Wiki FKKT - User contributions [en]

Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice

2017-04-17T20:45:31Z

TomazRozmaric: New page: [http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023 Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the e...

[http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023 Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells]

Humani respiratorni sincicijski virus (RSV) je virus, ki povzroči vnetje spodnjega dela dihal (traheja, primarni bronhiji in pljuča). Za okužbo so najbolj dovzetni dojenčki, otroki, posamezniki z oslabljenim imunskim sistemom in starejši ljudje. Vrh okužbe virus dosega v zimskih mesecih. Oseba, ki preboli RSV pridobi le kratkoročno imunsko zaščito in je tako čez čas ponovno dovzetna za okužbo. Virus se prenaša z dotikom in ostane na koži viabilen do pet ur. Po štirih do petih dneh inkubacijske dobe se pri odraslih pričnejo kazati simptomi nahoda, med tem ko se lahko pri otokih mlajših od enega leta razvije bronhiolitis oziroma gripa. Za omenjen virus trenutno obstaja le eno registrirano zdravilo-Palivizumab. Palivizumab je preventivno zdravilo in vsebuje monoklonska protitelesa proti fuzijskemu glikoproteinu RSV (RSV F). RSV F spada v tip 1 transmembranskih proteinov in sproži fuzijo med virusno in celično membrano s čimer omogoči vstop nukleokapside v citoplazmo. Zaradi njegove pomembne vloge pri okužbi in izredno ohranjenega aminokislinskega zaporedje se je izkazal kot odlična tarča za zdravljenje s protitelesi. Kitajski znanstveniki so se lotili problema RSV z razvojem cepiva DNA, ki je bilo osnovano na pVAX1 vektorju in je vseboval zaporedje scDEC205, sF in oznako His. scDEC205 je zaporedje DNA, ki zapisuje za variabilno domeno protitelesa proti receptorju DEC205. DEC205 je eden najbolj pomembnih receptorjev dendritskih celic, ki sproži imunski odziv in spada v družino tipa-C lektinskih receptorjev. Njegova vloga je privzem ter prezentacija antigena. Antigeni, ki se zelo dobro vežejo na CD205, imunske celice zelo dobro procesirajo in predstavijo na MHC 1 oziroma MHC 2, s tem pa se izboljša humoralna in/ali celična imunost. sF zaporedje zapisuje za zunajcelični del transmembranskega proteina F. Tako osnovano cepivo je uspešno dostavilo protein F RSV-ja do dendritskih celic, ki so ga internalizirale in nato prezentirale na površini. Po prezentaciji so se uspešno aktivirale celice ubijalke in celice Th1.

== Sestava in kloniranje konstrukta ==

Zapis za težko in lahko variabilno domeno protitelesa proti mišjemu DEC205 (scDEC) so pridobili s PCR pomnoževanjem plazmidov, ki so že vsebovale omenjen zapis. Posamezna zapisa so združili preko (G4S)4 povezovalca. Vzporedno so sestavili zapis za kontrolno izotopno variabilno domeno protitelesa (scISO). Na C koncu »protiteles« so nato preko (G4S)4 povezovalca dodali še optimizirano zaporedje sF in na njegovem 3' koncu oznako His. Tako sestavljena konstrukta sta bila klonirana v pVAX1 vektorja.

== Transfekcija in validacija izražanja rekombinantih proteinov ==

Izražanje rekombinantnih proteinov so validirali s transfekcijo celic 293T. Transficirane celice so lizirali in lizat analizirali z SDS-PAGE-om ter s prenosom western.

== Validacija vezave rekombinantnih proteinov na receptor DEC205 ==

Supernatant transficiranih celic 293T so centrifugirali in s tem odstranili celične ostanke. V tekočini so ostali rekombinantni proteini, ki so jih nato inkuburali z normalnimi celicami CHO in celicami CHOmDEC205, ki so na površini izražale receptor DEC205. Celice so sprali in nato inkubirali z monoklonskimi protitelesi proti RSV F. Po inkubaciji je ponovno sledilo spiranje in inkubacija s sekundarnimi protitelesi. Po spiranju so izvedli pretočno citometrijo in potrdili vezavo rekombinantnih proteinov na receptor DEC205.

== Testiranje zmožnosti celic DC2.4, da vežejo in internalizirajo rekombinantne proteine ==

Za testiranje zmožnosti celic DC2.4, da vežejo in internalizirajo rekombinantne proteine so očiščene rekombinantne proteine inkubirali skupaj s celicami DC2.4. Po inkubaciji so celice najprej označili s primarnimi protitelesi proti RSV F in nato še s sekundarnimi protitelesi konjugiranimi z PE-jem. Po označevanju so izvedli pretočno citometrijo in potrdili vezavo rekombinantnih proteinov na celice DC2.4.

Za izvedbo konfokalne mikroskopije so celice označili z enakimi primarnimi in sekundarnimi protitelesi kot pri prejšnji metodi ter še dodatno z FITC-faloidinom in DAPI-jem. Mikroskopija je potrdila internalizacijo rekombinantega proteina.

== Validacija cepiva in-vivo ==

Za in-vivo validacijo so miške vsake tri tedne immunizirali z vbizganjem različne količine cepiva v nožno mišico in elektroporacijo. S testom ELISA so potrdili prisotnost RSV-specifičnih igG-jev. Prav tako so potrdili celice ubijalke specifične za RSV in aktivacijo Th1 celic.

[[MBT seminarji 2017]]

MBT seminarji 2017

2017-04-17T10:25:58Z

TomazRozmaric:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir - prestavljeno na 6.6.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) Zaznavanje zunajcelične miR-210 kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001 Stukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v ''Mycobacterium tuberculosis'' Vid Jazbec
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-04-17T10:25:32Z

TomazRozmaric:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir - prestavljeno na 6.6.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) Zaznavanje zunajcelične miR-210 kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih z cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001 Stukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v ''Mycobacterium tuberculosis'' Vid Jazbec
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-04-17T10:24:49Z

TomazRozmaric:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir - prestavljeno na 6.6.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) Zaznavanje zunajcelične miR-210 kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih z DNA cepivom proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001 Stukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v ''Mycobacterium tuberculosis'' Vid Jazbec
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-04-17T10:22:15Z

TomazRozmaric:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir - prestavljeno na 6.6.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) Zaznavanje zunajcelične miR-210 kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih z DNA cepivom proti človeškim respiratornim sincicijskim virusu z usmerjanjem F proteina na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001 Stukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v ''Mycobacterium tuberculosis'' Vid Jazbec
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-04-17T10:16:21Z

TomazRozmaric:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir - prestavljeno na 6.6.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) Zaznavanje zunajcelične miR-210 kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih z DNA cepivom proti človeškemu respiratornem virusu z usmerjanjem F proteina na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001 Stukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v ''Mycobacterium tuberculosis'' Vid Jazbec
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

2017-bionano-seminar

2017-04-01T19:57:11Z

TomazRozmaric: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 2'''
|-
| Peter Prezelj||22.03.17||Spreminjanje vsebnosti in karakteristik hranilnih snovi v živilih in pripravljeni hrani z uporabo kovalentnih modifikacij, prečnega povezovanja in encimov||Vita Vidmar||Zala Gluhić
|-
| Boštjan Petrič||22.03.17||Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi||Luka Kavčič||Judita Avbelj
|-
| Ema Guštin||22.03.17||Nanoprevleka hrustanca za preprečitev osteoartritisa||Mojca Juteršek||Vid Jazbec
|-
| Tjaša Lapanja||29.03.17||Modificirana CHO celična linija prilagojena za ultrazvočno indukcijo izražanja proteinov v industrijskih bioreaktorjih||Bojana Lazović||Vita Vidmar
|-
| Maruša Prolič Kalinšek||29.03.17||Senzor za detekcijo Legionella bakterij na osnovi polidiacetilena||Eva Korošec||Luka Kavčič
|-
| Domen Klofutar||29.03.17||Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula||Tajda Buh||Mojca Juteršek
|-
| Simon Bolta||05.04.17||Sinteza inzulina pri sladkornih bolnikih neposredno po povišanju krvnega sladkorja||Peter Prezelj||Bojana Lazović
|-
| Tomaž Rozmarič||05.04.17||Korekcija vida s pomočjo nano robotov||Boštjan Petrič||Eva Korošec
|-
| Urša Kapš||05.04.17||Nanodelci za strjevanje krvi||Ema Guštin||Tajda Buh
|-
| Julija Mazej||12.04.17||opis teme ali naslov||Tjaša Lapanja||Peter Prezelj
|-
| Nataša Žigante||12.04.17||opis teme ali naslov||Maruša Prolič Kalinšek||Boštjan Petrič
|-
| Anja Herceg||12.04.17||opis teme ali naslov||Domen Klofutar||Ema Guštin
|-
| Mirjam Kmetič||19.04.17||Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib||Simon Bolta||Tjaša Lapanja
|-
| Mojca Kostanjevec||19.04.17||Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (cepiva in si-RNA - EpCAM) z uporabo nanodiskov||Tomaž Rozmarič||Maruša Prolič Kalinšek
|-
| Jan Rozman||19.04.17||Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo||Urša Kapš||Domen Klofutar
|-
| Barbara Dušak||03.05.17||Izboljšava gojenja mesa n vitro||Julija Mazej||Simon Bolta
|-
| Mateja Cigoj||03.05.17||Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.||Nataša Žigante||Tomaž Rozmarič
|-
| Toni Nagode||03.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Anja Herceg||Urša Kapš
|-
| Tim Božič||10.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Mirjam Kmetič||Julija Mazej
|-
| Darja Božič||10.05.17||opis teme ali naslov||Mojca Kostanjevec||Nataša Žigante
|-
| Petra Tavčar||10.05.17||Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov||Jan Rozman||Anja Herceg
|-
| Marjeta Horvat||17.05.17||FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa||Barbara Dušak||Mirjam Kmetič
|-
| Danijela Jošić||17.05.17||Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.||Mateja Cigoj||Mojca Kostanjevec
|-
| Tina Kuhar||17.05.17||Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.||Toni Nagode||Jan Rozman
|-
| Nika Strašek||24.05.17||Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom||Tim Božič||Barbara Dušak
|-
| Eva Vidak||24.05.17||Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije Rhodospirillum rubrum||Darja Božič||Mateja Cigoj
|-
| Alja Zgonc||24.05.17||Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni||Petra Tavčar||Toni Nagode
|-
| Zala Gluhić||31.05.17||Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.||Marjeta Horvat||Tim Božič
|-
| Judita Avbelj||31.05.17||Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.||Danijela Jošić||Darja Božič
|-
| Vid Jazbec||31.05.17||Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.||Tina Kuhar||Petra Tavčar
|-
| Vita Vidmar||31.05.17||'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic||Nika Strašek||Marjeta Horvat
|-
| Luka Kavčič||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Eva Vidak||Danijela Jošić
|-
| Mojca Juteršek||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Alja Zgonc||Tina Kuhar
|-
| Bojana Lazović||07.06.17||Poenostavljen pristop k razvoju novih senzorjev FRET (Förster resonance energy transfer)||Zala Gluhić||Nika Strašek
|-
| Eva Korošec||07.06.17||Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.||Judita Avbelj||Eva Vidak
|-
| Tajda Buh||07.06.17||opis teme ali naslov||Vid Jazbec||Alja Zgonc
|}

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte '''dva dneva pred datumom predstavitve''', ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Vsak recenzent predlaga izboljšavo projekta.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik dva dneva pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

MBT seminarji 2017

2017-03-01T20:13:39Z

TomazRozmaric:

MBT seminarji 2017

2017-02-28T22:21:13Z

TomazRozmaric:

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T22:25:48Z

TomazRozmaric: /* =Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al. */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze na željeno regijo v genomu, določili so. S testom T7EI so testirali učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema, pri čemer so ugotovili, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i). Pokazali so tudi, da je CRISPR-Cas9 veliko preprostejši za uporabo od starejših generacij, saj je za spremembo tarče na genomu potrebno spremeniti samo sgRNA, nukleaza Cas9 pa ostane enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.====
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo prišli do dovolj visoke stopnje zanseljivosti, saj so letos na Kitajskem izvedli prvo klinično raziskavo na ljudeh. V naslednjem letu bodo sledila klinična testiranja v ZDA. V kolikor bodo klinične raziskave obrodile sadove bomo počasi s tehnologijo spreminjanja genomov čez čas iztrebili vsa genetska obolenja. Za tem pa bo najverjetneje prišlo tudi manipuliranje človeškega telesa po naših željah. Ko bomo prišli do te stopje bomo izvajali evolucijo kar sami in bodo različne “nadgradnje” človeškega genoma, nekaj podobnega kot danes nadgradimo operacijski sistem.

==Viri==
#[http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n3/full/nbt.2501.html J Keith Joung et al. "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system" Nature Biotechnology 31, 227–229 (2013)]
#[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302: Chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1: Programmed_cell_death_protein_1]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell: Regulatory_T_cell]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease: Transcription_activator-like_effector_nuclease]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease: Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Seminarji SB 2016/17

2016-12-05T22:23:19Z

TomazRozmaric:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)
# [[Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema]]. Tomaž Rozmarič (6.12.2016)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)
#[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)
#[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)
#[[InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov]]. Alja Zgonc (6. 12. 2016)
#[[Mos(kit)o]]. Judita Avbelj (6. 12. 2016)
#[[BioSynthAge - Kvalitetno staranje]]. Tina Kuhar (6.12.2016)
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2016/17

2016-12-05T22:22:57Z

TomazRozmaric:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)
# [[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Za%C4%8Detki_uporabe_CRISPR-Cas9_sistema]]. Tomaž Rozmarič (6.12.2016)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)
#[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)
#[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)
#[[InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov]]. Alja Zgonc (6. 12. 2016)
#[[Mos(kit)o]]. Judita Avbelj (6. 12. 2016)
#[[BioSynthAge - Kvalitetno staranje]]. Tina Kuhar (6.12.2016)
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:49:52Z

TomazRozmaric: /* Zaključek */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze na željeno regijo v genomu, določili so. S testom T7EI so testirali učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema, pri čemer so ugotovili, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i). Pokazali so tudi, da je CRISPR-Cas9 veliko preprostejši za uporabo od starejših generacij, saj je za spremembo tarče na genomu potrebno spremeniti samo sgRNA, nukleaza Cas9 pa ostane enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo prišli do dovolj visoke stopnje zanseljivosti, saj so letos na Kitajskem izvedli prvo klinično raziskavo na ljudeh. V naslednjem letu bodo sledila klinična testiranja v ZDA. V kolikor bodo klinične raziskave obrodile sadove bomo počasi s tehnologijo spreminjanja genomov čez čas iztrebili vsa genetska obolenja. Za tem pa bo najverjetneje prišlo tudi manipuliranje človeškega telesa po naših željah. Ko bomo prišli do te stopje bomo izvajali evolucijo kar sami in bodo različne “nadgradnje” človeškega genoma, nekaj podobnega kot danes nadgradimo operacijski sistem.

