www.sciencemag.org/content/319/5871/1787.long in http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3858397/<br /> # Mehanizem X-inaktivacije – to je ključni referat celotne letošnje serije in lahko pričakujete kakšno vprašanje na izpitu iz tega seminarja: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3771680/<br /> # Primer X-inaktiviranega gena: O-GlcNAc transferaza: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X14011425<br /> # Iniciacija X-aktivacije pri miših in drugih sesalcih: poglavje Variable XCI initiation and mosaic X expression v preglednem članku http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4117651/<br /> # Pobeg iz X-inaktivacije: poglavje Sex bias in gene expression v preglednem članku http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4117651/ ter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3136209/<br /> # Ponovna aktivacija kromosoma X: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3293375/<br /> # Povečano izražanje genov na kromosomu X: poglavje Diverse mechanisms of X upregulation v preglednem članku http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4117651/<br /> # Uravnavanje X-inaktivacije pri boleznih: poglavje X chromosome regulation and disease v preglednem članku http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4117651/<br /> <br /> <br /> == Skupine ==<br /> <br /> <br /> Skupine za projektno nalogo oblikujte do 10.aprila (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme): <br /> <br /> npr.: 0. Evolucija mitohondrijskih genomov (Janez Gorenc, Petra Novak, Anja Dolenc)<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Evolucija_spolnih_kromosomov# Evolucija spolnih kromosomov] (Amadeja Lapornik, Jerneja Kocutar, Katja Malovrh)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Značilnosti_s_kromosomom_X_povezanih_geni# Značilnosti s kromosomom X povezanih genov] (Neža Brezovar, Tina Šimunović)<br /> # Dolge (in kratke) nekodirajoče RNA (Ernest Šprager, Gašper Marinšek, Bine Tršavec)<br /> # Mehanizem X-inaktivacije (Dominik Dekleva, Luka Dejanović, Matej Vrhovnik)<br /> # Primer X-inaktiviranega gena: O-GlcNAc transferaza (Primož Tič, Tadej Ulčnik, Tomaž Žagar)<br /> # Iniciacija X-aktivacije pri miših in drugih sesalcih (Jerneja Ovčar, Tjaša Sorčan, Urška Kašnik)<br /> # Pobeg iz X-inaktivacije (Živa Moravec, Monika Pepelnjak, Enja Kokalj)<br /> # Ponovna aktivacija kromosoma X (Vesna Podgrajšek, Marija Srnko, Urška Černe)<br /> # Povečano izražanje genov na kromosomu X (Inge Sotlar, Anja Tanšek, Nuša Kelhar)<br /> # Uravnavanje X-inaktivacije pri boleznih (Luka Lavrič, Nina Mavec, Jernej Vidmar)</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Zna%C4%8Dilnosti_s_kromosomom_X_povezanih_genov&diff=10425 2015-05-04T19:18:07Z

<p>Tinasimunovic: New page: Neža Brezovar, Tina Šimunović: povzetek sva napisali skupaj</p> <hr /> <div>Neža Brezovar, Tina Šimunović: povzetek sva napisali skupaj</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Zna%C4%8Dilnosti_s_kromosomom_X_povezanih_genov&diff=10424 2015-05-04T19:13:14Z

<p>Tinasimunovic: /* Uvod */</p> <hr /> <div>Geni na kromosomu X sesalcev so pri samcih prisotni v eni kopiji, pri samicah pa v dveh. Živali, ki imajo XX samice in XY ali X0 samce, imajo pri vsakem spolu različne količine genov, ki so povezani s kromosomom X. Regulacija kromosoma X vključuje več mehanizmov, eden od teh pa je tudi inaktivacija X kromosoma (to je, utišanje enega X kromosoma pri samicah sesalcev v somatskih celicah). Inaktivacija kromosoma je naključna, zato so samice finozrnat mozaik celic, ki izražajo alel zapisan na enem od kromosomov. Vsi mehanizmi izenačijo izražanje genov, ki so povezani s kromosomom X, neuspešno izenačenje pa običajno vodi v smrt že v začetku razvoja.<br /> <br /> Zahtevni mehanizmi vodijo v evolucijske in fizične razlike v izražanju genov med vrstami, spoloma, posamezniki, razvojnimi stopnjami, tkivi in tipi celic. X inaktivacija lahko odstrani spolne razlike zaradi izražanja genov povezanih s kromosomom X, ki jih povzročijo razlike v številu kopij gena. Pri nekaterih vrstah pa je v zgodnjem razvoju zakasnjena in nepopolna inaktivacija X kromosoma povzročila razlike v izražanju genov.<br /> <br /> Da bi razumeli regulacijo in funkcijo kromosoma X, moramo najprej definirati gensko sestavo tega kromosoma.<br /> <br /> == Različni tipi s kromosomom X povezanih genov == <br /> <br /> S kromosomom X povezane gene lahko kategoriziramo na podlagi števila kopij gena, zgodovine evolucije, način zvišanja ravni X izražanja in status inaktivacije X kromosoma (XCI).<br /> <br /> === Število kopij ===<br /> S kromosomom X povezani geni se delijo na gene z eno kopijo, z več kopijami (z najmanj dvema kopijama, ki nista prisotni na amplikonski regiji) in amplikonske gene (to so geni, ki so prisotni v segmentnih podvojitvah z več kot 10 kb po dolžini in si delijo več kot 99% enakih nukleotidov). Podobno kot avtosomni geni, tudi s kromosomom X povezani geni z eno kopijo in z več kopijami ne kažejo posebnega vzorca izražanja v testisih. Amplikonski s kromosomom X povezani geni pa se izražajo pretežno pri zarodnih celicah mod.<br /> <br /> === Zgodovina evolucije ===<br /> »Stari« s kromosomom X povezani geni so tisti, ki jih najdemo na ortolognih avtosomih 1 in 4 piščanca, medtem ko so »novi« tisti, ki so bili pridobljeni med evolucijo kromosoma X sesalca. Genska sestava X kromosoma višjih sesalcev je visoko ohranjena. Kartiranje genov na X kromosomu pri sesalcih v daljnem sorodstvu je pokazalo, da je le del kromosoma ohranjenega med višjimi sesalci in vrečarji (zadnji so se od višjih sesalcev »odcepili« 180 milijonov let nazaj). Daljša ročica in osrednja regija X kromosoma je ekvivalentna X kromosomu vrečarjev, kar pomeni da je ta del star vsaj 180 milijonov let. Ta regija je znana tudi kot ohranjena regija X kromosoma – XCR. Geni na kratki ročici pa so avtosomni pri vrečarjih, kar pomeni da se je ta regija dodala na spolne kromosome nekje od 130 do 80 milijonov let nazaj. Ta regija se imenuje dodana regija – XAR. Večino s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo in več kopijami imamo ljudje in miši enake, medtem ko je bila večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljena neodvisno pri teh vrstah sesalcev.