Wiki FKKT - User contributions [en]

2017-bionano-seminar

2017-03-16T20:14:15Z

Tjaša Lapanja:

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja
|-
! Peter Prezelj
| 22.03.17 || Spreminjanje vsebnosti in karakteristik hranilnih snovi v živilih in pripravljeni hrani z uporabo kovalentnih modifikacij, prečnega povezovanja in encimov
|-
! Boštjan Petrič
| 22.03.17 || Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi
|-
! Ema Guštin
| 22.03.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Tjaša Lapanja
| 29.03.17 || Modificirana CHO celična linija prilagojena za ultrazvočno indukcijo izražanja proteinov v industrijskih bioreaktorjih
|-
! Maruša Prolič Kalinšek
| 29.03.17 || Senzor za detekcijo Legionella bakterij na osnovi polidiacetilena
|-
! Domen Klofutar
| 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula
|-
! Simon Bolta
| 05.04.17 || Sinteza inzulina pri sladkornih bolnikih neposredno po povišanju krvnega sladkorja
|-
! Tomaž Rozmarič
| 05.04.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Urša Kapš
| 05.04.17 || Nanodelci za strjevanje krvi
|-
! Julija Mazej
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Nataša Žigante
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Anja Herceg
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mirjam Kmetič
| 19.04.17 || Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib
|-
! Mojca Kostanjevec
| 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (cepiva in si-RNA - EpCAM) z uporabo nanodiskov
|-
! Jan Rozman
| 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo
|-
! Barbara Dušak
| 03.05.17 || Izboljšava gojenja mesa n vitro
|-
! Mateja Cigoj
| 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.
|-
! Toni Nagode
| 03.05.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Tim Božič
| 10.05.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Darja Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Petra Tavčar
| 10.05.17 || Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov
|-
! Marjeta Horvat
| 17.05.17 || FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa
|-
! Danijela Jošić
| 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.
|-
! Tina Kuhar
| 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.
|-
! Nika Strašek
| 24.05.17 || Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom
|-
! Eva Vidak
| 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''
|-
! Alja Zgonc
| 24.05.17 || Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni
|-
! Zala Gluhić
| 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.
|-
! Judita Avbelj
| 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.
|-
! Vid Jazbec
| 31.05.17 || Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.
|-
! Vita Vidmar
| 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic
|-
! Luka Kavčič
| 07.06.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Mojca Juteršek
| 07.06.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Bojana Lazović
| 07.06.17 || Poenostavljen pristop k razvoju novih senzorjev FRET (Förster resonance energy transfer)
|-
! Eva Korošec
| 07.06.17 || Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.
|-
! Tajda Buh
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.
Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro

2017-03-13T11:39:54Z

Tjaša Lapanja:

'''High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity in vitro'''

Humani tkivni aktivator plazminogena je serinska proteaza, ki pretvori plazminogen v aktivno obliko, s čimer igra ključno vlogo pri razgradnji fibrinskega čepa. V medicini se humani aktivoator plazminogena uporablja za lajšanje bolezni, ki vključujejo trombozo, na primer miokardni infarkt, cerebralno trombozo in različne oblike vaskularnega embolizma.
Tkivni aktivator plazminogena je 70 kDa velik monomerni glikoprotein, sestavljen iz petih domen:

* Domena prstov, ki vključuje vezavno mesto za fibrin (F)
* Domena epidermalnega rastnega faktorja z vezavnim mestom za membranski receptor jeternih celic (E)
* Kringle1 domena (K1)
* Kringle 2 domena z drugim vezavnim mestom za fibrin (K2)
* Proteazna domena (P)

Ugotovili so, da sta domeni, ki vežeta fibrin (F in K2) znižujeta aktivnost encima. Če iz proteina odstranimo F domeno zmanjšamo moč vezave in pospešimo trombolizo. Domeni E in K1 sta ključni za odstranjevane tkivnega aktivatorja plazminogena iz sistema. Domena P ima proteazno aktivnost. Rekombinantni tkivni aktivator plazminogena brez domen F, E in K1 ima večjo stabilnost in nižjo stopnjo razgradnje v jetrih ter s tem podaljšano življensko dobo, hkrati pa ima večjo encimsko aktivnost.
Uporaba mlečnih žlez za produkcijo rekombinantnih proteinov omogoča visoko produktivnost in nizko ceno produkcije, enostavno izolacijo proteinov in pravilne posttranslacijske modifikacije rekombinantnega proteina. Uporaba zajcev za produkcijo proteinov v mleku je zanimiva zaradi enostavne in poceni vzgoje, velikega legla in kratke gastracijske dobe.

== Materiali in metode ==

Genski konstrukt so sestavljale 3' in 5' regije regulatornega gena za kozji β-kazein, med katere je bil vstavljen gen za rekombinantni humani tkivni aktivator plazminogena (samo fibrin vezavna domena K2 in encimsko aktivna domena P), pod kontrolo CMV promotorja. Konstrukt je bil pomnožen v plazmidu PCL25, na robovih pa je imel restrikcijska mesta za restriktazi Sal I in Not I, s katerima so 17 kb dolg konstrukt izrezali iz plazmida. Očiščen konstrukt so z metodo mikroiniciranja vnesli v oplojena jajčeca, embrije pa prenesli v samice. Med skotenimi mladiči so z verižno reakcijo s polimerazo identificirali transgenske živali. Vsebnost rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenih samic so določili z encimskim imunskim testom (ELISA)in Western prenosom, njegovo aktivnost pa s testom z agarozno ploščo s fibrinom (FAPA).

== Rezultati in diskusija ==

Po mikroinicjiranju so 326 embrijev prenesli v 15 samic, skotilo se je 57 zajcev. Z verižno reakcijo s polimerazo so identificirali 18 transgenskih zajcev, 12 samic in 6 samcev. Med laktacijo so analizirali mleko samic.

Z encimskim imunskim testom so s pomočjo umeritvene krivulje določali izražanje rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena. Med 12 transgenskimi samicami jih je 6 izražalo transgen protein v koncentraciji med 15,2 in 630 μg/mL. Z encimskim imunskim testom so določali tudi ektopično izražanje, rezultati kažejo, da v krvi in slini zajcev ni bilo prisotnega transgenega proteina. Z Western prenosom so pokazali, da ima rekombinantni humani aktivator plazminogena, izražen v mleku zajcev pravo velikost, 36 kDa.
Specifična aktivnost je bila določena s FAPA testom, pri katerem plazmin, ki ga aktivira tkivni aktivator plazminogena, razgradi fibrin, kar se kaže kot prosojni krog na agarozni plošči. Aktivnost tkivnega aktivatorja plazminogena se določi preko polmera kroga, umerja se na standard, ki ga predstavlja aktivnost alteplaze. Specifična aktivnost je bila določena iz razmerja aktivnosti encima (določena s FAPA testom) in koncentracije encima (določena z ELISA testom). Specifična aktivnost je bila do 360-krat večja kot pri alteplazi.
V raziskavi so pokazali da lahko v zajčjem mleku proizvajamo rekombinantni humanega aktivatorja plazminogena z visoko specifično aktivnostjo, kar bi lahko nadomestilo produkcijo v rekombinantnih bakterijah in celičnih linijah.

[[MBT seminarji 2017]]

Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro

2017-03-13T11:38:20Z

Tjaša Lapanja:

Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro

2017-03-13T11:33:24Z

Tjaša Lapanja: New page: '''High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity in vitro''' Humani tkivni aktivator p...