==Viri==
#[http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n3/full/nbt.2501.html J Keith Joung et al. "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system" Nature Biotechnology 31, 227–229 (2013)]
#[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302: Chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1: Programmed_cell_death_protein_1]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell: Regulatory_T_cell]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease: Transcription_activator-like_effector_nuclease]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease: Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:41:08Z

TomazRozmaric: /* Povzetek */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze na željeno regijo v genomu, določili so. S testom T7EI so testirali učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema, pri čemer so ugotovili, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i). Pokazali so tudi, da je CRISPR-Cas9 veliko preprostejši za uporabo od starejših generacij, saj je za spremembo tarče na genomu potrebno spremeniti samo sgRNA, nukleaza Cas9 pa ostane enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
#[http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n3/full/nbt.2501.html J Keith Joung et al. "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system" Nature Biotechnology 31, 227–229 (2013)]
#[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302: Chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1: Programmed_cell_death_protein_1]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell: Regulatory_T_cell]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease: Transcription_activator-like_effector_nuclease]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease: Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:36:26Z

TomazRozmaric: /* Viri */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
#[http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n3/full/nbt.2501.html J Keith Joung et al. "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system" Nature Biotechnology 31, 227–229 (2013)]
#[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302: Chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1: Programmed_cell_death_protein_1]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell: Regulatory_T_cell]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease: Transcription_activator-like_effector_nuclease]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease: Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:36:02Z

TomazRozmaric: /* Viri */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
#[http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n3/full/nbt.2501.html J Keith Joung et al. "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system" Nature Biotechnology 31, 227–229 (2013)
#[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302: Chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1: Programmed_cell_death_protein_1]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell: Regulatory_T_cell]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease: Transcription_activator-like_effector_nuclease]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease: Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:33:07Z

TomazRozmaric: /* Viri */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
#[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302: Chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1: Programmed_cell_death_protein_1]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell: Regulatory_T_cell]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease: Transcription_activator-like_effector_nuclease]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease: Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:32:52Z

TomazRozmaric: /* Viri */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
#[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302: chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1: Programmed_cell_death_protein_1]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell: Regulatory_T_cell]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease: Transcription_activator-like_effector_nuclease]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease: Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:30:41Z

TomazRozmaric: /* Viri */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
#[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302: chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1: Programmed_cell_death_protein_1]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell: Regulatory_T_cell]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease: Transcription_activator-like_effector_nuclease]
#[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease:Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:28:42Z

TomazRozmaric: /* Viri */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302:chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial]
[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1:Programmed_cell_death_protein_1]
[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell:Regulatory_T_cell]
[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease:Transcription_activator-like_effector_nuclease]
[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease:Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:26:46Z

TomazRozmaric: /* Viri */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302]
[https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1]
[https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell]
[https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease]
[https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:25:25Z

TomazRozmaric: /* Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016 */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1. klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302
https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1
https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell
https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease
https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:24:35Z

TomazRozmaric: /* Potek raziskave */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===

====Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom====
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.

sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.

Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.

S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.

====Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9====
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.

====Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-ji====
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.

V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
====Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.===
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.

===Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016===
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1 klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.

===Zaključek===
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302
https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1
https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell
https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease
https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:20:50Z

TomazRozmaric: /* Povzetek */

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče na genoma potrebno spremeniti le sgRNA, nukleaza Cas9 pa vedno ostaja enaka.

===Uvod===

====Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)====
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.

====TALEN-i====
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

====CRISPR-Cas====
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.

====T7EI test====
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se nato očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

===Potek raziskave===
Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.
sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.
Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.
S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.
Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.
Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-i
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.
V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.
Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1 klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.
Zaključek
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302
https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1
https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell
https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease
https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease

[[Seminarji SB 2016/17]]

Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema

2016-12-05T20:17:13Z

TomazRozmaric: New page: ==Povzetek== Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna ...

==Povzetek==
Leta 2013 so ameriški raziskovalci dokazali, da lahko uporabimo CRISPR-Cas9 sistem za usmerjeno spremembo genoma evkariontov (zebrice). V raziskavi so pokazali, da je enojna vodnica RNA (sgRNA) dovolj za usmerjanje Cas9 endonukleaze. Učinkovitost in uspešnost CRISPR-Cas9 sistema so preverili s testom T7EI. Ugotovili so, da je sistem enako učinkovit kot predhodna sistema za usmerjeno spremembo genomov (cinkovi prsti in TALEN-i), vendar je veliko preprostejši, saj je za spremembo tarče genoma potrebno spremeniti samo sgRNA, nukleaza Cas9 pa ostane enaka.

===Uvod===
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF)
Nukleaza cinkovih prstov (ZNF) so restrikcijski encimi za specifično rezanje dvojne vijačnice DNA. Sestavljeni so iz nespecifične endonukleaze, ki je fuzirana na vezavno domeno DNA sestavljeno iz cinkovih prstov. Posamezen ZFN je ponavadi sestavljen iz treh do šestih ponovitev cinkovih prstov. Posamezen cinkov prst lahko prepozna tri bazne pare DNA, tako da s šestimi cinkovimi prsti dosežemo specifičnost do 18 baznih parov.
TALEN-i
TALEN-i so restrikcijski encimi s katerimi lahko izzovemo načrtovan dvojni zlom DNA na specifičnem mestu. Sestavljeni so iz dveh delov, efektrojev TAL , ki vsebujejo DNA vezavno domeno (zagotovijo specifičnost vezave) in nukleaze, ki reže verigo DNA.

CRISPR-Cas
Sistem CRISPR-Cas je pridobljen imunski sistem bakterij in arhej. Služi kot zaščita pred tujim dednim materialom virusev in plazmidov. Imunost omenjeni prokarionti dobijo z vgradnjo tuje DNA v lokus CRISPR. Ta lokus se lahko prepisuje, pri čemer nastane dolga RNA, ki vsebuje več elementov tuje DNA. Po prepisu so ta RNA sprocesira v takoimenovane kratke CRISPR RNA transkripte (crRNA). crRNA se priležejo na trans-aktivirajočo crRNA (tracrRNA). tracrRNA skupaj s crRNA vodi Cas protein do tuje DNA, katero nato zareže. crRNA in tracrRNA je v laboratoriju mogoče združiti v eno samo molekulo enojna vodnice RNA (sgRNA), s čimer se sistem poenostavi.
T7EI test
T7EI test temelji na tvorbi heterodupleksov pri hibridizaciji med divjim tipom (wt) DNA in spremenjeno DNA matrico. Za test je potrebno najprej pomnožiti tarčno regijo, katero smo spremenili s sistemom CRISPR-Cas9. PCR produkte se očisti in nato se doda T7 endonukleaza. T7 endonukleaza je endokleaza ki prepozna nesparjene nukleotide (vsaj 2bp morata biti nesparjena) in jih odreže. Na podlagi analize fragmentov s pomočjo gelske ali kapilarne elektroforeze nato lahko določimo uspešnost spremembe gena.

Potek raziskave
Testiranje usmerjanja sgRNA in določitev optimalne koncentracije sgRNA s T7EI testom
Ameriški znanstevniki so najprej dokazali učinkovitost usmerjanja Cas9 encima s sgRNA v genomu zebrice. Zapis DNA za Cas9 je bil pomnožen z vektorja pMJ806. Dobljen PCR produkt so nato rezali z restriktazama NotI in AgeI ter vključek vstavili v vektor pMLM651.
sgRNA so vstavili v vektor pDR274, ki vsebuje T7 promotor. Začetek zapisa za sgRNA se je začel v sekvenci, ki je še zapisovala za vezavno mesto T7, prav takoje zapis za sgRNA vseboval dve restrikcijski mesti BsaI. Namen the dveh restrikcjiskim mest je enostavna zamenjava 20-ih nukleotidov, ki so pomembni da se vežejo na tarčno zaporedje DNA. Torej tak konstrukt jim je omogočil enostavno zamenjavo tarče. Prav tako so podaljšali 3’ konec sgRNA za nekaj nukleotidov s sekvenco tracrRNA. Razloga za podaljšanje v članku niso podali.
Za določitev optimalne koncentracije sgRNA in kodirajočo mRNA proteina Cas9 so injicirali različne koncentracije v enocelični stadij embrija zebrice.
Izkazalo se je, da so bile delecije in insercije prisotne pri vseh testiranih koncentracijah. Največji delež sprememb je bilo moč zaznati pri koncentraciji 12,5 ng/µl sgRNA in 300 ng/µl kodirajoče mRNA Cas9. S temi koncetracijami so nato izvedli vse nadaljne ekspreimente.
S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so nato potrdili modifikacije na resoluciji sekvence. Da so pridobili dovolj DNA za sekvenciranje so združili deset embrijev, nato izvdeli PCR. Produkte PCR so vstavili v klonirni vektor in iz prekonočne kulture izolirali DNA ter jo posekvencirali. Analiza sekvenc je pokazala, da se indeli začnejo na 5’ koncu DNA, kar je bilo s pričakovanji.
Testiranje robustnosti sistema sgRNA:Cas9
Da bi ugotovili zanesljivost metode sgRNA:Cas9, je ameriška skupina Joun et al. izvedla hkratno modifikacijo desetih genov (fh 1, apoea, gria3a, th1, rgs4, tia1l, tph1a, slc6a3, gsk3b, drd3). Postopek so ponovili po že prej opisanem postopku. Izkazalo se je, da so uspeli uspešno spremeniti 8 od 10 modificiranih genov. Frekvenca uspešno spremenjenih celic je med geni variirala med 24.1%-59.4%. Ugotovili so tudi, da ni razlike, če so spremenili smerno ali protismerno verigo DNA.
Primerjava sgRNA:Cas9 s TALEN-i in ZFN-i
Uspešnost sgRNA:Cas9 je bila primerljiva s TALEN-i in ZFN pri spreminjanju enakih genov. Prav tako vse tri metode vnesejo enako dolžino indelnih mutacij. sgRNA:Cas9 je v primerjavi s ZFN in TALEN-i precej preprostejša v izvedbi. Za spremembo tarče je potrebno spremeniti le sgRNA, Cas9 encim pa ostaja vedno enak. To je cenovno bolj ugodno in eksperimentalno manj zahtevno kot pri TALEN-ih in ZFN, kjer je potrebno spremeniti celotni nukleazi (smerna in protismerna veriga) za vsak gen. Slabost TALEN-ov je tudi velikost zapisa za vse podenote (do 3kb). Velikost je problematična zaradi težave pri vnosu v calico, prav tako postavlja oviro pri sekvenciranju zaradi ponavljajočih se elemenotv in obstaja možnost za rekombinacijo.
V članku so izpostavili, da je omejujoč dejavnik sgRNA:Cas9 zahteva po specifični sekvenci, ki mora zadostiti pogoju 5’-GG-N18-NGG-3’. Omenjen vzorec se v DNA naključno pojavi vsakih 128 bp. Dinukleotid GG na 5’ je potreben, ker je ta sekvenca del T7 promotorja in je potrebna za vezavo. NGG motiv pa deluje kot PAM sekvenca. Nekatere študije kažejo, da T7 promotor ne potrebuje GG za delovanje in bi tako lahko uporabili motiv 5’-(G/A)(G/A)-N18-NGG-3’, kar bi zmanjšalo naključnost pojava motiva na vsakih 32 bp.
Zaključne misli ameriške ekipe Jouan et al.
Ameriški raziskovalci so v tem člnaku dokazali, da je mogoče uporabiti sgRNA:Cas9 sistem za modifikacijo genoma zebrice. V prihodnosti so predlagali, da je potrebno narediti izven tarčne spremembe sgRNA:Cas9 sistema. Prav tako je potrebno še analizirati toksičnost, ker je smrtnost enoceličnih embrijev variirala pri različnih sgRNA-jih. Smrtnost je sicer bila podobna, kot je že bila opažena pri uporabi TALEN-ov in ZFN-ov.
Prva uporaba CRISPR-Cas9 na ljudeh v letu 2016
Oktobra 2016 se je na Kitajskem začela izvajati prva faza 1 klinične študije pri kateri so pacientom z metastatskim nedrobnocelični rakom pljuč vbrizgali s CRISPR-Cas9 spremenjene celice-T. Pacienti, ki so bili izbrani za študijo se neodzivajo na dosedaj možne načine zdravljenja (kemoterapijo, obsevanje,..).
Kitajska ekipa je iz krvi izolirala celice T, iz katerih so s pomočjo CRISPR-Cas9 izbili gen PDCD1, ki zapisuje za protein programirane celične smrti 1 (PD-1). PD-1 spada v družino imunoglobulinov in je membranski celični receptor. PD-1 deluje kot imunska kontrolna točka in preprečuje prekomerno aktivacijo celic-T, kar bi lahko drugače sprožilo avtoimunski odziv. V limfnih vozlih poveča apoptozo celic-T hkrati pa zmanjša regulatorne celice T. Pravilnost izbitja gena PDCD1 so pred vrnitvijo spremenjenih celic v paciente preverili s sekvenciranjem.
Zaključek
V tehnologijo CRISPR-Cas9 se vlaga veliko denarja in upanja. Učinkovitost in specifičnost se počasi viša in izgleda, da smo že prišli do zadovoljive ravni, saj so se letos na Kitajskem začela prva testiranja na ljudeh, v naslednjem letu pa bodo sledila še klinična testiranja v ZDA. S tehnologijo spreminjanja genomov bomo lahko čez čas iztrebili vsa genetska obolenja.

==Viri==
http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302
https://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death_protein_1
https://en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell
https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease
https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nuclease

[[Seminarji SB 2016/17]]

Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami

2013-05-27T23:46:04Z

TomazRozmaric:

== Uvod ==

Odkritje induciranih pluripotentnih celic so nam omogočile tehnike in znanstvena načela ki so bila odkrita v 2. Polovici 20. Stoletja. V tem obdobju je so se dovolj izpopolnile tehike ločevanja, vzgajanja in preučevanja celic, s prenosom somatskega jedra je bilo dokazano, da diferencirane celice ohranijo enak genetski material kot embrionalne zarodne celice in prišli smo do spozananja, da so transkripcijski faktorji ključnega pomena za diferenciacijo celic.

== Raziskava ==

Leta 2005 je potekala raziskava v kateri so preverjali alternativno možnost za reprogramiranje somatskih celic v celice embrionalnega značaja. Do takrat je bilo že znano, da je citoplazma oocite zmožna reprogramirati genom somatske celice v embrionalno stanje, v novi metodi pa bi namesto oocit vlogo reprogramerja igrale človeške zarodne celice. Vlaganje truda v razumevanje procesov, ki potekajo med reprogramiranjnem ima veliko perspektivnih aplikacij v bodočni medicini in raziskavah. Dobro poznavanje mehanizmov nam bi namreč omogočilo izdelavo genetsko prirejenih celičnih linij za nove študije in zdravljenje bolezni.

