Wiki FKKT - User contributions [en]

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:23:05Z

Tjasa mlakar: /* Rezultati */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintezne združbe imunskih celic, kar bi omogočilo bolj varno in učinkovito imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. ''Chimeric antigen receptor'') je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR, izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem je sposoben izvajati različne funkcije kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logično procesiranje signalov ter neodvisno kontroliranje različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije[1].

'''g) Večcelični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so zasnovali tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:22:19Z

Tjasa mlakar: /* Rezultati */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintezne združbe imunskih celic, kar bi omogočilo bolj varno in učinkovito imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. ''Chimeric antigen receptor'') je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR, izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem je sposoben izvajati različne funkcije kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logično procesiranje signalov ter neodvisno kontroliranje različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije[1].

'''g) Večcelični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:22:00Z

Tjasa mlakar: /* Rezultati */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintezne združbe imunskih celic, kar bi omogočilo bolj varno in učinkovito imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. ''Chimeric antigen receptor'') je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR, izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem je sposoben izvajati različne funkcije kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logično procesiranje signalov ter neodvisno kontroliranje različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije[1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:19:53Z

Tjasa mlakar: /* Rezultati */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintezne združbe imunskih celic, kar bi omogočilo bolj varno in učinkovito imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. ''Chimeric antigen receptor'') je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR, izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem je sposoben izvajati različne funkcije kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logično procesiranje signalov ter neodvisno kontroliranje različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:18:00Z

Tjasa mlakar: /* SUPRA CAR */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintezne združbe imunskih celic, kar bi omogočilo bolj varno in učinkovito imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. ''Chimeric antigen receptor'') je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR, izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem je sposoben izvajati različne funkcije kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logično procesiranje signalov ter neodvisno kontroliranje različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:16:16Z

Tjasa mlakar: /* SUPRA CAR */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintezne združbe imunskih celic, kar bi omogočilo bolj varno in učinkovito imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. ''Chimeric antigen receptor'') je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR, izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem ima številne zmožnosti kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logičnega procesiranja signalov ter neodvisnega kontroliranja različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:13:36Z

Tjasa mlakar: /* CAR */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintezne združbe imunskih celic, kar bi omogočilo bolj varno in učinkovito imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. ''Chimeric antigen receptor'') je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem ima številne zmožnosti kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logičnega procesiranja signalov ter neodvisnega kontroliranja različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:13:17Z

Tjasa mlakar: /* Uvod */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintezne združbe imunskih celic, kar bi omogočilo bolj varno in učinkovito imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. Chimeric antigen receptor) je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem ima številne zmožnosti kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logičnega procesiranja signalov ter neodvisnega kontroliranja različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:09:29Z

Tjasa mlakar: /* Literatura */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintetske združbe imunskih celic, kar bi omogočilo varnejšo in učinkovitejšo imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. Chimeric antigen receptor) je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem ima številne zmožnosti kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logičnega procesiranja signalov ter neodvisnega kontroliranja različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:09:12Z

Tjasa mlakar: /* Literatura */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintetske združbe imunskih celic, kar bi omogočilo varnejšo in učinkovitejšo imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. Chimeric antigen receptor) je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem ima številne zmožnosti kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logičnega procesiranja signalov ter neodvisnega kontroliranja različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.

[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.

[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.

[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:08:56Z

Tjasa mlakar: /* Literatura */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintetske združbe imunskih celic, kar bi omogočilo varnejšo in učinkovitejšo imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. Chimeric antigen receptor) je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem ima številne zmožnosti kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logičnega procesiranja signalov ter neodvisnega kontroliranja različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.
[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.
[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.
[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:07:18Z

Tjasa mlakar: /* Zaključek */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintetske združbe imunskih celic, kar bi omogočilo varnejšo in učinkovitejšo imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. Chimeric antigen receptor) je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem ima številne zmožnosti kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logičnega procesiranja signalov ter neodvisnega kontroliranja različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=

Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.

='''Literatura'''=

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:06:58Z

Tjasa mlakar: /* Rezultati */

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-021-21078-7 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

='''Uvod'''=

Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintetske združbe imunskih celic, kar bi omogočilo varnejšo in učinkovitejšo imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.

='''CAR in (SUPRA) CAR sistem'''=
=='''CAR'''==

Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. Chimeric antigen receptor) je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].

=='''SUPRA CAR'''==

Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem ima številne zmožnosti kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logičnega procesiranja signalov ter neodvisnega kontroliranja različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].

='''Raziskava'''=

Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].

=='''Rezultati'''==
'''a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema'''

Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].

'''b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije'''

Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].

'''c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih'''

Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].

'''d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje'''

Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].

'''e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema'''

Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].

'''f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije'''

SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva [1].

'''g) Več-celični sistem stikala smrti'''

Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so ustvarili tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].

'''h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic'''

Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].

='''Zaključek'''=
='''Literatura'''=

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:03:32Z

Tjasa mlakar: /* Raziskava */

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T21:02:28Z

Tjasa mlakar: /* SUPRA CAR */

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T20:59:39Z

Tjasa mlakar: /* CAR */

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T20:55:38Z

Tjasa mlakar: /* Uvod */

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T19:16:13Z

Tjasa mlakar:

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T19:15:18Z

Tjasa mlakar:

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T19:13:19Z

Tjasa mlakar:

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T19:06:52Z

Tjasa mlakar:

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T19:04:38Z

Tjasa mlakar:

Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom

2021-05-16T19:03:22Z

Tjasa mlakar: New page: ''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-020-20756-2 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing ...

''Povzeto po članku:''[https://www.nature.com/articles/s41467-020-20756-2 J. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. Collins, W.W. Wong: Engineering advanced logic and distrubuted computing in human CAR immune cells. ''Nat. Commun.'' '''2021''', 12, 792-, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21078-7]

Seminarji SB 2020/21

2021-05-16T18:48:58Z

Tjasa mlakar:

[http://www.example.com link title]V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) 
# [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) 
# [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) 
#[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_humanih_CAR_imunskih_celic_z_napredno_logiko_in_porazdeljenim_računalništvom Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom] (Tjaša Mlakar) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
# [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
# [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
# [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
# [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
# [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
# [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
# [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 
# [[Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače]] (Sabina Sladič Oblak) 
 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

BNT-seminar

2021-03-13T11:07:30Z

Tjasa mlakar:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30170022 
30200303 
30019363 
30019057 
30170131 
30170078 
30019040 
30170177 
30200324 
30200315 
30019063 
30200312 
30170002 
30170103 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
30200317 
30170193 
30200307 
30200321 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
18.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Matija Ruparčič 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Ajda Godec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Urša Lovše 
Sara Laznik 
Neža Pvko 
Doroteja Armič 
Martina Lokar 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
Luka Gnidovec 
Almina Tahirović 
Mirsad Mešić 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Ernestina Lavrih 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Eva Keber 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Mirsad Mešić 
Urša Lovše 
Anamarija Agnič 
Neža Pavko 
Mateja Žvipelj 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
Urban Hribar 
Tina Kolenc Milavec 
Tadej Medved 
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-11T19:18:56Z

Tjasa mlakar:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30200303 
30019363 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
30200317 
30170193 
30200315 

| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
11.5.2021 
13.4.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
Luka Gnidovec 
Urša Lovše 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
Urban Hribar 
Mirsad Mešić 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.