'''High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity in vitro'''

Humani tkivni aktivator plazminogena je serinska proteaza, ki pretvori plazminogen v aktivno obliko, s čimer igra ključno vlogo pri razgradnji fibrinskega čepa. V medicini se humani aktivoator plazminogena uporablja za lajšanje bolezni, ki vključujejo trombozo, na primer miokardni infarkt, cerebralno trombozo in različne oblike vaskularnega embolizma.
Tkivni aktivator plazminogena je 70 kDa velik monomerni glikoprotein, sestavljen iz petih domen:

* Domena prstov, ki vključuje vezavno mesto za fibrin (F)
* Domena epidermalnega rastnega faktorja z vezavnim mestom za membranski receptor jeternih celic (E)
* Kringle1 domena (K1)
* Kringle 2 domena z drugim vezavnim mestom za fibrin (K2)
* Proteazna domena (P)

Ugotovili so, da sta domeni, ki vežeta fibrin (F in K2) znižujeta aktivnost encima. Če iz proteina odstranimo F domeno zmanjšamo moč vezave in pospešimo trombolizo. Domeni E in K1 sta ključni za odstranjevane tkivnega aktivatorja plazminogena iz sistema. Domena P ima proteazno aktivnost. Rekombinantni tkivni aktivator plazminogena brez domen F, E in K1 ima večjo stabilnost in nižjo stopnjo razgradnje v jetrih ter s tem podaljšano življensko dobo, hkrati pa ima večjo encimsko aktivnost.
Uporaba mlečnih žlez za produkcijo rekombinantnih proteinov omogoča visoko produktivnost in nizko ceno produkcije, enostavno izolacijo proteinov in pravilne posttranslacijske modifikacije rekombinantnega proteina. Uporaba zajcev za produkcijo proteinov v mleku je zanimiva zaradi enostavne in poceni vzgoje, velikega legla in kratke gastracijske dobe.

==Materiali in metode==

Genski konstrukt so sestavljale 3' in 5' regije regulatornega gena za kozji β-kazein, med katere je bil vstavljen gen za rekombinantni humani tkivni aktivator plazminogena (samo fibrin vezavna domena K2 in encimsko aktivna domena P), pod kontrolo CMV promotorja. Konstrukt je bil pomnožen v plazmidu PCL25, na robovih pa je imel restrikcijska mesta za restriktazi Sal I in Not I, s katerima so 17 kb dolg konstrukt izrezali iz plazmida. Očiščen konstrukt so z metodo mikroiniciranja vnesli v oplojena jajčeca, embrije pa prenesli v samice. Med skotenimi mladiči so z verižno reakcijo s polimerazo identificirali transgenske živali. Vsebnost rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenih samic so določili z encimskim imunskim testom (ELISA)in Western prenosom, njegovo aktivnost pa s testom z agarozno ploščo s fibrinom (FAPA).

==Rezultati in diskusija==

Po mikroinicjiranju so 326 embrijev prenesli v 15 samic, skotilo se je 57 zajcev. Z verižno reakcijo s polimerazo so identificirali 18 transgenskih zajcev, 12 samic in 6 samcev. Med laktacijo so analizirali mleko samic.

Z encimskim imunskim testom so s pomočjo umeritvene krivulje določali izražanje rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena. Med 12 transgenskimi samicami jih je 6 izražalo transgen protein v koncentraciji med 15,2 in 630 μg/mL. Z encimskim imunskim testom so določali tudi ektopično izražanje, rezultati kažejo, da v krvi in slini zajcev ni bilo prisotnega transgenega proteina. Z Western prenosom so pokazali, da ima rekombinantni humani aktivator plazminogena, izražen v mleku zajcev pravo velikost, 36 kDa.
Specifična aktivnost je bila določena s FAPA testom, pri katerem plazmin, ki ga aktivira tkivni aktivator plazminogena, razgradi fibrin, kar se kaže kot prosojni krog na agarozni plošči. Aktivnost tkivnega aktivatorja plazminogena se določi preko polmera kroga, umerja se na standard, ki ga predstavlja aktivnost alteplaze. Specifična aktivnost je bila določena iz razmerja aktivnosti encima (določena s FAPA testom) in koncentracije encima (določena z ELISA testom). Specifična aktivnost je bila do 360-krat večja kot pri alteplazi.
V raziskavi so pokazali da lahko v zajčjem mleku proizvajamo rekombinantni humanega aktivatorja plazminogena z visoko specifično aktivnostjo, kar bi lahko nadomestilo produkcijo v rekombinantnih bakterijah in celičnih linijah.

MBT seminarji 2017

2017-03-13T11:13:38Z

Tjaša Lapanja:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

[[Link title]]

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Jerneja Kocutar
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) Mechano rastni faktor-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za inženirstvo tkiva ligamentov. Peter Prezelj, 29. marca 2017
#Domen Klofutar

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Ema Guštin <3
# Jan Rozman
# Alja Zgonc

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir
# Petra Vivod
# Marija Kisilak

'''Cepiva''' (19. april) 
#Tomaž Rozmarič
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
#Vid Jazbec <3 <3
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Nataša Traven
# Bine Tršavec
#

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# Anja Tanšek

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-03-13T11:12:18Z

Tjaša Lapanja:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

[[Link title]]

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Jerneja Kocutar
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost ''in vitro'']]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) Mechano rastni faktor-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za inženirstvo tkiva ligamentov. Peter Prezelj, 29. marca 2017
#Domen Klofutar

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Ema Guštin <3
# Jan Rozman
# Alja Zgonc

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir
# Petra Vivod
# Marija Kisilak

'''Cepiva''' (19. april) 
#Tomaž Rozmarič
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
#Vid Jazbec <3 <3
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Nataša Traven
# Bine Tršavec
#

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# Anja Tanšek

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-03-13T11:10:49Z

Tjaša Lapanja:

MBT seminarji 2017

2017-03-13T11:08:09Z

Tjaša Lapanja:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

[[Link title]]

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Jerneja Kocutar
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega plazminogen aktivatorja v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) Mechano rastni faktor-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za inženirstvo tkiva ligamentov. Peter Prezelj, 29. marca 2017
#Domen Klofutar

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Ema Guštin <3
# Jan Rozman
# Alja Zgonc

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir
# Petra Vivod
# Marija Kisilak

'''Cepiva''' (19. april) 
#Tomaž Rozmarič
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
#Vid Jazbec <3 <3
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Nataša Traven
# Bine Tršavec
#

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# Anja Tanšek

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-03-01T19:44:40Z

Tjaša Lapanja:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti ''Streptococcus pneumoniae'' v kloroplastih alge ''Chlamydomonas reinhardtii''. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) Bioinženiring rastlinske kulture ''Capsium frutescens'' z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
#

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Jerneja Kocutar
# Tjaša Lapanja
#

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Ana Cirnski

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) Mechano rastni faktor-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za inženirstvo tkiva ligamentov. Peter Prezelj, 29. marca 2017
#Domen Klofutar

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# HIV antibodies for treatment of HIV infection (D. M. Margolis; Immunological reviews, 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imr.12506/full). Protitelesa HIV za zdravljenje okužbe s HIV. Ema Guštin, 5. april 2017
# Jan Rozman
# Alja Zgonc

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir
# Petra Vivod
#

'''Cepiva''' (19. april) 
#Tomaž Rozmarič
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
#Vid Jazbec <3
#
#

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
#
#

'''Encimi''' (10. maj) 
#
#
#

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
#
#
#

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# Matic Kovačič
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
#
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

Negativna avtoregulacija pospeši odzivni čas transkripcijskih omrežij

2017-01-15T18:57:54Z

Tjaša Lapanja: /* Potek eksperimenta in rezultati */

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12417193 Negative Autoregulation Speeds the Response Times of Transcription Networks]

Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.