Raziskava na podlagi predhodnih eksperimentov na mišjih zarodnih celicah predvideva, da so človeške zarodne celice dober kandidat za reprogramiranje somatskih celic. Poslužili so se metode kjer s polietilen glikolom (PEG) spojijo membrane človeških fibroblastov in zarodnih celic (hES). Ker fuzija s PEG ni zelo učinkovita so s transfekcijo pripravili proti higromicinu odporne in GFP pozitivne hES, s transdukcijo pa proti purimicinu odporne fibroblaste. Tako pripravljeni kulturi so zmešali, dodali PEG in jih na gojišču za hES izpostvili dvojni selekciji (prisotnost purimicina in higromicina). Na ta način je bilo poskrbljeno, da so v kulturi le celice, ki so se uspešno spojile.

Za dodaten dokaz ,da so na antibiotike odporne celice res nastale s fuzijo obeh tipov celic so primerjali fluorescenco hES in hibridnih celic ter izvedli PCR na hibridnih celicah. Rezultati so pokazali, da je fluorescenca v hibridnih celicah prisotna v enaki meri kot v hES ter, da hibridne celice vsebujejo viralni vektor ki so ga vnesli v celice fibroblasta.

V nadaljevanju je bilo potrebno odgovoriti na vprašanje, če se je somatski genom po fuziji res reprogramiral. Opazovanja rasti celic, njihovega celičnega cikla, celične delitve, transkripcijskih faktorjev in antigenov, so pokazala da hibridne celice izražajo vse lastnosti hES. Hibridne celice so izražale transkripcijske faktorje kot je OCT4, ki je specifičen za zarodne celice, zaznana je bila telomerazna aktivnost, izraženi so bili embrionalno specifični antigeni (SSEA4, TRA1-61,TRA1-80) in opažena je bila nesmrtna rast celic.

V primeru uspešnega reprogramiranja somatskega jedra bi morale biti hibridne celice pluripotentne. V raziskavi so pluripotentnost hibridnih celic opazovali in vivo in in vitro. V primeru in vitro testiranja, kjer so bile hES in hibridne celice kulturirane v suspenziji, je v obeh primerih prišlo do tvorbe embrionalnih telesc. Tudi pri in vivo testu je bil rezultat za obe skupini celic enak. Po injiciranju celic v golo miš je prišlo do tvorbe teratomov v katerih so bili izraženi proteinski produkti značilni za posamezne zarodne plasti; beta3- tubulin (neuroectoderm), miosin (mesoderm), alfa-fetoprotein (endoderm).

Za prevrjanje če so se embrionalni geni v hibridnih celicah reaktivirali so uporabili transgeni reporter, v katerem je bilo izražanje GFP odvisno od promotorskih regij Rex-1 gena. Rex-1 je specifičen protein za zarodne celice. Reporter je bil aktiven, ko je bil transficiran v hES in neaktivn ko je bil vnešen v celice fibroblasta. Celice fibroblasta ki so vsebovale reporter so nato spojili s hES, ki niso nosile gena za GFP. Nastale hibridne cleice so izražale GFP v enaakih koncentracijah kot hES, kar kaže na to da so se embrionalni geni reaktivirali.

Genski produkt CRIPTO/TDGF1 je komponenta NODAL signalne poti in se izraža samo v hES. V raziskavi je bil opažen fibroblastno secifičen polimorfizem na enem nukleotidu neprepisanega CRIPTO/TDGF1 gena. V raziskavi je bilo opaženo, da je bil fibroblastno specifičen polimorfizem prisoten tudi v treh od devetih izoliranih DNA hibridnih celic. To odkritje nakazuje na to, da so bili somatski aleli tega gena aktivirani po fuziji hES s fibroblasti, vendar aktivacija ni potekla 100%.

Za ugotovitev ali je v hibridnih celicah prevladovalo embrionalno transripcijsko stanje ali je bilo morda izraženo tudi somatsko transkripcijsko stanje, so v raziskavi uporabili metodo genome wide transcriptional profiling . Končni rezultat je pokazal da je bilo več kot 99% analiziranih transkriptov reprogramiranih.

V raziskavi so opazovali tudi epigenetske spremembe pluripotentnih genov kot je OCT4. Ugotovili so da so CG dinukleotidi v regiji za OCT4 gen v primeru fibroblastov metilerani, pri hES pa demetilirani. Opažanja pri hibridnih celicah so pojazala da se njihova epigenetska struktura ne razlikuje od hES.

Za konec so v raziskavi ponovili eksperiment le, da so tokrat uporabili drugo linijo hES celic in namesto fibroblastov vzeli kostne celice. Rezultati eksperimenta so bili enaki kot v prvem delu, kar kaže na to, da zmožnost reprogramiranja hES ni omejena samo na eno linijo hES celic in eno vrsto somatskih celic.

== Zaključek ==

Odkritja raziskave so pokazala da imajo hES celice zmožnost reprogramiranja somatskih celic v embrionalni značaj. Tako predstavljajo perspektivno zamenjavo za človeške oocite, kar bi močno pripomoglo k lažjemu raziskovanju mehanizmov reprogramiranja somatskih celic. Preden pa se bodo lahko hES uporabljele v terapeutske namene moramo ugotoviti kako se znebiti dodatnih kromosomov pred ali po fuziji celic. Če bi po enukleaciji hES obdržale reprogramske lastnosti, in če bi ugotovili kateri transkripcijski faktorji so pomembni da do reprogramiranja pride, potem bi se izognili nekaterim socialno etičnim problemom, ki se tičejo jedernega prenosa v človeške oocite.

== Viri ==
*Chad A. Chowan; Nuclear reprograming of somatic cellsafter fusion with human Embryonic stem cells; Nature vol. 309
*Matthias Stadtfeld; Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications; Genes and Development 2010 vol. 24
*Konrad Hochedlinger, Ph.D.; Nuclear Transplantation, Embryonic Stem Cells, and the Potential for Cell Therapy; New england journal of medicine 2003 vol.349
*James A. Thomson;Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts;Science 1998 vol.282

Reprogramiranje celic

2013-05-27T23:28:38Z

TomazRozmaric: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijske_zna%C4%8Dilnosti_izvornih_celic Biokemijske značilnosti izvornih celic](Urška Rode)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Epigenetsko_reprogramiranje_celic Epigenetsko reprogramiranje] (Karmen Belšak, Maša Mohar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_somatskih_celic_po_fuziji_z_embrionalnimi_izvornimi_celicami Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami] (Erik Janežič, Tomaž Rozmarič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inducirane_pluripotentne_celice_iz_mišjih_fibroblastov Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov ](Ana Kunšek, Nastja Pirman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izboljšane_mišje_inducirane_pluripotentne_celice Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice] /za 3 študente/ (Julija Mazej, Bojana Lazović, Maja Kostanjevec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_iPSC_za_zdravljenje_anemije_srpastih_celic_pri_miših Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših] (Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prve_človeške_inducirane_pluripotentne_celice Prve človeške inducirane pluripotentne celice](Dejan Marjanovič, Suzana Semič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezvirusni_na%C4%8Din_priprave_iPSC Brezvirusni način priprave iPSC](Griša Prinčič, Erik Mršnik, Jakob Gašper Lavrenčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema Reprogramiranje z dvema faktorjema](Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_s_transpozicijo Reprogramiranje s transpozicijo] (Barbara Dušak, Sara Lorbek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kloniranje_miši_iz_iPSC Kloniranje miši iz iPSC](Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tumorigenost_iPSC Tumorigenost iPSC](Urška Navodnik, Ana Remžgar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_miRNA Reprogramiranje z miRNA] (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pregled_in_prihodnost_postopkov_za_pripravo_iPSC Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC] / (Aleksander Benčič, Jernej Pušnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombiniranje_tehnologije_induciranih_pluripotentnih_mati%C4%8Dnih_celic_in_genskih_modifikacij_pri_zdravljenju_mi%C5%A1i%C4%8Dne_distrofije] (Urška Rauter)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.

Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami

2013-05-27T23:27:02Z

TomazRozmaric: New page: == Uvod == Odkritje induciranih pluripotentnih celic so nam omogočile tehnike in znanstvena načela ki so bila odkrita v 2. Polovici 20. Stoletja. V tem obdobju je so se dovolj izpopolni...

User:TomazRozmaric

2013-05-27T23:21:39Z

Reprogramiranje celic

2013-03-29T09:06:17Z

TomazRozmaric: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled
# Epigenetsko reprogramiranje - pregled
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/
# Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html
# Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
# Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/
# Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full
# Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/

== Skupine ==

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

# Biokemijske značilnosti izvornih celic
# Epigenetsko reprogramiranje (Karmen Belšak, Maša Mohar)
# Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Erik Janežič, Tomaž Rozmarič)
# Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Ana Kunšek, Nastja Pirman)
# Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/ (Julija Mazej, Bojana Lazović, Maja Kostanjevec)
# Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)
# Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Dejan Marjanovič, Suzana Semič)
# Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/(Griša Prinčič, Erik Mršnik)
# Reprogramiranje z dvema faktorjema (Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)
# Reprogramiranje s transpozicijo (Barbara Dušak, Sara Lorbek)
# Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)
# Tumorigenost iPSC (Urška Navodnik, Ana Remžgar)
# Reprogramiranje z miRNA (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)
# Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Urška Rauter)
# Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Aleksander Benčič, Jernej Pušnik)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.

BIO2 Povzetki seminarjev 2012

2012-11-09T22:17:18Z

TomazRozmaric:

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2012 stran]

===Griša Prinčič: Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice ===

S pomočjo EM je bilo mogoče podrobneje prepoznati in opisati tip III sekrecijski sistem in njegove komponente. Identificirali so vsaj pet različnih strukturnih komponent, njihovo proteinsko sestavo in delovanje.Več kot 20 različnih proteinov (YopD, YopB, YscF, YscP, YscR, YscS, YscT, YscU, YscV...) je potrebnih za učinkovito funkcioniranje T3SS-a, od katerih jih veliko kaže sekvenčno podobnost pri različnih vrstah. T3SS je sestavljen iz: igelnega dela , ki sestoji iz sekvenčno različnega proteina in tvori zvonasto ali filamentozno strukturo, zunajmembranskega kompleksa, znotrajmembranskega kompleksa in regulatornih komponent.

Efektorji, ki jih bakterija »dostavi« v celico modulirajo različne signalne poti. Blokirajo lahko MAPK in MAPKK (ospF, YopJ), kar zavre imunski odziv celice in prepreči vnetne procese. Pospešijo ali upočasnijo ubiquitinacijo (Cif in CHBP), za kar koristnost in učinkovitost še ni znana. Blokirajo majhne GTP-aze (IbpA), kar povzroči spremembe v aktinskem citoskeletu in moten membranski transport. Nekatere bakterije se v gostiteljski celisi razmnožujejo s pomočjo vakuol. SifA in SseJ sta bakterijska proteina, ki omogočata učinkovito tvorjenje tovrstnih struktur. Nekateri efektorji motijo tudi sintezo maščobnih kislin, nekateri poškodujejo pomembne celične strukture kot je na primer golgijev aparat. Vsi bakterijski efektorji delujejo na principu kovalentne modifikacije, torej trajno spremenijo strukturo in s tem inaktivirajo proteine – preprečijo kaskadno verigo.

===Erik Janežič: Hippo signalna pot in matične celice ===

Hippo signalna pot je ena glavnih regulatornih sistemov, ki preprečujejo tumorogenezo, nadzorujejo rast organov in sodelujejo pri diferneciaciji in vzdrževanju stalne gostote zarodnih celic. Hippo, drugače imenovana tudi Salvador/warts/hippo (SWH), je dobila takšno ime, ker mutacije v mehanizmu peljejo do preraščanja tkiva, kar lahko s tujko imenujemo »Hippopotamus «like phenotype. Prvič je bila opazovana v vinski mušici Drosophilia in večina ključnih raziskav je potekala prav na tem modelnem organizmu. Znanje pridobljeno z opazovanjem mehanizma mušic pa lahko direktno prenesemo tudi na lastnosti Hippo signalizacije sesalcev. Študije so namreč pokazale, da imajo vse ključne komponente pri mušici direktne ortologe v sesalcih in drugih organizmih. Smiselen se zdi sklep, da je bila Hippo signalna pot v veliki meri takšna kakor jo poznamo danes, prisotna že v prvih večceličnih organizmih,kar je tudi logično saj je pravilna diferenciacija in usmerjanje celic ključnega pomena za nastanke funkcionalnih celičnih enot (organov).
V preteklem desetletju s številne raziskave s Hippo področja zagotovile dobro poznavanje osrednje kinazne kaskade, katere funkcija je inaktivacija oziroma aktivacija YAP/TAZ transkripcijskih kofaktorjev proteinov družine TEA. Pri Hippo signalizaciji poleg osrednje kaskade sodelujejo tudi številni membranski in citoskeletni proteini, ki imajo veliko funkcij tudi pri kontaktni inhibiciji. Ogromno eksperimentalnih dokazov kaže neposredno povezanost nepravilnega delovanja Hippo signalizacije in nastankom raka, kar je verjetno razlog za intenzivne raziskave na tem področju v današnjem času.

===Dejan Marjanovič: Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov===

Vimentina, glavni predstavnik intermediarnih filamentov (IF) , je izražen v normalnih mezenhimskih celicah, in je znano, da ohrani celovitost celic in zagotavlja odpornost proti stresu. Povečano koncentracijo vimentina, so poročali v različnih rakavih epitelih, vključno raka prostate, tumorjev prebavil, tumorjev centralnega živčnega sistema, raka dojke, pljučnega raka in druge vrste raka. Prekomerno izražanje vimentina v raku je povezano tudi z večjo rastjo tumorja, vendar je vloga vimentina v napredovanju raka še vedno nejasna.
Na podlagi njegovega prekomernega izražanja v rakavih obolenjih in njegovo vlogo pri posredovanju v različnih tumorgenih dogodkih, vimentin služi kot privlačen cilj za zdravljenje raka. Poleg tega naj bi raziskave, usmerjene k pojasnjevanju vloge vimentina v različnih signalnih poteh, odpirale številne nove pristope za razvoj obetavnih zdravil za zdravljenje.

Ker pa je moje širše področje signalizacija,se bom bolj podrobno usmeril za signalizacijske poti, razjasnitev številnih mehanizmov in vmesnih sodelujočih proteinov, encimov itd. Vimentin je znan po tem, da interagira z velikim številom proteinov in sodeluje v različnih celičnih funkcijah. Poleg tega vimentin sodeluje tudi v številnih drugih procesih, ki vključujejo oblikovanje kompleksov z več signalnimi molekulami in drugimi proteini.

Iz te študije je razvidno, da vimentin ne deluje le kot ogrodni protein, temveč tudi posreduje pri večih poteh sporočanja in v celičnih procesih. Prav tako bi bilo zanimivo izvedeti, druge funkcije vimentina v jedru in morebitne vloge pri posredovanju v procesih celičnega cikla. Poleg tega bi lahko zunajcelični vimentin sodeloval pri posredovanje pri več signalnih procesih z vezavo na specifične receptorje, ki jih je treba še raziskati.

