Wiki FKKT - User contributions [en]

Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola

2017-11-27T14:56:10Z

Tjaša Grum:

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/1475-2859-7-36'''Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol ''']

(Tjaša Grum)

==Uvod==
Naraščajoči stroški energije in vse večja skrb za okolje so vplivali na razvoj proizvodnje obnovljivih goriv in kemikalij iz biomase. Trenutni standard biogoriva je etanol, vendar pa obstaja več razlogov za proizvodnjo in iskanje novih alternativ. Etanol ima namreč nizko energijsko gostoto, je higroskopen, ne da se ga napeljati po ceveh in je drag za destilacijo. V primerjavi z etanolom, je n-butanol bolj hidrofoben, ima višjo energijsko gostoto, lahko se transportira po napeljavi in se meša z bencinom v vseh razmerjih. Zaradi omenjenih lastnosti je n-butanol boljše biogorivo kot etanol. n-butanol se lahko proizvaja kemijsko iz nafte ali fermentacijsko iz različnih sevov bakterij iz rodu ''Clostridium''. Zaradi razvoja biotehnologije in podražitve nafte narašča zanimanje za fermentacijsko pridobivanje n-butanola. Vendar pa bakterije iz rodu ''Clostridium'' niso najbolj primerne za omenjeno proizvodnjo. Razlogi za to so naslednji: pomanjkanje genetskih orodij, s katerim bi lahko spreminjali njihov metabolizem, počasna rast, intoleranca na n-butanol (nad 1-2-odstotno vsebnostjo) in na kisik ter proizvodnja stranskih produktov (aceton, butirat, etanol). V članku so raziskovalci za gostiteljski organizem izbrali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae'', saj je ta genetsko obvladljiv in dobro opisan organizem, je trenutni industrijski sev, ki proizvaja etanol ter je bil v preteklosti že manipuliran za proizvodnjo drugih heterolognih metabolitov.

==Materiali in metode==
Gene bakterije ''Clostridium beijerinckii'' so klonirali iz genomske DNA. Gena ''phaA'' in ''phaB'' (iz bakterije ''Ralstonia eutropha''), gen ''adhe2'' (iz bakterije ''C. beijerinckii'') in gen ''ccr'' (iz bakterije ''Streptomyces collinus'') so bili sintetizirani. Vsi geni so bili pomnoženi s PCR s polimerazo Phusion. Začetni oligonukleotidi so bili načrtovani tako, da so imeli 30-bp dolge robne regije, ki so bile homologne insercijskim regijam (''gal1'' ali ''gal10'' promotorju in ''CYC1'', ''ADH1'' ali ''PGK1'' terminatorju) na plazmidu. Plazmide so konstruirali z metodo SLIC (od zaporedja in od ligacije neodvisno kloniranje), ki je nadgradnja metode LIC (od ligacije neodvisno kloniranje). Metoda omogoča združevanje številnih fragmentov DNA v eni sami reakciji z uporabo ''in vitro'' homologne rekombinacije in enoverižnega prileganja. Omenjena metoda posnema ''in vivo'' homologno rekombinacijo, ki so jo odkrili v ''E. coli''. Deluje na principu štrlečih koncev ssDNA v vključkih in vektorskih fragmentih, ki jih generira T4 DNA-polimeraza s svojo eksonukleazno aktivnostjo ter združevanju teh fragmentov z rekombinacijo ''in vitro''. Bakterija ''E. coli'', po transformaciji, dobljeni krožni produkt (z zarezami) enostavno popravi. SLIC vključke lahko naredimo tudi z nepopolnim PCR ali z mešanim PCR. Dodatek proteina RecA (popravlja DNA) pred transformacijo, omogoča uporabo metode tudi pri zelo majhni koncentraciji DNA (npr. 3 ng).

Konstruirani plazmidi so izhajali iz plazmida p''ADS-AMO-CRP''-opt-''LEU2D'' in pESC-''HIS''. Pomnoževanje plazmidov je potekalo v bakteriji ''E. coli''. Celice so gojili pri 37 °C v LB mediju s 100 mg/L ampicilina. Starševski sev ''S. cerevisiae'' so gojili v bogatem YPD mediju pri 30 °C; spremenjeni sevi kvasovk pa so uspevali v SD mediju brez levcina, uracila, histidina in/ali metionina. Za induciranje genov, ki so bili pod promotorjema ''GAL1'' in ''GAL10'', so seve ''S. cerevisiae'' gojili ob prisotnosti 2-odstotne galaktoze, kot edinega vira ogljika. Kvasovke so transformirali z litijevim acetatom. Sevi ESY1-11 so bili konstruirani s kotransformacijo plazmidov, tej pa je sledila selekcija na ploščah SC-LEU ali SC-LEU-HIS.

Za analizo metabolitov so zbirali po 10 mL kulture po 24h, 72h, 120h in 144h. Za detekcijo n-butanola so 10 mL vzorca dodali 2 mL internega standarda (etil acetat, ki je vseboval n-pentanol) in vorteksirali 1 min. Nato so vzorce nanesli na plinsko kromatografijo (GC). Kvantifikacijska analiza je bila narejena s programom Xcalibur. Analizo intermediatov biosintezne poti pa so naredili s pomočjo tekočinske kromatografije sklopljene s tandemskim masnim spektrometrom (LC-MS/MS).

== Biosintezna pot n-butanola==
Biosintezno pot so zasnovali na podlagi biosintezne poti v bakteriji ''C. beijerinckii'', kjer najprej encim tiolaza katalizira pretvorbo 2-acetil-CoA (AcCoA) v acetoacetil-CoA (AcAcCoA), slednjega nato 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v 3-hidroksibutiril-CoA (HbCoA), v naslednjem koraku pa se HbCoA s pomočjo encima krotonaza pretvori v krotonoil-CoA (CrCoA). Ta se v nadaljevanju z encimom butiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v butiril-CoA (BtCoA). Slednji produkt se nato ob prisotnosti encima butiraldehid-dehidrogenaza pretvori v butiraldehid. Zadnjo stopnjo sintezne poti pa katalizira butanol- dehidrogenaza, ki butiraldehid pretvori v butanol.

== Testiranje encimov in proizvodnja n-butanola==
Izražanje izoencimov biosintezne poti n-butanola iz različnih organizmov v ''S. cerevisiae'' privede do proizvodnje n-butanola. Za vsako reakcijo biosintezne poti so testirali več različnih encimov. Sevi ESY2, ESY3 in ESY4 so vsebovali encime iz bakterije ''R. eutropha'' (gen ''phaA'', ki kodira za tiolazo in gen ''phaB'', ki kodira za HbCoA-dehidrogenazo), ''S. collinus'' (gen ''ccr'', ki kodira za BtCoA-dehidrogenazo), ''C. beijerinckii'' (gen ''crt'', ki kodira za krotonazo in gen ''adhe2'', ki kodira za butiraldehid/butanol- dehidrogenazo), ''E. coli'' (gen ''atoB'', ki kodira za tiolazo) in iz kvasovke ''S. cerevisiae'' (gen ''ERG10'', ki kodira za tiolazo). Sevi so se razlikovali le v prvi stopnji sintezne poti (v encimu tiolaza). Encime iz ''R. eutropha'' so testirali zato, ker že obstajajo dokazi o njihovi visoki aktivnosti pri proizvajanju polihidroksialkanoatov v ''E. coli''. Ostali dve tiolazi pa so testirali zato, ker je ERG10 nativna tiolaza v ''S. cerevisiae'', encim AtoB pa zato, ker je že dokazana njegova uspešna uporaba pri prekomernem proizvajanju AcAcCoA v drugih metabolnih poteh. Izmed omenjenih sevov, je največjo količino n-butanola proizvedel sev ESY2 (1 mg/L), kar kaže na to, da je PhaA najboljša tiolaza za to biosintezno pot.