Pri proučevanju regulatornih mrež opazimo pogost motiv negativne avtoregulacije, kjer transkripcijski faktorji negativno regulirajo lastno transkripcijo. Omenjen sistem je, na primer, pri ''E.coli'' prisoten pri več kot 40% transkripcijskih faktorjev, pri čemer gre večinoma za globalne transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri odzivu na stres in regulaciji metabolizma.

Dokazali so, da negativna avtoregulacija zmanjša razlike v koncentraciji transkripcijskih faktorjev med celicami v stacionarni fazi, v članku pa avtorji predstavljajo nov pogled na pomen negativne avtoregulacije, vpliv na kinetiko transkripcije.

==Modeliranje==

Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z DNA, in negativno avtoreguliranega vezja, katerega produkt zavira lastno izražanje. Vezji sta dizajnirani tako, da dosežeta enako stacionarno stanje.

V obeh modelih so koncentracijo proteina določali z razliko med produkcijo in redčenjem koncentracije proteina, ker pa so v modelu uporabili dolgožive proteine so predpostavili, da se koncentracija zmanjšuje le zaradi rasti celice in celičnih delitev, vpliv razgradnje pa so zanemarili. Kot merilo odzivnosti sistema je bil uporabljen vzponski čas, čas potreben, da se koncentracija proteina povzpne na polovico maksimalne koncentracije ob polno induciranem promotorju.
Za enostavno transkripcijsko enoto, ki od aktivacije naprej stalno proizvaja maksimalno količino transkripta, ob opisanih predpostavkah velja, da se razlika med koncentracijo proteina v celici in maksimalno koncentracijo proteina ob vsaki celični delitvi zmanjša za polovico. Vzponski čas enostavne transkripcijske enote je torej enak enemu celičnemu ciklu.

Pri negativno avtoreguliranem genskem vezju je produkcija proteina odvisna od koncentracije produkta. Avtorji so predpostavili, da aktivnost promotorja deluje po principu, ki sovpada z Michaelis-Mentenovo kinetiko. Produkcija proteina je odvisna od treh parametrov, produkcije ob polni aktivnosti, koncentracije produkta v celici in konstante disociacije represorja z lastnega promotorja. Ob uporabi močnega avtorepresorja se lahko konstanto disociacije zanemari. Ob analizi tako poenostavljene enačbe so ugotovili, da je vzponski čas koncentracije produkta negativno avtoregulirane transkripcijske enote 0,21 podvojitvenega časa . Vzponski čas lahko dodatno zmanjša kooperativnost med večimi represorji, analize so pokazale, da lahko ob kooperativnosti štirih represorjev vzponski čas zmanjšamo na 0,01 podvojitvenega časa.

Na delovanje represiranega sistema lahko vpliva tudi nekaj minutni zamik, ki nastane med iniciacijo transkripcije in oblikovanjem aktivnega represorja zaradi časa potrebnega za sintezo mRNA, translacijo, zvijanje proteina in nastanek kompleksov. Raziskovalci so z modelom pokazali, da ima ta zamik pomembno vlogo pri odzivnosti sistema. Večji kot je zamik med iniciacijo produkcije in nastankom aktivnega represorja, manjši je vzponski čas. Sistem ima tudi slabost, ki pa se pokaže predvsem v primeru, ko je promotor tako močan, da v času zamika že proizvede količino mRNA, primerljivo s koncentracijo v stacionarnem stanju, saj je v tem primeru v času, ko postanejo prvi represorji aktivni v procesu sinteze že velika količina novih represorjev, katerih nastanka ne moremo več zaustaviti. Tako dobimo velik presežek represorjev, kar je nezaželeno zaradi povečane cene produkcije, metabolnega bremena in možnih toksičnih vplivov presežne koncentracije represorja. Hkrati se velike koncentracije represorja le počasi redčijo iz sistema, ko ga izklopimo,kar poslabša odzivnost sistema.

==Eksperimentalna primerjava sistemov==

===Biološki sistemi in vezja===

Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano <ref name="serrano">Serrano L, Becksei A. [http://www.nature.com/nature/journal/v405/n6786/full/405590a0.html Engineering stability in gene networks by autoregulation]. Nature 2000 (Vol. 405), 590-593.</ref>. Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''E.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

===Potek eksperimenta in rezultati===

Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom (aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (1012 M-1) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke, ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se Tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

==Diskusija in zaključki==

Primerjava dveh sistemov za uravnavanje izražanja genov je pokazala, da negativno reguliran sistem poveča hitrost odziva za približno petkrat. Za enostavne transkripcijske kaskade z dolgoživimi proteini je namreč znano, da se na dani stimuli odziva zelo počasi. Prvi produkti sicer nastanejo že v roku minut, polovica maksimalne koncentracije pa je dosežena šele v času enega celičnega cikla.

Za razliko od tega pa se koncentracija proteinov pod avtoreguliranim promotorjem dvigne zelo hitro, polovico maksimalne koncentracije dosežejo že po petini celičnega cikla. Sistema se razlikujeta predvsem v moči promotorja, avtoregulirani sistem uporablja mnogo močnejši promotor, ki je odgovoren za hiter porast mRNA in posledično proteinov v celici. Zaradi negativne avtoregulacije, ki ob prisotnosti produkta inhibira transkripcijo se le ta kmalu upočasni in doseže stacionarno stanje. Koncentracija produkta ob stacionarnem stanju je enaka stacionarni koncentraciji produkta, ki ga proizvaja preprosto negativno regulirano vezje ob prisotnosti šibkejšega promotorja.
Omenjeno preprosto vezje bi ob uporabi močnega promotorja, uporabljenega v avtoreguliranem vezju doseglo enako visoko koncentracijo še hitreje avtoregulirano vezje, a bi bila koncentracija v stacionarnem stanju v tem primeru mnogo višja. Previsoka koncentracija proteina pa je nezaželena, saj predstavlja nepotrebna produkcija proteina metabolno breme, hkrati pa lahko protein doseže koncentracijo, pri kateri postane toksičen. Prevelika koncentracija proteina predstavlja težavo tudi pri odzivnosti sistema, saj je potrebno dolgo časa, da se razredči oziroma razgradi.

Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje, kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.<ref name="rosenfeld">Rosenfeld N, Elowitz B. M., Alon U. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12417193 Negative Autoregulation Speeds the Response Times of Transcription Networks]. J. Mol. Biol (2002) 323, 785-793.</ref>

==Viri==
<references />

Negativna avtoregulacija pospeši odzivni čas transkripcijskih omrežij

2017-01-15T18:57:22Z

Tjaša Lapanja: /* Potek eksperimenta in rezultati */

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12417193 Negative Autoregulation Speeds the Response Times of Transcription Networks]

Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.

Pri proučevanju regulatornih mrež opazimo pogost motiv negativne avtoregulacije, kjer transkripcijski faktorji negativno regulirajo lastno transkripcijo. Omenjen sistem je, na primer, pri ''E.coli'' prisoten pri več kot 40% transkripcijskih faktorjev, pri čemer gre večinoma za globalne transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri odzivu na stres in regulaciji metabolizma.

Dokazali so, da negativna avtoregulacija zmanjša razlike v koncentraciji transkripcijskih faktorjev med celicami v stacionarni fazi, v članku pa avtorji predstavljajo nov pogled na pomen negativne avtoregulacije, vpliv na kinetiko transkripcije.

==Modeliranje==

Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z DNA, in negativno avtoreguliranega vezja, katerega produkt zavira lastno izražanje. Vezji sta dizajnirani tako, da dosežeta enako stacionarno stanje.