===Estera Merljak: Vpliv PKM2 na rakave celice===

Piruvat kinaza M2 (PKM2) ima zelo pomembno vlogo pri rakavih celicah. je ena izmed oblik piruvat kinaze, ki katalizira pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat, pri čemer se fosfatna skupina iz PEP prenese na ADP ter s tem dobimo ATP. PKM2 je v izražena v celicah, ki se hitro delijo, kot so zarodne in rakave celice. Izražanje omogoča veliko transkripcijskih faktrojev, posebno pomembni pa so transkripcijski faktorji iz družine heterogenih jedernih ribonukleoproteinov (hnRNPs), ki dajejo prednost sintezi PKM2 z neposrednim vplivanjem na mRNA.
Vpliv PKM2 na celičen metabolizem je zelo pomembna, saj lahko v celici prehaja med neaktivno dimerno obliko in aktivno tetramerno obliko, kar privede do različnih produktov. Aktivnost PKM2 je regulirana s strani mnogih snovi, med drugim intermediatov glikolize, ki lahko povečajo ali zmanjšajo aktivnost piruvat kinaze M2. Prav tako na aktivnost vplivajo razne post-translacijske spremembe aminokislin v samem proteinu, ki so rezultat kompleksnih reakcij v celici. S takimi procesi celica regulira sintezo energije in sintezo drugih prekurzorjev za množitev celic.
Poznavanje teh procesov ima velik medicinski pomen, saj lahko pripelje do oznajdbe specifičnih zdravil za zdravljenje raka, ki bi napadale in uničile le rakave celice, zdravih pa ne.

===Maja Kostanjevec: Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah===

Glukoza je pomemben vir energije, ki ureja marsikatero metabolno pot. Njena vloga se razlikuje od celice do celice glede na to, kakšne naloge opravlja. Posledično so se v evoluciji razvili različni mehanizmi njenega zaznavanja in prenosa signalov.

Preučevanje zaznavnih mehanizmov glukoze je zapleteno, saj ima poleg hranilne vloge tudi signalno, ki pa jo včasih težko ločimo od ostalih procesov, v katerih sodeluje. Trenutno so najbolj raziskani mehanizmi v kvasovkah, saj gre za najenostavnejše evkarionte. V njih so odkrili štiri različne signalne poti: glavno represivno pot, cAMP pot ter inducirani poti, ki sta odvisni od senzorjev Snf3 in Rgt2 oz. od fosforilacije.

Veliko bolj zahtevna je regulacija glukoze v rastlinah. V njih skrbi za izražanje različnih genov, ki urejajo procese fotosinteze, metabolizma, rasti… V modelni rastlini Arabidopisis thaliana so bili raziskani trije različni mehanizmi zaznavanja. Prvi je odvisen od heksokinaze in represira fotosintetske gene, drugi je od heksokinaze neodvisen in vsebuje še neznan receptor ter tretji, ki temelji na procesu glikolize in njenih vmesnih produktov.

Zaznavanje glukoze pri sesalcih ima posebne lastnosti, ki se razlikujejo tako od tistih v kvasovkah kot v rastlinah. Ti mehanizmi so najbolje preučeni v beta celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke, ki skrbijo za izločanje inzulina. Znano je, da je pri tem potreben obsežen metabolizem glukoze, kot glavni mediator pa nastopa ATP.

===Julija Mazej: Metabolizem glukoze v živčnih celicah===

Glukoza je preferenčno gorivo za možganske celice. Čeprav možgani predstavljajo le 2% celotne telesne mase, za svoje delovanje porabijo kar 25% zaužite glukoze. Možganske celice lahko kot energijski substrat uporabijo tudi: laktat, piruvat, glutamin in glutamat. Kakršnakoli ovira pri energijski oskrbi, je zelo rizična in se lahko konča z nezavestjo ali celo komo v manj kot 10 sekundah. V izogib takšnemu izidu so nekatere celice sposobne nadomestiti primanjkljaj energije oz. ATP z intenzivnejšo glikolizo. To velja za nevroglijalne celice, ki z glikolizo proizvajajo laktat. Vendar pa povišana glikoliza nima enakega vpliva na vse živčne celice. Nevroni zaradi povišane glikolize manj glukoze oksidirajo po pentoza-fosfatni poti, ki tam sicer poteka v normalnih razmerah. Ta metabolična pot je za nevrone zelo pomembna, ker se pri pretvorbi glukoza-6-fosfata v ribozo-5-fosfat regenerira NADPH. To je pomemben antioksidant, ki regenerira reduciran glutation in tako varuje nevrone pred poškodbami, zaradi reaktivnih kisikovih spojin. Glikolizo v nevro celicah stimulirajo hipoksični pogoji, nevrotoksične snovi, mutacije v respiratorni verigi.. Anomalije v metabolizmu glukoze so prisotne v mnogih nevrodegenerativnih boleznih, npr. Alzheimerjevi, Parkinsonovi, Huntingtonovi bolezni. Tu se kaže aplikativen pomen raziskav povezanih z metabolizmom glukoze v možganih. Velik problem pri razumevanju metabolizma v živčnih celicah predstavljajo nepojasnjene interakcije med glija celicami in nevroni .

===Jernej Pušnik: Uravnavanje metabolizma z acetilacijo proteinov===

V svoji seminarski nalogi bom predstavil pomen posttranslacijske modifikacije-acetilacije pri uravnavanju celotnega celičnega metabolizma. Kot že verjetno vsi veste, je večina reakcij, ki so del neke metabolne poti, kataliziranih z encimi. Ti pa so v osnovi proteinske makromolekule, sestavljene iz dvajsetih različnih aminokislin. Ena izmed teh aminokislin je lizin in vsebuje dve amino skupini. S prvo se povezuje v peptidno vez, druga, ki se nahaja na koncu ogljikovodikove verige pa je tarča acetilacije. Ko se acetilna skupina enkrat veže na lizinski ostanek, to povzroči določene spremembe v strukturi proteinske molekule, s tem pa se tudi spremeni encimska aktivnost. Na ta način so regulirani skoraj vsi encimi metabolizma. V seminarju sem opisal kako pride do same acetilacije in deacetilacije, da je pri tem potrebna prisotnost določenih encimov, kako se spremeni delovanje encimov delujočih v glikolizi, glukoneogenezi, citratnem ciklu, oksidaciji maščobnih kislin, oksidaciji aminokislin in ciklu sečnine. Ker je acetilacija tako razširjena modifikacija pri nadzorovanju metabolizma, imajo raziskave na tem področju velik potencial za odkritje novih terapevtskih pristopov k zdravljenju bolezni srca in ožilja, diabetesa, debelosti, itd.

===Rok Razpotnik: Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija===

V dani seminarski nalogi bom predstavil osnovne lastnosti rakavih celic, tipe celic, ki se nahajajo v tumorskem mikrookolju, ter podrobneje predstavil nekatere osnovne lastnosti metabolizma rakastih celic ter njene regulacije. Mutacije onkogenov in tumor supresorskih genov povzročijo spremembe v signalizacijskih poteh, katere povzročijo spremembe metabolizma rakastega tkiva. Metabolizem deluje v prid celični rasti, intenzivni celični delitvi, zaviranju apoptoze itd. Sam metabolizem rakastih celicah temelji na treh osnovnih temeljih: povečani produkciji energije, zadostni biosintezi potrebnih makromolekul in vzdrževanju redoks stanja. Da izpolnjujejo vse tri pogoje se rakaste celice poslužujejo mnogih regulacij metabolizma, z različnimi strateškimi potmi, npr. proteoliza skeletnih mišic, lipoliza maščobnega tkiva, intratumorna simbioza med laktat-proizvajajočimi in laktat-porabnimi celicami, upočasnevanje glikolize in usmerjanje intermediatov v pentoza fosfatno pot itd. Ker pa je mikrookolje, ki obkroža rakasto tkivo zelo dinamično, je za rakaste celice značilna metabolična fleksibilnost. Raziskave in razumevanje metabolične fleksibilnosti bi doprinesle k novim možnim strategijam zdravljenja. Učinek na reguliran metabolizem rakastega tkiva, bi imel ogromen vpliv na viabilnost rakastega tkiva, saj je metabolizem sklopljen s številnimi lastnostmi rakastih celic.

===Ajda Rojc: Metabolizem skeletnih mišic===

Mišice so največji porabnik energije v telesu, saj nam omogočajo vrsto različnih dejavnosti pri katerih se porablja energija. V našem telesu potekata dva različna sistema metabolizma – anaerobni in aerobni. Pri anaerobnem metabolizmu imata pomembno vlogo kreatin fosfat in glikogen. Zaloge ATP je v mišicah zelo malo, zato takoj nastopi cepitev visokoenergetskih vezi v kreatin fosfatu. Po porabi te energije se v glikolizi razgradi glikogen, ki se pri pomanjkanju kisika v mišicah namesto v piruvat, pretvori v laktat in to povzroča bolečine v mišicah. Druga vrsta metabolizma pa deluje kadar je kisika dovolj in to je aerobni metabolizem. Poleg glukoze se pri tej vrsti presnove razgrajujejo tudi maščobne kisline, ki se v β-oksidaciji reducirajo do vodika in acetil-CoA, ta pa vstopi v Krebsov cikel, kjer se proizvede energija ATP. Večja razpoložljivost maščobnih kislin vpliva na nalaganje znotrajmišičnega prostega Pi in AMP med vadbo. Pi in AMP sta odgovorna za regulacijo encima glikogen fosforilaze, ki cepi glikogen. Torej, če se njune koncentracije znižajo pride do manjšega števila cepitev glikogena na glukozo. Pri znatnem povišanju dostopnosti maščobnih kislin je glikogen fosforilaza inhibirana. To je le eden od načinov regulacije substratov v mišičnem metabolizmu. Domnevajo, da je oksidacija maščob regulirana s podobnimi faktorji (npr. adrenalin, Ca2+, ADP, AMP, Pi; AMPK, pH, acetil-CoA) kot razgradnja ogljikovih hidratov, vendar je glede tega, kako te faktorji vplivajo na regulacijo maščobnih kislin in oksidacijo maščob ter kaj je njihova vloga še veliko nejasnosti.

===Janez Meden: NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo===

Celično dihanje je sestavljeno iz glikolize, citratnega ciklusa in verige za prenos elektronov. Večina energije nastane, v obliki ATP pri zadnji stopnji celičnega dihanja, torej pri prenosu elektronov skozi komplekse I, II, III, IV in nastanku ATP-ja v kompleksu V – ATP-sintazi. Zadnja stopnja pa je mogoča le v prisotnosti O2.
Pa vendar življenje obstaja tudi v hipoksičnem okolju. Posebna oblika energijskega metabolizma, ki je značilno za nekatere bakterije, notranje zajedavce in školjke ter celo rakave celice je fumaratsko dihanje. Ta način metabolizma omogoča nekoliko boljši izkoristek energije. Pri njem sodelujeta le dva kompleksa I in II. Kompleks II je povezan s citratnim ciklusom – TCA in verigo za prenos elektronov. Prenašalec med kompleksoma je kvinon z nizkim redoks potencialom, kot je npr. rodokvinon pri A. suum, ali pa menakvinon, znan kot vitamin K.
Z razumevanjem mehanizma fumaratskega dihanja bi lahko razvili zdravila, ki bi inhibirala ali celo onemogočila delovanje tega mehanizma. Primerna tarča novih zdravil bi lahko bila Fp podenota kompleksa II ali pa bi zdravilo lahko delovalo tudi kot kompetitivni inhibitor kvinona.

===Ana Kunšek: Večfunkcionalnost akonitaze===

Akonitaza je protein, ki katalizira drugo stopnjo Krebsovega cikla, torej pretvorbo citrata v izocitrat. Vendar je tudi eden izmed "moonlighting" proteinov, torej proteinov, ki imajo poleg glavne tudi druge funkcije. Prav zato, ker ima toliko funkcij je njena vloga v celici še toliko bolj pomembna, nepravilno delovanje pa lahko pripelje tudi do pojava diabetesa in miopatije.

Akonitaza poleg kataliziranja omenjene pretvorbe citrata v izocitrat pomaga tudi pri uravnavanju koncentracije železa v celici, stabilizaciji oz. destabilizaciji mitohondrijske DNA ter pri odgovoru na oksidativni stres. Pri uravnavanju koncentracije železa se veže na mRNA in s tem zaustavi sintezo feritina (proteina, ki veže železo) ter s tem pomaga pri uravnavanju homeostaze. Mitohondrijsko DNA destabilizira, kar ji pomaga za lažje podvojevanje, pri oksidativnem stresu pa je ključni faktor pri uravnavanju pravilnega pH-ja v celici, brez katerega encimi ne morejo pravilni delovati.

Že samo s temi funkcijami smo ugotovili, da je akonitaza zelo pomembna v našem življenju, vendar verjetno še vedno ne poznamo vseh njenih funkcij, saj je odkrivanje "moonlighting" proteinov in njihovih ostalih funkcij zelo težko in zahteva veliko eksperimentalnega dela. Vendar bi lahko z vedenjem vseh funkcij proteinov iznašli tudi takšna zdravila, ki stranskih učinkov ne bi imela, saj bi zablokirala ali pospešila sintezo le tistega proteina, za katerega je to potrebno in ne bi s tem vplivala tudi na ostale funkcije proteina v organizmu.

===Tomaž Rozmarič: Warburg in Crabtree efekt===

Znanstveniki so ugotovili, da rakave celice, kljub prisotnosti kisika, ne izvajajo aerobnih procesov. Namesto tega so se usmerile v glikolizo. Temu se reče Warburg efekt. Kaj so rakave celice s tem pridobile, še ni čisto raziskano. Obstajajo pa hipoteze, da so zaradi tega veliko bolj invazivne, se sposobne deliti pri nizkih koncentracijah kisika in se izogniti apoptozi. Warburgov efekt je reguliran na večih stopnjah metabolne poti, s prekomerno izraženimi in prekomerno aktivnimi encimi, ki vzpodbujajo glikolizo ter inhibicijo proteinov, ki spodbujajo aerobni metabolizem.
Zraven Warburgovega efekta poznamo še Crabtree efekt. Ta mehanizem rakavi celici omogoča preklop na aerobni metabolizem pri pomanjkanju glukoze in obratno pri velikih koncentracijah. Brez poznavanja obeh mehanizmov in prekinitvi obeh hkrati je uspešnost zdravljenja raka zelo majhna.
Znanstveniki so našli vrsto kvasovke, ki ima skoraj identični metabolizem, kot ga ima rakava in je Crabtree pozitivna. Pri nizkih koncentracijah glukoze izvaja anaerobni metabolizem, v prisotnosti visoke koncentracije pa aerobni. Zaradi navedenih lastnosti je idealna za študijo rakavih celic.
Ko bodo znanstveniki natančno proučili Warburg in Crabtree efekt, se bodo lahko razvila tarčna zdravila, katera bi bistveno izboljšala kakovost našega življenja.