Druga skupina sevov je vsebovala različne HbCoA-dehidrogenaze. Eden teh encimov (PhaB) kot kofaktor uporablja NADPH, drugi encim (Hbd) pa uporablja NADH. Najuspešnejši je bil sev ESY7 (''ERG10'', ''hbd''), ki je v primerjavi s prejšnjim najboljšim sevom (ESY2- ''phaA'', ''phaB'' ) podvojil količino proizvedenega n-butanola in dosegel količino 2,5 mg/L. Raziskovalcem se to ni zdelo presenetljivo, saj je omenjeni sev vseboval ERG10, ki je nativna tiolaza ter Hbd, ki uporablja NADH, ki ga je v fermentacijskih pogojih na voljo v zadostni količini. Opazili so tudi, da je sev, ki vsebuje gen za encim PhaA, v kombinaciji s Hbd manj učinkovit kot s PhaB. Mogoče je, da sta bila PhaA in PhaB med evolucijo optimizirana, da sodelujeta za boljšo proizvodnjo polihidroksibutirata v bakteriji ''R. eutropha''.

S konstruiranjem zadnjega seva (ESY11) so preverili, če katera od alternativnih BtCoA-dehidrogenaz, za katere je bilo dokazano, da znatno povečajo proizvodnjo n-butanola v ''E. coli'', poveča količino n-butanola v primerjavi s sevom ESY7. Sev ESY11, ki je izražal encime Bcd (BtCoA-dehidrogenaza) in EtfAB (dva elektron prenašalna flavoproteina A in B) iz bakterije ''C. beijerinckii'', ni občutno povečal proizvodnje n-butanola. ESY11 je bil drugi najuspešnejši sev in se je od seva ESY7 razlikoval le v omenjeni BtCoA-dehidrogenazi.

== Analiza metabolitov biosintezne poti==
Z namenom, da bi razložili razlike med sevi in njihovo različno proizvodnjo n-butanola, so raziskovalci analizirali intermediate biosintezne poti. Razvili so LC-MS metodo za spremljanje vseh metabolitov v biosintezni poti n-butanola hkrati. Detekcija vseh metabolnih standardov je bila uspešna, prav tako je bila uspešna detekcija intermediatov (z izjemo AcAcCoA). Po 24h so bili nivoji AcCoA v sevih ESY4 in ESY7 nerazločljivi, medtem ko so bili nivoji HbCoA in BtCoA višji v sevu ESY7 kot v sevu ESY4. Pretvorba AcAcCoA v HbCoA je bila očitno uspešnejša z encimom Hbd kot z encimom PhaB. Sev ESY11, ki se je od seva ESY7 razlikoval zgolj v BtCoA-dehidrogenazi (Ccr v ESY7 in EtfAB/Bcd v ESY11), je akumuliral BtCoA, kar kaže na možno ozko grlo. S prenosom western so analizirali topnost Adhe2 in ugotovili, da je večina proteina v netopni frakciji. Povečano izražanje gena ''adhe2'' v sevu ESY11, bi lahko ublažilo akumulacijo BtCoA in izboljšalo proizvodnjo n-butanola. Raziskovalci so na podlagi rezultatov analize zaključili, da je nastanek HbCoA s HbCo-dehidrogenazo, stopnja, ki omejuje hitrost sinteze in odloča o nastanku n-butanola.

==Zaključek==
V članku je prvič predstavljena vzpostavitev biosintezne poti n-butanola v kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae''. Raziskovalci so testirali številne izoencime za različne stopnje v metabolni poti. Z izbiro ustreznih encimov so dosegli 10-kratno povečanje proizvodnje n-butanola (2,5 mg/L). Najučinkovitejši sevi so vsebovali encim 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza iz bakterije ''Clostridium beijerinckii'', ki kot kofaktor uporablja NADH, in acetoacetil-CoA transferazo iz ''S. cerevisiae'' ali iz ''E. coli''. Izražanje genov, ki kodirajo za butiril-CoA-dehidrogenazo iz ''C. beijerinckii'' (''bcd'' in ''etfAB''), ni občutno izboljšalo proizvodnje butanola, kot so to predhodno omenjali pri ''E. coli''. Z analizo metabolitov so avtorji članka ugotovil katere stopnje omenjene biosintezne poti so težavne in zato primerne za optimizacijo v prihodnosti. V članku avtorji kot vodilo za nadaljnje študije navajajo primerjavo konstruiranih sevov (2,5 mg/L) z naravnimi sevi, ki proizvajajo n-butanol – ''Clostridium'' (približno 10 g/L) in pred kratkim pripravljeni sevi ''E. coli'' (približno 0,5 g/L).

==Viri==
E.J. Steen, R. Chan, N. Prasad, S. Myers, C.J. Petzold, A. Redding , M. Ouellet, J.D. Keasling: Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol. ''Microbial Cell Factories''. 2008.7:36.

S.J. Elledge, L. MZ: SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in molecular biology. 2012.852:51-9.

Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola

2017-11-27T14:43:45Z

Tjaša Grum:

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/1475-2859-7-36#Tab1'''Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol ''']

(Tjaša Grum)

==Uvod==
Naraščajoči stroški energije in vse večja skrb za okolje so vplivali na razvoj proizvodnje obnovljivih goriv in kemikalij iz biomase. Trenutni standard biogoriva je etanol, vendar pa obstaja več razlogov za proizvodnjo in iskanje novih alternativ. Etanol ima namreč nizko energijsko gostoto, je higroskopen, ne da se ga napeljati po ceveh in je drag za destilacijo. V primerjavi z etanolom, je n-butanol bolj hidrofoben, ima višjo energijsko gostoto, lahko se transportira po napeljavi in se meša z bencinom v vseh razmerjih. Zaradi omenjenih lastnosti je n-butanol boljše biogorivo kot etanol. n-butanol se lahko proizvaja kemijsko iz nafte ali fermentacijsko iz različnih sevov bakterij iz rodu ''Clostridium''. Zaradi razvoja biotehnologije in podražitve nafte narašča zanimanje za fermentacijsko pridobivanje n-butanola. Vendar pa bakterije iz rodu ''Clostridium'' niso najbolj primerne za omenjeno proizvodnjo. Razlogi za to so naslednji: pomanjkanje genetskih orodij, s katerim bi lahko spreminjali njihov metabolizem, počasna rast, intoleranca na n-butanol (nad 1-2-odstotno vsebnostjo) in na kisik ter proizvodnja stranskih produktov (aceton, butirat, etanol). V članku so raziskovalci za gostiteljski organizem izbrali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae'', saj je ta genetsko obvladljiv in dobro opisan organizem, je trenutni industrijski sev, ki proizvaja etanol ter je bil v preteklosti že manipuliran za proizvodnjo drugih heterolognih metabolitov.