V obeh modelih so koncentracijo proteina določali z razliko med produkcijo in redčenjem koncentracije proteina, ker pa so v modelu uporabili dolgožive proteine so predpostavili, da se koncentracija zmanjšuje le zaradi rasti celice in celičnih delitev, vpliv razgradnje pa so zanemarili. Kot merilo odzivnosti sistema je bil uporabljen vzponski čas, čas potreben, da se koncentracija proteina povzpne na polovico maksimalne koncentracije ob polno induciranem promotorju.
Za enostavno transkripcijsko enoto, ki od aktivacije naprej stalno proizvaja maksimalno količino transkripta, ob opisanih predpostavkah velja, da se razlika med koncentracijo proteina v celici in maksimalno koncentracijo proteina ob vsaki celični delitvi zmanjša za polovico. Vzponski čas enostavne transkripcijske enote je torej enak enemu celičnemu ciklu.

Pri negativno avtoreguliranem genskem vezju je produkcija proteina odvisna od koncentracije produkta. Avtorji so predpostavili, da aktivnost promotorja deluje po principu, ki sovpada z Michaelis-Mentenovo kinetiko. Produkcija proteina je odvisna od treh parametrov, produkcije ob polni aktivnosti, koncentracije produkta v celici in konstante disociacije represorja z lastnega promotorja. Ob uporabi močnega avtorepresorja se lahko konstanto disociacije zanemari. Ob analizi tako poenostavljene enačbe so ugotovili, da je vzponski čas koncentracije produkta negativno avtoregulirane transkripcijske enote 0,21 podvojitvenega časa . Vzponski čas lahko dodatno zmanjša kooperativnost med večimi represorji, analize so pokazale, da lahko ob kooperativnosti štirih represorjev vzponski čas zmanjšamo na 0,01 podvojitvenega časa.

Na delovanje represiranega sistema lahko vpliva tudi nekaj minutni zamik, ki nastane med iniciacijo transkripcije in oblikovanjem aktivnega represorja zaradi časa potrebnega za sintezo mRNA, translacijo, zvijanje proteina in nastanek kompleksov. Raziskovalci so z modelom pokazali, da ima ta zamik pomembno vlogo pri odzivnosti sistema. Večji kot je zamik med iniciacijo produkcije in nastankom aktivnega represorja, manjši je vzponski čas. Sistem ima tudi slabost, ki pa se pokaže predvsem v primeru, ko je promotor tako močan, da v času zamika že proizvede količino mRNA, primerljivo s koncentracijo v stacionarnem stanju, saj je v tem primeru v času, ko postanejo prvi represorji aktivni v procesu sinteze že velika količina novih represorjev, katerih nastanka ne moremo več zaustaviti. Tako dobimo velik presežek represorjev, kar je nezaželeno zaradi povečane cene produkcije, metabolnega bremena in možnih toksičnih vplivov presežne koncentracije represorja. Hkrati se velike koncentracije represorja le počasi redčijo iz sistema, ko ga izklopimo,kar poslabša odzivnost sistema.

==Eksperimentalna primerjava sistemov==

===Biološki sistemi in vezja===

Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano <ref name="serrano">Serrano L, Becksei A. [http://www.nature.com/nature/journal/v405/n6786/full/405590a0.html Engineering stability in gene networks by autoregulation]. Nature 2000 (Vol. 405), 590-593.</ref>. Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''E.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

===Potek eksperimenta in rezultati===

Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom (aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (1012 M-1) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke, ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

==Diskusija in zaključki==

Primerjava dveh sistemov za uravnavanje izražanja genov je pokazala, da negativno reguliran sistem poveča hitrost odziva za približno petkrat. Za enostavne transkripcijske kaskade z dolgoživimi proteini je namreč znano, da se na dani stimuli odziva zelo počasi. Prvi produkti sicer nastanejo že v roku minut, polovica maksimalne koncentracije pa je dosežena šele v času enega celičnega cikla.

Za razliko od tega pa se koncentracija proteinov pod avtoreguliranim promotorjem dvigne zelo hitro, polovico maksimalne koncentracije dosežejo že po petini celičnega cikla. Sistema se razlikujeta predvsem v moči promotorja, avtoregulirani sistem uporablja mnogo močnejši promotor, ki je odgovoren za hiter porast mRNA in posledično proteinov v celici. Zaradi negativne avtoregulacije, ki ob prisotnosti produkta inhibira transkripcijo se le ta kmalu upočasni in doseže stacionarno stanje. Koncentracija produkta ob stacionarnem stanju je enaka stacionarni koncentraciji produkta, ki ga proizvaja preprosto negativno regulirano vezje ob prisotnosti šibkejšega promotorja.
Omenjeno preprosto vezje bi ob uporabi močnega promotorja, uporabljenega v avtoreguliranem vezju doseglo enako visoko koncentracijo še hitreje avtoregulirano vezje, a bi bila koncentracija v stacionarnem stanju v tem primeru mnogo višja. Previsoka koncentracija proteina pa je nezaželena, saj predstavlja nepotrebna produkcija proteina metabolno breme, hkrati pa lahko protein doseže koncentracijo, pri kateri postane toksičen. Prevelika koncentracija proteina predstavlja težavo tudi pri odzivnosti sistema, saj je potrebno dolgo časa, da se razredči oziroma razgradi.

Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje, kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.<ref name="rosenfeld">Rosenfeld N, Elowitz B. M., Alon U. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12417193 Negative Autoregulation Speeds the Response Times of Transcription Networks]. J. Mol. Biol (2002) 323, 785-793.</ref>

==Viri==
<references />

Negativna avtoregulacija pospeši odzivni čas transkripcijskih omrežij

2017-01-15T18:55:14Z

Tjaša Lapanja:

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12417193 Negative Autoregulation Speeds the Response Times of Transcription Networks]

Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.

Pri proučevanju regulatornih mrež opazimo pogost motiv negativne avtoregulacije, kjer transkripcijski faktorji negativno regulirajo lastno transkripcijo. Omenjen sistem je, na primer, pri ''E.coli'' prisoten pri več kot 40% transkripcijskih faktorjev, pri čemer gre večinoma za globalne transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri odzivu na stres in regulaciji metabolizma.

Dokazali so, da negativna avtoregulacija zmanjša razlike v koncentraciji transkripcijskih faktorjev med celicami v stacionarni fazi, v članku pa avtorji predstavljajo nov pogled na pomen negativne avtoregulacije, vpliv na kinetiko transkripcije.

==Modeliranje==

Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z DNA, in negativno avtoreguliranega vezja, katerega produkt zavira lastno izražanje. Vezji sta dizajnirani tako, da dosežeta enako stacionarno stanje.

V obeh modelih so koncentracijo proteina določali z razliko med produkcijo in redčenjem koncentracije proteina, ker pa so v modelu uporabili dolgožive proteine so predpostavili, da se koncentracija zmanjšuje le zaradi rasti celice in celičnih delitev, vpliv razgradnje pa so zanemarili. Kot merilo odzivnosti sistema je bil uporabljen vzponski čas, čas potreben, da se koncentracija proteina povzpne na polovico maksimalne koncentracije ob polno induciranem promotorju.
Za enostavno transkripcijsko enoto, ki od aktivacije naprej stalno proizvaja maksimalno količino transkripta, ob opisanih predpostavkah velja, da se razlika med koncentracijo proteina v celici in maksimalno koncentracijo proteina ob vsaki celični delitvi zmanjša za polovico. Vzponski čas enostavne transkripcijske enote je torej enak enemu celičnemu ciklu.

Pri negativno avtoreguliranem genskem vezju je produkcija proteina odvisna od koncentracije produkta. Avtorji so predpostavili, da aktivnost promotorja deluje po principu, ki sovpada z Michaelis-Mentenovo kinetiko. Produkcija proteina je odvisna od treh parametrov, produkcije ob polni aktivnosti, koncentracije produkta v celici in konstante disociacije represorja z lastnega promotorja. Ob uporabi močnega avtorepresorja se lahko konstanto disociacije zanemari. Ob analizi tako poenostavljene enačbe so ugotovili, da je vzponski čas koncentracije produkta negativno avtoregulirane transkripcijske enote 0,21 podvojitvenega časa . Vzponski čas lahko dodatno zmanjša kooperativnost med večimi represorji, analize so pokazale, da lahko ob kooperativnosti štirih represorjev vzponski čas zmanjšamo na 0,01 podvojitvenega časa.