BIO2 Seminar 2012

2012-11-03T21:06:06Z

TomazRozmaric: /* Seznam seminarjev */

== Novice za študente ==
[https://www.google.com/calendar/embed?src=94r835uhlqu6sornlvmnldb5d0%40group.calendar.google.com&ctz=Europe/Belgrade Razpored izpitnih rokov in kolokvijev ter nekaterih kolokvijev iz vaj]

= Biokemijski seminar =
Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 9:00 do 12:00.

Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema*'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Erik Kristian Janežič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892412000694 Hippo signalna pot in matične celice ]||Filip Mihalič||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012
|-
| Dejan Marjanovič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482707001450 Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov]||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012
|-
| Griša Prinčič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000411001149 Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice]||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||Ajda Rojc||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012
|-
| Maja Kostanjevec||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000401018059# Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah]||Sara Lorbek||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012
|-
| Julija Mazej||14||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002072 Metabolizem glukoze v živčnih celicah]||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||Ana Kunšek||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012
|-
| Estera Merljak||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800041200059X Vloga PKM2 v rakavih celicah]||Suzana Semič||Monika Biasizzo||Janez Meden||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012
|-
| Jernej Pušnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410001702 Uravnavanje metabolnih poti z acetilacijo proteinov]||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012
|-
| Rok Razpotnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304419X12000534 Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija]||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||Erik Mršnik||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012
|-
| Ajda Rojc||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001448271000282X Metabolizem skeletnih mišic]||Ana Grom||Matej Vrhovnik||Katja Leben||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012
|-
| Tomaž Rozmarič||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272810006869 Crabtree in Warburg efekt: izvor energije rakavih celic]||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||Matic Kovačič||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012
|-
| Ana Kunšek||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000406000843 Akonitaza in mitohondrijska DNA]||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012
|-
| Janez Meden||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304416511003059 Moj naslov]||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012
|-
| Ana Cirnski||17||Moj izbrani naslov||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||Nastja Pirman||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012
|-
| Erik Mršnik||17||[http://www.nature.com/nrneurol/journal/v3/n3/full/ncpneuro0421.html Adrenolevkodistrofija]||Julija Mazej||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012
|-
| Katja Leben||17||Moj izbrani naslov||Estera Merljak||Suzana Semič||Monika Biasizzo||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012
|-
| Matic Kovačič||18||Moj izbrani naslov||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012
|-
| Zala Gluhić||18||Moj izbrani naslov||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012
|-
| Bojana Lazović||18||Moj izbrani naslov||Ajda Rojc||Ana Grom||Matej Vrhovnik||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012
|-
| Nastja Pirman||19||Moj izbrani naslov||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012
|-
| Špela Tomaž||19||Moj izbrani naslov||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012
|-
| Monika Biasizzo||19||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002138 Mitohondrijski razklopni proteini]||Janez Meden||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012
|-
| Jakob Gašper Lavrenčič||20||Moj izbrani naslov||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012
|-
| Barbara Dušak||20||Moj izbrani naslov||Erik Mršnik||Julija Mazej||Ellen Malovrh||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012
|-
| Matej Vrhovnik||20||Moj izbrani naslov||Katja Leben||Estera Merljak||Suzana Semič||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012
|-
| Filip Mihalič||21||Moj izbrani naslov||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013
|-
| Samo Zakotnik||21||Moj izbrani naslov||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013
|-
| Mirjana Malnar||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000409001418 Adipokini - vpliv na metabolizem lipidov]||Bojana Lazović||Ajda Rojc||Ana Grom||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013
|-
| Sara Lorbek||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410000915 Glutaminska odvisnost rakavih celic]||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013
|-
| Ellen Malovrh||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000407002150 Biosinteza hema v plazmodiju]||Špela Tomaž||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013
|-
| Suzana Semič||22||Moj izbrani naslov||Monika Biasizzo||Janez Meden||Griša Prinčič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013
|-
| Katarina Tolar||23||Moj izbrani naslov||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013
|-
| Aleksander Benčič||23||Moj izbrani naslov||Barbara Dušak||Erik Mršnik||Julija Mazej||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013
|-
| Ana Grom||23||Moj izbrani naslov||Matej Vrhovnik||Katja Leben||Estera Merljak||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti članek iz revije [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS], če tam ne najdete primerne teme, lahko izberete tudi pregledni članek iz kakšne druge revije, ki ima faktor vpliva nad 5. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2012|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli vsakemu od recenzentov in docentu (docentu ga pošljite po e-pošti).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte avtorju in Gunčarju.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar-2012

2012-05-12T19:32:29Z

TomazRozmaric: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/
username: tbk
password: samozameDD

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Link'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Ana Cirnski||TAL efektorji - proteini za urejanje genov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120105141141.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Matej Prevc||Ana Grom||Erik Mršnik
|-
| Griša Prinčič||DNK nanoroboti||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216144238.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Katja Leben||Jernej Pušnik||Maja Kostanjevec
|-
| Bojana Lazović||Vloga prionov pri preživetju in razvoju kvasovk||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120215142817.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Matic Urlep||Špela Tomaž||Sandra Zupančič
|-
| Vesna Radić||Odziv imunskega sistema z IFN-λ || [http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120209135106.htm povezava]||07.03.||09.03.||12.03.||Ana Grom||Katarina Tolar||Ana Cirnski
|-
| Julija Mazej||Pretvorba HDL v LDL preko CETP molekule||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120221165941.htm povezava]||07.03.||09.03.||12.03.||Aleksander Benčič||Mirana Krim Godler||Bojana Lazović
|-
| Matej Prevc||Moj naslov||povezava||07.03.||09.03.||12.03.||Jan Taškar||Zala Gluhić||Špela Tomaž
|-
| Erik Kristian Janežič||Študije golih krtovskih podgan ||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120223182512.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Griša Prinčič||Rok Razpotnik||Matic Urlep
|-
| Ana Grom||Visokotehnološko zaznavanje rakavih celic dojk||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/10/111028082715.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Matic Kovačič||Jan Taškar||Katja Leben
|-
| Robert Berger||Svetlobno stikalo za bolečino|| [http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120222093506.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Sara Bitenc||Rok Babič||Ajda Rojc
|-
| Filip Mihalič||Kako lizocimi v solzah uničijo nevarne bakterije||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120119143332.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Matej Vrhovnik||Dejan Marjanovič||Vesna Radić
|-
| Samo Zakotnik||Telomeri in nesmrtnost celic||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120227152612.htm povezava]||19.03.||22.03.||26.03.||Ana Kunšek||Tomaž Rozmarič||Ana Grom
|-
| Špela Tomaž||Specifično gibanje motornega proteina Dineina||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120113210652.htm povezava]||19.03.||22.03.||26.03.||Erik Kristian Janežič||Matej Prevc||Rok Babič
|-
| Katarina Tolar||Razvoj plastidov in Paulinella||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120227152819.htm povezava]||19.03.||22.03.||26.03.||Alenka Mikuž||Sara Bitenc||Monika Biasizzo
|-
| Zala Gluhić||Rubisco aktivaza|| [http://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111108104620.htm povezava] ||19.03.||22.03.||26.03.||Luka Krmpotić||Aleksander Benčič||Nastja Pirman
|-
| Veronika Furlan||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Špela Tomaž||Katja Leben||Sara Bitenc
|-
| Nastja Pirman||Aktinidni kelatorji||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120306181212.htm povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Jernej Pušnik||Sandra Zupančič||Estera Merljak
|-
| Barbara Dušak||Funkcionalne posledice spremenjenih podenot v RNA polimerazah|| [http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120301143743.htm povezava] ||21.03.||26.03.||02.04.||Rok Babič||Bojana Lazović||Rok Razpotnik
|-
| Rok Razpotnik||Botulinum toksin v kompleksu z NTNHA||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120223142628.htm]||23.03.||28.03.||02.04.||Ajda Rojc||Veronika Furlan||Luka Krmpotić
|-
| Erik Mršnik||Sintetični protein Oct4 amplificira gene matičnih celic||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216133922.htm povezava]||04.04.||11.04.||16.04.||Ana Cirnski||Julija Mazej||Filip Mihalič
|-
| Matic Kovačič||Kronični stres vodi do poškodb DNA||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/08/110821141135.htm povezava]||04.04.||11.04.||16.04.||Bojana Lazović||Samo Zakotnik||Aleksander Benčič
|-
| Matej Vrhovnik||Nove spojine, ki preprečujejo širjenje in izboljšajo zdravljenje raka||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120328142753.htm povezava]||04.04.||11.04.||16.04.||Mirana Krim Godler||Luka Krmpotić||Erik Kristian Janežič
|-
| Andreja Kukovec||Epigenetska blokada kognitivnih funkcij pri Alzheimerjevi demenci||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120229155534.htm||04.04.||11.04.||16.04.||Monika Biasizzo||Ellen Malovrh||Bojan Juloski
|-
| Rok Babič||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Tomaž Rozmarič||Matej Vrhovnik||Ellen Malovrh
|-
| Sara Bitenc||Okužba s Toxoplasmo gondii in povečana količina dopamina||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111104102125.htm povezava]||11.04.||16.04.||23.04.||Sandra Zupančič||Matic Urlep||Matic Kovačič
|-
| Jan Taškar||Pridobivanje elektrike s stratosferskimi bakterijami||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120221212614.htm povezava]||11.04.||16.04.||23.04.||Jakob Gašper Lavrenčič||Alenka Mikuž||Tomaž Rozmarič
|-
| Bojan Juloski||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Erik Mršnik||Robert Berger||Katarina Tolar
|-
| Monika Biasizzo||Vloga signalne poti TOR pri regeneraciji tkiv||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120320161318.htm povezava]||19.04.||26.04.||07.05.||Ellen Malovrh||Ajda Rojc||Alenka Mikuž
|-
| Katja Leben||Staranje celic||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120123101831.htm povezava]||19.04.||26.04.||07.05.||Maja Kostanjevec||Matic Kovačič||Janez Meden
|-
| Maja Kostanjevec||Antioksidanti - spojine, ki lahko poškodujejo DNK||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120322174621.htm povezava]||19.04.||26.04.||07.05.||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič||Matej Vrhovnik
|-
| Matic Urlep||Odpornost bakterij na sulfonamidne antibiotike||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120302082909.htm povezava]||19.04.||26.04.||07.05.||Katarina Tolar||Vesna Radić||Mirjana Malnar
|-
| Tomaž Rozmarič||Inženiring hiper-katalitičnega encima||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120417152732.htm||07.05.||11.05.||14.05.||Veronika Furlan||Ana Kunšek||Andreja Kukovec
|-
| Mirjana Malnar||Kaj vpliva na hitrost sinteze proteinov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120328142850.htm povezava]||26.04.||07.05.||14.05.||Janez Meden||Erik Kristian Janežič||Veronika Furlan
|-
| Luka Krmpotić||Vpliv 4 genov na spomin pri odraslih||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120415151347.htm povezava]||26.04.||07.05.||14.05.||Vesna Radić||Monika Biasizzo||Ana Kunšek
|-
| Ellen Malovrh||Dolgoživi jedrni proteini in njihov vpliv na celično staranje||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120203180905.htm povezava]||26.04.||07.05.||14.05.||Julija Mazej||Janez Meden||Mirana Krim Godler
|-
| Aleksander Benčič||S1P1 receptorji in njihov vpliv na multiplo sklerozo ter ostale bolezni||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216143957.htm povezava]||07.05.||14.05.||21.05.||Zala Gluhić||Griša Prinčič||Julija Mazej
|-
| Jakob Gašper Lavrenčič||Bio-sončne celice||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120202092246.htm]||07.05.||14.05.||21.05.||Dejan Marjanovič||Estera Merljak||Jernej Pušnik
|-
| Dejan Marjanovič||Moj naslov||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216094728.htm||07.05.||14.05.||21.05.||Rok Razpotnik||Erik Mršnik||Samo Zakotnik
|-
| Esra Böğürcü|| Triple-negative breast cancer||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120404133755.htm ||07.05.||14.05.||21.05.||Samo Zakotnik||Nastja Pirman||Matej Prevc
|-
| Ana Kunšek||Proteini za zaznavanje dotika||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120219143049.htm povezava]||14.05.||21.05.||28.05.||Estera Merljak||Mirjana Malnar||Jan Taškar
|-
| Sandra Zupančič||Moj naslov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120412182253.htm povezava]||14.05.||21.05.||28.05.||Filip Mihalič||Maja Kostanjevec||Zala Gluhić
|-
| Ajda Rojc||Strup meduz||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Mirjana Malnar||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič
|-
| Jernej Pušnik||Zaznavanje proteinov z zlatimi nanodelci||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120314111736.htm povezava]||14.05.||21.05.||28.05.||Nastja Pirman||Andreja Kukovec||Griša Prinčič
|-
| Estera Merljak||Nanotablete||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120316145755.htm povezava]||21.05.||28.05.||04.06.||Andreja Kukovec||Bojan Juloski||Barbara Dušak
|-
| Alenka Mikuž||Odkriti novi krvni skupini||[http://www.nature.com/ng/journal/v44/n2/abs/ng.1069.html povezava]||21.05.||28.05.||04.06.||Bojan Juloski||Ana Cirnski||Robert Berger
|-
| Janez Meden||Struktura ključnega proteina pri parkinsovi bolezni||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/10/111024113140.htm]||21.05.||28.05.||04.06.||Robert Berger||Filip Mihalič||Dejan Marjanovič
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2011. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
* Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 18 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava- 4 minute. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TBK2012 in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TBK2012-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dEozRlMwVDh0NDBmSmd2VnV0TUwtVGc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1 Povzetki seminarjev

2012-05-07T17:47:24Z

TomazRozmaric: /* Gregor Gunčar: Sintetični DNA vezavni proteini */

== Tomaž Rozmarič: Inženiring hiper katalitičnega encima ==
Dan danes je uporaba encimov v industriji zelo visoka. Bakterije gensko modificirajo in uporabljajo za sintezo najrazličnejših snovi.Zadnje
čase so bakterije postale zanimive za proizvodnjo energije, saj so sposobne sintetizirati vodik, z njimi porizvajajo bio-goriva in celo
elektriko. Te reakcije so še prepočasne, da bi bile uporabne v masovnih proizvodnjah in bi lahko bile konkurenca že obstoječim virom energije
kot so fosilna goriva(nafta) in jedrska energija. Zato so se znanstveniki začeli spraševati, kako bi lahko povečali hitrost reakcij in prav s
tem so se ukvarjali v članku, katerega sem prebral. Idejo jim je dal mehanizem reakcije v očesu. Ko svetloba pade na rodopsin povzroči vrsto
kemijskih reakcij, med drugim tudi konformacijske. To konformacijo zazna določen protein, ki jo pretvori v električni signal in pošlje do
možganov. Na podlagi tega so se odločili, da bi na nek encim pripeli neko molekulo, katera bi regulirala konformacijo encima, ko bi
to oni hoteli. To so potem naredili s pripetjem azobenzenskega mostu na encim(azobenzen pod določeno valovno dolžino spremeni konformacijo iz
cis v trans in obratno) in ugotovili, da se je hitrost reakcije znatno povečala, kar bi lahko bil velik prelom za biogoriva in druge encimsko
odvisnie reakcije.