<br /> <br /> Leta 2012 je bila objavljena analiza izražanja genov na kromosomu X v 6 različnih somatskih tkivih miši na podlagi spolov. Rezultati kažejo, da je X kromosom miši obogaten z geni, ki so pri samicah drugače izraženi, osiromašen pa z geni, ki so drugače izraženi pri samcih. Iz tega sklepamo, da se feminizacija, prav tako kot tudi de-maskulinizacija X kromosoma pojavi ob pogojih genskega izražanja v ne-razmnoževalnih tkivih. Pobeg X inaktivaciji je eden izmed glavnih mehanizmov, ki naj bi bili odgovorni za nadzor izražanja genov, ki so pri ženskah drugače izraženi. Pobeg je bil potrjen v primeru Tmem29, v katerem je bila uporabljena RNA-FISH analiza. Prav tako so odkrili, da že znani pobegli geni le delno obrazložijo preveliko zastopanje s kromosomom X povezanih genov, ki so pri samicah drugače izraženi, predvsem za tkivno-specifične gene.<br /> <br /> Analiza starosti genov je pokazala, da so evolucijsko stari geni, ki so povezani s kromosomom X, pogosteje geni, ki se drugače izražajo pri samicah, kot pa mlajši geni. Kot zaključek analize pa je podano, da imajo njihovi rezultati vpliv na razumevanje regulacije in evolucije genov kromosoma X sesalcev.<br /> <br /> === Način zvišanja ravni X izražanja ===<br /> Do sedaj sta bila opisana dva mehanizma zvišanja kromosoma X: s histon-acetiltransferaza KAT8 posredovan mehanizem za izboljšano iniciacijo transkripcije in mehanizem, ki poviša razpolovni čas RNA. Nekateri geni so bolj občutljivi na regulacijo KAT8, nekateri pa na regulacijo stabilnosti RNA. Geni, ki so povezani v mreže in velike proteinske komplekse so občutljivi za dozo.<br /> <br /> === XCI status ===<br /> S kromosomom X povezani geni se ali izognejo ali pa doživijo XCI do različne stopnje. Geni, ki se izognejo XCI, so definirani kot tisti, ki kažejo več kot 10 % izražanja iz neaktivnega X alela v primerjavi z aktivnim. Pobegli geni se lahko izražajo izključno iz neaktivnega kromosoma X, na primer X inaktiven specifičen transkript (XIST). Nekateri pobegli geni so pripadniki X-Y genskega para s paralogom na Y kromosomu, ki ima lahko isto funkcijo kot X paralog. Drugi pobegli geni so svoj Y paralog izgubili ali pa se je ta razvil ločeno, večinoma za testise specifično funkcijo. <br /> <br /> == Geni značilni za samce ==<br /> <br /> Kopičenje genov na X kromosomu sesalcev, ki so koristni za samce, razloži veliko teorij, vključno s spolnim antagonizmom (to je, evolucija alelov, ki so koristni enemu spolu in škodljivi drugemu), X hemizigotnostjo pri moških in X prenosom, ki je drugačen pri ženskah (to je, dvojen prenašalni čas pri ženskah glede na moške). Kromosom X je obogaten s kodirajočimi geni za proteine in miRNA, ki se izražajo v testisih. Večina s kromosomom X povezanih genov specifičnih za samce je pretežno ali izključno izražena v testisih v stopnjah pred in po mejozi, kar podpira hipotezo o spolnem antagonizmu. Med tema stopnjama inaktivacija mejoznih spolnih kromosomov (MSCI) utiša s kromosomom X povezane gene – popolno utišanje genov na XY bivalentu v profazi mejoze.<br /> <br /> Poleg genov, ki se izražajo v testisih, obstaja tudi veliko amplikonskih genov, ki predstavljajo 13 % s kromosomom X povezanih genov pri človeku in 17 % pri miših. Po razhodu skupnega prednika človeka in miši, je večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljenih neodvisno pri obeh vrstah. Nasprotno pa je več kot 94 % s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo ohranjenih med temi vrstami.<br /> <br /> Ker imata razvoj zarodne celice in funkcija mod podobne značilnosti pri človeku in miših, so si funkcije amplikonskih s kromosomom X povezanih genov verjetno podobne in se prekrivajo, ne glede na njihov različen izvor. Nasprotno pa so fenotipske razlike v funkciji mod med vrstami lahko delno določene z neodvisno pridobitvijo iz različnih družin genov.<br /> <br /> == Geni značilni za samice ==<br /> <br /> Pri človeku so stara skupina s kromosomom X povezani geni pogosto taki, da so pri samicah drugače izraženi in imajo visoke stopnje izražanja v jajčnikih v primerjavi s kontrolno skupino starih avtosomnih genov.S kromosomom X povezani geni preživijo dvakrat več svojega razvojnega časa pri samicah kot pri samcih. Zato so lahko aleli, ki so dobri za samice privilegirani na X kromosomu, če niso slabi za samce. Geni, ki so dobri za samce in slabi za samice, pa težje preživijo na X kromosomu.Povečano izražanje s kromosomom X povezanih genov je nujno za normalno delovanje jajčnikov. To podpira dejstvo, da posamezniki s Turnerjevim sindromom, ki imajo samo en X kromosom, kažejo na motnje v razvoju jajčnikov.V genski sestavi je X kromosom različen po spolu, vendar v določenih primerih lahko ta različnost favorizira gene, ki koristijo obema spoloma.<br /> <br /> == Geni značilni za možgane ==<br /> <br /> Poleg genov, ki so pomembni za razmnoževanje, je X kromosom sesalcev obogaten tudi z geni povezanimi z nevrološkimi funkcijami. Veliko istih genov, ki se izraža v modih, se izraža tudi v možganih. Ti s kromosomom X povezani geni so pomembni pri razvoju možganov in njihovem delovanju, zato lahko mozaicizem polimorfnih X alelov prispeva h spolnim razlikam pri delovanju možganov - vplivajo na spolno dimorfen razvoj možganov. Lahko imajo vlogo pri spolni diferenciaciji, če so bolj izraženi pri ženskah kot pri moških, zaradi nepopolne X inaktivacije.