Na delovanje represiranega sistema lahko vpliva tudi nekaj minutni zamik, ki nastane med iniciacijo transkripcije in oblikovanjem aktivnega represorja zaradi časa potrebnega za sintezo mRNA, translacijo, zvijanje proteina in nastanek kompleksov. Raziskovalci so z modelom pokazali, da ima ta zamik pomembno vlogo pri odzivnosti sistema. Večji kot je zamik med iniciacijo produkcije in nastankom aktivnega represorja, manjši je vzponski čas. Sistem ima tudi slabost, ki pa se pokaže predvsem v primeru, ko je promotor tako močan, da v času zamika že proizvede količino mRNA, primerljivo s koncentracijo v stacionarnem stanju, saj je v tem primeru v času, ko postanejo prvi represorji aktivni v procesu sinteze že velika količina novih represorjev, katerih nastanka ne moremo več zaustaviti. Tako dobimo velik presežek represorjev, kar je nezaželeno zaradi povečane cene produkcije, metabolnega bremena in možnih toksičnih vplivov presežne koncentracije represorja. Hkrati se velike koncentracije represorja le počasi redčijo iz sistema, ko ga izklopimo,kar poslabša odzivnost sistema.

==Eksperimentalna primerjava sistemov==

===Biološki sistemi in vezja===

Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano <ref name="serrano">Serrano L, Becksei A. [http://www.nature.com/nature/journal/v405/n6786/full/405590a0.html Engineering stability in gene networks by autoregulation]. Nature 2000 (Vol. 405), 590-593.</ref>. Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''E.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

===Potek eksperimenta in rezultati===

Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom (aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (1012 M-1) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke , ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

==Diskusija in zaključki==

Primerjava dveh sistemov za uravnavanje izražanja genov je pokazala, da negativno reguliran sistem poveča hitrost odziva za približno petkrat. Za enostavne transkripcijske kaskade z dolgoživimi proteini je namreč znano, da se na dani stimuli odziva zelo počasi. Prvi produkti sicer nastanejo že v roku minut, polovica maksimalne koncentracije pa je dosežena šele v času enega celičnega cikla.

Za razliko od tega pa se koncentracija proteinov pod avtoreguliranim promotorjem dvigne zelo hitro, polovico maksimalne koncentracije dosežejo že po petini celičnega cikla. Sistema se razlikujeta predvsem v moči promotorja, avtoregulirani sistem uporablja mnogo močnejši promotor, ki je odgovoren za hiter porast mRNA in posledično proteinov v celici. Zaradi negativne avtoregulacije, ki ob prisotnosti produkta inhibira transkripcijo se le ta kmalu upočasni in doseže stacionarno stanje. Koncentracija produkta ob stacionarnem stanju je enaka stacionarni koncentraciji produkta, ki ga proizvaja preprosto negativno regulirano vezje ob prisotnosti šibkejšega promotorja.
Omenjeno preprosto vezje bi ob uporabi močnega promotorja, uporabljenega v avtoreguliranem vezju doseglo enako visoko koncentracijo še hitreje avtoregulirano vezje, a bi bila koncentracija v stacionarnem stanju v tem primeru mnogo višja. Previsoka koncentracija proteina pa je nezaželena, saj predstavlja nepotrebna produkcija proteina metabolno breme, hkrati pa lahko protein doseže koncentracijo, pri kateri postane toksičen. Prevelika koncentracija proteina predstavlja težavo tudi pri odzivnosti sistema, saj je potrebno dolgo časa, da se razredči oziroma razgradi.

Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje, kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.<ref name="rosenfeld">Rosenfeld N, Elowitz B. M., Alon U. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12417193 Negative Autoregulation Speeds the Response Times of Transcription Networks]. J. Mol. Biol (2002) 323, 785-793.</ref>

==Viri==
<references />

Negativna avtoregulacija pospeši odzivni čas transkripcijskih omrežij

2017-01-15T18:10:07Z

Tjaša Lapanja:

Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.

Pri proučevanju regulatornih mrež opazimo pogost motiv negativne avtoregulacije, kjer transkripcijski faktorji negativno regulirajo lastno transkripcijo. Omenjen sistem je, na primer, pri ''E.coli'' prisoten pri več kot 40% transkripcijskih faktorjev, pri čemer gre večinoma za globalne transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri odzivu na stres in regulaciji metabolizma.

Dokazali so, da negativna avtoregulacija zmanjša razlike v koncentraciji transkripcijskih faktorjev med celicami v stacionarni fazi, v članku pa avtorji predstavljajo nov pogled na pomen negativne avtoregulacije, vpliv na kinetiko transkripcije.

==Modeliranje==

Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z DNA, in negativno avtoreguliranega vezja, katerega produkt zavira lastno izražanje. Vezji sta dizajnirani tako, da dosežeta enako stacionarno stanje.

V obeh modelih so koncentracijo proteina določali z razliko med produkcijo in redčenjem koncentracije proteina, ker pa so v modelu uporabili dolgožive proteine so predpostavili, da se koncentracija zmanjšuje le zaradi rasti celice in celičnih delitev, vpliv razgradnje pa so zanemarili. Kot merilo odzivnosti sistema je bil uporabljen vzponski čas, čas potreben, da se koncentracija proteina povzpne na polovico maksimalne koncentracije ob polno induciranem promotorju.
Za enostavno transkripcijsko enoto, ki od aktivacije naprej stalno proizvaja maksimalno količino transkripta, ob opisanih predpostavkah velja, da se razlika med koncentracijo proteina v celici in maksimalno koncentracijo proteina ob vsaki celični delitvi zmanjša za polovico. Vzponski čas enostavne transkripcijske enote je torej enak enemu celičnemu ciklu.

Pri negativno avtoreguliranem genskem vezju je produkcija proteina odvisna od koncentracije produkta. Avtorji so predpostavili, da aktivnost promotorja deluje po principu, ki sovpada z Michaelis-Mentenovo kinetiko. Produkcija proteina je odvisna od treh parametrov, produkcije ob polni aktivnosti, koncentracije produkta v celici in konstante disociacije represorja z lastnega promotorja. Ob uporabi močnega avtorepresorja se lahko konstanto disociacije zanemari. Ob analizi tako poenostavljene enačbe so ugotovili, da je vzponski čas koncentracije produkta negativno avtoregulirane transkripcijske enote 0,21 podvojitvenega časa . Vzponski čas lahko dodatno zmanjša kooperativnost med večimi represorji, analize so pokazale, da lahko ob kooperativnosti štirih represorjev vzponski čas zmanjšamo na 0,01 podvojitvenega časa.

Na delovanje represiranega sistema lahko vpliva tudi nekaj minutni zamik, ki nastane med iniciacijo transkripcije in oblikovanjem aktivnega represorja zaradi časa potrebnega za sintezo mRNA, translacijo, zvijanje proteina in nastanek kompleksov. Raziskovalci so z modelom pokazali, da ima ta zamik pomembno vlogo pri odzivnosti sistema. Večji kot je zamik med iniciacijo produkcije in nastankom aktivnega represorja, manjši je vzponski čas. Sistem ima tudi slabost, ki pa se pokaže predvsem v primeru, ko je promotor tako močan, da v času zamika že proizvede količino mRNA, primerljivo s koncentracijo v stacionarnem stanju, saj je v tem primeru v času, ko postanejo prvi represorji aktivni v procesu sinteze že velika količina novih represorjev, katerih nastanka ne moremo več zaustaviti. Tako dobimo velik presežek represorjev, kar je nezaželeno zaradi povečane cene produkcije, metabolnega bremena in možnih toksičnih vplivov presežne koncentracije represorja. Hkrati se velike koncentracije represorja le počasi redčijo iz sistema, ko ga izklopimo,kar poslabša odzivnost sistema.