== Ana Cirnski: TAL efektorji - proteini, ki urejajo gene ==
TAL (transcription activator – like) efektorji so regulatorni proteini, ki vplivajo na delovanje RNA polimeraze pri prepisovanju DNA. Z vezavnimi domenami se vežejo na specifična zaporedja baz na dvojni vijačnici in tako uravnavajo hitrost sinteze proteinov. Najbolj znani regulatorni proteini so motiv cinkovega prsta, motiv levcinske zadrge in motiv vijačnica – obrat – vijačnica.

TAL efektorje so odkrili v bakteriji vrste Xanthomonas, ki jih je uporabljala za reprogramiranje gostiteljskih celic, tako da so te sintetizirale proteine, ki so ustrezali bakteriji.

Domena TAL efektorja, ki se veže na DNA vsebuje 1-35 TAL ponovitev. Vsaka ponovitev je specifična za en bazni par na DNA in vsebuje 33-35 aminokislin (zadnja je okrnjena na 20 aminokislin), ki so vedno na istem mestu. Izjema sta mesti 12 in 13, znani tudi kot RVD mesti (repeat variable diresidues), ki določata specifičnost med efektorjem in DNA verigo.

TAL efektorji se med seboj ločijo po aminokislinskem zaporedju in številu njihovih ponovitev. Od teh lastnosti je odvisna specifičnost efektorja.
Za prepoznavo specifičnih mest na DNA sta odgovorni RVD mesti, ki določata, kam se bo efektor vezal. Obstaja tudi posebna koda po kateri se en par aminokislin veže na določen nukleotid. TAL ponovitve nimajo medsebojnega vpliva zato jih je lažje sestavljati in tako spremeniti efektor.
Uporabljajo se lahko kot umetni restrikcijski encimi (TALEN) za dvoverižne prekinitve DNA (DSB – [double–strand breaks]), kar povzroči v celici popravljalne mehanizme in vodi do sprememb v genskem zapisu. Lahko pa tudi kot transkripcijski faktor (dTALE) za vklapljanje in izklapljanje genov.

Čeprav je o TAL efektorjih še veliko neznanega, kažejo možnosti za široko uporabo na področju biotehnologije in genetike za izboljševanje lastnosti živil in zdravljenje nekaterih bolezni (HIV).

== Griša Prinčič: DNK nanotehnologija ==
Nanotehnologija je ustvarjanje in inženiring funkcionalnih sistemov na atomskem in molekularnem nivoju. DNK nanotehnologija je veja nanotehnologije, ki izkorišča strukturne in kemijske lastnosti DNK molekule ter iz nje sestavlja strukture, ki ne nosijo informacijskega zapisa in so v velikosti do nekaj 100 nanometrov. Najpomembnejši del pri sintezi DNK makromolekul je optimizirano zaporedje nukleinskih kislin. Sekundarno strukturo lahko tvori več različnih zaporedij baz, vendar bo velika večina teh zaporedij imela tudi negativne medsebojne interakcije, kar bi lahko privedlo do spremembe v obliki sekundarne strukture. DNK molekula ima sposobnost samosestavljanja (self-assembly). Pod določenimi pogoji lahko enotno daljšo verigo DNK pripravimo do zvijanja (folding) oz. tvorbe določene (želene) strukture.

V seminarski nalogi se bom osredotočil predvsem na razvoj tako imenovanih nanorobotov, ki služijo kot specializiran dostavni sistem signalnih molekul do celic v človeškem telesu. Ob aktivaciji receptorja se kapsula odpre in na mesto dostavi signalne ali druge molekule.

Pripravljeni so bili nanoroboti v obliki heksagonalnega »soda«, ki so sposobni prepoznati okvarjene ali rakaste celice s pomočjo aptamernega receptorja, ki služi tudi kot »ključavnični mehanizem«. Učinkovitost prepoznavanja celic in »ključavničnega mehanizma« je bila preizkušena na šestih vrstah rakastih celic. Celic Burkitt-ovega limfoma nanoroboti niso prepoznali (se niso aktivirali), pri ostalih petih vzorcih je bila aktivacija potrjena.

== Bojana Lazović: Vloga prionov pri preživetju divjih kvasovk ==
Kvasovke imajo pomembno vlogo pri odkrivanju in spoznavanju lastnosti prionov. Raziskave na njih lahko močno pomagajo tudi pri razumevanju prionskih bolezni, ki se pojavljajo pri ljudeh.
Znano je, da je velika posebnost prionov ta, da se lahko razmnožujejo brez DNK zapisa. Znanstveniki so pri raziskavah na laboratorijskih kulturah kvasovk prišli do pomembnih ugotovitev, glede vloge prionov pri dedovanju v kvasovkah. Razne konformacije proteinov v teh celicah imajo pomembno vlogo pri epigenetskem dedovanju, to je dedovanju, ki ni odvisno od zapisa na DNK verigi. S svojim delovanjem ustvarjajo dedne fenotipske lastnosti, njihova raznolikost pa spodbuja preživetje v spreminjajočih se okoljih in vpliva na razvoj novih lastnosti. Toda te lastnosti so potrdili le v laboratorijskih kulturah. Zato se je porajalo vprašanje, če enako velja tudi v naravi oz. za »divje« vrste kvasovk ali so ugotovljene značilnosti le umetno vzpodbujene v laboratoriju. Iz tega razloga so biokemično testirali okoli 700 različnih sevov vrste kvasovk Saccharomyce, da bi ugotovili če imajo prisotne prione. Rezultati so potrdili prejšnje raziskave. Tako so potrdili tezo, da prioni v splošnem urejajo nekatere dedne lastnosti v naravi, na način ki korenito poveča sposobnost prilagajanja.

== Vesna Radić: Odziv imunskega sistema z IFN-λ ==
Imunost je sposobnost obrambe telesa pred tujimi oz. škodljivimi snovmi, ki jih imenujemo tudi antigeni. Ko se ti pojavijo v telesu, jih imunski sistem prepozna in se odzove tako, da jih skuša uničiti na različne načine.
IFN lambda že dolgo veljajo kot pomembno orožje v imunskem sistemu v obrambi proti virusom, bakterija, parazitom in tudi tumorom. So namreč interferoni, saj so zmožni posegati v razmnoževanje in delovanje patogenov. Interferoni so celične beljakovine sposobne komuniciranja med celicami in tako na razne načine sprožitve delovanja imunskega sistema. IFN-λ so del razreda II citokinov. Lambda je podoben α, saj oba delujeta proti virusom. Razlika med njima je ta, da IFN-α lahko proizvedejo vse celice, ki imajo jedro, IFN-λ pa le nekaj določenih celic. Makrofagi proizvajajo IFN-λ za odziv na virusne in/ali bakterijske okužbe. Citokin IFN lambda se ustvari predvsem iz limfocita CD8+ T – spominske celice. T celice se aktivirajo ob prisotnosti že znanega antigena če ne pa živijo v neaktivnem stanju, ko se pa znova srečajo z že znanim antigenom, sprostijo IFN-λ.
Regulacija sproščanja IFN-λ še ni povsem znana; na podlagi novih študij izvemo, da se lahko sprostijo tudi brez aktivacije pri kontaktu z antigeni. Prav tako so odkrili tudi, da imajo ti interferoni pomembno vlogo pri zdravljenju hepatitisa B in C, astme in raka.
== Julija Mazej: Pretvorba HDL v LDL preko CETP molekule ==
Lipoproteini so raznovrstni delci, sestavljeni iz proteinskega in holesterolnega dela. Na podlagi deleža proteinov in holesterola v posameznem delcu ločimo 5 vrst lipoproteinov: hilomikrone, LDL,HDL,VLDL in IDS. V seminarju se bom omejila na dva, ki imata še posebej veliko vlogo pri transportu holesterola po krvni plazmi. HDL je lipoprotein visoke gostote in ima prevladujoč proteinski del. Znan je tudi kot dober holesterol, saj prenaša presežni holesterol iz celic do jeter, kjer poteče razgradnja. LDL pa je lipoprotein, ki prenaša holesterol v obratni smeri. V kolikor ima celica dovolj holesterola, se prične ta kopičiti na stenah žil, kar vodi do kardiovaskularnih bolezni. Pred kratkim so znanstveniki odkrili mehanizem pretvorbe dobrega holesterola v slab holesterol, preko majhne molekule CETP. Molekula deluje kot most med obema lipoproteinoma in prečrpa holesterol iz HDL v LDL. To odkritje daje nove perspektive na področju zdravljenja kardiovaskularnih bolezni, ki so glavni vzrok bolezni in prezgodnje smrti v Evropski Uniji in razvitem svetu. Učinkovito zdravilo, bi torej moralo inhibirati delovanje CETP molekule. Po rezultatih raziskave medicinske univerze na Dunaju, pa takšno zdravilo nebi pomagalo pacientom z ledvično odpovedjo. Pri nekaterih pacientih na dializi so namreč izsledili nefunkcionalen HDL. Spregovorila bom tudi o nastanku "<ra slabega" LDL, pri starejših in obolelih za diabetesom tipa 2.

== Ana Grom: Visokotehnološko odkrivanje rakavih celic dojk ==
Rak na dojkah je v današnjem svetu kar velik problem pri ženskah. Metode, ki se uporabljajo za zaznavo le tega, pa niso dovršene. Vsaka od njih (mamografija, ultrazvok, magnetna resonanca in druge) ima kakšno slabo lastnost. Metode, ki bi bila zdravju popolnoma neškodljiva, nezmotljiva, kratkotrajna in cenovno lahko dostopna še ni odkrita. Zato so znanstveniki prišli na idejo, da bi poizkusili z nanodelci detektirati rakave celice. Najprej so si izbrali Her2 protein (Human epidermal growth factor receptor 2), ki bo tarča teh nanodelcev. Za protein so predhodno vedeli, da se v 30% rakavih celic dojk čezmerno izraža. Da bi se magnetni nanodelci usmerili proti rakavim celicam in nanje tudi vezali, so ustvarili nanodelce povezane s protitelesi za Her2 protein. Nato, ko bi se nanodelci vezali na celice, pa bi s posebnimi občutljivimi napravami zaznavali te nanodelce in s tem tudi rakave celice v telesu. Poskusi, ki so jih izvedli, da bi potrdili svoja predvidevanja so bili zelo spodbudni. Uspelo jim je dokazati, da se nanodelci resnično v večji meri vežejo na celice, ki imajo več Her2 receptorjev (rakave celice). Nekaj izmed metod, s katerimi so prišli do teh rezultatov, bom tudi sama predstavila.

== Robert Berger: Svetlobno stikalo za bolečino ==
S podaljševanjem življenjske dobe in vse bolj tveganimi življenjskimi slogi v današnjem času ne moremo mimo bolečin, pa naj bodo akutne ali kronične, zato si medicina prizadeva, da bi jih, če jih že ne more odpraviti, vsaj lajšala. Vendar pri analgetikih in anastetikih pogosto naletimo na sistemske stranske učinke in odvisnosti, zato je odkrivanje novih vrst anastetikov in analgetikov eden pomembnejših ciljev farmacevtske industrije. Quaternary ammonium – azobenzene – quaternary ammonium oziroma QAQ je ena izmed možnih rešitev pri nadzoru bolečine. Sicer obstajajo optogenetske metode za uravnavanje aktivnosti nociceptorjev (bolečinskih receptorjev), vendar so pogosto preveč invazivne, saj zahtevajo spremembo DNK in lahko vodijo v trajne genetske spremembe, kar pa ni vedno zaželeno. QAQ s svojo strukturo omogoča blokado ionskih kanalov v nociceptorjih in tako prepreči bolečinski signal. Njegova posebnost pa je v njegovi strukturi, saj ga lahko z določenimi valovnimi dolžinami svetlobe (380 in 500 nm) spreminjamo med cis in trans izomerom, pri čemer cis izomer dovoljuje nemoten pretok Na+ in Ca2+ ionov, trans izomer pa zapre ionski kanal. Tako lahko prostorsko in tudi časovno nadzorujemo njegovo aktivnost. Pri podobnih anastetikih, kot so npr lidokain, ki deluje na podoben način kot QAQ izomerizacija in s tem tudi časovni nadzor nista možna.

== Erik Janežič:Raziskave golih krtovskih podgan (GKP) ==
Tekom zgodovine je velika večina tehnoloških iznajdb našla navdih v živalskem svetu. Danes pa morda prav živali kot so gole krtovske podgane, skrivajo odgovera na nekatera največja vprašanja človeštva kot sta zdravljenje raka in staranje. Gole krtovske podgane niso pritegnile posebne pozornosti med zannstveniki, dokler ni bil v 2. trtjini 20. stoletja pri njih odkrit eusocialen način življenja. Do danes so bile odkrite izjemna lasttnosti golih krtovskih podgan kot naprimer; odpornost na raka, na hipooksično okolje, neobčutljivost na iritacijo s kislinami ter izredno dolga življenska doba v primerjavi z drugimi glodalci. V seminarski nalogi vam bom predstavil nekaj splošnih značilnosti golih krtovskih podgan in njihove odpornosti na rakava obolenja, podrobneje pa bom predstavil raziskavo, ki se je ukvarjala z opazovanjem intracelularnega kalcija pri izpostavitvi možganskih celic GKP hipooksičnem okolju. Povečane koncentracije intracelularnega kalcija v možganskih celicah je namreč glavni razlog, da celice odmrejo oziroma imajo trajne poškodbe strukture in funkcije.

== Špela Tomaž: Specifično gibanje motornega proteina dineina ==
Za normalno delovanje celic in potek celičnih procesov, so med drugim izredno pomembne funkcije transporta, organizacije ter gibanja celičnih delov in organelov. Nalogo opravljajo tako imenovani motorni proteini, ki aktivno prenašajo tovor z enega dela celice na drugega, s svojim gibanjem omogočijo delovanje bičkov ter migetalk in so odgovorni tudi za gibanje mišic. Posebej zanimiva je mehanika njihovega premikanja, saj zaradi sprememb v konformaciji njihovih sestavnih proteinov dobesedno korakajo po svoji bazi (mikrotubuli ali aktinski filamenti). Medtem ko je kinetika gibalnih proteinov miozinov in kinezinov že raziskana, pa je premikanje tretje vrste, dineinov, še vedno slabo poznano. Dineini se v mnogih strukturnih lastnostih od ostalih vrst razlikujejo, kar posledično vpliva tudi na njihovo korakanje, ki ni urejeno in periodično, tako kot pri miozinih in kinezinih. Sposobni so različno dolgih korakov, ne le naprej in nazaj, temveč tudi vstran pod različnimi koti. Izmenično preklapljajo med koordiniranim in nekoordiniranim gibanjem in so nepredvidljivi ter dinamični, kar bi jim predvidoma lahko prinašalo mnoge ugodnosti in boljše sposobnosti prilagoditve. V seminarski nalogi bom opisala nekatere ugotovitve nedavnih raziskav ter predstavila nekatere odkrite značilnosti gibanja dineina.