<br /> <br /> X kromosom sesalcev vsebuje okoli 1800 genov, med katerimi so geni pomembni pri delovanju možganov in pri razmnoževanju zastopani nesorazmerno. Delež teh genov je znatno višji kot pri drugih somatskih tkivih. Da ima X kromosom pomembno vlogo pri razvoju možganov in njihovem delovanju, dokazuje visoka vsebnost genov, katerih mutacija povzroča umsko prizadetost. S kromosomom X povezane oblike umske prizadetosti so 3,5-krat bolj pogoste kot avtosomske oblike. Pri takem prizadetem posamezniku ima skoraj 100 človeških s kromosomom X povezanih genov mutacije. Učinki teh mutacij se razlikujejo pri ženskah, zaradi nenaključne inaktivacije X kromosoma ali pobega pri XCI. Občutljivost moških na mutacije s kromosomom X povezanih genov pa je očiten vir spolnih razlik pri boleznih. Že več kot stoletje je znano da je umska prizadetost bolj pogosta pri moških kot pri ženskah.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> * Deng, X. D., Berletch, J.B., Nguyen, D.K., Disteche, C. M.: X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease, Nat Rev Genet., [online] 6, (10), 2014, 367-378<br /> * Reinius, B., Johansson M. M., Radomska1 K.J., Morrow, E.H., Pandey, G.K, Kanduri, C. , Sandberg, R., Williams, W.R., Jazin, E. : Abundance of female-biased and paucity of male-biased somatically expressed genes on the mouse X-chromosome, Reinius et al. BMC Genomics, [online] 2012, 13-607<br /> * Mueller, J., L., Mahadevaiah, S., K., Park, P., J., Warburton, P., E., Page, D., C., Turner, J., M., A.: The mouse X chromosome is enriched for multicpy testis genes showing postmeiotic expression, Nature Genetics., [online] 6, (40), 2008, 794-799<br /> * Xu, J., Disteche, C., M.: Sex differences in brain expression of X- and Y-linked genes, Brain Research., [online] 1126, 2006, 50-55<br /> * Meller, V., H.: Dosage compensation: making 1x equal 2X, Cell Biology., [online] 10, 2000, 54-59<br /> * Delbridge, M., L., McMillan, D., A., Doherty, R., J., Deakin, J., E., Graves, J., A., G.: Origin and evolution of candidate mental retardation genes on the human X chromosome (MRX), BMC Genomics., [online] 9, (65), 2008, 1-10<br /> * Zheng, K., Yang, F., Wang, P., J.: Regulation of Male Fertility by X-Linked Genes, Journal of andrology., [online] 1, (31), 2010, 79-85<br /> * Arnold, A., P.: Sex chromosomes and brain gender, Nature Reviews, Neuroscience., [online] (5), 2004, 1-8<br /> <br /> [[Category:SEM]][[Category:BMB]]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Zna%C4%8Dilnosti_s_kromosomom_X_povezanih_genov&diff=10423 2015-05-04T19:12:28Z

<p>Tinasimunovic: /* Viri */</p> <hr /> <div>== Uvod == <br /> Geni na kromosomu X sesalcev so pri samcih prisotni v eni kopiji, pri samicah pa v dveh. Živali, ki imajo XX samice in XY ali X0 samce, imajo pri vsakem spolu različne količine genov, ki so povezani s kromosomom X. Regulacija kromosoma X vključuje več mehanizmov, eden od teh pa je tudi inaktivacija X kromosoma (to je, utišanje enega X kromosoma pri samicah sesalcev v somatskih celicah). Inaktivacija kromosoma je naključna, zato so samice finozrnat mozaik celic, ki izražajo alel zapisan na enem od kromosomov. Vsi mehanizmi izenačijo izražanje genov, ki so povezani s kromosomom X, neuspešno izenačenje pa običajno vodi v smrt že v začetku razvoja.<br /> <br /> Zahtevni mehanizmi vodijo v evolucijske in fizične razlike v izražanju genov med vrstami, spoloma, posamezniki, razvojnimi stopnjami, tkivi in tipi celic. X inaktivacija lahko odstrani spolne razlike zaradi izražanja genov povezanih s kromosomom X, ki jih povzročijo razlike v številu kopij gena. Pri nekaterih vrstah pa je v zgodnjem razvoju zakasnjena in nepopolna inaktivacija X kromosoma povzročila razlike v izražanju genov.<br /> <br /> Da bi razumeli regulacijo in funkcijo kromosoma X, moramo najprej definirati gensko sestavo tega kromosoma.<br /> <br /> == Različni tipi s kromosomom X povezanih genov == <br /> <br /> S kromosomom X povezane gene lahko kategoriziramo na podlagi števila kopij gena, zgodovine evolucije, način zvišanja ravni X izražanja in status inaktivacije X kromosoma (XCI).<br /> <br /> === Število kopij ===<br /> S kromosomom X povezani geni se delijo na gene z eno kopijo, z več kopijami (z najmanj dvema kopijama, ki nista prisotni na amplikonski regiji) in amplikonske gene (to so geni, ki so prisotni v segmentnih podvojitvah z več kot 10 kb po dolžini in si delijo več kot 99% enakih nukleotidov). Podobno kot avtosomni geni, tudi s kromosomom X povezani geni z eno kopijo in z več kopijami ne kažejo posebnega vzorca izražanja v testisih. Amplikonski s kromosomom X povezani geni pa se izražajo pretežno pri zarodnih celicah mod.<br /> <br /> === Zgodovina evolucije ===<br /> »Stari« s kromosomom X povezani geni so tisti, ki jih najdemo na ortolognih avtosomih 1 in 4 piščanca, medtem ko so »novi« tisti, ki so bili pridobljeni med evolucijo kromosoma X sesalca. Genska sestava X kromosoma višjih sesalcev je visoko ohranjena. Kartiranje genov na X kromosomu pri sesalcih v daljnem sorodstvu je pokazalo, da je le del kromosoma ohranjenega med višjimi sesalci in vrečarji (zadnji so se od višjih sesalcev »odcepili« 180 milijonov let nazaj). Daljša ročica in osrednja regija X kromosoma je ekvivalentna X kromosomu vrečarjev, kar pomeni da je ta del star vsaj 180 milijonov let. Ta regija je znana tudi kot ohranjena regija X kromosoma – XCR. Geni na kratki ročici pa so avtosomni pri vrečarjih, kar pomeni da se je ta regija dodala na spolne kromosome nekje od 130 do 80 milijonov let nazaj. Ta regija se imenuje dodana regija – XAR. Večino s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo in več kopijami imamo ljudje in miši enake, medtem ko je bila večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljena neodvisno pri teh vrstah sesalcev.<br /> <br /> Leta 2012 je bila objavljena analiza izražanja genov na kromosomu X v 6 različnih somatskih tkivih miši na podlagi spolov. Rezultati kažejo, da je X kromosom miši obogaten z geni, ki so pri samicah drugače izraženi, osiromašen pa z geni, ki so drugače izraženi pri samcih. Iz tega sklepamo, da se feminizacija, prav tako kot tudi de-maskulinizacija X kromosoma pojavi ob pogojih genskega izražanja v ne-razmnoževalnih tkivih. Pobeg X inaktivaciji je eden izmed glavnih mehanizmov, ki naj bi bili odgovorni za nadzor izražanja genov, ki so pri ženskah drugače izraženi. Pobeg je bil potrjen v primeru Tmem29, v katerem je bila uporabljena RNA-FISH analiza. Prav tako so odkrili, da že znani pobegli geni le delno obrazložijo preveliko zastopanje s kromosomom X povezanih genov, ki so pri samicah drugače izraženi, predvsem za tkivno-specifične gene.<br /> <br /> Analiza starosti genov je pokazala, da so evolucijsko stari geni, ki so povezani s kromosomom X, pogosteje geni, ki se drugače izražajo pri samicah, kot pa mlajši geni. Kot zaključek analize pa je podano, da imajo njihovi rezultati vpliv na razumevanje regulacije in evolucije genov kromosoma X sesalcev.<br /> <br /> === Način zvišanja ravni X izražanja ===<br /> Do sedaj sta bila opisana dva mehanizma zvišanja kromosoma X: s histon-acetiltransferaza KAT8 posredovan mehanizem za izboljšano iniciacijo transkripcije in mehanizem, ki poviša razpolovni čas RNA. Nekateri geni so bolj občutljivi na regulacijo KAT8, nekateri pa na regulacijo stabilnosti RNA. Geni, ki so povezani v mreže in velike proteinske komplekse so občutljivi za dozo.<br /> <br /> === XCI status ===<br /> S kromosomom X povezani geni se ali izognejo ali pa doživijo XCI do različne stopnje. Geni, ki se izognejo XCI, so definirani kot tisti, ki kažejo več kot 10 % izražanja iz neaktivnega X alela v primerjavi z aktivnim. Pobegli geni se lahko izražajo izključno iz neaktivnega kromosoma X, na primer X inaktiven specifičen transkript (XIST). Nekateri pobegli geni so pripadniki X-Y genskega para s paralogom na Y kromosomu, ki ima lahko isto funkcijo kot X paralog. Drugi pobegli geni so svoj Y paralog izgubili ali pa se je ta razvil ločeno, večinoma za testise specifično funkcijo. <br /> <br /> == Geni značilni za samce ==<br /> <br /> Kopičenje genov na X kromosomu sesalcev, ki so koristni za samce, razloži veliko teorij, vključno s spolnim antagonizmom (to je, evolucija alelov, ki so koristni enemu spolu in škodljivi drugemu), X hemizigotnostjo pri moških in X prenosom, ki je drugačen pri ženskah (to je, dvojen prenašalni čas pri ženskah glede na moške). Kromosom X je obogaten s kodirajočimi geni za proteine in miRNA, ki se izražajo v testisih. Večina s kromosomom X povezanih genov specifičnih za samce je pretežno ali izključno izražena v testisih v stopnjah pred in po mejozi, kar podpira hipotezo o spolnem antagonizmu. Med tema stopnjama inaktivacija mejoznih spolnih kromosomov (MSCI) utiša s kromosomom X povezane gene – popolno utišanje genov na XY bivalentu v profazi mejoze.<br /> <br /> Poleg genov, ki se izražajo v testisih, obstaja tudi veliko amplikonskih genov, ki predstavljajo 13 % s kromosomom X povezanih genov pri človeku in 17 % pri miših. Po razhodu skupnega prednika človeka in miši, je večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljenih neodvisno pri obeh vrstah. Nasprotno pa je več kot 94 % s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo ohranjenih med temi vrstami.<br /> <br /> Ker imata razvoj zarodne celice in funkcija mod podobne značilnosti pri človeku in miših, so si funkcije amplikonskih s kromosomom X povezanih genov verjetno podobne in se prekrivajo, ne glede na njihov različen izvor. Nasprotno pa so fenotipske razlike v funkciji mod med vrstami lahko delno določene z neodvisno pridobitvijo iz različnih družin genov.<br /> <br /> == Geni značilni za samice ==<br /> <br /> Pri človeku so stara skupina s kromosomom X povezani geni pogosto taki, da so pri samicah drugače izraženi in imajo visoke stopnje izražanja v jajčnikih v primerjavi s kontrolno skupino starih avtosomnih genov.S kromosomom X povezani geni preživijo dvakrat več svojega razvojnega časa pri samicah kot pri samcih. Zato so lahko aleli, ki so dobri za samice privilegirani na X kromosomu, če niso slabi za samce. Geni, ki so dobri za samce in slabi za samice, pa težje preživijo na X kromosomu.Povečano izražanje s kromosomom X povezanih genov je nujno za normalno delovanje jajčnikov. To podpira dejstvo, da posamezniki s Turnerjevim sindromom, ki imajo samo en X kromosom, kažejo na motnje v razvoju jajčnikov.V genski sestavi je X kromosom različen po spolu, vendar v določenih primerih lahko ta različnost favorizira gene, ki koristijo obema spoloma.<br /> <br /> == Geni značilni za možgane ==<br /> <br /> Poleg genov, ki so pomembni za razmnoževanje, je X kromosom sesalcev obogaten tudi z geni povezanimi z nevrološkimi funkcijami. Veliko istih genov, ki se izraža v modih, se izraža tudi v možganih. Ti s kromosomom X povezani geni so pomembni pri razvoju možganov in njihovem delovanju, zato lahko mozaicizem polimorfnih X alelov prispeva h spolnim razlikam pri delovanju možganov - vplivajo na spolno dimorfen razvoj možganov. Lahko imajo vlogo pri spolni diferenciaciji, če so bolj izraženi pri ženskah kot pri moških, zaradi nepopolne X inaktivacije.<br /> <br /> X kromosom sesalcev vsebuje okoli 1800 genov, med katerimi so geni pomembni pri delovanju možganov in pri razmnoževanju zastopani nesorazmerno. Delež teh genov je znatno višji kot pri drugih somatskih tkivih. Da ima X kromosom pomembno vlogo pri razvoju možganov in njihovem delovanju, dokazuje visoka vsebnost genov, katerih mutacija povzroča umsko prizadetost. S kromosomom X povezane oblike umske prizadetosti so 3,5-krat bolj pogoste kot avtosomske oblike. Pri takem prizadetem posamezniku ima skoraj 100 človeških s kromosomom X povezanih genov mutacije. Učinki teh mutacij se razlikujejo pri ženskah, zaradi nenaključne inaktivacije X kromosoma ali pobega pri XCI. Občutljivost moških na mutacije s kromosomom X povezanih genov pa je očiten vir spolnih razlik pri boleznih. Že več kot stoletje je znano da je umska prizadetost bolj pogosta pri moških kot pri ženskah.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> * Deng, X. D., Berletch, J.B., Nguyen, D.K., Disteche, C. M.: X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease, Nat Rev Genet., [online] 6, (10), 2014, 367-378<br /> * Reinius, B., Johansson M. M., Radomska1 K.J., Morrow, E.H., Pandey, G.K, Kanduri, C. , Sandberg, R., Williams, W.R., Jazin, E. : Abundance of female-biased and paucity of male-biased somatically expressed genes on the mouse X-chromosome, Reinius et al. BMC Genomics, [online] 2012, 13-607<br /> * Mueller, J., L., Mahadevaiah, S., K., Park, P., J., Warburton, P., E., Page, D., C., Turner, J., M., A.: The mouse X chromosome is enriched for multicpy testis genes showing postmeiotic expression, Nature Genetics., [online] 6, (40), 2008, 794-799<br /> * Xu, J., Disteche, C., M.: Sex differences in brain expression of X- and Y-linked genes, Brain Research., [online] 1126, 2006, 50-55<br /> * Meller, V., H.: Dosage compensation: making 1x equal 2X, Cell Biology., [online] 10, 2000, 54-59<br /> * Delbridge, M., L., McMillan, D., A., Doherty, R., J., Deakin, J., E., Graves, J., A., G.: Origin and evolution of candidate mental retardation genes on the human X chromosome (MRX), BMC Genomics., [online] 9, (65), 2008, 1-10<br /> * Zheng, K., Yang, F., Wang, P., J.: Regulation of Male Fertility by X-Linked Genes, Journal of andrology., [online] 1, (31), 2010, 79-85<br /> * Arnold, A., P.: Sex chromosomes and brain gender, Nature Reviews, Neuroscience., [online] (5), 2004, 1-8<br /> <br /> [[Category:SEM]][[Category:BMB]]</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Zna%C4%8Dilnosti_s_kromosomom_X_povezanih_genov&diff=10422 2015-05-04T19:12:00Z

<p>Tinasimunovic: /* Način zvišanja ravni X izražanja */</p> <hr /> <div>== Uvod == <br /> Geni na kromosomu X sesalcev so pri samcih prisotni v eni kopiji, pri samicah pa v dveh. Živali, ki imajo XX samice in XY ali X0 samce, imajo pri vsakem spolu različne količine genov, ki so povezani s kromosomom X. Regulacija kromosoma X vključuje več mehanizmov, eden od teh pa je tudi inaktivacija X kromosoma (to je, utišanje enega X kromosoma pri samicah sesalcev v somatskih celicah). Inaktivacija kromosoma je naključna, zato so samice finozrnat mozaik celic, ki izražajo alel zapisan na enem od kromosomov. Vsi mehanizmi izenačijo izražanje genov, ki so povezani s kromosomom X, neuspešno izenačenje pa običajno vodi v smrt že v začetku razvoja.<br /> <br /> Zahtevni mehanizmi vodijo v evolucijske in fizične razlike v izražanju genov med vrstami, spoloma, posamezniki, razvojnimi stopnjami, tkivi in tipi celic. X inaktivacija lahko odstrani spolne razlike zaradi izražanja genov povezanih s kromosomom X, ki jih povzročijo razlike v številu kopij gena. Pri nekaterih vrstah pa je v zgodnjem razvoju zakasnjena in nepopolna inaktivacija X kromosoma povzročila razlike v izražanju genov.<br /> <br /> Da bi razumeli regulacijo in funkcijo kromosoma X, moramo najprej definirati gensko sestavo tega kromosoma.<br /> <br /> == Različni tipi s kromosomom X povezanih genov == <br /> <br /> S kromosomom X povezane gene lahko kategoriziramo na podlagi števila kopij gena, zgodovine evolucije, način zvišanja ravni X izražanja in status inaktivacije X kromosoma (XCI).<br /> <br /> === Število kopij ===<br /> S kromosomom X povezani geni se delijo na gene z eno kopijo, z več kopijami (z najmanj dvema kopijama, ki nista prisotni na amplikonski regiji) in amplikonske gene (to so geni, ki so prisotni v segmentnih podvojitvah z več kot 10 kb po dolžini in si delijo več kot 99% enakih nukleotidov). Podobno kot avtosomni geni, tudi s kromosomom X povezani geni z eno kopijo in z več kopijami ne kažejo posebnega vzorca izražanja v testisih. Amplikonski s kromosomom X povezani geni pa se izražajo pretežno pri zarodnih celicah mod.<br /> <br /> === Zgodovina evolucije ===<br /> »Stari« s kromosomom X povezani geni so tisti, ki jih najdemo na ortolognih avtosomih 1 in 4 piščanca, medtem ko so »novi« tisti, ki so bili pridobljeni med evolucijo kromosoma X sesalca. Genska sestava X kromosoma višjih sesalcev je visoko ohranjena. Kartiranje genov na X kromosomu pri sesalcih v daljnem sorodstvu je pokazalo, da je le del kromosoma ohranjenega med višjimi sesalci in vrečarji (zadnji so se od višjih sesalcev »odcepili« 180 milijonov let nazaj). Daljša ročica in osrednja regija X kromosoma je ekvivalentna X kromosomu vrečarjev, kar pomeni da je ta del star vsaj 180 milijonov let. Ta regija je znana tudi kot ohranjena regija X kromosoma – XCR. Geni na kratki ročici pa so avtosomni pri vrečarjih, kar pomeni da se je ta regija dodala na spolne kromosome nekje od 130 do 80 milijonov let nazaj. Ta regija se imenuje dodana regija – XAR. Večino s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo in več kopijami imamo ljudje in miši enake, medtem ko je bila večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljena neodvisno pri teh vrstah sesalcev.<br /> <br /> Leta 2012 je bila objavljena analiza izražanja genov na kromosomu X v 6 različnih somatskih tkivih miši na podlagi spolov. Rezultati kažejo, da je X kromosom miši obogaten z geni, ki so pri samicah drugače izraženi, osiromašen pa z geni, ki so drugače izraženi pri samcih. Iz tega sklepamo, da se feminizacija, prav tako kot tudi de-maskulinizacija X kromosoma pojavi ob pogojih genskega izražanja v ne-razmnoževalnih tkivih. Pobeg X inaktivaciji je eden izmed glavnih mehanizmov, ki naj bi bili odgovorni za nadzor izražanja genov, ki so pri ženskah drugače izraženi. Pobeg je bil potrjen v primeru Tmem29, v katerem je bila uporabljena RNA-FISH analiza. Prav tako so odkrili, da že znani pobegli geni le delno obrazložijo preveliko zastopanje s kromosomom X povezanih genov, ki so pri samicah drugače izraženi, predvsem za tkivno-specifične gene.<br /> <br /> Analiza starosti genov je pokazala, da so evolucijsko stari geni, ki so povezani s kromosomom X, pogosteje geni, ki se drugače izražajo pri samicah, kot pa mlajši geni. Kot zaključek analize pa je podano, da imajo njihovi rezultati vpliv na razumevanje regulacije in evolucije genov kromosoma X sesalcev.<br /> <br /> === Način zvišanja ravni X izražanja ===<br /> Do sedaj sta bila opisana dva mehanizma zvišanja kromosoma X: s histon-acetiltransferaza KAT8 posredovan mehanizem za izboljšano iniciacijo transkripcije in mehanizem, ki poviša razpolovni čas RNA. Nekateri geni so bolj občutljivi na regulacijo KAT8, nekateri pa na regulacijo stabilnosti RNA. Geni, ki so povezani v mreže in velike proteinske komplekse so občutljivi za dozo.<br /> <br /> === XCI status ===<br /> S kromosomom X povezani geni se ali izognejo ali pa doživijo XCI do različne stopnje. Geni, ki se izognejo XCI, so definirani kot tisti, ki kažejo več kot 10 % izražanja iz neaktivnega X alela v primerjavi z aktivnim. Pobegli geni se lahko izražajo izključno iz neaktivnega kromosoma X, na primer X inaktiven specifičen transkript (XIST). Nekateri pobegli geni so pripadniki X-Y genskega para s paralogom na Y kromosomu, ki ima lahko isto funkcijo kot X paralog. Drugi pobegli geni so svoj Y paralog izgubili ali pa se je ta razvil ločeno, večinoma za testise specifično funkcijo. <br /> <br /> == Geni značilni za samce ==<br /> <br /> Kopičenje genov na X kromosomu sesalcev, ki so koristni za samce, razloži veliko teorij, vključno s spolnim antagonizmom (to je, evolucija alelov, ki so koristni enemu spolu in škodljivi drugemu), X hemizigotnostjo pri moških in X prenosom, ki je drugačen pri ženskah (to je, dvojen prenašalni čas pri ženskah glede na moške). Kromosom X je obogaten s kodirajočimi geni za proteine in miRNA, ki se izražajo v testisih. Večina s kromosomom X povezanih genov specifičnih za samce je pretežno ali izključno izražena v testisih v stopnjah pred in po mejozi, kar podpira hipotezo o spolnem antagonizmu. Med tema stopnjama inaktivacija mejoznih spolnih kromosomov (MSCI) utiša s kromosomom X povezane gene – popolno utišanje genov na XY bivalentu v profazi mejoze.<br /> <br /> Poleg genov, ki se izražajo v testisih, obstaja tudi veliko amplikonskih genov, ki predstavljajo 13 % s kromosomom X povezanih genov pri človeku in 17 % pri miših. Po razhodu skupnega prednika človeka in miši, je večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljenih neodvisno pri obeh vrstah. Nasprotno pa je več kot 94 % s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo ohranjenih med temi vrstami.<br /> <br /> Ker imata razvoj zarodne celice in funkcija mod podobne značilnosti pri človeku in miših, so si funkcije amplikonskih s kromosomom X povezanih genov verjetno podobne in se prekrivajo, ne glede na njihov različen izvor. Nasprotno pa so fenotipske razlike v funkciji mod med vrstami lahko delno določene z neodvisno pridobitvijo iz različnih družin genov.<br /> <br /> == Geni značilni za samice ==<br /> <br /> Pri človeku so stara skupina s kromosomom X povezani geni pogosto taki, da so pri samicah drugače izraženi in imajo visoke stopnje izražanja v jajčnikih v primerjavi s kontrolno skupino starih avtosomnih genov.S kromosomom X povezani geni preživijo dvakrat več svojega razvojnega časa pri samicah kot pri samcih. Zato so lahko aleli, ki so dobri za samice privilegirani na X kromosomu, če niso slabi za samce. Geni, ki so dobri za samce in slabi za samice, pa težje preživijo na X kromosomu.Povečano izražanje s kromosomom X povezanih genov je nujno za normalno delovanje jajčnikov. To podpira dejstvo, da posamezniki s Turnerjevim sindromom, ki imajo samo en X kromosom, kažejo na motnje v razvoju jajčnikov.V genski sestavi je X kromosom različen po spolu, vendar v določenih primerih lahko ta različnost favorizira gene, ki koristijo obema spoloma.<br /> <br /> == Geni značilni za možgane ==<br /> <br /> Poleg genov, ki so pomembni za razmnoževanje, je X kromosom sesalcev obogaten tudi z geni povezanimi z nevrološkimi funkcijami. Veliko istih genov, ki se izraža v modih, se izraža tudi v možganih. Ti s kromosomom X povezani geni so pomembni pri razvoju možganov in njihovem delovanju, zato lahko mozaicizem polimorfnih X alelov prispeva h spolnim razlikam pri delovanju možganov - vplivajo na spolno dimorfen razvoj možganov. Lahko imajo vlogo pri spolni diferenciaciji, če so bolj izraženi pri ženskah kot pri moških, zaradi nepopolne X inaktivacije.<br /> <br /> X kromosom sesalcev vsebuje okoli 1800 genov, med katerimi so geni pomembni pri delovanju možganov in pri razmnoževanju zastopani nesorazmerno. Delež teh genov je znatno višji kot pri drugih somatskih tkivih. Da ima X kromosom pomembno vlogo pri razvoju možganov in njihovem delovanju, dokazuje visoka vsebnost genov, katerih mutacija povzroča umsko prizadetost. S kromosomom X povezane oblike umske prizadetosti so 3,5-krat bolj pogoste kot avtosomske oblike. Pri takem prizadetem posamezniku ima skoraj 100 človeških s kromosomom X povezanih genov mutacije. Učinki teh mutacij se razlikujejo pri ženskah, zaradi nenaključne inaktivacije X kromosoma ali pobega pri XCI. Občutljivost moških na mutacije s kromosomom X povezanih genov pa je očiten vir spolnih razlik pri boleznih. Že več kot stoletje je znano da je umska prizadetost bolj pogosta pri moških kot pri ženskah.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> * Deng, X. D., Berletch, J.B., Nguyen, D.K., Disteche, C. M.: X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease, Nat Rev Genet., [online] 6, (10), 2014, 367-378<br /> * Reinius, B., Johansson M. M., Radomska1 K.J., Morrow, E.H., Pandey, G.K, Kanduri, C. , Sandberg, R., Williams, W.R., Jazin, E. : Abundance of female-biased and paucity of male-biased somatically expressed genes on the mouse X-chromosome, Reinius et al. BMC Genomics, [online] 2012, 13-607<br /> * Mueller, J., L., Mahadevaiah, S., K., Park, P., J., Warburton, P., E., Page, D., C., Turner, J., M., A.: The mouse X chromosome is enriched for multicpy testis genes showing postmeiotic expression, Nature Genetics., [online] 6, (40), 2008, 794-799<br /> * Xu, J., Disteche, C., M.: Sex differences in brain expression of X- and Y-linked genes, Brain Research., [online] 1126, 2006, 50-55<br /> * Meller, V., H.: Dosage compensation: making 1x equal 2X, Cell Biology., [online] 10, 2000, 54-59<br /> * Delbridge, M., L., McMillan, D., A., Doherty, R., J., Deakin, J., E., Graves, J., A., G.: Origin and evolution of candidate mental retardation genes on the human X chromosome (MRX), BMC Genomics., [online] 9, (65), 2008, 1-10<br /> * Zheng, K., Yang, F., Wang, P., J.: Regulation of Male Fertility by X-Linked Genes, Journal of andrology., [online] 1, (31), 2010, 79-85<br /> * Arnold, A., P.: Sex chromosomes and brain gender, Nature Reviews, Neuroscience., [online] (5), 2004, 1-8</div>

Tinasimunovic https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Zna%C4%8Dilnosti_s_kromosomom_X_povezanih_genov&diff=10421 2015-05-04T19:05:12Z

<p>Tinasimunovic: New page: == Uvod == Geni na kromosomu X sesalcev so pri samcih prisotni v eni kopiji, pri samicah pa v dveh. Živali, ki imajo XX samice in XY ali X0 samce, imajo pri vsakem spolu različne koli...</p> <hr /> <div>== Uvod == <br /> Geni na kromosomu X sesalcev so pri samcih prisotni v eni kopiji, pri samicah pa v dveh. Živali, ki imajo XX samice in XY ali X0 samce, imajo pri vsakem spolu različne količine genov, ki so povezani s kromosomom X. Regulacija kromosoma X vključuje več mehanizmov, eden od teh pa je tudi inaktivacija X kromosoma (to je, utišanje enega X kromosoma pri samicah sesalcev v somatskih celicah). Inaktivacija kromosoma je naključna, zato so samice finozrnat mozaik celic, ki izražajo alel zapisan na enem od kromosomov. Vsi mehanizmi izenačijo izražanje genov, ki so povezani s kromosomom X, neuspešno izenačenje pa običajno vodi v smrt že v začetku razvoja.<br /> <br /> Zahtevni mehanizmi vodijo v evolucijske in fizične razlike v izražanju genov med vrstami, spoloma, posamezniki, razvojnimi stopnjami, tkivi in tipi celic. X inaktivacija lahko odstrani spolne razlike zaradi izražanja genov povezanih s kromosomom X, ki jih povzročijo razlike v številu kopij gena. Pri nekaterih vrstah pa je v zgodnjem razvoju zakasnjena in nepopolna inaktivacija X kromosoma povzročila razlike v izražanju genov.<br /> <br /> Da bi razumeli regulacijo in funkcijo kromosoma X, moramo najprej definirati gensko sestavo tega kromosoma.<br /> <br /> == Različni tipi s kromosomom X povezanih genov == <br /> <br /> S kromosomom X povezane gene lahko kategoriziramo na podlagi števila kopij gena, zgodovine evolucije, način zvišanja ravni X izražanja in status inaktivacije X kromosoma (XCI).<br /> <br /> === Število kopij ===<br /> S kromosomom X povezani geni se delijo na gene z eno kopijo, z več kopijami (z najmanj dvema kopijama, ki nista prisotni na amplikonski regiji) in amplikonske gene (to so geni, ki so prisotni v segmentnih podvojitvah z več kot 10 kb po dolžini in si delijo več kot 99% enakih nukleotidov). Podobno kot avtosomni geni, tudi s kromosomom X povezani geni z eno kopijo in z več kopijami ne kažejo posebnega vzorca izražanja v testisih. Amplikonski s kromosomom X povezani geni pa se izražajo pretežno pri zarodnih celicah mod.<br /> <br /> === Zgodovina evolucije ===<br /> »Stari« s kromosomom X povezani geni so tisti, ki jih najdemo na ortolognih avtosomih 1 in 4 piščanca, medtem ko so »novi« tisti, ki so bili pridobljeni med evolucijo kromosoma X sesalca. Genska sestava X kromosoma višjih sesalcev je visoko ohranjena. Kartiranje genov na X kromosomu pri sesalcih v daljnem sorodstvu je pokazalo, da je le del kromosoma ohranjenega med višjimi sesalci in vrečarji (zadnji so se od višjih sesalcev »odcepili« 180 milijonov let nazaj). Daljša ročica in osrednja regija X kromosoma je ekvivalentna X kromosomu vrečarjev, kar pomeni da je ta del star vsaj 180 milijonov let. Ta regija je znana tudi kot ohranjena regija X kromosoma – XCR. Geni na kratki ročici pa so avtosomni pri vrečarjih, kar pomeni da se je ta regija dodala na spolne kromosome nekje od 130 do 80 milijonov let nazaj. Ta regija se imenuje dodana regija – XAR. Večino s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo in več kopijami imamo ljudje in miši enake, medtem ko je bila večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljena neodvisno pri teh vrstah sesalcev.<br /> <br /> Leta 2012 je bila objavljena analiza izražanja genov na kromosomu X v 6 različnih somatskih tkivih miši na podlagi spolov. Rezultati kažejo, da je X kromosom miši obogaten z geni, ki so pri samicah drugače izraženi, osiromašen pa z geni, ki so drugače izraženi pri samcih. Iz tega sklepamo, da se feminizacija, prav tako kot tudi de-maskulinizacija X kromosoma pojavi ob pogojih genskega izražanja v ne-razmnoževalnih tkivih. Pobeg X inaktivaciji je eden izmed glavnih mehanizmov, ki naj bi bili odgovorni za nadzor izražanja genov, ki so pri ženskah drugače izraženi. Pobeg je bil potrjen v primeru Tmem29, v katerem je bila uporabljena RNA-FISH analiza. Prav tako so odkrili, da že znani pobegli geni le delno obrazložijo preveliko zastopanje s kromosomom X povezanih genov, ki so pri samicah drugače izraženi, predvsem za tkivno-specifične gene.<br /> <br /> Analiza starosti genov je pokazala, da so evolucijsko stari geni, ki so povezani s kromosomom X, pogosteje geni, ki se drugače izražajo pri samicah, kot pa mlajši geni. Kot zaključek analize pa je podano, da imajo njihovi rezultati vpliv na razumevanje regulacije in evolucije genov kromosoma X sesalcev.<br /> <br /> === Način zvišanja ravni X izražanja ===<br /> Do sedaj sta bila opisana dva mehanizma zvišanja kromosoma X: histon-acetiltransferaza s KAT8 posredovan mehanizem za izboljšano iniciacijo transkripcije in mehanizem, ki poviša razpolovni čas RNA. Nekateri geni so bolj občutljivi na regulacijo s KAT8, nekateri pa na regulacijo stabilnosti RNA. Geni, ki so povezani v mreže in velike proteinske komplekse so občutljivi za dozo.<br /> <br /> === XCI status ===<br /> S kromosomom X povezani geni se ali izognejo ali pa doživijo XCI do različne stopnje. Geni, ki se izognejo XCI, so definirani kot tisti, ki kažejo več kot 10 % izražanja iz neaktivnega X alela v primerjavi z aktivnim. Pobegli geni se lahko izražajo izključno iz neaktivnega kromosoma X, na primer X inaktiven specifičen transkript (XIST). Nekateri pobegli geni so pripadniki X-Y genskega para s paralogom na Y kromosomu, ki ima lahko isto funkcijo kot X paralog. Drugi pobegli geni so svoj Y paralog izgubili ali pa se je ta razvil ločeno, večinoma za testise specifično funkcijo. <br /> <br /> == Geni značilni za samce ==<br /> <br /> Kopičenje genov na X kromosomu sesalcev, ki so koristni za samce, razloži veliko teorij, vključno s spolnim antagonizmom (to je, evolucija alelov, ki so koristni enemu spolu in škodljivi drugemu), X hemizigotnostjo pri moških in X prenosom, ki je drugačen pri ženskah (to je, dvojen prenašalni čas pri ženskah glede na moške). Kromosom X je obogaten s kodirajočimi geni za proteine in miRNA, ki se izražajo v testisih. Večina s kromosomom X povezanih genov specifičnih za samce je pretežno ali izključno izražena v testisih v stopnjah pred in po mejozi, kar podpira hipotezo o spolnem antagonizmu. Med tema stopnjama inaktivacija mejoznih spolnih kromosomov (MSCI) utiša s kromosomom X povezane gene – popolno utišanje genov na XY bivalentu v profazi mejoze.<br /> <br /> Poleg genov, ki se izražajo v testisih, obstaja tudi veliko amplikonskih genov, ki predstavljajo 13 % s kromosomom X povezanih genov pri človeku in 17 % pri miših. Po razhodu skupnega prednika človeka in miši, je večina s kromosomom X povezanih amplikonskih genov pridobljenih neodvisno pri obeh vrstah. Nasprotno pa je več kot 94 % s kromosomom X povezanih genov z eno kopijo ohranjenih med temi vrstami.<br /> <br /> Ker imata razvoj zarodne celice in funkcija mod podobne značilnosti pri človeku in miših, so si funkcije amplikonskih s kromosomom X povezanih genov verjetno podobne in se prekrivajo, ne glede na njihov različen izvor. Nasprotno pa so fenotipske razlike v funkciji mod med vrstami lahko delno določene z neodvisno pridobitvijo iz različnih družin genov.<br /> <br /> == Geni značilni za samice ==<br /> <br /> Pri človeku so stara skupina s kromosomom X povezani geni pogosto taki, da so pri samicah drugače izraženi in imajo visoke stopnje izražanja v jajčnikih v primerjavi s kontrolno skupino starih avtosomnih genov.S kromosomom X povezani geni preživijo dvakrat več svojega razvojnega časa pri samicah kot pri samcih. Zato so lahko aleli, ki so dobri za samice privilegirani na X kromosomu, če niso slabi za samce. Geni, ki so dobri za samce in slabi za samice, pa težje preživijo na X kromosomu.Povečano izražanje s kromosomom X povezanih genov je nujno za normalno delovanje jajčnikov. To podpira dejstvo, da posamezniki s Turnerjevim sindromom, ki imajo samo en X kromosom, kažejo na motnje v razvoju jajčnikov.V genski sestavi je X kromosom različen po spolu, vendar v določenih primerih lahko ta različnost favorizira gene, ki koristijo obema spoloma.<br /> <br /> == Geni značilni za možgane ==<br /> <br /> Poleg genov, ki so pomembni za razmnoževanje, je X kromosom sesalcev obogaten tudi z geni povezanimi z nevrološkimi funkcijami. Veliko istih genov, ki se izraža v modih, se izraža tudi v možganih. Ti s kromosomom X povezani geni so pomembni pri razvoju možganov in njihovem delovanju, zato lahko mozaicizem polimorfnih X alelov prispeva h spolnim razlikam pri delovanju možganov - vplivajo na spolno dimorfen razvoj možganov. Lahko imajo vlogo pri spolni diferenciaciji, če so bolj izraženi pri ženskah kot pri moških, zaradi nepopolne X inaktivacije.<br /> <br /> X kromosom sesalcev vsebuje okoli 1800 genov, med katerimi so geni pomembni pri delovanju možganov in pri razmnoževanju zastopani nesorazmerno. Delež teh genov je znatno višji kot pri drugih somatskih tkivih. Da ima X kromosom pomembno vlogo pri razvoju možganov in njihovem delovanju, dokazuje visoka vsebnost genov, katerih mutacija povzroča umsko prizadetost. S kromosomom X povezane oblike umske prizadetosti so 3,5-krat bolj pogoste kot avtosomske oblike. Pri takem prizadetem posamezniku ima skoraj 100 človeških s kromosomom X povezanih genov mutacije. Učinki teh mutacij se razlikujejo pri ženskah, zaradi nenaključne inaktivacije X kromosoma ali pobega pri XCI. Občutljivost moških na mutacije s kromosomom X povezanih genov pa je očiten vir spolnih razlik pri boleznih. Že več kot stoletje je znano da je umska prizadetost bolj pogosta pri moških kot pri ženskah.<br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> * Deng, X. D., Berletch, J.B., Nguyen, D.K., Disteche, C. M.: X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease, Nat Rev Genet., [online] 6, (10), 2014, 367-378<br /> * Reinius, B., Johansson M. M., Radomska1 K.J., Morrow, E.H., Pandey, G.K, Kanduri, C. , Sandberg, R., Williams, W.R., Jazin, E. : Abundance of female-biased and paucity of male-biased somatically expressed genes on the mouse X-chromosome, Reinius et al. BMC Genomics, [online] 2012, 13-607<br /> * Mueller, J., L., Mahadevaiah, S., K., Park, P., J., Warburton, P., E., Page, D., C., Turner, J., M., A.: The mouse X chromosome is enriched for multicpy testis genes showing postmeiotic expression, Nature Genetics., [online] 6, (40), 2008, 794-799<br /> * Xu, J., Disteche, C., M.: Sex differences in brain expression of X- and Y-linked genes, Brain Research., [online] 1126, 2006, 50-55<br /> * Meller, V., H.: Dosage compensation: making 1x equal 2X, Cell Biology., [online] 10, 2000, 54-59<br /> * Delbridge, M., L., McMillan, D., A., Doherty, R., J., Deakin, J., E., Graves, J., A., G.: Origin and evolution of candidate mental retardation genes on the human X chromosome (MRX), BMC Genomics., [online] 9, (65), 2008, 1-10<br /> * Zheng, K., Yang, F., Wang, P., J.: Regulation of Male Fertility by X-Linked Genes, Journal of andrology., [online] 1, (31), 2010, 79-85<br /> * Arnold, A., P.: Sex chromosomes and brain gender, Nature Reviews, Neuroscience., [online] (5), 2004, 1-8</div>

Tinasimunovic