==Materiali in metode==
Gene bakterije ''Clostridium beijerinckii'' so klonirali iz genomske DNA. Gena ''phaA'' in ''phaB'' (iz bakterije ''Ralstonia eutropha''), gen ''adhe2'' (iz bakterije ''C. beijerinckii'') in gen ''ccr'' (iz bakterije ''Streptomyces collinus'') so bili sintetizirani. Vsi geni so bili pomnoženi s PCR s polimerazo Phusion. Začetni oligonukleotidi so bili načrtovani tako, da so imeli 30-bp dolge robne regije, ki so bile homologne insercijskim regijam (''gal1'' ali ''gal10'' promotorju in ''CYC1'', ''ADH1'' ali ''PGK1'' terminatorju) na plazmidu. Plazmide so konstruirali z metodo SLIC (od zaporedja in od ligacije neodvisno kloniranje), ki je nadgradnja metode LIC (od ligacije neodvisno kloniranje). Metoda omogoča združevanje številnih fragmentov DNA v eni sami reakciji z uporabo ''in vitro'' homologne rekombinacije in enoverižnega prileganja. Omenjena metoda posnema ''in vivo'' homologno rekombinacijo, ki so jo odkrili v ''E. coli''. Deluje na principu štrlečih koncev ssDNA v vključkih in vektorskih fragmentih, ki jih generira T4 DNA-polimeraza s svojo eksonukleazno aktivnostjo ter združevanju teh fragmentov z rekombinacijo ''in vitro''. Bakterija ''E. coli'', po transformaciji, dobljeni krožni produkt (z zarezami) enostavno popravi. SLIC vključke lahko naredimo tudi z nepopolnim PCR ali z mešanim PCR. Dodatek proteina RecA (popravlja DNA) pred transformacijo, omogoča uporabo metode tudi pri zelo majhni koncentraciji DNA (npr. 3 ng).

Konstruirani plazmidi so izhajali iz plazmida p''ADS-AMO-CRP''-opt-''LEU2D'' in pESC-''HIS''. Pomnoževanje plazmidov je potekalo v bakteriji ''E. coli''. Celice so gojili pri 37 °C v LB mediju s 100 mg/L ampicilina. Starševski sev ''S. cerevisiae'' so gojili v bogatem YPD mediju pri 30 °C; spremenjeni sevi kvasovk pa so uspevali v SD mediju brez levcina, uracila, histidina in/ali metionina. Za induciranje genov, ki so bili pod promotorjema ''GAL1'' in ''GAL10'', so seve ''S. cerevisiae'' gojili ob prisotnosti 2-odstotne galaktoze, kot edinega vira ogljika. Kvasovke so transformirali z litijevim acetatom. Sevi ESY1-11 so bili konstruirani s kotransformacijo plazmidov, tej pa je sledila selekcija na ploščah SC-LEU ali SC-LEU-HIS.

Za analizo metabolitov so zbirali po 10 mL kulture po 24h, 72h, 120h in 144h. Za detekcijo n-butanola so 10 mL vzorca dodali 2 mL internega standarda (etil acetat, ki je vseboval n-pentanol) in vorteksirali 1 min. Nato so vzorce nanesli na plinsko kromatografijo (GC). Kvantifikacijska analiza je bila narejena s programom Xcalibur. Analizo intermediatov biosintezne poti pa so naredili s pomočjo tekočinske kromatografije sklopljene s tandemskim masnim spektrometrom (LC-MS/MS).

== Biosintezna pot n-butanola==
Biosintezno pot so zasnovali na podlagi biosintezne poti v bakteriji ''C. beijerinckii'', kjer najprej encim tiolaza katalizira pretvorbo 2-acetil-CoA (AcCoA) v acetoacetil-CoA (AcAcCoA), slednjega nato 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v 3-hidroksibutiril-CoA (HbCoA), v naslednjem koraku pa se HbCoA s pomočjo encima krotonaza pretvori v krotonoil-CoA (CrCoA). Ta se v nadaljevanju z encimom butiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v butiril-CoA (BtCoA). Slednji produkt se nato ob prisotnosti encima butiraldehid-dehidrogenaza pretvori v butiraldehid. Zadnjo stopnjo sintezne poti pa katalizira butanol- dehidrogenaza, ki butiraldehid pretvori v butanol.

== Testiranje encimov in proizvodnja n-butanola==
Izražanje izoencimov biosintezne poti n-butanola iz različnih organizmov v ''S. cerevisiae'' privede do proizvodnje n-butanola. Za vsako reakcijo biosintezne poti so testirali več različnih encimov. Sevi ESY2, ESY3 in ESY4 so vsebovali encime iz bakterije ''R. eutropha'' (gen ''phaA'', ki kodira za tiolazo in gen ''phaB'', ki kodira za HbCoA-dehidrogenazo), ''S. collinus'' (gen ''ccr'', ki kodira za BtCoA-dehidrogenazo), ''C. beijerinckii'' (gen ''crt'', ki kodira za krotonazo in gen ''adhe2'', ki kodira za butiraldehid/butanol- dehidrogenazo), ''E. coli'' (gen ''atoB'', ki kodira za tiolazo) in iz kvasovke ''S. cerevisiae'' (gen ''ERG10'', ki kodira za tiolazo). Sevi so se razlikovali le v prvi stopnji sintezne poti (v encimu tiolaza). Encime iz ''R. eutropha'' so testirali zato, ker že obstajajo dokazi o njihovi visoki aktivnosti pri proizvajanju polihidroksialkanoatov v ''E. coli''. Ostali dve tiolazi pa so testirali zato, ker je ERG10 nativna tiolaza v ''S. cerevisiae'', encim AtoB pa zato, ker je že dokazana njegova uspešna uporaba pri prekomernem proizvajanju AcAcCoA v drugih metabolnih poteh. Izmed omenjenih sevov, je največjo količino n-butanola proizvedel sev ESY2 (1 mg/L), kar kaže na to, da je PhaA najboljša tiolaza za to biosintezno pot.

Druga skupina sevov je vsebovala različne HbCoA-dehidrogenaze. Eden teh encimov (PhaB) kot kofaktor uporablja NADPH, drugi encim (Hbd) pa uporablja NADH. Najuspešnejši je bil sev ESY7 (''ERG10'', ''hbd''), ki je v primerjavi s prejšnjim najboljšim sevom (ESY2- ''phaA'', ''phaB'' ) podvojil količino proizvedenega n-butanola in dosegel količino 2,5 mg/L. Raziskovalcem se to ni zdelo presenetljivo, saj je omenjeni sev vseboval ERG10, ki je nativna tiolaza ter Hbd, ki uporablja NADH, ki ga je v fermentacijskih pogojih na voljo v zadostni količini. Opazili so tudi, da je sev, ki vsebuje gen za encim PhaA, v kombinaciji s Hbd manj učinkovit kot s PhaB. Mogoče je, da sta bila PhaA in PhaB med evolucijo optimizirana, da sodelujeta za boljšo proizvodnjo polihidroksibutirata v bakteriji ''R. eutropha''.

S konstruiranjem zadnjega seva (ESY11) so preverili, če katera od alternativnih BtCoA-dehidrogenaz, za katere je bilo dokazano, da znatno povečajo proizvodnjo n-butanola v ''E. coli'', poveča količino n-butanola v primerjavi s sevom ESY7. Sev ESY11, ki je izražal encime Bcd (BtCoA-dehidrogenaza) in EtfAB (dva elektron prenašalna flavoproteina A in B) iz bakterije ''C. beijerinckii'', ni občutno povečal proizvodnje n-butanola. ESY11 je bil drugi najuspešnejši sev in se je od seva ESY7 razlikoval le v omenjeni BtCoA-dehidrogenazi.

== Analiza metabolitov biosintezne poti==
Z namenom, da bi razložili razlike med sevi in njihovo različno proizvodnjo n-butanola, so raziskovalci analizirali intermediate biosintezne poti. Razvili so LC-MS metodo za spremljanje vseh metabolitov v biosintezni poti n-butanola hkrati. Detekcija vseh metabolnih standardov je bila uspešna, prav tako je bila uspešna detekcija intermediatov (z izjemo AcAcCoA). Po 24h so bili nivoji AcCoA v sevih ESY4 in ESY7 nerazločljivi, medtem ko so bili nivoji HbCoA in BtCoA višji v sevu ESY7 kot v sevu ESY4. Pretvorba AcAcCoA v HbCoA je bila očitno uspešnejša z encimom Hbd kot z encimom PhaB. Sev ESY11, ki se je od seva ESY7 razlikoval zgolj v BtCoA-dehidrogenazi (Ccr v ESY7 in EtfAB/Bcd v ESY11), je akumuliral BtCoA, kar kaže na možno ozko grlo. S prenosom western so analizirali topnost Adhe2 in ugotovili, da je večina proteina v netopni frakciji. Povečano izražanje gena ''adhe2'' v sevu ESY11, bi lahko ublažilo akumulacijo BtCoA in izboljšalo proizvodnjo n-butanola. Raziskovalci so na podlagi rezultatov analize zaključili, da je nastanek HbCoA s HbCo-dehidrogenazo, stopnja, ki omejuje hitrost sinteze in odloča o nastanku n-butanola.

==Zaključek==
V članku je prvič predstavljena vzpostavitev biosintezne poti n-butanola v kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae''. Raziskovalci so testirali številne izoencime za različne stopnje v metabolni poti. Z izbiro ustreznih encimov so dosegli 10-kratno povečanje proizvodnje n-butanola (2,5 mg/L). Najučinkovitejši sevi so vsebovali encim 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza iz bakterije ''Clostridium beijerinckii'', ki kot kofaktor uporablja NADH, in acetoacetil-CoA transferazo iz ''S. cerevisiae'' ali iz ''E. coli''. Izražanje genov, ki kodirajo za butiril-CoA-dehidrogenazo iz ''C. beijerinckii'' (''bcd'' in ''etfAB''), ni občutno izboljšalo proizvodnje butanola, kot so to predhodno omenjali pri ''E. coli''. Z analizo metabolitov so avtorji članka ugotovil katere stopnje omenjene biosintezne poti so težavne in zato primerne za optimizacijo v prihodnosti. V članku avtorji kot vodilo za nadaljnje študije navajajo primerjavo konstruiranih sevov (2,5 mg/L) z naravnimi sevi, ki proizvajajo n-butanol – ''Clostridium'' (približno 10 g/L) in pred kratkim pripravljeni sevi ''E. coli'' (približno 0,5 g/L).

==Viri==
E.J. Steen, R. Chan, N. Prasad, S. Myers, C.J. Petzold, A. Redding , M. Ouellet, J.D. Keasling: Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol. ''Microbial Cell Factories''. 2008.7:36.

S.J. Elledge, L. MZ: SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in molecular biology. 2012.852:51-9.

Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola

2017-11-26T20:29:01Z

Tjaša Grum:

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/1475-2859-7-36#Tab1'''Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol ''']

==Uvod==
Naraščajoči stroški energije in vse večja skrb za okolje so vplivali na razvoj proizvodnje obnovljivih goriv in kemikalij iz biomase. Trenutni standard biogoriva je etanol, vendar pa obstaja več razlogov za proizvodnjo in iskanje novih alternativ. Etanol ima namreč nizko energijsko gostoto, je higroskopen, ne da se ga napeljati po ceveh in je drag za destilacijo. V primerjavi z etanolom, je n-butanol bolj hidrofoben, ima višjo energijsko gostoto, lahko se transportira po napeljavi in se meša z bencinom v vseh razmerjih. Zaradi omenjenih lastnosti je n-butanol boljše biogorivo kot etanol. n-butanol se lahko proizvaja kemijsko iz nafte ali fermentacijsko iz različnih sevov bakterij iz rodu ''Clostridium''. Zaradi razvoja biotehnologije in podražitve nafte narašča zanimanje za fermentacijsko pridobivanje n-butanola. Vendar pa bakterije iz rodu ''Clostridium'' niso najbolj primerne za omenjeno proizvodnjo. Razlogi za to so naslednji: pomanjkanje genetskih orodij, s katerim bi lahko spreminjali njihov metabolizem, počasna rast, intoleranca na n-butanol (nad 1-2-odstotno vsebnostjo) in na kisik ter proizvodnja stranskih produktov (aceton, butirat, etanol). V članku so raziskovalci za gostiteljski organizem izbrali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae'', saj je ta genetsko obvladljiv in dobro opisan organizem, je trenutni industrijski sev, ki proizvaja etanol ter je bil v preteklosti že manipuliran za proizvodnjo drugih heterolognih metabolitov.

==Materiali in metode==
Gene bakterije ''Clostridium beijerinckii'' so klonirali iz genomske DNA. Gena ''phaA'' in ''phaB'' (iz bakterije ''Ralstonia eutropha''), gen ''adhe2'' (iz bakterije ''C. beijerinckii'') in gen ''ccr'' (iz bakterije ''Streptomyces collinus'') so bili sintetizirani. Vsi geni so bili pomnoženi s PCR s polimerazo Phusion. Začetni oligonukleotidi so bili načrtovani tako, da so imeli 30-bp dolge robne regije, ki so bile homologne insercijskim regijam (''gal1'' ali ''gal10'' promotorju in ''CYC1'', ''ADH1'' ali ''PGK1'' terminatorju) na plazmidu. Plazmide so konstruirali z metodo SLIC (od zaporedja in od ligacije neodvisno kloniranje), ki je nadgradnja metode LIC (od ligacije neodvisno kloniranje). Metoda omogoča združevanje številnih fragmentov DNA v eni sami reakciji z uporabo ''in vitro'' homologne rekombinacije in enoverižnega prileganja. Omenjena metoda posnema ''in vivo'' homologno rekombinacijo, ki so jo odkrili v ''E. coli''. Deluje na principu štrlečih koncev ssDNA v vključkih in vektorskih fragmentih, ki jih generira T4 DNA-polimeraza s svojo eksonukleazno aktivnostjo ter združevanju teh fragmentov z rekombinacijo ''in vitro''. Bakterija ''E. coli'', po transformaciji, dobljeni krožni produkt (z zarezami) enostavno popravi. SLIC vključke lahko naredimo tudi z nepopolnim PCR ali z mešanim PCR. Dodatek proteina RecA (popravlja DNA) pred transformacijo, omogoča uporabo metode tudi pri zelo majhni koncentraciji DNA (npr. 3 ng).

Konstruirani plazmidi so izhajali iz plazmida p''ADS-AMO-CRP''-opt-''LEU2D'' in pESC-''HIS''. Pomnoževanje plazmidov je potekalo v bakteriji ''E. coli''. Celice so gojili pri 37 °C v LB mediju s 100 mg/L ampicilina. Starševski sev ''S. cerevisiae'' so gojili v bogatem YPD mediju pri 30 °C; spremenjeni sevi kvasovk pa so uspevali v SD mediju brez levcina, uracila, histidina in/ali metionina. Za induciranje genov, ki so bili pod promotorjema ''GAL1'' in ''GAL10'', so seve ''S. cerevisiae'' gojili ob prisotnosti 2-odstotne galaktoze, kot edinega vira ogljika. Kvasovke so transformirali z litijevim acetatom. Sevi ESY1-11 so bili konstruirani s kotransformacijo plazmidov, tej pa je sledila selekcija na ploščah SC-LEU ali SC-LEU-HIS.

Za analizo metabolitov so zbirali po 10 mL kulture po 24h, 72h, 120h in 144h. Za detekcijo n-butanola so 10 mL vzorca dodali 2 mL internega standarda (etil acetat, ki je vseboval n-pentanol) in vorteksirali 1 min. Nato so etil acetat odstranili in nanesli na plinsko kromatografijo (GC). Kvantifikacijska analiza je bila narejena s programom Xcalibur. Analizo intermediatov biosintezne poti pa so naredili s pomočjo tekočinske kromatografije sklopljene s tandemskim masnim spektrometrom (LC-MS/MS).

== Biosintezna pot n-butanola==
Biosintezno pot so zasnovali na podlagi biosintezne poti v bakteriji ''C. beijerinckii'', kjer najprej encim tiolaza katalizira pretvorbo 2-acetil-CoA (AcCoA) v acetoacetil-CoA (AcAcCoA), slednjega nato 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v 3-hidroksibutiril-CoA (HbCoA), v naslednjem koraku pa se HbCoA s pomočjo encima krotonaza pretvori v krotonoil-CoA (CrCoA). Ta se v nadaljevanju z encimom butiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v butiril-CoA (BtCoA). Slednji produkt se nato ob prisotnosti encima butiraldehid-dehidrogenaza pretvori v butiraldehid. Zadnjo stopnjo sintezne poti pa katalizira butanol- dehidrogenaza, ki butiraldehid pretvori v butanol.

== Testiranje encimov in proizvodnja n-butanola==
Izražanje izoencimov biosintezne poti n-butanola iz različnih organizmov v ''S. cerevisiae'' privede do proizvodnje n-butanola. Za vsako reakcijo biosintezne poti so testirali več različnih encimov. Sevi ESY2, ESY3 in ESY4 so vsebovali encime iz bakterije ''R. eutropha'' (gen ''phaA'', ki kodira za tiolazo in gen ''phaB'', ki kodira za HbCoA-dehidrogenazo), ''S. collinus'' (gen ''ccr'', ki kodira za BtCoA-dehidrogenazo), ''C. beijerinckii'' (gen ''crt'', ki kodira za krotonazo in gen ''adhe2'', ki kodira za butiraldehid/butanol- dehidrogenazo), ''E. coli'' (gen ''atoB'', ki kodira za tiolazo) in iz kvasovke ''S. cerevisiae'' (gen ''ERG10'', ki kodira za tiolazo). Sevi so se razlikovali le v prvi stopnji sintezne poti (v encimu tiolaza). Encime iz ''R. eutropha'' so testirali zato, ker že obstajajo dokazi o njihovi visoki aktivnosti pri proizvajanju polihidroksialkanoatov v ''E. coli''. Ostali dve tiolazi pa so testirali zato, ker je ERG10 nativna tiolaza v ''S. cerevisiae'', encim AtoB pa zato, ker je že dokazana njegova uspešna uporaba pri prekomernem proizvajanju AcAcCoA v drugih metabolnih poteh. Izmed omenjenih sevov, je največjo količino n-butanola proizvedel sev ESY2 (1 mg/L), kar kaže na to, da je PhaA najboljša tiolaza za to biosintezno pot.

Druga skupina sevov je vsebovala različne HbCoA-dehidrogenaze. Eden teh encimov (PhaB) kot kofaktor uporablja NADPH, drugi encim (Hbd) pa uporablja NADH. Najuspešnejši je bil sev ESY7 (''ERG10'', ''hbd''), ki je v primerjavi s prejšnjim najboljšim sevom (ESY2- ''phaA'', ''phaB'' ) podvojil količino proizvedenega n-butanola in dosegel količino 2,5 mg/L. Raziskovalcem se to ni zdelo presenetljivo, saj je omenjeni sev vseboval ERG10, ki je nativna tiolaza ter Hbd, ki uporablja NADH, ki ga je v fermentacijskih pogojih na voljo v zadostni količini. Opazili so tudi, da je sev, ki vsebuje gen za encim PhaA, v kombinaciji s Hbd manj učinkovit kot s PhaB. Mogoče je, da sta bila PhaA in PhaB med evolucijo optimizirana, da sodelujeta za boljšo proizvodnjo polihidroksibutirata v bakteriji ''R. eutropha''.

S konstruiranjem zadnjega seva (ESY11) so preverili, če katera od alternativnih BtCoA-dehidrogenaz, za katere je bilo dokazano, da znatno povečajo proizvodnjo n-butanola v ''E. coli'', poveča količino n-butanola v primerjavi s sevom ESY7. Sev ESY11, ki je izražal encime Bcd (BtCoA-dehidrogenaza) in EtfAB (dva elektron prenašalna flavoproteina A in B) iz bakterije ''C. beijerinckii'', ni občutno povečal proizvodnje n-butanola. ESY11 je bil drugi najuspešnejši sev in se je od seva ESY7 razlikoval le v omenjeni BtCoA-dehidrogenazi.

== Analiza metabolitov biosintezne poti==
Z namenom, da bi razložili razlike med sevi in njihovo različno proizvodnjo n-butanola, so raziskovalci analizirali intermediate biosintezne poti. Razvili so LC-MS metodo za spremljanje vseh metabolitov v biosintezni poti n-butanola hkrati. Detekcija vseh metabolnih standardov je bila uspešna, prav tako je bila uspešna detekcija intermediatov (z izjemo AcAcCoA). Po 24h so bili nivoji AcCoA v sevih ESY4 in ESY7 nerazločljivi, medtem ko so bili nivoji HbCoA in BtCoA višji v sevu ESY7 kot v sevu ESY4. Pretvorba AcAcCoA v HbCoA je bila očitno uspešnejša z encimom Hbd kot z encimom PhaB. Sev ESY11, ki se je od seva ESY7 razlikoval zgolj v BtCoA-dehidrogenazi (Ccr v ESY7 in EtfAB/Bcd v ESY11), je akumuliral BtCoA, kar kaže na možno ozko grlo. S prenosom western so analizirali topnost Adhe2 in ugotovili, da je večina proteina v netopni frakciji. Povečano izražanje gena ''adhe2'' v sevu ESY11, bi lahko ublažilo akumulacijo BtCoA in izboljšalo proizvodnjo n-butanola. Raziskovalci so na podlagi rezultatov analize zaključili, da je nastanek HbCoA s HbCo-dehidrogenazo, stopnja, ki omejuje hitrost sinteze in odloča o nastanku n-butanola.

==Zaključek==
V članku je prvič predstavljena vzpostavitev biosintezne poti n-butanola v kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae''. Raziskovalci so testirali številne izoencime za različne stopnje v metabolni poti. Z izbiro ustreznih encimov so dosegli 10-kratno povečanje proizvodnje n-butanola (2,5 mg/L). Najučinkovitejši sevi so vsebovali encim 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza iz bakterije ''Clostridium beijerinckii'', ki kot kofaktor uporablja NADH, in acetoacetil-CoA transferazo iz ''S. cerevisiae'' ali iz ''E. coli''. Izražanje genov, ki kodirajo za butiril-CoA-dehidrogenazo iz ''C. beijerinckii'' (''bcd'' in ''etfAB''), ni občutno izboljšalo proizvodnje butanola, kot so to predhodno omenjali pri ''E. coli''. Z analizo metabolitov so avtorji članka ugotovil katere stopnje omenjene biosintezne poti so težavne in zato primerne za optimizacijo v prihodnosti. V članku avtorji kot vodilo za nadaljnje študije navajajo primerjavo konstruiranih sevov (2,5 mg/L) z naravnimi sevi, ki proizvajajo n-butanol – ''Clostridium'' (približno 10 g/L) in pred kratkim pripravljeni sevi ''E. coli'' (približno 0,5 g/L).

==Viri==
E.J. Steen, R. Chan, N. Prasad, S. Myers, C.J. Petzold, A. Redding , M. Ouellet, J.D. Keasling: Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol. ''Microbial Cell Factories''. 2008.7:36.

S.J. Elledge, L. MZ: SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in molecular biology. 2012.852:51-9.

Seminarji SB 2017/18

2017-11-26T16:20:13Z

Tjaša Grum:

V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# "NO problem"
#

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

---------------------------
Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

27.11. 
1 Marija Srnko 
2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku] 

28.11. 
1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
2 
3 Petra Vivod 
4 Urška Černe 

4.12. 
1 Sara Kimm Fuhrmann 
2 Anja Tanšek 

5.12. 
1 Urška Furar 
2 Tina Lekan 
3 Katja Malovrh 
4 Jernej Vidmar 

12.12. 
1 Helena Jakše 
2 Tjaša Bensa 
3 Sabina Štukelj 
4 Amadeja Lapornik 

19.12. 
1 Ana Krišelj 
2 Vanna Imširović 
3 Dominik Dekleva 
4 Neža Gaube 

9.1. 
1 Nastja Marondini 
2 Elizabeta Jevnikar 
3 Nina Roštan 
4 Barbara Lipovšek 

15.1. 
1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda] 

16.1. 
1 Inge Sotlar 
2 Marija Kisilak 
3 Nataša Traven 
4 Tina Šimunović 

22.1. 
1 Mojca Hunski 
2 Tomaž Žagar 
3 Tadej Ulčnik 
4 Jakob Rupert 

23.1. 
1 Ana Cirnski 
2 
3 
4

Seminarji SB 2017/18

2017-11-26T16:16:34Z

Tjaša Grum:

V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
#
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# "NO problem"
#

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

---------------------------
Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

27.11. 
1 Marija Srnko 
2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku] 

28.11. 
1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
2 
3 Petra Vivod 
4 Urška Černe 

4.12. 
1 Sara Kimm Fuhrmann 
2 Anja Tanšek 

5.12. 
1 Urška Furar 
2 Tina Lekan 
3 Katja Malovrh 
4 Jernej Vidmar 

12.12. 
1 Helena Jakše 
2 Tjaša Bensa 
3 Sabina Štukelj 
4 Amadeja Lapornik 

19.12. 
1 Ana Krišelj 
2 Vanna Imširović 
3 Dominik Dekleva 
4 Neža Gaube 

9.1. 
1 Nastja Marondini 
2 Elizabeta Jevnikar 
3 Nina Roštan 
4 Barbara Lipovšek 

15.1. 
1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda] 

16.1. 
1 Inge Sotlar 
2 Marija Kisilak 
3 Nataša Traven 
4 Tina Šimunović 

22.1. 
1 Mojca Hunski 
2 Tomaž Žagar 
3 Tadej Ulčnik 
4 Jakob Rupert 

23.1. 
1 Ana Cirnski 
2 
3 
4

Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola

2017-11-26T16:13:58Z

Tjaša Grum: New page: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/1475-2859-7-36#Tab1'''Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol '''] ==Uvod=...

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/1475-2859-7-36#Tab1'''Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol ''']

==Uvod==
Naraščajoči stroški energije in vse večja skrb za okolje so vplivali na razvoj proizvodnje obnovljivih goriv in kemikalij iz biomase. Trenutni standard biogoriva je etanol, vendar pa obstaja več razlogov za proizvodnjo in iskanje novih alternativ. Etanol ima namreč nizko energijsko gostoto, je higroskopen, ne da se ga napeljati po ceveh in je drag za destilacijo. V primerjavi z etanolom, je n-butanol bolj hidrofoben, ima višjo energijsko gostoto, lahko se transportira po napeljavi in se meša z bencinom v vseh razmerjih. Zaradi omenjenih lastnosti je n-butanol boljše biogorivo kot etanol. n-butanol se lahko proizvaja kemijsko iz nafte ali fermentacijsko iz različnih sevov bakterij iz rodu ''Clostridium''. Zaradi razvoja biotehnologije in podražitve nafte narašča zanimanje za fermentacijsko pridobivanje n-butanola. Vendar pa bakterije iz rodu ''Clostridium'' niso najbolj primerne za omenjeno proizvodnjo. Razlogi za to so naslednji: pomanjkanje genetskih orodij, s katerim bi lahko spreminjali njihov metabolizem, počasna rast, intoleranca na n-butanol (nad 1-2-odstotno vsebnostjo) in na kisik ter proizvodnja stranskih produktov (aceton, butirat, etanol). V članku so raziskovalci za gostiteljski organizem izbrali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae'', saj je ta genetsko obvladljiv in dobro opisan organizem, je trenutni industrijski sev, ki proizvaja etanol ter je bil v preteklosti že manipuliran za proizvodnjo drugih heterolognih metabolitov.

==Materiali in metode==
Gene bakterije ''Clostridium beijerinckii'' so klonirali iz genomske DNA. Gena ''phaA'' in ''phaB'' (iz bakterije ''Ralstonia eutropha''), gen ''adhe2'' (iz bakterije ''C. beijerinckii'') in gen ''ccr'' (iz bakterije ''Streptomyces collinus'') so bili sintetizirani. Vsi geni so bili pomnoženi s PCR s polimerazo Phusion. Začetni oligonukleotidi so bili načrtovani tako, da so imeli 30-bp dolge robne regije, ki so bile homologne insercijskim regijam (''gal1'' ali ''gal10'' promotorju in ''CYC1'', ''ADH1'' ali ''PGK1'' terminatorju) na plazmidu. Plazmide so konstruirali z metodo SLIC (od zaporedja in od ligacije neodvisno kloniranje), ki je nadgradnja metode LIC (od ligacije neodvisno kloniranje). Metoda omogoča združevanje številnih fragmentov DNA v eni sami reakciji z uporabo ''in vitro'' homologne rekombinacije in enoverižnega prileganja. Omenjena metoda posnema ''in vivo'' homologno rekombinacijo, ki so jo odkrili v ''E. coli''. Deluje na principu štrlečih koncev ssDNA v vključkih in vektorskih fragmentih, ki jih generira T4 DNA-polimeraza s svojo eksonukleazno aktivnostjo ter združevanju teh fragmentov z rekombinacijo ''in vitro''. Bakterija ''E. coli'', po transformaciji, dobljeni krožni produkt (z zarezami) enostavno popravi. SLIC vključke lahko naredimo tudi z nepopolnim PCR ali z mešanim PCR. Dodatek proteina RecA (popravlja DNA) pred transformacijo, omogoča uporabo metode tudi pri zelo majhni koncentraciji DNA (npr. 3 ng).
Konstruirani plazmidi so izhajali iz plazmida p''ADS-AMO-CRP''-opt-''LEU2D'' in pESC-''HIS''. Pomnoževanje plazmidov je potekalo v bakteriji ''E. coli''. Celice so gojili pri 37 °C v LB mediju s 100 mg/L ampicilina. Starševski sev ''S. cerevisiae'' so gojili v bogatem YPD mediju pri 30 °C; spremenjeni sevi kvasovk pa so uspevali v SD mediju brez levcina, uracila, histidina in/ali metionina. Za induciranje genov, ki so bili pod promotorjema ''GAL1'' in ''GAL10'', so seve ''S. cerevisiae'' gojili ob prisotnosti 2-odstotne galaktoze, kot edinega vira ogljika. Kvasovke so transformirali z litijevim acetatom. Sevi ESY1-11 so bili konstruirani s kotransformacijo plazmidov, tej pa je sledila selekcija na ploščah SC-LEU ali SC-LEU-HIS.
Za analizo metabolitov so zbirali po 10 mL kulture po 24h, 72h, 120h in 144h. Za detekcijo n-butanola so 10 mL vzorca dodali 2 mL internega standarda (etil acetat, ki je vseboval n-pentanol) in vorteksirali 1 min. Nato so etil acetat odstranili in nanesli na plinsko kromatografijo (GC). Kvantifikacijska analiza je bila narejena s programom Xcalibur. Analizo intermediatov biosintezne poti pa so naredili s pomočjo tekočinske kromatografije sklopljene s tandemskim masnim spektrometrom (LC-MS/MS).

== Biosintezna pot n-butanola==
Biosintezno pot so zasnovali na podlagi biosintezne poti v bakteriji ''C. beijerinckii'', kjer najprej encim tiolaza katalizira pretvorbo 2-acetil-CoA (AcCoA) v acetoacetil-CoA (AcAcCoA), slednjega nato 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v 3-hidroksibutiril-CoA (HbCoA), v naslednjem koraku pa se HbCoA s pomočjo encima krotonaza pretvori v krotonoil-CoA (CrCoA). Ta se v nadaljevanju z encimom butiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v butiril-CoA (BtCoA). Slednji produkt se nato ob prisotnosti encima butiraldehid-dehidrogenaza pretvori v butiraldehid. Zadnjo stopnjo sintezne poti pa katalizira butanol- dehidrogenaza, ki butiraldehid pretvori v butanol.

== Testiranje encimov in proizvodnja n-butanola==
Izražanje izoencimov biosintezne poti n-butanola iz različnih organizmov v ''S. cerevisiae'' privede do proizvodnje n-butanola. Za vsako reakcijo biosintezne poti so testirali več različnih encimov. Sevi ESY2, ESY3 in ESY4 so vsebovali encime iz bakterije ''R. eutropha'' (gen ''phaA'', ki kodira za tiolazo in gen ''phaB'', ki kodira za HbCoA-dehidrogenazo), ''S. collinus'' (gen ''ccr'', ki kodira za BtCoA-dehidrogenazo), ''C. beijerinckii'' (gen ''crt'', ki kodira za krotonazo in gen ''adhe2'', ki kodira za butiraldehid/butanol- dehidrogenazo), ''E. coli'' (gen ''atoB'', ki kodira za tiolazo) in iz kvasovke ''S. cerevisiae'' (gen ''ERG10'', ki kodira za tiolazo). Sevi so se razlikovali le v prvi stopnji sintezne poti (v encimu tiolaza). Encime iz ''R. eutropha'' so testirali zato, ker že obstajajo dokazi o njihovi visoki aktivnosti pri proizvajanju polihidroksialkanoatov v ''E. coli''. Ostali dve tiolazi pa so testirali zato, ker je ERG10 nativna tiolaza v ''S. cerevisiae'', encim AtoB pa zato, ker je že dokazana njegova uspešna uporaba pri prekomernem proizvajanju AcAcCoA v drugih metabolnih poteh. Izmed omenjenih sevov, je največjo količino n-butanola proizvedel sev ESY2 (1 mg/L), kar kaže na to, da je PhaA najboljša tiolaza za to biosintezno pot.
Druga skupina sevov je vsebovala različne HbCoA-dehidrogenaze. Eden teh encimov (PhaB) kot kofaktor uporablja NADPH, drugi encim (Hbd) pa uporablja NADH. Najuspešnejši je bil sev ESY7 (''ERG10'', ''hbd''), ki je v primerjavi s prejšnjim najboljšim sevom (ESY2- ''phaA'', ''phaB'' ) podvojil količino proizvedenega n-butanola in dosegel količino 2,5 mg/L. Raziskovalcem se to ni zdelo presenetljivo, saj je omenjeni sev vseboval ERG10, ki je nativna tiolaza ter Hbd, ki uporablja NADH, ki ga je v fermentacijskih pogojih na voljo v zadostni količini. Opazili so tudi, da je sev, ki vsebuje gen za encim PhaA, v kombinaciji s Hbd manj učinkovit kot s PhaB. Mogoče je, da sta bila PhaA in PhaB med evolucijo optimizirana, da sodelujeta za boljšo proizvodnjo polihidroksibutirata v bakteriji ''R. eutropha''.
S konstruiranjem zadnjega seva (ESY11) so preverili, če katera od alternativnih BtCoA-dehidrogenaz, za katere je bilo dokazano, da znatno povečajo proizvodnjo n-butanola v ''E. coli'', poveča količino n-butanola v primerjavi s sevom ESY7. Sev ESY11, ki je izražal encime Bcd (BtCoA-dehidrogenaza) in EtfAB (dva elektron prenašalna flavoproteina A in B) iz bakterije ''C. beijerinckii'', ni občutno povečal proizvodnje n-butanola. ESY11 je bil drugi najuspešnejši sev in se je od seva ESY7 razlikoval le v omenjeni BtCoA-dehidrogenazi.

== Analiza metabolitov biosintezne poti==
Z namenom, da bi razložili razlike med sevi in njihovo različno proizvodnjo n-butanola, so raziskovalci analizirali intermediate biosintezne poti. Razvili so LC-MS metodo za spremljanje vseh metabolitov v biosintezni poti n-butanola hkrati. Detekcija vseh metabolnih standardov je bila uspešna, prav tako je bila uspešna detekcija intermediatov (z izjemo AcAcCoA). Po 24h so bili nivoji AcCoA v sevih ESY4 in ESY7 nerazločljivi, medtem ko so bili nivoji HbCoA in BtCoA višji v sevu ESY7 kot v sevu ESY4. Pretvorba AcAcCoA v HbCoA je bila očitno uspešnejša z encimom Hbd kot z encimom PhaB. Sev ESY11, ki se je od seva ESY7 razlikoval zgolj v BtCoA-dehidrogenazi (Ccr v ESY7 in EtfAB/Bcd v ESY11), je akumuliral BtCoA, kar kaže na možno ozko grlo. S prenosom western so analizirali topnost Adhe2 in ugotovili, da je večina proteina v netopni frakciji. Povečano izražanje gena ''adhe2'' v sevu ESY11, bi lahko ublažilo akumulacijo BtCoA in izboljšalo proizvodnjo n-butanola. Raziskovalci so na podlagi rezultatov analize zaključili, da je nastanek HbCoA s HbCo-dehidrogenazo, stopnja, ki omejuje hitrost sinteze in odloča o nastanku n-butanola.

==Zaključek==
V članku je prvič predstavljena vzpostavitev biosintezne poti n-butanola v kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae''. Raziskovalci so testirali številne izoencime za različne stopnje v metabolni poti. Z izbiro ustreznih encimov so dosegli 10-kratno povečanje proizvodnje n-butanola (2,5 mg/L). Najučinkovitejši sevi so vsebovali encim 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza iz bakterije ''Clostridium beijerinckii'', ki kot kofaktor uporablja NADH, in acetoacetil-CoA transferazo iz ''S. cerevisiae'' ali iz ''E. coli''. Izražanje genov, ki kodirajo za butiril-CoA-dehidrogenazo iz ''C. beijerinckii'' (''bcd'' in ''etfAB''), ni občutno izboljšalo proizvodnje butanola, kot so to predhodno omenjali pri ''E. coli''. Z analizo metabolitov so avtorji članka ugotovil katere stopnje omenjene biosintezne poti so težavne in zato primerne za optimizacijo v prihodnosti. V članku avtorji kot vodilo za nadaljnje študije navajajo primerjavo konstruiranih sevov (2,5 mg/L) z naravnimi sevi, ki proizvajajo n-butanol – ''Clostridium'' (približno 10 g/L) in pred kratkim pripravljeni sevi ''E. coli'' (približno 0,5 g/L).

==Viri==
E.J. Steen, R. Chan, N. Prasad, S. Myers, C.J. Petzold, A. Redding , M. Ouellet, J.D. Keasling: Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol. ''Microbial Cell Factories''. 2008.7:36.

S.J. Elledge, L. MZ: SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in molecular biology. 2012.852:51-9.

Seminarji SB 2017/18

2017-11-16T15:51:19Z

Tjaša Grum:

Seminarji SB 2017/18

2017-11-16T15:47:39Z

Tjaša Grum:

MBT seminarji 2017

2017-05-21T19:04:34Z

Tjaša Grum:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Enhancing digestibility and ethanol yield of ''Populus'' wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase (Y. Cai ''et al''; Nature Communications 7, 2016; http://www.nature.com/articles/ncomms11989) [[Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem mutirane monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus]]. Inge Sotlar, 17. maj 2017
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5) [[Litična polisaharid monooksigenaza PaLPMO9H, iz glive Podospora anserina, katalizira oksidativno cepitev raznolikih matričnih glikanov celične stene rastlin]]. Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 [[Metabolno inženirstvo in vitro za proizvodnjo bioelektrike preko popolne oksidacije glukoze]] Barbara Dušak
# Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties (M. Eichenberger in sodelavci; Metabolic Engineering 39, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859) [[Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.]]Tjaša Grum, 24. maj 2017
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (7. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Danijela Jošić
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

User:Tjaša Grum

2017-05-21T19:00:49Z

Tjaša Grum: User:Tjaša Grum moved to Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.

#REDIRECT [[Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.]]

Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.

2017-05-21T19:00:49Z

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859 '''Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties''']

Dihidrohalkoni (DHC) so sekundarni rastlinski metaboliti, ki vsebujejo molekule, ki so zanimive za uporabo kot antioksidanti, antidiabetiki in sladila. Nahajajo se v številnih rastlinah, med drugim tudi v grozdju, malinah in jabolkih. Dihidrohalkoni imajo skelet iz 1,3-difenilpropan-1-on-a. Poznamo več kot 200 strukturno različnih dihidrohalkonov. Funkcionalna vloga teh spojin v rastlinah je zaenkrat slabo poznana, veliko pa je zanimanja za njihove učinke za zdravje ljudi.

==Uporaba DHC-jev==
Florizin je hipoglikemično sredstvo in deluje tako, da zavira glukozna transporterja SGLT1 in SGLT2, ki sodelujeta pri absorpciji glukoze v črevesju in reabsorpciji v ledvicah. Uporabili so ga za osnovo pri načrtovanju več kot desetih antidiabetičnih zdravil, trije od teh so bili odobreni s strani FDA in EMA.
Aspalatin in notofagin imata močne antioksidantne učinke in se nahajata v rooibos-u (''Aspalathus linearis'').
Naringin dihidrohalkon (NDC) in neohesperidin dihidrohalkon (NHDC) sta sladili z 1-kratno in 20-kratno sladkostjo saharina, ki ju lahko kemično sintetiziramo iz citrusnih flavanonov. Neohesperidin dihidrohalkon je v Evropi odobren za uporabo kot aditiv v prehrani (E959).

==Metode dela==
Za subkloniranje genov so uporabili celice ''E. coli''. Kodirajoča zaporedja za izbrane encime so pomnožili s PCR in jih klonirali v ekspresijske kasete plazmidov. Te so z ''in vivo'' homologno rekombinacijo (metoda DNA »assembler«) združili v multiekspresijske plazmide. Vsi eksperimenti (izražanje biosinteznih poti) so potekali v ''S. Cerevisiae''.

==Testiranje reduktaz dvojnih vezi (DBR) za proizvodnjo floretina v kvasovkah==
Pomemben korak pri proizvodnji DHC-jev je redukcija α,β-dvojne vezi v p-kumaroil-CoA. Raziskovalci so testirali reduktaze iz jabolk, ki so bile predhodno omenjene v različnih študijah, vendar z nobenim od teh encimov niso dosegli uspešne aktivnosti v kvasovkah. Namesto tega so izkoristili stransko aktivnost nativne dolgoverižne enoil-CoA reduktaze ScTsc13 iz kvasovke. S čezmernim izražanjem omenjenega encima so uspešno reducirali dvojno vez v p-kumaroil-CoA in dobili floretin. Nastanek naringenina (obsežnega stranskega produkta osnovne poti) pa so znatno zmanjšali z uporabo visoko specifične halkon-sintaze (CHS) iz ječmena.

==Uporaba ScTsc13 za proizvajanje pinocembrin DHC-ja==
Večina naravno prisotnih DHC-jev izvira iz floretina, nekatere rastline (''Uvaria angolensis'', ''Mitrella kentia'') kopičijo tudi DHC-je, ki nimajo 4-hidroksi skupine. To pomeni, da najverjetneje izhajajo iz pinocembrin DHC-ja in nastanejo s pomočjo encima CHS iz dihidrokiscinamoil-CoA in treh enot malonil-CoA. Ustvarili so seva PIN1 in PIN2, ki sta vsebovala pot za pinocembrin (''AtPAL2'', ''At4CL2'' in ''HaCHS'') z ali brez prekomerno izraženega ''ScTSC13''. Sev PIN1 z nativnim izražanjem ''ScTSC13'', je proizvedel 1.47 ± 0.07 mg/l pinocembrin DHC-ja poleg 11.6 ± 0.3 mg/l pinocembrina. Prekomerno izražanje ''ScTSC13'' v sevu PIN2, je povečalo proizvajanje pinocembrin DHC-ja na 0.43 ± 0.06 mg/l. To dokazuje, da je tudi cinamoil-CoA substrat ScTsc13.

==Proizvodnja derivatov floretina==
V študiji so opisali tudi proizvodnjo monoglikoziliranih DHC-jev (florezina in notofagina) in NDC-jev z uporabo poznanih od UDP odvisnih glikoziltransferaz (UGT) ter proizvodnjo 3-hidroksifloretina. Proizvodnja različnih derivatov floretina je bila uspešna z dodatkom encimov z znano aktivnostjo za DHC-je ali z izkoriščanjem substratov encimov, ki so naravno prisotni pri biosintezi flavonoidov ali halkonov.

==Zaključek==
V študiji poročajo o ''de novo'' proizvodnji številnih DHC-jev v mikrobnem gostitelju, z izražanjem celotnih biosinteznih poti, ki vsebujejo 4-9 genov. Raziskovalcem je uspela proizvodnja antioksidanta notofagina, antidiabetika florizina, sladke molekule naringin dihidrohalkona in 3-hidroksifloretina. V študiji je bila heterologna proizvodnja DHC-jev še kar obsežna, vendar pa bi bilo za ekonomsko izvedljiv industrijski proces potrebno precejšnje zvišanje proizvodnje omenjenih spojin.

==Viri==
M.Eichenberger, B.J. Lehka, C. Folly, D. Fischer, S. Martens, E. Simón, M. Naesby: Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for de novo production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties. Metabolic Engineering. 2017, 39, 80–89.

Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.

2017-05-21T18:22:07Z

Tjaša Grum: New page: [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859 '''Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antio...

MBT seminarji 2017

2017-05-15T12:22:46Z

Tjaša Grum:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Enhancing digestibility and ethanol yield of ''Populus'' wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase (Y. Cai ''et al''; Nature Communications 7, 2016; http://www.nature.com/articles/ncomms11989) Inge Sotlar, 17. maj 2017
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 Barbara Dušak
# Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties (M. Eichenberger in sodelavci; Metabolic Engineering 39, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859) Metabolno inženirstvo kvasovke ''Saccharomyces cerevisiae ''za namen ''de novo'' proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom. Tjaša Grum, 24. maj 2017
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Danijela Jošić
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].