== Samo Zakotnik: Telomeri in nesmrtnost celic ==

Človeštvo že odkar obstaja sanja o nesmrtnosti, o večnem življenju. Medicina je skozi človeško zgodovino uspešno podaljševala življenja z odkrivanjem vedno novih zdravil in zdi se, da je v prihodnosti možno doseči nesmrtnost, toda le, če bomo premagali staranje. Starost samih celic pa je močno povezana z dolžino telomerov. Telomer je ponavljajoče se zaporedje nukleotidov, ki ščitijo kromosome pred poškodbami. Premajhna dolžina telomerov naj bi vodila v razvoj škodljivih mutacij in razvoju onkogenov, ki vodijo v nastanek raka. Da bi lahko preprečili škodljivo krajšanje telomerov moramo podrobno preučiti mehanizme, ki zagotavljajo ohranjanje dolžin telomerov v okvirjih, ki niso potencialno škodljivi, ali celo omogočajo obnavljanje telomerov in njihovo podaljševanje, kar bi vodilo do celične nesmrtnosti. Vse to je povezano s samo zgradbo telomerov in delovanjem telomeraze, encima, ki skrbi za podaljševanje telomerov.
V drugem delu seminarja pa bom predstavil mehanizme somatskega obnavljanja telomerov in posledice inhibicije telomeraze na primeru ploskih črvov vrste Schmidtea mediterranea. Vrsta je predmet preučevanja že več kot 200 let zaradi izjemnih sposobnosti regeneracije, v sedanjem času pa postaja vse pomembnejši modelni organizem za preučevanje telomer in delovanja telomeraz. Leta 2010 so podelili Nobelovo nagrado za medicino in fizlologijo prav za odkritje, kako so konci kromosomov zaščiteni s telomeri in za odkritje encima telomeraze.

== Zala Gluhić: Rubisco aktivaza ==

Rubisco je encim, ki v temotnih reakcijah fotosinteze katalizira pretvorbo sladkorja ribuloza-1,5-bifosfat v molekuli 3-fosfoglicerata, iz katerih se nato lahko tvori glukoza. Vezava ribuloze-1,5-bifosfata na nekarboksiliran encim Rubisco inhibira. Za nemoten potek fotosinteze je potrebno sladkor odstraniti, kar v rastlinah poteka s pomočjo ATP odvisnega procesa z encimom Rubisco aktivaza. Rubisco aktivaze delimo na zeleni in rdeči tip. Struktura pri zelenem tipu je bila pojasnjena s pomočjo Rubisco aktivaze, poimenovane Rca, pri vrsti tobakovca N. tabacum. Pri rdečem tipu so bili izolirani kristali kompleksa iz rdeče alge R. sphaeroides (Rubisco aktivazo so poimenovali Cbbx). Pri obeh proteinih so odkrili podobno zgradbo. Sestavljena sta iz dveh domen - α/β poddomene ter α-vijačnica poddomene. Za svoje delovanje potrebujeta ATP, tvorita heksamerne obročaste strukture, na sredini katerih se nahaja pora. Zaenkrat mehanizem njunega delovanja še ni pojasnjen. Sklepajo, da gre pri Rca za premestitev Rubisca do centralne pore, kjer zanke destabilizirajo Rubiscovo aktivno mesto. Pri Cbbx pa verjetno sodeluje podaljšan C-konec Rubisca, ki ga aktivaza potegne v poro in s tem sprosti zanko, ki na Rubiscu veže sladkor, zato se sladkor lahko odcepi in Rubisco spet normalno deluje naprej.

== Katarina Tolar: Razvoj plastidov (kloroplastov) in Paulinella ==

Endosimbioza in posledično razvoj organelov je še vedno dokaj nepojasnjena. Čeprav je čedalje več rezultatov raziskav, ki endosimbiotsko teorijo potrjujejo in razlagajo. Najprimernejši in najuporabnejši organizem za raziskovanje in preučevanje tega dela evolucije je organizem Paulinella chromatophora. Ta organizem je najprimernejši, ker znanstveniki verjamejo, da je to najbolj izvoren še živeč fotosintetski protist. P. chromatophora naj bi bil en prvih organizmov, ki je vključil cianobakterije. Plastidi, ki so vključeni v različnih vrstah protistov se med seboj razlikujejo. Ugotovili so, da je genom plastida močno reduciran, v nekaterih vrstah plastidov bolj, v drugih manj. Vendar so med njimi velike podobnosti. Prav tako so dokazali, da so se plastidi res razvili iz cianobakterij, saj obstaja ogromna podobnost med genomi cianobakterij in genomi plastidov. Ker je genom plastidov močno zreduciran, so posledično plastidi močno odvisni od jedra. Zato so plastidi in gostiteljska celica razvili Tic in Toc premestitven sistem, ki omogoča prenos proteinov, ki so pomembni za gradnjo in razvoj plastidov iz citoplazme v sam plastid. Ta premestitveni sistem se je razvijal skupaj z rastlinami. Vendar je ohranjal tudi cianobakterijske lastnosti. To je še en dokaz, ki potrjuje endosimbiotsko teorijo.

== Barbara Dušak: Funkcionalne posledice spremenjenih podenot v RNA polimerazah ==

RNA polimeraze so encimi, ki usmerjajo transkripcijo DNA in sodelujejo pri genski regulaciji. V vseh evkariontskih organizmih so prisotne tri različne RNA polimeraze (I, II, III), rastline pa imajo še dve dodatni polimerazi RNA (IV in V). Polimeraze RNA II, IV in V so sestavljene iz 12 različnih podenot, ki imajo različne vloge. Izbrana raziskava se je osredotočila na delovanje devete podenote, ki ima dve različici, 9a in 9b, v Pol II, IV in V pri rastlini Arabidopsis thaliana. Izkazalo se je, da imata nefunkcionalni podenoti različne posledice na delovanje polimeraz. Raziskave so izvajali s križanjem rastlin divjega tipa z mutantkami 9a-1 in 9b-1, nato pa opazovali spremembe v organizmu. Heterozigoti 9a-1 niso kazali nobenih sprememb, 9b-1 pa so se fenotipsko razlikovali od divjega tipa. Homozigoti za mutirani različici obeh genov se sploh niso razvili.
Predstavila bom spremembe, ki so se pojavile na molekularnem nivoju, v povezavi s tem, kar je že znano o delovanju polimeraz RNA.

== Rok Razpotnik: Botulinum toksin v kompleksu z NTNHA (nehemaglutinirajočimi proteini) ==

Botulinum toksin je najmočnejši do sedaj odkriti nevrotoksin. Botulinum nevrotoksin je možen agent za bioterorizem, po drugi strani pa se uporablja v terapijah in kozmetični industriji, znan pod imenom botox. V obeh primerih deluje kot inhibitor acetilholina, pri čemer napade živčne celice. Preden pa uspe priti do živčnih celic, ki nadzirajo delovanje mišic, mora toksin, pri zaužitju, iti skozi dolgo pot – preko celotne prebavne poti, kjer so prisotni številni prebavni encimi in izredno močno kislinsko okolje, do črevesja, kjer je nato vsrkan v krvni obtok, kjer se prevaža vse do živčnih celic. V seminarski nalogi vam bom predstavil organizem, ki proizvaja omenjeni nevrotoksin; bolezensko stanje, ki ga povzroča kontaminacija z botulinum toksinom; strukturo ter mehanizem delovanja, ter na koncu izsledke raziskave, kjer so ugotovili mehanizem delovanja kompleksa, v katerem je nevrotoksin vezan pri poti skozi prebavni trakt. V raziskavi so ugotovili, da se botulinum toksin veže v zaprt in stabilen kompleks z netoksičnim nehemaglutinirajočim proteinom (NTNHA), ta pa ga varuje pred ekstremnimi pogoji v želodcu (nizek pH, delovanje prebavnih proteaz). Kompleks se razpusti ko ta preide v črevesje, kjer vlada nevtralna pH vrednost. Tako prosti botulinum toksin v črevesju vstopi v krvožilje, ki potuje naprej do kolinergičnih nevronov, ker povzroči inhibicijo acetilholina. To se kaže v paralizmu mišic. Ugotovili so torej, da je mehanizem vezave botulinum toksina ter NTNHA ter preživetja nevrotoksina pogojen z mehanizmom spremembe pH vrednosti.

== Erik Mršnik: Vloga Oct4 pri izražanju genov matičnih celic ==

Med sesalčevim razvojem je potrebno, da iz ene totipotentne celice nastane več kot dvesto različnih tipov celic. Inducirane pluripotentne zarodne celice (ali krajše iPSCs) je možno pridobivati tudi iz somatskih celic z ekspresijo transkripcijskih faktorjev, ki so navadno izraženi v ESCs. Pluripotentno stanje se da vzdrževati z določenimi citokini. Na primer z LIF-om ali BMP4.
Transkripcijski faktor Oct 4 (iz družine PouV) je osnoven za nastajanje in vzdrževanje iPSCs in ESCs. Če ga odstranimo, povzročimo diferenciacijo teh celic. Oct4 se izraža tudi v fazi gastrulacije matičnih celic, kjer blokira prezgodnjo diferenciacijo. Kljub mnogim raziskavam pa še vedno ni povsem znano, kako Oct4 deluje kot transkripcijski faktor pri reguliranju diferenciacije. Nekateri eksperimenti so pokazali, da lahko deluje kot aktivator ali represor genske transkripcije.
Odkrili so, da se Oct4 pri svojem delovanju združuje z nekaterimi drugimi transkripcijskimi faktorji. Predvsem z Sox2 (iz družine HMG) in Nanog. Ti naj bi istočasno kontrolirali izražanje genov in regulirali razvoj ESCs.
V tej študiji so se posvetili derivatom Oct4, ki so jih izdelali izključno kot aktivatorje ali represorje transkripcije. Vsak protein ima PouV DNA-prepoznavno sekvenco združeno z močno aktivacjsko (VP16) ali represijsko (Engrailed ali HP1) regijo transkripcije. Tekom študije so ugotovili, da pravzaprav samo aktivatorska oblika povzroči nastanek iPSCs. Aktivatorska fuzija vzdržuje rast in pluripotentnost mišjih ESCs, ki jim manjka »divjega tipa« Oct4. Oct4-aktivatorska fuzija lahko prepreči pluripotentost ne glede na pisotnost LIF-a. Predvidevajo, da delovanje Oct4 kot aktivatorja zadošča za povzročitev nastanka iPSC in vzdrževanje ESCs.

== Matej Vrhovnik: Nove spojine, ki preprečujejo širjenje in izboljšajo zdravljenje raka ==

Glioblastom je oblika agresivnega malignega raka, ki se razvije iz vezivnega tkiva v možganih. Po operaciji imajo pacienti naveč 2 leti življenja, brez zdravljena nekje do 3 mesece. Problem se pojavi po operaciji, kjer se odstrani do 99% rakastega tkiva in obsevanju, ker noben kemoterapevtik ne deluje dovolj učinkovito. Glioblastom tvori veliko metastaz, ki so zelo razširjene po zdravem tkivu in zato ne moremo z kemoterapevtiki napasti vse rakave celice, ker bi uničili tudi preveč zdravega tkiva, oziroma zdravilo ima preveč blag učinek.
Znanstveniki so zato ustvarili spojino imipramine blue. Deluje tako, da inhibira tvorjenje reaktivnih kisikovih spojin, inhibira NADPH-oksidazo in reorganizira aktin v citoskeletu. Ravno reaktivne kisiko spojine so krive za invazivno širjenje rakastih celic po zdravem tkivu, kar pa imipramine blue prepreči, posledično je rak v strjeni skupini, kjer kemoterapevtik lažje opravi svoje delo. Dokazali so, da v kombinaciji z doxorubicinom zelo podaljša življenjsko dobo podgan, ki imajo tumor RT2, ki je zelo podoben človeškemu glioblastomu. Prav tako preprečuje poškodbo krvno-možganske pregrade, kar je ponavadi eden izmed stranskih učinkov kemoterapevtikov.

== Matic Kovačič: Kronični stres vodi do poškodb DNA ==

Stres je pri ljudeh prisoten že odkar imata nadledvični žlezi sposobnost izločanja stresnih hormonov, kot sta na primer adrenalin in noradrenalin. Včasih sta se hormona izločala kratek čas med bojem in telo pripravila na lažje preživetje. Danes pa smo v moderni družbi zaradi hitrega načina življenja in obveznosti, ki jih moramo izpolniti, podvrženi stresu skoraj ves čas. Dolgoročni stres, ki se imenuje tudi kronični stres, ima na naše zdravje in počutje negativne posledice. Znanstveniki so s poskusi na miših, na katerih so simulirali kroničen stres, ugotovili, da kronični stres vodi do povečanih napak v DNA z zmanjšanjem koncentracije proteina p53. Stresni hormoni, kot je recimo adrenalin, se vežejo na β2-adrenoreceptorje, kar povzroči večji izvoz proteinov p53 iz jedra v citosol, kjer jih proteasom razgradi. Protein p53 imenujejo tudi varuh genoma, saj v primeru poškodbe DNA zaustavi celični cikel in aktivira popravljanje poškodovanih delov DNA, če pa so poškodbe DNA prevelike, p53 povzroči celično smrt. Neka druga skupina znanstvenikov pa je ugotovila, da kroničen stres tudi zelo močno pospeši rast tumorjev. Povedal bom nekaj splošnih stvari o stresu in proteinu p53, nato pa predstavil raziskave in ugotovitve znanstvenikov.

== Andreja Kukovec: Epigenetska blokada kognitivnih funkcij pri Alzheimerjevi demenci ==

Alzheimerjeva demenca je ena od najpogostejših oblik demence. Večinoma se pojavi po 65. letu starosti. Eden začetnih simptomov je poslabšanje spomina, kar posamezniki pogosto napačno interpretirajo kot posledico staranja ali stresa. Gre za nevrogenenrativno bolezen. Točen vzrok nastanka Alzheimerjeve demence še ni znan. Dandanes je v veljavi opredelitev, da je Alzheimerjeva demenca posledica akumuliranja napačno zvitih proteinov - t. i. beta amiloidni plaki. Prisotni so tudi nevrofibrilarni vozli, ki se pa, za razliko od amiloidnih plakov, nahajajo znotraj nevronov. Histoni so bazični proteini, okoli katerih se ovije DNA. Na nestabilnih aminokislinskih koncih histonov se odvijajo različne modifikacije, ki regulirajo izražanje genov. Med slednje spadata tudi acetilacija in deacetilacija, ki imata pomembno vlogo pri izražanju genov, ki so povezani s spominom in učenjem. V raziskavi so ugotovili, da je histon HDAC2 pri bolnikih z Alzheimerjevo demenco prisoten v preveliki meri, kar blokira izražanje genov, pomembnih za spomin. Ko so z inhibitorji zmanjšali nivo HDAC2 se je nevronom povrnila sinaptična plastičnost in izražanje s spominom povezanih genov. To znižanje HDAC2 pa se je pokazalo tudi kot izboljšanje kognitivnih funkcij (pri miših), kar pomeni, da bi te ugotovitve lahko imele pomembno vlogo pri zdravljenju Alzheimerjeve demence.

