Wiki FKKT - User contributions [en]

Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah

2015-04-21T17:05:36Z

Tjaša Blatnik:

'''UVOD'''

Rekombinantna monoklonska protitelesa, pridobljena iz celičnih linij CHO, predstavljajo najhitreje rastoči razred bioterapevtikov, zato so se v tej raziskavi usmerili na izboljšanje zaporedja signalnih peptidov humanih imunoglobulinskih težkih in lahkih verig protiteles, ki doprinese k večji produkciji in sekreciji protiteles. Izbrane signalne peptide so preizkusili na petih najbolje prodajanih terapevtikih, in sicer Humira (adalimumab), Remicade (infliximab), Avastin (bevacizumab), Rituxan (rituximab) in Hepceptin (transtuzumab).
Ključen korak v proteinski sekreciji je translokacija iz citosola v ER, ki je uravnavana s signalnim peptidom, ki vsebuje med 5 in 30 aminokislin in se nahaja na N-terminalnem koncu nastajajočega proteina. Študije so pokazale, da so omenjeni signalni peptidi zelo heterogeni in celo izmenljivi med različnimi vrstami organizmov. Svojo pomembnost pa so dokazali tudi pri proteinski sekreciji, in sicer učinkovitost je močno odvisna od njihovega zaporedja. Tako kot mnogi drugi proteini, se tudi protitelesa izločajo iz celic po kotranslacijski translokacijski poti. N-terminalno zaporedje nastajajočega proteina prepozna SRP (signal recognition particle), ki SRP-RNC kompleks proteina in ribosoma dostavi do SRP receptorjev na membrani ER. V lumen ER vstopa nastajajoča polipeptidna veriga, SPP (signal peptide peptidase) pa delo dokonča in odcepi stran signalni peptid. To cepljenje vpliva na samo učinkovitost izločanja rekombinantnih protiteles iz sesalskih celičnih sistemov, zato so želeli v tej študiji na podlagi boljših signalnih zaporedij izboljšati količino protiteles.

'''MATERIALI IN METODE'''

Z ustvarjanjem podatkovne baze humanih signalnih peptidov za težke in lahke kappa verige so le-te lahko pregledno uvrstili in jih razvrstili glede na podobnosti v sekvenci. Nadaljevali so z generiranjem konstruktov za težke in lahke kappa verige in iskanjem variabilnih regij izbranih verig iz javno dostopnih podatkovnih baz. Analizirali so signalne peptide iz 172 težkih verig IgG, IgM, IgD, IgA in IgE, ter iz 62 lahkih verig. Identificirali so najboljših osem signalnih peptidov za težke verige (H1 do H8) ter dva za lahke (L1 in L2) in izvedli njihovo fuzijo s konstantnimi regijami IgG1 z metodo prekrivajočega se PCR. Vsako težko in lahko verigo terapevtskih protiteles so fuzirali z vsemi izbranimi signalnimi peptidi za obe verigi. Izvedli so transfekcijo na CHO-K1 celicah z uporabo FuGENE 6 reagenta. Sledila je analiza uspešnosti transfekcije z imunoadsorpcijskim testom ELISA. Z uporabo kita za mestno specifične mutacije so ustvarili mutante signalnega peptida H7 za Avastin. Protitelesa so bila očiščena s FPLC, z masnim spektrometrom pa so preverjali dejansko vgradnjo signalnih peptidov v variabilne dele lahkih in težkih verig.

'''REZULTATI'''

Večina signalnih peptidov težkih verig vsebuje 19 aminokislin, ki jih lahko razvrstimo med tri domene, vse signalne peptide obravnavanih lahkih verig pa sestavlja 22 aminokislin. S šestnajstimi narejenimi kombinacijami med lahkimi in težkimi verigami so testirali njihov vpliv na izločanje protiteles in ugotovili, da najboljše rezultate v smislu najvišje sekrecije prispeva signalni peptid H7 pri terapevtikih Avastin, Remicade, Rituxan in Humira z obema možnima kombinacijama signalih peptidov lahkih verig (L1 in L2). Za najboljše kombinacije signalnih peptidov za obe verigi so se izkazali pari H5/L1, H7/L1, H7/L2, H7/L2 in H7/L1. Največje izločanje protiteles iz celic se je pokazalo v naslednjem vrstnem redu: Herceptin > Rituxan > Avastin > Humira > Remicade. V primeru Rituxana so dokazali znantno boljše sekrecijske sposobnosti z optimiziranimi signalnimi peptidi (H7/L2) v primerjavi z nativnimi.

'''ZAKLJUČEK'''

V raziskavi so uspeli optimizirati pare signalnih peptidov za variabilne regije obeh verig petih najbolje prodajanih terapevtskih mAb in s tem povečati njihovo sekrecijo iz celic. Njihova platforma za odkrivanje boljših signalnih peptidov bi lahko ostala uporabna tudi za optimizacijo drugih terapevtskih protiteles v prihodnosti.

Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah

2015-04-21T17:05:17Z

Tjaša Blatnik:

Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah

2015-04-21T17:04:49Z

Tjaša Blatnik:

UVOD

Rekombinantna monoklonska protitelesa, pridobljena iz celičnih linij CHO, predstavljajo najhitreje rastoči razred bioterapevtikov, zato so se v tej raziskavi usmerili na izboljšanje zaporedja signalnih peptidov humanih imunoglobulinskih težkih in lahkih verig protiteles, ki doprinese k večji produkciji in sekreciji protiteles. Izbrane signalne peptide so preizkusili na petih najbolje prodajanih terapevtikih, in sicer Humira (adalimumab), Remicade (infliximab), Avastin (bevacizumab), Rituxan (rituximab) in Hepceptin (transtuzumab).
Ključen korak v proteinski sekreciji je translokacija iz citosola v ER, ki je uravnavana s signalnim peptidom, ki vsebuje med 5 in 30 aminokislin in se nahaja na N-terminalnem koncu nastajajočega proteina. Študije so pokazale, da so omenjeni signalni peptidi zelo heterogeni in celo izmenljivi med različnimi vrstami organizmov. Svojo pomembnost pa so dokazali tudi pri proteinski sekreciji, in sicer učinkovitost je močno odvisna od njihovega zaporedja. Tako kot mnogi drugi proteini, se tudi protitelesa izločajo iz celic po kotranslacijski translokacijski poti. N-terminalno zaporedje nastajajočega proteina prepozna SRP (signal recognition particle), ki SRP-RNC kompleks proteina in ribosoma dostavi do SRP receptorjev na membrani ER. V lumen ER vstopa nastajajoča polipeptidna veriga, SPP (signal peptide peptidase) pa delo dokonča in odcepi stran signalni peptid. To cepljenje vpliva na samo učinkovitost izločanja rekombinantnih protiteles iz sesalskih celičnih sistemov, zato so želeli v tej študiji na podlagi boljših signalnih zaporedij izboljšati količino protiteles.

MATERIALI IN METODE

Z ustvarjanjem podatkovne baze humanih signalnih peptidov za težke in lahke kappa verige so le-te lahko pregledno uvrstili in jih razvrstili glede na podobnosti v sekvenci. Nadaljevali so z generiranjem konstruktov za težke in lahke kappa verige in iskanjem variabilnih regij izbranih verig iz javno dostopnih podatkovnih baz. Analizirali so signalne peptide iz 172 težkih verig IgG, IgM, IgD, IgA in IgE, ter iz 62 lahkih verig. Identificirali so najboljših osem signalnih peptidov za težke verige (H1 do H8) ter dva za lahke (L1 in L2) in izvedli njihovo fuzijo s konstantnimi regijami IgG1 z metodo prekrivajočega se PCR. Vsako težko in lahko verigo terapevtskih protiteles so fuzirali z vsemi izbranimi signalnimi peptidi za obe verigi. Izvedli so transfekcijo na CHO-K1 celicah z uporabo FuGENE 6 reagenta. Sledila je analiza uspešnosti transfekcije z imunoadsorpcijskim testom ELISA. Z uporabo kita za mestno specifične mutacije so ustvarili mutante signalnega peptida H7 za Avastin. Protitelesa so bila očiščena s FPLC, z masnim spektrometrom pa so preverjali dejansko vgradnjo signalnih peptidov v variabilne dele lahkih in težkih verig.

REZULTATI

Večina signalnih peptidov težkih verig vsebuje 19 aminokislin, ki jih lahko razvrstimo med tri domene, vse signalne peptide obravnavanih lahkih verig pa sestavlja 22 aminokislin. S šestnajstimi narejenimi kombinacijami med lahkimi in težkimi verigami so testirali njihov vpliv na izločanje protiteles in ugotovili, da najboljše rezultate v smislu najvišje sekrecije prispeva signalni peptid H7 pri terapevtikih Avastin, Remicade, Rituxan in Humira z obema možnima kombinacijama signalih peptidov lahkih verig (L1 in L2). Za najboljše kombinacije signalnih peptidov za obe verigi so se izkazali pari H5/L1, H7/L1, H7/L2, H7/L2 in H7/L1. Največje izločanje protiteles iz celic se je pokazalo v naslednjem vrstnem redu: Herceptin > Rituxan > Avastin > Humira > Remicade. V primeru Rituxana so dokazali znantno boljše sekrecijske sposobnosti z optimiziranimi signalnimi peptidi (H7/L2) v primerjavi z nativnimi.

ZAKLJUČEK

V raziskavi so uspeli optimizirati pare signalnih peptidov za variabilne regije obeh verig petih najbolje prodajanih terapevtskih mAb in s tem povečati njihovo sekrecijo iz celic. Njihova platforma za odkrivanje boljših signalnih peptidov bi lahko ostala uporabna tudi za optimizacijo drugih terapevtskih protiteles v prihodnosti.

MBT seminarji 2015

2015-04-21T15:36:54Z

Tjaša Blatnik:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 [[Glikoliziran Enfuvirtid: glikopeptid z močno proti HIV aktivnostjo s podaljšanim delovanjem]]. Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from ''Metschnikowia fructicola'' and overexpressed in ''Pichia pastoris'' to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah. [[Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah]] Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

MBT seminarji 2015

2015-04-21T15:32:03Z

Tjaša Blatnik:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 [[Glikoliziran Enfuvirtid: glikopeptid z močno proti HIV aktivnostjo s podaljšanim delovanjem]]. Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from ''Metschnikowia fructicola'' and overexpressed in ''Pichia pastoris'' to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah. [[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optimizacija_signalnih_peptidov_te%C5%BEkih_in_lahkih_verig_za_ve%C4%8Djo_ekspresijo_terapevtskih_protiteles_v_CHO_celi%C4%8Dnih_linijah]] Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah

2015-04-21T15:24:43Z

Tjaša Blatnik: New page: UVOD Rekombinantna monoklonska protitelesa, pridobljena iz celičnih linij CHO, predstavljajo najhitreje rastoči razred bioterapevtikov, zato so se v tej raziskavi usmerili na izboljšan...

MBT seminarji 2015

2015-04-21T15:22:24Z

Tjaša Blatnik:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 [[Glikoliziran Enfuvirtid: glikopeptid z močno proti HIV aktivnostjo s podaljšanim delovanjem]]. Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from ''Metschnikowia fructicola'' and overexpressed in ''Pichia pastoris'' to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah. Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

ZVIŠEVANJE OCENE

2013-12-30T16:49:15Z

Tjaša Blatnik:

30017949

30017952

30017941

30017940

30015138

30016257

30017947

30017933

Gene overexpression

2013-11-01T17:03:15Z

Tjaša Blatnik:

== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in ''Pleurotus ostreatus'' Using Promoter Swapping''' ==

'''UVOD'''

β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. ''Pleurotus ostreatus'' je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz ''Aspergillus nidulans''.

'''MATERIALI IN METODE'''

Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz ''Aspergillus nidulans''. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence ''P. ostreatus'' GLS.

TD-OE PCR

Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.
Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.

TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA ''P. ostreatus'' TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2

Protoplaste ''P. ostreatus'' TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR

Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.

ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER

Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.

'''REZULTATI'''

DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.

'''ZAKLJUČEK'''

Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.

Gene overexpression

2013-11-01T17:01:39Z

Tjaša Blatnik:

== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in ''Pleurotus ostreatus'' Using Promoter Swapping''' ==

'''UVOD'''

β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. ''Pleurotus ostreatus'' je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz ''Aspergillus nidulans''.

'''MATERIALI IN METODE'''

Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz ''Aspergillus nidulans''. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence ''P. ostreatus'' GLS.

TD-OE PCR

Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.
Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.

TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2

Protoplaste ''P. ostreatus'' TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR

Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.

ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER

Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.

'''REZULTATI'''

DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.

'''ZAKLJUČEK'''

Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.

Gene overexpression

2013-11-01T16:59:31Z

Tjaša Blatnik:

== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping''' ==

'''UVOD'''

β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.

'''MATERIALI IN METODE'''

Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.

TD-OE PCR

Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.
Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.

TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2

Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR

Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.

ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER

Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.

'''REZULTATI'''

DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.

'''ZAKLJUČEK'''

Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.

Gene overexpression

2013-11-01T16:58:47Z

Tjaša Blatnik:

Gene overexpression

2013-11-01T16:57:47Z

Tjaša Blatnik:

== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping''' ==

UVOD
β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.

MATERIALI IN METODE
Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.

TD-OE PCR
Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.
Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.

TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2
Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR
Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.

ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER
Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.

REZULTATI

DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.

ZAKLJUČEK

Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.

Gene overexpression

2013-11-01T16:57:33Z

Tjaša Blatnik:

'''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping'''

UVOD
β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.

MATERIALI IN METODE
Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.

TD-OE PCR
Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.
Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.

TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2
Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR
Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.

ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER
Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.

REZULTATI

DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.

ZAKLJUČEK

Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.

Gene overexpression

2013-11-01T16:57:13Z

Tjaša Blatnik: New page: β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping UVOD β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten....

β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping

UVOD
β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.

MATERIALI IN METODE
Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.

TD-OE PCR
Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.
Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.

TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2
Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR
Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.

ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER
Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.

REZULTATI

DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.

ZAKLJUČEK

Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.

Seminarji TehDNA

2013-10-30T07:12:29Z

Tjaša Blatnik:

Seminarje iz Tehnologije DNA bo v študijskem letu 2013/14 vodila asist. dr. Helena Čelešnik.

Seznam tem za seminarje:

# Mutageneza (16.10.), 3 seminarji: 1. Urban Bezeljak (CRISPR/Cas9) 2. Uroš Stupar (ZFN nukleaze) 3. Helena Vajović (tarčna mutageneza)
# Izražanje na površini (23.10.), 3 seminarji: 1. Mitja Crček (Ribosome display), 2. Klara Tereza Novoselc (Phage display) 3. Živa Marsetič (Predstavitev na površini bakterij)
# Dvohibridni sistemi (30.10.), 3 seminarji: 1. Katja Kovačič (BiFC) 2. Barbara Žužek (YTH s knjižnico celic HeLa) 3. Bernarda Majc (YTH)
# Mutageneza/genetika (2 seminarja: npr. insercijska mutageneza, gene silencing (RNAi, Morpholino), gene overexpression), izražanje na površini (1 seminar) (6.11.), skupaj 3 seminarji: 1. Valter Bergant (scFv phage display), 2. Ana Kapraljević (gene silencing shRNA), 3. Tjaša Blatnik (gene overexpression)
# GSO v agronomiji (13.11.), 3 seminarji: 1. Niki Bursič, 2. Petra Malavašič, 3. Jernej Mustar
# Transgenske živali (27.11.), 3 seminarji: 1. Andrea Grof (transgenske kokoši), 2. Eva Lucija Kozak, 3. Špela Pohleven
# Izvorne celice (4.12.), 4 seminarji: 1. Sara Primec, 2. Alja Zottel, 3. Tjaša Goričan, 4. Rok Štemberger
# DNA-diagnostika (11.12.), 4 seminarji: 1. Tina Gregorič , 2. Eva Knapič, 3. Veronika Jarc, 4. Jana Verbančič
# Forenzika, arheologija, sistematika (18.12.), 3 seminarji: 1. Matja Zalar, 2. Andreja Bratovš, 3. Maja Remškar
# Mikromreže, genomike (8.1.), 3 seminarji: 1. Andrej Vrankar, 2. Filip Kolenc 3. Nastja Štemberger
# Gensko zdravljenje s. lat. (15.1.), 3 seminarji: 1. Ana Dolinar 2. Staša Komljenovič, 3. Katarina Uršič

'''IZBIRANJE ČLANKOV ZA SEMINARJE:
Ni nujno, da je metoda, ki jo želimo predstaviti, sama tematika izbranega članka. Zaželeno je, da članek obravnava neko biološko temo, pri raziskovanju le-te pa avtorji uporabljajo metodo, ki jo želimo predstaviti.'''

'''POVZETKI ZA SEMINARJE 30.10.2013'''
# Katja Kovačič ([[BiFC]])
# Barbara Žužek ([[YTH s knjižnico celic HeLa]])
# Bernarda Majc ([[YTH]])

'''POVZETKI ZA SEMINARJE 23.10.2013'''
# Mitja Crček ([[Predstavitev na ribosomih]])
# Klara Tereza Novoselc ([[Phage display]])
# Živa Marsetič ([[Predstavitev na površini bakterij]])

'''POVZETKI ZA SEMINARJE 14.10.2013'''
# Urban Bezeljak ([[CRISPR/Cas9]])
# Uroš Stupar ([[ZFN nukleaze]])
# Helena Vajović ([[tarčna mutageneza]])