==Eksperimentalna primerjava sistemov==

===Biološki sistemi in vezja===

Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano (Nature, 2000). Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''E.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

===Potek eksperimenta in rezultati===

Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom ( aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (1012 M-1) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke , ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

==Diskusija in zaključki==

Primerjava dveh sistemov za uravnavanje izražanja genov je pokazala, da negativno reguliran sistem poveča hitrost odziva za približno petkrat. Za enostavne transkripcijske kaskade z dolgoživimi proteini je namreč znano, da se na dani stimuli odziva zelo počasi. Prvi produkti sicer nastanejo že v roku minut, polovica maksimalne koncentracije pa je dosežena šele v času enega celičnega cikla.

Za razliko od tega pa se koncentracija proteinov pod avtoreguliranim promotorjem dvigne zelo hitro, polovico maksimalne koncentracije dosežejo že po petini celičnega cikla. Sistema se razlikujeta predvsem v moči promotorja, avtoregulirani sistem uporablja mnogo močnejši promotor, ki je odgovoren za hiter porast mRNA in posledično proteinov v celici. Zaradi negativne avtoregulacije, ki ob prisotnosti produkta inhibira transkripcijo se le ta kmalu upočasni in doseže stacionarno stanje. Koncentracija produkta ob stacionarnem stanju je enaka stacionarni koncentraciji produkta, ki ga proizvaja preprosto negativno regulirano vezje ob prisotnosti šibkejšega promotorja.
Omenjeno preprosto vezje bi ob uporabi močnega promotorja, uporabljenega v avtoreguliranem vezju doseglo enako visoko koncentracijo še hitreje avtoregulirano vezje, a bi bila koncentracija v stacionarnem stanju v tem primeru mnogo višja. Previsoka koncentracija proteina pa je nezaželena, saj predstavlja nepotrebna produkcija proteina metabolno breme, hkrati pa lahko protein doseže koncentracijo, pri kateri postane toksičen. Prevelika koncentracija proteina predstavlja težavo tudi pri odzivnosti sistema, saj je potrebno dolgo časa, da se razredči oziroma razgradi.

Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje, kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.

Negativna avtoregulacija pospeši odzivni čas transkripcijskih omrežij

2017-01-15T18:09:51Z

Tjaša Lapanja:

Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.

Pri proučevanju regulatornih mrež opazimo pogost motiv negativne avtoregulacije, kjer transkripcijski faktorji negativno regulirajo lastno transkripcijo. Omenjen sistem je, na primer, pri ''E.coli'' prisoten pri več kot 40% transkripcijskih faktorjev, pri čemer gre večinoma za globalne transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri odzivu na stres in regulaciji metabolizma.

Dokazali so, da negativna avtoregulacija zmanjša razlike v koncentraciji transkripcijskih faktorjev med celicami v stacionarni fazi, v članku pa avtorji predstavljajo nov pogled na pomen negativne avtoregulacije, vpliv na kinetiko transkripcije.

==Modeliranje==

Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z DNA, in negativno avtoreguliranega vezja, katerega produkt zavira lastno izražanje. Vezji sta dizajnirani tako, da dosežeta enako stacionarno stanje.

V obeh modelih so koncentracijo proteina določali z razliko med produkcijo in redčenjem koncentracije proteina, ker pa so v modelu uporabili dolgožive proteine so predpostavili, da se koncentracija zmanjšuje le zaradi rasti celice in celičnih delitev, vpliv razgradnje pa so zanemarili. Kot merilo odzivnosti sistema je bil uporabljen vzponski čas, čas potreben, da se koncentracija proteina povzpne na polovico maksimalne koncentracije ob polno induciranem promotorju.
Za enostavno transkripcijsko enoto, ki od aktivacije naprej stalno proizvaja maksimalno količino transkripta, ob opisanih predpostavkah velja, da se razlika med koncentracijo proteina v celici in maksimalno koncentracijo proteina ob vsaki celični delitvi zmanjša za polovico. Vzponski čas enostavne transkripcijske enote je torej enak enemu celičnemu ciklu.

Pri negativno avtoreguliranem genskem vezju je produkcija proteina odvisna od koncentracije produkta. Avtorji so predpostavili, da aktivnost promotorja deluje po principu, ki sovpada z Michaelis-Mentenovo kinetiko. Produkcija proteina je odvisna od treh parametrov, produkcije ob polni aktivnosti, koncentracije produkta v celici in konstante disociacije represorja z lastnega promotorja. Ob uporabi močnega avtorepresorja se lahko konstanto disociacije zanemari. Ob analizi tako poenostavljene enačbe so ugotovili, da je vzponski čas koncentracije produkta negativno avtoregulirane transkripcijske enote 0,21 podvojitvenega časa . Vzponski čas lahko dodatno zmanjša kooperativnost med večimi represorji, analize so pokazale, da lahko ob kooperativnosti štirih represorjev vzponski čas zmanjšamo na 0,01 podvojitvenega časa.

Na delovanje represiranega sistema lahko vpliva tudi nekaj minutni zamik, ki nastane med iniciacijo transkripcije in oblikovanjem aktivnega represorja zaradi časa potrebnega za sintezo mRNA, translacijo, zvijanje proteina in nastanek kompleksov. Raziskovalci so z modelom pokazali, da ima ta zamik pomembno vlogo pri odzivnosti sistema. Večji kot je zamik med iniciacijo produkcije in nastankom aktivnega represorja, manjši je vzponski čas. Sistem ima tudi slabost, ki pa se pokaže predvsem v primeru, ko je promotor tako močan, da v času zamika že proizvede količino mRNA, primerljivo s koncentracijo v stacionarnem stanju, saj je v tem primeru v času, ko postanejo prvi represorji aktivni v procesu sinteze že velika količina novih represorjev, katerih nastanka ne moremo več zaustaviti. Tako dobimo velik presežek represorjev, kar je nezaželeno zaradi povečane cene produkcije, metabolnega bremena in možnih toksičnih vplivov presežne koncentracije represorja. Hkrati se velike koncentracije represorja le počasi redčijo iz sistema, ko ga izklopimo,kar poslabša odzivnost sistema.

==Eksperimentalna primerjava sistemov==

===Biološki sistemi in vezja===

Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano (Nature, 2000). Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''E.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

===Potek eksperimenta in rezultati===

Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom ( aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (1012 M-1) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke , ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

==Diskusija in zaključki==

Primerjava dveh sistemov za uravnavanje izražanja genov je pokazala, da negativno reguliran sistem poveča hitrost odziva za približno petkrat. Za enostavne transkripcijske kaskade z dolgoživimi proteini je namreč znano, da se na dani stimuli odziva zelo počasi. Prvi produkti sicer nastanejo že v roku minut, polovica maksimalne koncentracije pa je dosežena šele v času enega celičnega cikla.

Za razliko od tega pa se koncentracija proteinov pod avtoreguliranim promotorjem dvigne zelo hitro, polovico maksimalne koncentracije dosežejo že po petini celičnega cikla. Sistema se razlikujeta predvsem v moči promotorja, avtoregulirani sistem uporablja mnogo močnejši promotor, ki je odgovoren za hiter porast mRNA in posledično proteinov v celici. Zaradi negativne avtoregulacije, ki ob prisotnosti produkta inhibira transkripcijo se le ta kmalu upočasni in doseže stacionarno stanje. Koncentracija produkta ob stacionarnem stanju je enaka stacionarni koncentraciji produkta, ki ga proizvaja preprosto negativno regulirano vezje ob prisotnosti šibkejšega promotorja.
Omenjeno preprosto vezje bi ob uporabi močnega promotorja, uporabljenega v avtoreguliranem vezju doseglo enako visoko koncentracijo še hitreje avtoregulirano vezje, a bi bila koncentracija v stacionarnem stanju v tem primeru mnogo višja. Previsoka koncentracija proteina pa je nezaželena, saj predstavlja nepotrebna produkcija proteina metabolno breme, hkrati pa lahko protein doseže koncentracijo, pri kateri postane toksičen. Prevelika koncentracija proteina predstavlja težavo tudi pri odzivnosti sistema, saj je potrebno dolgo časa, da se razredči oziroma razgradi.

Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje , kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.

Negativna avtoregulacija pospeši odzivni čas transkripcijskih omrežij

2017-01-15T18:08:34Z

Tjaša Lapanja:

Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.

Pri proučevanju regulatornih mrež opazimo pogost motiv negativne avtoregulacije, kjer transkripcijski faktorji negativno regulirajo lastno transkripcijo. Omenjen sistem je, na primer, pri E.coli prisoten pri več kot 40% transkripcijskih faktorjev, pri čemer gre večinoma za globalne transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri odzivu na stres in regulaciji metabolizma.

Dokazali so, da negativna avtoregulacija zmanjša razlike v koncentraciji transkripcijskih faktorjev med celicami v stacionarni fazi, v članku pa avtorji predstavljajo nov pogled na pomen negativne avtoregulacije, vpliv na kinetiko transkripcije.

==Modeliranje==

Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z DNA, in negativno avtoreguliranega vezja, katerega produkt zavira lastno izražanje. Vezji sta dizajnirani tako, da dosežeta enako stacionarno stanje.

V obeh modelih so koncentracijo proteina določali z razliko med produkcijo in redčenjem koncentracije proteina, ker pa so v modelu uporabili dolgožive proteine so predpostavili, da se koncentracija zmanjšuje le zaradi rasti celice in celičnih delitev, vpliv razgradnje pa so zanemarili. Kot merilo odzivnosti sistema je bil uporabljen vzponski čas, čas potreben, da se koncentracija proteina povzpne na polovico maksimalne koncentracije ob polno induciranem promotorju.
Za enostavno transkripcijsko enoto, ki od aktivacije naprej stalno proizvaja maksimalno količino transkripta, ob opisanih predpostavkah velja, da se razlika med koncentracijo proteina v celici in maksimalno koncentracijo proteina ob vsaki celični delitvi zmanjša za polovico. Vzponski čas enostavne transkripcijske enote je torej enak enemu celičnemu ciklu.

Pri negativno avtoreguliranem genskem vezju je produkcija proteina odvisna od koncentracije produkta. Avtorji so predpostavili, da aktivnost promotorja deluje po principu, ki sovpada z Michaelis-Mentenovo kinetiko. Produkcija proteina je odvisna od treh parametrov, produkcije ob polni aktivnosti, koncentracije produkta v celici in konstante disociacije represorja z lastnega promotorja. Ob uporabi močnega avtorepresorja se lahko konstanto disociacije zanemari. Ob analizi tako poenostavljene enačbe so ugotovili, da je vzponski čas koncentracije produkta negativno avtoregulirane transkripcijske enote 0,21 podvojitvenega časa . Vzponski čas lahko dodatno zmanjša kooperativnost med večimi represorji, analize so pokazale, da lahko ob kooperativnosti štirih represorjev vzponski čas zmanjšamo na 0,01 podvojitvenega časa.

Na delovanje represiranega sistema lahko vpliva tudi nekaj minutni zamik, ki nastane med iniciacijo transkripcije in oblikovanjem aktivnega represorja zaradi časa potrebnega za sintezo mRNA, translacijo, zvijanje proteina in nastanek kompleksov. Raziskovalci so z modelom pokazali, da ima ta zamik pomembno vlogo pri odzivnosti sistema. Večji kot je zamik med iniciacijo produkcije in nastankom aktivnega represorja, manjši je vzponski čas. Sistem ima tudi slabost, ki pa se pokaže predvsem v primeru, ko je promotor tako močan, da v času zamika že proizvede količino mRNA, primerljivo s koncentracijo v stacionarnem stanju, saj je v tem primeru v času, ko postanejo prvi represorji aktivni v procesu sinteze že velika količina novih represorjev, katerih nastanka ne moremo več zaustaviti. Tako dobimo velik presežek represorjev, kar je nezaželeno zaradi povečane cene produkcije, metabolnega bremena in možnih toksičnih vplivov presežne koncentracije represorja. Hkrati se velike koncentracije represorja le počasi redčijo iz sistema, ko ga izklopimo,kar poslabša odzivnost sistema.

==Eksperimentalna primerjava sistemov==

===Biološki sistemi in vezja===

Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano (Nature, 2000). Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''e.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

===Potek eksperimenta in rezultati===

Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom ( aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (1012 M-1) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke , ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

==Diskusija in zaključki==

Primerjava dveh sistemov za uravnavanje izražanja genov je pokazala, da negativno reguliran sistem poveča hitrost odziva za približno petkrat. Za enostavne transkripcijske kaskade z dolgoživimi proteini je namreč znano, da se na dani stimuli odziva zelo počasi. Prvi produkti sicer nastanejo že v roku minut, polovica maksimalne koncentracije pa je dosežena šele v času enega celičnega cikla.

Za razliko od tega pa se koncentracija proteinov pod avtoreguliranim promotorjem dvigne zelo hitro, polovico maksimalne koncentracije dosežejo že po petini celičnega cikla. Sistema se razlikujeta predvsem v moči promotorja, avtoregulirani sistem uporablja mnogo močnejši promotor, ki je odgovoren za hiter porast mRNA in posledično proteinov v celici. Zaradi negativne avtoregulacije, ki ob prisotnosti produkta inhibira transkripcijo se le ta kmalu upočasni in doseže stacionarno stanje. Koncentracija produkta ob stacionarnem stanju je enaka stacionarni koncentraciji produkta, ki ga proizvaja preprosto negativno regulirano vezje ob prisotnosti šibkejšega promotorja.
Omenjeno preprosto vezje bi ob uporabi močnega promotorja, uporabljenega v avtoreguliranem vezju doseglo enako visoko koncentracijo še hitreje avtoregulirano vezje, a bi bila koncentracija v stacionarnem stanju v tem primeru mnogo višja. Previsoka koncentracija proteina pa je nezaželena, saj predstavlja nepotrebna produkcija proteina metabolno breme, hkrati pa lahko protein doseže koncentracijo, pri kateri postane toksičen. Prevelika koncentracija proteina predstavlja težavo tudi pri odzivnosti sistema, saj je potrebno dolgo časa, da se razredči oziroma razgradi.

Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje , kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.

Negativna avtoregulacija pospeši odzivni čas transkripcijskih omrežij

2017-01-15T18:07:35Z

Tjaša Lapanja: New page: ==Modeliranje== Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z...

==Modeliranje==

Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z DNA, in negativno avtoreguliranega vezja, katerega produkt zavira lastno izražanje. Vezji sta dizajnirani tako, da dosežeta enako stacionarno stanje.

V obeh modelih so koncentracijo proteina določali z razliko med produkcijo in redčenjem koncentracije proteina, ker pa so v modelu uporabili dolgožive proteine so predpostavili, da se koncentracija zmanjšuje le zaradi rasti celice in celičnih delitev, vpliv razgradnje pa so zanemarili. Kot merilo odzivnosti sistema je bil uporabljen vzponski čas, čas potreben, da se koncentracija proteina povzpne na polovico maksimalne koncentracije ob polno induciranem promotorju.
Za enostavno transkripcijsko enoto, ki od aktivacije naprej stalno proizvaja maksimalno količino transkripta, ob opisanih predpostavkah velja, da se razlika med koncentracijo proteina v celici in maksimalno koncentracijo proteina ob vsaki celični delitvi zmanjša za polovico. Vzponski čas enostavne transkripcijske enote je torej enak enemu celičnemu ciklu.

Pri negativno avtoreguliranem genskem vezju je produkcija proteina odvisna od koncentracije produkta. Avtorji so predpostavili, da aktivnost promotorja deluje po principu, ki sovpada z Michaelis-Mentenovo kinetiko. Produkcija proteina je odvisna od treh parametrov, produkcije ob polni aktivnosti, koncentracije produkta v celici in konstante disociacije represorja z lastnega promotorja. Ob uporabi močnega avtorepresorja se lahko konstanto disociacije zanemari. Ob analizi tako poenostavljene enačbe so ugotovili, da je vzponski čas koncentracije produkta negativno avtoregulirane transkripcijske enote 0,21 podvojitvenega časa . Vzponski čas lahko dodatno zmanjša kooperativnost med večimi represorji, analize so pokazale, da lahko ob kooperativnosti štirih represorjev vzponski čas zmanjšamo na 0,01 podvojitvenega časa.

Na delovanje represiranega sistema lahko vpliva tudi nekaj minutni zamik, ki nastane med iniciacijo transkripcije in oblikovanjem aktivnega represorja zaradi časa potrebnega za sintezo mRNA, translacijo, zvijanje proteina in nastanek kompleksov. Raziskovalci so z modelom pokazali, da ima ta zamik pomembno vlogo pri odzivnosti sistema. Večji kot je zamik med iniciacijo produkcije in nastankom aktivnega represorja, manjši je vzponski čas. Sistem ima tudi slabost, ki pa se pokaže predvsem v primeru, ko je promotor tako močan, da v času zamika že proizvede količino mRNA, primerljivo s koncentracijo v stacionarnem stanju, saj je v tem primeru v času, ko postanejo prvi represorji aktivni v procesu sinteze že velika količina novih represorjev, katerih nastanka ne moremo več zaustaviti. Tako dobimo velik presežek represorjev, kar je nezaželeno zaradi povečane cene produkcije, metabolnega bremena in možnih toksičnih vplivov presežne koncentracije represorja. Hkrati se velike koncentracije represorja le počasi redčijo iz sistema, ko ga izklopimo,kar poslabša odzivnost sistema.

==Eksperimentalna primerjava sistemov==

===Biološki sistemi in vezja===

Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano (Nature, 2000). Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''e.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

===Potek eksperimenta in rezultati===

Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom ( aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (1012 M-1) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke , ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

==Diskusija in zaključki==

Primerjava dveh sistemov za uravnavanje izražanja genov je pokazala, da negativno reguliran sistem poveča hitrost odziva za približno petkrat. Za enostavne transkripcijske kaskade z dolgoživimi proteini je namreč znano, da se na dani stimuli odziva zelo počasi. Prvi produkti sicer nastanejo že v roku minut, polovica maksimalne koncentracije pa je dosežena šele v času enega celičnega cikla.

Za razliko od tega pa se koncentracija proteinov pod avtoreguliranim promotorjem dvigne zelo hitro, polovico maksimalne koncentracije dosežejo že po petini celičnega cikla. Sistema se razlikujeta predvsem v moči promotorja, avtoregulirani sistem uporablja mnogo močnejši promotor, ki je odgovoren za hiter porast mRNA in posledično proteinov v celici. Zaradi negativne avtoregulacije, ki ob prisotnosti produkta inhibira transkripcijo se le ta kmalu upočasni in doseže stacionarno stanje. Koncentracija produkta ob stacionarnem stanju je enaka stacionarni koncentraciji produkta, ki ga proizvaja preprosto negativno regulirano vezje ob prisotnosti šibkejšega promotorja.
Omenjeno preprosto vezje bi ob uporabi močnega promotorja, uporabljenega v avtoreguliranem vezju doseglo enako visoko koncentracijo še hitreje avtoregulirano vezje, a bi bila koncentracija v stacionarnem stanju v tem primeru mnogo višja. Previsoka koncentracija proteina pa je nezaželena, saj predstavlja nepotrebna produkcija proteina metabolno breme, hkrati pa lahko protein doseže koncentracijo, pri kateri postane toksičen. Prevelika koncentracija proteina predstavlja težavo tudi pri odzivnosti sistema, saj je potrebno dolgo časa, da se razredči oziroma razgradi.

Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje , kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.

Seminarji SB 2016/17

2017-01-15T17:55:15Z

Tjaša Lapanja:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)
# [[Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema]]. Tomaž Rozmarič (6.12.2016)
# [[Robusten oscilator sinteznih genov z različnimi nastavitvami periode]]. Domen Klofutar (13.12.2016)
# [[Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov]]. Petra Tavčar (13.12.2016)
# [[Procesiranje celičnih informacij s sintetičnimi RNA napravami]]. Tim Božič (20.12.2016)
# [[Usklajeno delovanje sinteznobioloških ur z zaznavanjem celične gostote]]. Luka Kavčič (20.12.2016)
# [[Časovni in prostorski nadzor celičnega signaliziranja prek s svetlobo sprožene interakcije proteinov]]. Boštjan Petrič (3. 1. 2017)
# [[Programiranje celic s ponavljajočim večmestnim modeliranjem genoma in pospešeno evolucijo]] Jan Rozman (3. 1. 2017)
# [[Emergentne lastnosti zmanjšanega genoma E. coli]]. Eva Korošec (10. 1. 2017)
# [[Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz]] Maruša Prolič-Kalinšek (10.1.2017)
# [[Negativna avtoregulacija pospeši odzivni čas transkripcijskih omrežij]] Tjaša Lapanja (17.1.2017)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)
#[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)
#[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)
#[[InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov]]. Alja Zgonc (6. 12. 2016)
#[[Mos(kit)o]]. Judita Avbelj (6. 12. 2016)
#[[BioSynthAge - Kvalitetno staranje]]. Tina Kuhar (6.12.2016)
#[[PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil]]. Tajda Buh (13.12.2016)
#[[Biomaterial za privzemanje urana iz okolja - "žetveni stroj" urana]]. Anja Herceg (13.12.2016)
#[[Biosenzor etilena]]. Toni Nagode (13.12.2016)
#[[aSTARice – biosinteza astaksantina v rižu]]. Eva Vidak (20. 12. 2016)
#[[PANTIDE - nov kmetijski sistem, ki ciljano uničuje določene škodljivce]]. Mirjam Kmetič (20.12.2016)
#[[Razvoj novega dostavnega sistema za gensko zdravljenje cistične fibroze]]. Bojana Lazović (20.12.2016)
#[[Z majhnimi molekulami regulirani ogrodni proteini]]. Mojca Kostanjevec (3. 1. 2017)
#[[Biobalon]] Iza Ogris (3. 1. 2017)
#[[Proizvodnja bioloških leč in laserjev za izboljšave v mikroskopiji]]. Julija Mazej (3. 1. 2017)
#[[Senzor za detekcijo spolno prenosljivih okužb]]. Nika Strašek (10.1.2017)
#[[Obliž iz biorazgradljive plastike, proteinov pajkove svile in bakteriocinov]]. Barbara Dušak (10.1.2017)
#[[Vodni medvedki in reševanje proteinov]]. Peter Prezelj (10.1.2017)
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.