== Sara Bitenc: Okužba s Toxoplasmo gondii in povečana količina dopamina ==

Kljub veliki farmacevtski ponudbi cepiv in antibiotikov na tržišču se žal ne moremo izogniti nekaterim infekcijskim boleznim, katerih vzrok so mikroorganizmi. Eden izmed takšnih organizmov, ki povzroča povsem svetu razširjeno in zahrbtno bolezen t. i. toksoplazmozo, je Toxoplasma gondii, znotrajcelični zajedavec. Ta zahteva tako gostitelja kot tudi vmesnega gostitelja, da je življenjski cikel parazita sklenjen. Ciste parazita povzročajo kronično infekcijo, pri čemer se razširijo v gostiteljeve mišice in možgane (največjih delež teh se je nahajal v amygdali in nucleus accumbens – predela v možganih), v posameznih znotrajceličnih tkivnih cistah pa T. gondii tvori več sto bradiozit. Da bi znanstveniki podali zaključek v zvezi s spremembami količine dopamine, so s paraziti okužene možgane pri miših raziskovali s protitelesi dopamina in ugotovili,da parazit prevzame nadzor nad gostiteljsko celico in začne spreminjati nevrotransmitsko signalno transdukcijo, kar v organizmu izzove različne vedenjske spremembe. Glavna ugotovitev moje seminarske naloge je, da je količina sproščenega dopamina povezana s številom parazitov v gojeni kulturi. Poskusi, ki jih bom predstavila, so bili izvedeni »in vivo« in »in vitro«. Veriga interakcij med patogenom (tistim, ki povzroča bolezen – T. gondii) in njegovim gostiteljem (v našem primeru je ta žrtev naša npr. živčna celica) je torej zelo zapletena; nedolgo nazaj je znanstvenike begala povezava med parazitom in njegovim obnašanjem… Danes pa vemo, da je za spremembe v metabolizmu dopamina ključna T. gondii, ta dognanja pa bodo prispevala k razlagi razvoja bolezni pri bolnikih s toksoplazmozo in nekaterih psihovedenjskih bolezni.

== Jan Taškar: Mikrobske gorivne celice in uporaba umetnega konzorcija bakterij ==

Današnji svet se približuje energetski krizi, saj smo še vedno v preveliki meri odvisni od fosilnih goriv, ki jih bo kmalu zmanjkalo,a še vedno nimamo dovolj razvitih alternativnih virov energije, ki bi jih lahko nadomestili. Zato se stalno odkriva nove alternativne načine pridobivanja energije, kot so tudi mikrobske gorivne celice. Mikrobska gorivna celica ali MFC (microbial fuel cell), kot druge gorivne celice, proizvaja električni tok, le da za njegov nastanek izkorišča naravne procese mikroorganizmov, kjer se nek organski substrat razgradi in nastanejo elektroni. Sama ideja pridobivanja elektrike s pomočjo mikroorganizmov nam je znana že od leta 1911, vendar se je zanimanje za njih povečalo šele po sedemdesetih letih prejšnjega stoletja, ko so počasi začeli bolje razumevati mikroorganizme prisotne pri pridelavi elektrike, ter odkrivati nove načine za izboljšanje delovanja in s tem tudi potencial MFC-jev kot čisti vir energije. Dandanes je vloženo veliko truda v izboljšanje in tudi boljše razumevanje te zelo potencialne tehnologije, z namenom da bi nekegega dne lahko dosegli dovoljšen izkoristek da bi s pomočjo posebnih mikroorganizmov hkrati čistili odpadne vode, ter istočasno pridobivali dovolj elektriko za naše potrebe.

== Monika Biasizzo: Vloga TOR signalne poti pri regeneraciji tkiv ==

Regeneracija je proces obnavljanja, popravljanja in rasti, ki omogoče organizmom ustrezen odgovor na poškodbe ali motnje, ki negativno delujejo na organizem. Poškodovano ali izgubljeno tkivo morajo nadomestiti nove celice, zato sta potrebni celična rast in delitev. Celično rast in delitev sprožijo in omogočijo različne signalne poti in mehanizmi. Ena izmed pomembnih signalnih poti je TOR signalna pot. Protein TOR oziroma tarča rapamicina je glavni protein TOR signalne poti, ki vpliva na sintezo proteinov preko stimulacije mRNA translacije, transkripcije in biosinteze ribosomov. TOR signalna pot lahko sproži in zavre sintezo proteinov glede na zunanje signale, kot so dostopnost hranil, rastni hormoni in nivo celične energije. Zaradi te signalne poti celica ob premajhni količini hranil in energije ne raste in se ne deli, saj je sinteza proteinov zavrta. Ta mehanizem omogoča celicam, da rastejo in se delijo le, ko imajo na voljo dovolj snovi. Vlogo TOR signalne poti pri regeneraciji tkiv so raziskovali pri ploskih črvih rodu ''Planaria'', ker imajo izredno sposobnost regeneracije. Skupino ploskih črvov, ki so jim utišali izražanje gena za protein TOR s tehnologijo RNAi, so primerjali s kontrolno skupino med regeneracijo po amputaciji. Ugotovili so, da ima TOR signalna pot pomembno vlogo pri mitotski delitvi in tvorjenju blastem – novo tkivo, kjer se manjkajoče strukture regenerirajo. TOR signalna pot je v zadnjem času predmet raziskav za terapije proti raku in inhibicija TOR v planarijih nam lahko pokaže posledice dolgoročne inhibicije TOR signalne poti.

== Matic Urlep: Odpornost bakterij na sulfonamidne antibiotike ==

V današnjem času je vedno več bakterij, ki so postala odporna na veliko antibiotikov in to postaja vedno večji problem. V svojem seminarju bom opisal raziskavo znanstvenikov ustanove » St. Jude Children's Research Hospital «. Ti so se osredotočili na sulfonamidne antibiotike. Ti antibiotiki inhibirajo delovanje dihidropteroat sintaze, encima ki je ključen pri biosintezi folne kisline. Folat ali folna kislina pa pomaga pri sintezi DNA, popravi DNA in pri hitri celični delitvi. Sposobnost bakterij do prilagoditve je naredila te antibiotike skoraj neuporabne. Znanstveniki pod okriljem Mi-Kyung Yuna so se osredotočili na delovanje DHPS ( dihidropteroat sintaza ) in kaj se dogaja z aktivnim mestom med samo biosintezo dihidropteroata in kako sulfoamidi uničijo bakterije. Njihova odkritja odpirajo možnosti za proizvodnjo novih antibiotikov na katera bi se bakterije težje prilagodile in bi imeli manj stranskih učinkov.

== Maja Kostanjevec: Antioksidanti - spojine, ki lahko poškodujejo DNA ==

Antioksidanti so spojine, ki ščitijo celice pred škodljivimi radikali, ki nastajajo v procesu oksidacije. Njihovi učinki se danes raziskujejo v povezavi z različnimi boleznimi, saj je za njih značilno, da imajo na telo pozitivne učinke. Vendar pa je raziskava genotoksičnih spojin pokazala, da lahko nekateri v velikih koncentracijah poškodujejo DNA. Za določitev genotoksičnih spojin so raziskovalci ustvarili novo metodo analize, ki temelji na povišanju ravni proteina ATAD5. Ta se v celici pojavi ob poškodbi DNA, saj zavira genomsko nestabilnost in nastajanje tumorjev ter sodeluje pri popravljanju DNA. Za tri antioksidante (resveratrol, genisteinin in baicalein) so v raziskavi dokazali, da lahko uničijo celice, za katere je značilna hitra delitev, poleg tega pa so tudi selektivni, kar pomeni, da ne poškodujejo celic okoli njih. V celici ne povzročajo večjih preureditev in premestitev kromosomov. Te lastnosti omogočajo potencialno uporabo antioksidantov v prihodnosti pri zdravljenju raka, saj je moč njihove genotokičnosti primerljiva s trenutno uporabljajočimi kemoterapevtiki. Poleg tega pa so antioksidanti selektivni in ne povzročajo mutageneze, zaradi česar bi bili primernejši od zdajšnjih kemoterapevtikov. Vsekakor pa bo potrebno še več raziskav, ki bodo podrobneje pokazale, katere vrste rakastih celic ti antioksidanti uničujejo.

== Katja Leben: Vpliv zgradbe agregiranih proteinov na celico ==

S podaljševanjem življenske dobe postajajo vse bolj aktualne tudi nekatere bolezni, ki se pojavijo s starostjo, kot sta Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen. Obe sta povezani s proteinskimi agregati, ki se nalagajo v organizmu.
Preden proizvedeni protein doseže nativno stanje je kratek čas izpostavljen topilu in takrat lahko hidrofobni in polarni deli, ki tvorijo vodikove vezi, reagirajo intra ali pa intermolekularno, predvsem so k temu nagnjeni proteini, ki nimajo enotno določene sekundarne in terciarne strukture. V določenih pogojih, primer je tudi visoka koncentracija proteinov, ki je značilna za rekombinantne proteine, prevladajo intermolekularne interakcije in nastanejo agregati, kar privede do problemov pri ekspresiji rekombinantnega proteina.
Agregacija proteinov v celici je dokazano toksična, a do nedavnega je bil vpliv zgradbe proteinov, ki sestavljajo agregate, na celično kondicijo nepoznan. Izsledki raziskav kažejo, da je vpliv agregacije proteina na celico tesno povezan z aminokislinskim zaporedjem polipeptida, ki tvori agregat. Pogojuje stopnjo agregacije ter posredno strukturne in funkcionalne lastnosti agregata, od katerih je odvisen učinek šaperonov na agregate.
Ugotovitve raziskave so zagotovile osnovne podatke o vplivih mutacij v zaporedju na strukturne lastnosti agregatov, ki bodo omogočile predvidevanje vplivov proteinskih agregatov na kompleksnejše žive organizme in nadaljnje raziskave, ki bi vodile k razumevanju in posledično zdravljenju bolezni kot je Alzheimerjeva.

== Filip Mihalič: Kako lizocimi v solzah uničijo nevarne bakterije ==

Lizocimi so encimi, ki jih najdemo v človeških solzah ter smrklju in katalizirajo razcep glikozidne vezi med dvema monosaharidnima enotama v molekuli peptidoglikana, v celični steni bakterije ter s tem povzroči njen propad. Sam mehanizem kako lizocim katalizira razcep te vezi, ter njegovo spreminjanje konformacije med procesom sta bila do nedavnega še precej neraziskana, saj znanstveniki niso poznali metode s katero bi lahko opazovali posamezne molekule.
Raziskovalci z univerze "Univerza v Kaliforniji, Irvine", so pred nedavnim uporabili nov pristop za opazovanje posameznih makromolekul, in sicer so eno samo molekulo lizocima povezali z karbonsko nanocevko prek pirenskega sidrišča ter nato spremljali tresljale ki jih je sprožila molekula lizocima. ob tem so prišli do zanimivih ugotovitev, saj so lahko zelo natančno določili gibanje molekule ter njeno obnašanje v procesu cepitve glikozidne vezi. Bolj kot samo opazovanje lizocima je pomembna sama metoda s katero so opazovali molekulo, saj odpira nove možnosti na opazovanju posameznih molekul v naravnem okolju - metod ki bi omogočale opazovanje posameznih molekul je zelo malo pa še te so po večini nezanesljive, oz. neuporabne za daljše opazovanje molekul. V predstavitvi bom povedal najprej nekaj o lizocimu, nato pa se bom posvetil znanstveni raziskavi ter njenim rezultatom.

== Mirjana Malnar: Zastoji v procesu translacije ==

Translacija je prevajanje nukleotidnega zaporedja mRNA v aminokislinsko. Pri procesu translacije pride do zastojev (trenutna prekinitev translacije ali upočasnjena translacija). Ti zastoji so posledica ali določenega zaporedja baz mRNA ali interakcij med novo sintetiziranim polipeptidom in ribosomskim tunelom. V raziskavah se je izkazalo da so različni predeli ribosomskega tunela različno ugodni za določene delce (odvisno od velikosti, polarnosti, hidrofobnosti delcev). Posledično bodo polipeptidi, odvisno od svojih lastnosti čez tunel potovali različno (zastoji na različnih mestih ipd.). Raziskave so bile narejene na primeru E.coli. secA je motorni protein E.coli ki sodeluje pri prenosu proteinov čez celično membrano. Njegova sinteza je regulirana s translacijo secM proteina, katerega se kodirajoča sekvenca nahaja navzgor od kodirajoče sekvence secA (na isti mRNA). Ugotovili so da določeno zaporedje aminokislin secM tvori interakcije z ribosomskim tunelom zaradi česa pride do zastoja v translaciji. Če je ta zastoj daljši, se sintetizira več secA proteina. V drugih raziskavah so prišli do ugotovitve da do zastojev pride tudi pri translaciji kodirajoče sekvence za secA, ampak ti zastoji niso bili povezani z interakcijami z ribosomskim tunelom. Izkazalo se da sekvence podobne Shine-Dalgarno sekvencami (SD) v kodirajočem zaporedju mRNA povzročijo te zastoje zaradi interakcij z rRNA. (SD sekvenca je pomembna ker se veže z anti-Shine-Dalgarno sekvenco na rRNA in pri tem tvori mRNA-ribosom kompleks; nahaja se 8-10 baz pred start kodonom). Bolj so te sekvence podobne SD, večjo imajo afiniteto do vezave z anti-SD na rRNA in posledično povzročajo daljše zastoje.

== Ellen Malovrh: Dolgoživi jedrni proteini in njihov vpliv na celično staranje ==

Proteini sodijo med najkompleksnejše in najštevilčnejše organske molekule v celicah in omogočajo njihovo pravilno delovanje. Že med samim nastankom ali v času delovanja pa se lahko izkaže, da so proteini nefunkcionalni, zato je za celico izjemno pomemben proces razgradnje takih proteinov in sinteza novih. Proteini, ki se počasi obnavljajo oziroma imajo dolge življenjske dobe, so zato bolj izpostavljeni kopičenju škode.
Taki so tudi proteini nukleoporini, ki tvorijo kompleks jedrne pore, ki omogoča transport molekul med citoplazmo in jedrom. V raziskavi, ki sem jo predstavila v seminarski nalogi, so znanstveniki v možganih podgan odkrili nukleoporine, ki so bili stari celo več kot eno leto. Poškodbe na teh proteinih povečajo prepustnost jedrnih por, zato lahko citoplazemski proteini vdirajo v jedro. Spremeni se lahko tudi genski zapis v celici, kar je bilo opaženo predvsem pri starajočih se celicah.
Pričujoča raziskava bi tako lahko rešila eno od ključnih znanstvenih vprašanj o življenju: kako in zakaj se celice starajo ter posledično omogočila razvoj novih načinov zdravljenja starostno pogojenih bolezni. Spremembe v genskem zapisu so namreč odgovorne za staranje celic in lahko vodijo do številnih starostnih bolezni, kot sta Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen.