Wiki FKKT - User contributions [en]

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-04T18:57:27Z

Tonja omansusnik: /* Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi */

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.

Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na šibke, inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.

Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).

Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.

Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem gojišču YPD in minimalnem gojišču YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem gojišču Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim gojiščem YPD. Stabilnost v različnih gojiščih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.

Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je manjši fragment luciferaze, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo sicer v vseh primerih uspešno, vendar razlike nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.

Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Ta opažanja bi lahko pripisali različnim regulatornim elementom 5′-UTR, vendar k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.

Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.

Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše "puščanje". Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.

Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.

Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so nato preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem fibroblastnem rastnem faktorju 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalni peptid so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitost so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zvijanja proteinov in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To je posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zvijanja proteinov, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.

Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-04T18:56:49Z

Tonja omansusnik: /* Zaključek */

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.

Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na šibke, inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.

Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).

Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.

Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem gojišču YPD in minimalnem gojišču YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem gojišču Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim gojiščem YPD. Stabilnost v različnih gojiščih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.

Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je manjši fragment luciferaze, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo sicer v vseh primerih uspešno, vendar razlike nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.

Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Ta opažanja bi lahko pripisali različnim regulatornim elementom 5′-UTR, vendar k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.

Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.

Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše "puščanje". Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.

Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.

Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so nato preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem fibroblastnem rastnem faktorju 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalni peptid so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitost so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zlaganja in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To je posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zvijanja proteinov, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.

Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-04T18:55:22Z

Tonja omansusnik: /* Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi */

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.

Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na šibke, inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.

Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).

Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.

Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem gojišču YPD in minimalnem gojišču YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem gojišču Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim gojiščem YPD. Stabilnost v različnih gojiščih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.

Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je manjši fragment luciferaze, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo sicer v vseh primerih uspešno, vendar razlike nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.

Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Ta opažanja bi lahko pripisali različnim regulatornim elementom 5′-UTR, vendar k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.

Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.

Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše "puščanje". Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.

Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.

Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so nato preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem fibroblastnem rastnem faktorju 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalni peptid so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitost so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zlaganja in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To bi lahko bila posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zlaganja, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.

Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-04T18:52:41Z

Tonja omansusnik: /* Identifikacija in karakterizacija terminatorjev */

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.

Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na šibke, inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.

Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).

Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.

Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem gojišču YPD in minimalnem gojišču YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem gojišču Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim gojiščem YPD. Stabilnost v različnih gojiščih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.

Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je manjši fragment luciferaze, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo sicer v vseh primerih uspešno, vendar razlike nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.

Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Ta opažanja bi lahko pripisali različnim regulatornim elementom 5′-UTR, vendar k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.

Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.

Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše "puščanje". Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.

Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.

Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem rastnem faktorju fibroblastov 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalnega peptida so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitosti izločanja so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zlaganja in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To bi lahko bila posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zlaganja, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.

Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-04T14:39:47Z

Tonja omansusnik: /* Robustnost in vsestranskost pL41 */

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.

Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na šibke, inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.

Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).

Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.

Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem gojišču YPD in minimalnem gojišču YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem gojišču Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim gojiščem YPD. Stabilnost v različnih gojiščih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.

Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je manjši fragment luciferaze, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo sicer v vseh primerih uspešno, vendar razlike nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.

Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Razlike bi lahko pripisali regulatornim elementom v 5′-UTR, vendar rezultati nakazujejo, da k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.

Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.

Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše puščanje. Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.

Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.

Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem rastnem faktorju fibroblastov 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalnega peptida so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitosti izločanja so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zlaganja in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To bi lahko bila posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zlaganja, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.

Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-04T14:38:24Z

Tonja omansusnik: /* Robustnost in vsestranskost pL41 */

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.

Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na šibke, inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.

Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).

Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.

Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem gojišču YPD in minimalnem gojišču YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem gojišču Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim gojiščem YPD. Stabilnost v različnih gojiščih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.

Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je majhen fragment, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo v vseh primerih uspešno, vendar razlike v izločanju nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.

Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Razlike bi lahko pripisali regulatornim elementom v 5′-UTR, vendar rezultati nakazujejo, da k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.

Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.

Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše puščanje. Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.

Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.

Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem rastnem faktorju fibroblastov 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalnega peptida so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitosti izločanja so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zlaganja in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To bi lahko bila posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zlaganja, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.

Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-04T14:36:23Z

Tonja omansusnik: /* Transkriptomska analiza */

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.

Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na šibke, inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.

Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).

Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.

Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem mediju YPD in minimalnem mediju YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem mediju Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim medijem YPD. Stabilnost v različnih medijih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.

Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je majhen fragment, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo v vseh primerih uspešno, vendar razlike v izločanju nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.

Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Razlike bi lahko pripisali regulatornim elementom v 5′-UTR, vendar rezultati nakazujejo, da k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.

Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.

Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše puščanje. Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.

Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.

Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem rastnem faktorju fibroblastov 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalnega peptida so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitosti izločanja so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zlaganja in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To bi lahko bila posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zlaganja, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.

Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Seminarji SB 2025/26

2026-05-03T20:12:32Z

Tonja omansusnik:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Logično_vezje_IN,_ki_vključuje_sistem_CRISPR/Cas9_in_HCR_za_natančno_detekcijo_ctDNA Logično vezje IN, ki vključuje sistem CRISPR/Cas9 in HCR za natančno detekcijo ctDNA] (Tiara Pšeničnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ekspresijska_kaseta_za_sintezo_heterolognih_proteinov_v_Y._lipolytica Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica] (Tonja Oman Sušnik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SKIPPIT SKIPPIT] (Brina Klinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/InkSight InkSight] (Lucija Kovaček)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=KunPeng KunPeng] (Lara Ferjančič)

(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-03T19:09:58Z

Tonja omansusnik:

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.

Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.

Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).

Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.

Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem mediju YPD in minimalnem mediju YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem mediju Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim medijem YPD. Stabilnost v različnih medijih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.

Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je majhen fragment, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo v vseh primerih uspešno, vendar razlike v izločanju nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.

Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Razlike bi lahko pripisali regulatornim elementom v 5′-UTR, vendar rezultati nakazujejo, da k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.

Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.

Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše puščanje. Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.

Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.

Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem rastnem faktorju fibroblastov 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalnega peptida so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitosti izločanja so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zlaganja in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To bi lahko bila posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zlaganja, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.

Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-03T19:08:06Z

Tonja omansusnik:

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.
Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.
Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).
Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.
Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem mediju YPD in minimalnem mediju YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem mediju Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim medijem YPD. Stabilnost v različnih medijih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.
Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je majhen fragment, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo v vseh primerih uspešno, vendar razlike v izločanju nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.
Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Razlike bi lahko pripisali regulatornim elementom v 5′-UTR, vendar rezultati nakazujejo, da k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.
Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.
Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše puščanje. Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.
Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.
Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem rastnem faktorju fibroblastov 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalnega peptida so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitosti izločanja so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zlaganja in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To bi lahko bila posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zlaganja, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.
Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

2026-05-03T19:05:26Z

Tonja omansusnik: Created page with "izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica] == Uvod == Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita..."

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica]

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.
Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.
Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed).
Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.
Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem mediju YPD in minimalnem mediju YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem mediju Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim medijem YPD. Stabilnost v različnih medijih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.
Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je majhen fragment, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo v vseh primerih uspešno, vendar razlike v izločanju nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA.
Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Razlike bi lahko pripisali regulatornim elementom v 5′-UTR, vendar rezultati nakazujejo, da k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.
Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.
Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše puščanje. Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.
Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.
Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem rastnem faktorju fibroblastov 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalnega peptida so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitosti izločanja so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zlaganja in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To bi lahko bila posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zlaganja, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.
Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1] R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.
[2] „CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.
[3] H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.
[4] G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag

Seminarji SB 2025/26

2026-05-03T18:49:45Z

Tonja omansusnik:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Logično_vezje_IN,_ki_vključuje_sistem_CRISPR/Cas9_in_HCR_za_natančno_detekcijo_ctDNA Logično vezje IN, ki vključuje sistem CRISPR/Cas9 in HCR za natančno detekcijo ctDNA] (Tiara Pšeničnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ekspresijska_kaseta_za_sintezo_heterolognih_proteinov_v_Y._lipolytica Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica] (Tonja)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SKIPPIT SKIPPIT] (Brina Klinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/InkSight InkSight] (Lucija Kovaček)

(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

Seminarji SB 2025/26

2026-05-03T18:48:41Z

Tonja omansusnik:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Logično_vezje_IN,_ki_vključuje_sistem_CRISPR/Cas9_in_HCR_za_natančno_detekcijo_ctDNA Logično vezje IN, ki vključuje sistem CRISPR/Cas9 in HCR za natančno detekcijo ctDNA] (Tiara Pšeničnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ekspresijska_kaseta_za_sintezo_heterolognih_proteinov_v_Y._lipolytica] (Tonja)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SKIPPIT SKIPPIT] (Brina Klinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/InkSight InkSight] (Lucija Kovaček)

(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

2026-BNT-seminar

2026-03-25T20:10:51Z

Tonja omansusnik: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2026- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 18/03/2025 || Bionanotehnološki pristop k dolgoročnemu arhiviranju digitalnih podatkov z DNA zaporedjem || DNArchive || Kozel, Vid || Bajramovikj, Denis || Ribič, Rebeka
|-
| 18/03/2025 || Sistem za adsorpcijo in razgradnjo gliadina (uporaba v medicini in prehranski industriji) || GlutenBlock || Horvat, Nejc || Šenica Pavletič, Primož || Hvalec, Jan
|-
| 18/03/2025 || Zaščita titanovih implantantov s samoobnovljivim nanofilmom || ImplantShield || Perc, Anže || Agrež, Tim-David || Klopčič, Klemen
|-
| 18/03/2025 || Bionanosenzorski obliž za merjenje cirkadianega ritma preko sline || CircAlign || Kovaček, Lucija || Bervar, Amber || Mohar, Teja
|-
| 25/03/2025 || Mazilo z odzivnimi nanodelci za selektivno zdravljenje atopijskega dermatitisa || SmartDerm || Pezo Zupančič, Neža || Habot, Hanna || Vogrič, Vanja
|-
| 25/03/2025 || Verižica za zaznavanje drog || SafeSip || Bogataj, Lenart || Jarm, Lea || Bajramovikj, Denis
|-
| 25/03/2025 || Nalepka za kožo za neinvazivno spremljanje hidracijskega stanja preko znoja|| HydraShow || Ferjančič, Lara || Todorovska, Milena || Šenica Pavletič, Primož
|-
| 25/03/2025 || Injekcija za hitrejšo rekonstrukcijo sprednje križne vezi (ACL) || RegelAcl || Briševac, Tea || Klinar, Brina || Agrež, Tim-David
|-
| 01/04/2025 || Kontaktne leče za zdravljenje migrene || MigraLens || Pšeničnik, Tiara || Kozel, Vid || Bervar, Amber
|-
| 01/04/2025 || || || Jukić, Lea || Horvat, Nejc || Habot, Hanna
|-
| 01/04/2025 || || || Petrovič, Filip || Perc, Anže || Jarm, Lea
|-
| 01/04/2025 || || || Novak, Anja || Kovaček, Lucija || Todorovska, Milena
|-
| 01/04/2025 || Sistem za začasno dodatno oskrbo s kisikom pri ovirani ventilaciji || Atmos || Oman Sušnik, Tonja || Pezo Zupančič, Neža || Klinar, Brina
|-
| 08/04/2025 || Pristop k zdravljenju neonatalne zlatenice || ZlatoHome || Auer, Špela || Bogataj, Lenart || Kozel, Vid
|-
| 08/04/2025 || || || Dimovska, Andreja || Ferjančič, Lara || Horvat, Nejc
|-
| 08/04/2025 || || || Gomiršek, Katarina || Briševac, Tea || Perc, Anže
|-
| 08/04/2025 || Detektor Salmonelle v jajcih (doma, male farme) || EggGuard || Titova, Varvara || Pšeničnik, Tiara || Kovaček, Lucija
|-
| 08/04/2025 || || || Kristan, Maruša || Jukić, Lea || Pezo Zupančič, Neža
|-
| 15/04/2025 || || || Škorjanc, Meri || Petrovič, Filip || Bogataj, Lenart
|-
| 15/04/2025 || || || Bregar, Jana || Novak, Anja || Ferjančič, Lara
|-
| 15/04/2025 || || || Smrečnik, Meta || Oman Sušnik, Tonja || Briševac, Tea
|-
| 15/04/2025 || || || Tušek, Marcel || Auer, Špela || Pšeničnik, Tiara
|-
| 15/04/2025 || || || Zupan, Zala || Dimovska, Andreja || Jukić, Lea
|-
| 22/04/2025 || Mikrofluidni nanosenzorski sistem za zgodnje zaznavanje bolezni mačk preko analize urina || LitterLab || Lešnik, Tjaša || Gomiršek, Katarina || Petrovič, Filip
|-
| 22/04/2025 || || || Čarman, Jasna || Titova, Varvara || Novak, Anja
|-
| 22/04/2025 || || || Ribič, Rebeka || Kristan, Maruša || Oman Sušnik, Tonja
|-
| 06/05/2025 || || || Hvalec, Jan || Škorjanc, Meri || Auer, Špela
|-
| 06/05/2025 || || || Klopčič, Klemen || Bregar, Jana || Dimovska, Andreja
|-
| 06/05/2025 || || || Mohar, Teja || Smrečnik, Meta || Gomiršek, Katarina
|-
| 06/05/2025 || || || Vogrič, Vanja || Tušek, Marcel || Titova, Varvara
|-
| 13/05/2025 || || || Bajramovikj, Denis || Zupan, Zala || Kristan, Maruša
|-
| 13/05/2025 || || || Šenica Pavletič, Primož || Lešnik, Tjaša || Škorjanc, Meri
|-
| 13/05/2025 || || || Agrež, Tim-David || Čarman, Jasna || Bregar, Jana
|-
| 13/05/2025 || || || Bervar, Amber || Ribič, Rebeka || Smrečnik, Meta
|-
| 20/05/2025 || || || Habot, Hanna || Hvalec, Jan || Tušek, Marcel
|-
| 20/05/2025 || || || Jarm, Lea || Klopčič, Klemen || Zupan, Zala
|-
| 20/05/2025 || || || Todorovska, Milena || Mohar, Teja || Lešnik, Tjaša
|-
| 20/05/2025 || || || Klinar, Brina || Vogrič, Vanja || Čarman, Jasna
|-
| 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morata predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc
* 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2026-BNT-seminar

2026-03-03T10:59:20Z

Tonja omansusnik: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2026- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 18/03/2025 || || || Kozel, Vid || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Horvat, Nejc || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Perc, Anže || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Kovaček, Lucija || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Pezo Zupančič, Neža || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Bogataj, Lenart || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Ferjančič, Lara || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Briševac, Tea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Pšeničnik, Tiara || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Jukić, Lea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Petrovič, Filip || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Novak, Anja || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Kristan, Maruša || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Auer, Špela || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Dimovska, Andreja || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Gomiršek, Katarina || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Titova, Varvara || ||
|-
| 08/04/2025 || Atmos: Sistem za dostavo kisika pri pljučnih boleznih in potencialna uporaba v vojski|| || Oman Sušnik, Tonja || Tjaša Lešnik ||
|-
| 15/04/2025 || || || Škorjanc, Meri || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Bregar, Jana || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Smrečnik, Meta || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Tušek, Marcel || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Zupan, Zala || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Lešnik, Tjaša || Tonja Oman Sušnik ||
|-
| 22/04/2025 || || || Čarman, Jasna || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Ribič, Rebeka || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Hvalec, Jan || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Klopčič, Klemen || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Mohar, Teja || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Vogrič, Vanja || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bajramovikj, Denis || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Šenica Pavletič, Primož || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Agrež, Tim-David || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bervar, Amber || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Habot, Hanna || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Jarm, Lea || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Todorovska, Milena || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Klinar, Brina || ||
|-
| 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc
* 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2026-BNT-seminar

2026-03-03T10:48:37Z

Tonja omansusnik: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2026- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 18/03/2025 || || || Kozel, Vid || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Horvat, Nejc || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Perc, Anže || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Kovaček, Lucija || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Pezo Zupančič, Neža || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Bogataj, Lenart || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Ferjančič, Lara || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Briševac, Tea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Pšeničnik, Tiara || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Jukić, Lea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Petrovič, Filip || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Novak, Anja || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Kristan, Maruša || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Auer, Špela || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Dimovska, Andreja || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Gomiršek, Katarina || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Titova, Varvara || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Oman Sušnik, Tonja || Tjaša Lešnik ||
|-
| 15/04/2025 || || || Škorjanc, Meri || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Bregar, Jana || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Smrečnik, Meta || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Tušek, Marcel || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Zupan, Zala || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Lešnik, Tjaša || Tonja Oman Sušnik ||
|-
| 22/04/2025 || || || Čarman, Jasna || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Ribič, Rebeka || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Hvalec, Jan || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Klopčič, Klemen || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Mohar, Teja || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Vogrič, Vanja || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bajramovikj, Denis || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Šenica Pavletič, Primož || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Agrež, Tim-David || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bervar, Amber || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Habot, Hanna || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Jarm, Lea || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Todorovska, Milena || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Klinar, Brina || ||
|-
| 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc
* 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2026-BNT-seminar

2026-03-03T10:47:52Z

Tonja omansusnik: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2026- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 18/03/2025 || || || Kozel, Vid || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Horvat, Nejc || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Perc, Anže || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Kovaček, Lucija || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Pezo Zupančič, Neža || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Bogataj, Lenart || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Ferjančič, Lara || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Briševac, Tea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Pšeničnik, Tiara || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Jukić, Lea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Petrovič, Filip || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Novak, Anja || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Kristan, Maruša || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Auer, Špela || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Dimovska, Andreja || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Gomiršek, Katarina || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Titova, Varvara || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Oman Sušnik, Tonja Tjaša Lešnik ||
|-
| 15/04/2025 || || || Škorjanc, Meri || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Bregar, Jana || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Smrečnik, Meta || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Tušek, Marcel || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Zupan, Zala || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Lešnik, Tjaša Tonja Oman Sušnik ||
|-
| 22/04/2025 || || || Čarman, Jasna || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Ribič, Rebeka || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Hvalec, Jan || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Klopčič, Klemen || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Mohar, Teja || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Vogrič, Vanja || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bajramovikj, Denis || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Šenica Pavletič, Primož || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Agrež, Tim-David || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bervar, Amber || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Habot, Hanna || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Jarm, Lea || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Todorovska, Milena || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Klinar, Brina || ||
|-
| 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc
* 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2023

2023-11-06T16:23:58Z

Tonja omansusnik: /* Tonja Oman Sušnik - Metabolizem glukoze, senescenca živčni celic in Alzheimerjeva bolezen */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 =
==Anja Kokol - Pomen kompertmentalizirane signalizacije v membranskih raftih pri razvoju raka==
Raziskovanje lipidnih raftov, membranskih domen, bogatih s holesterolom in sfingolipidi, je izboljšalo razumevanje celične membrane pri signalni transdukciji. Te sortirne platforme igrajo ključno vlogo pri kompartmentalizaciji signalnih poti in s tem spodbujajo ali zavirajo preživetje, smrt in metastazo tumorskih celic. Transformirane celice vsebujejo višjo raven znotrajceličnega holesterola in s tem posledično več membranskih raftov. Rafti so, zraven prenosa signalov, pomembni za aktivacijo receptorjev, endocitozo, znotrajcelični promet in organizacijo z lipidi in proteini. V obliki lipidnih lupin zagotavljajo proteinom, ki so jih tako ločili od ostalih, primerno mikrookolje in s pomočjo takšnega mehanizma vklopijo ali izklopijo določene poti prenosa signala. Na celične procese pomembno vpliva asimetrija holesterola v plazemski membrani, ki se vzdržuje z aktivnim transportom holesterola iz notranjega v zunanji del. Zaradi prenosa signala po lipidnih raftih lahko pride do prekomerne ekspresije in aktivacije številnih poti in sistemov rastnih faktorjev, kar pripomore k razvoju tumorja. Eden od njih je tudi aktivator signalne poti PI3K/AKT, ki je pomemben udeleženec pri nastanku raka. Značilnost sesalskih celic je prisotnost receptorjev smrti na njihovi površini. Ti zagotavljajo sposobnost apoptoze. Ligandi receptorjev smrti sprožijo značilno signalizacijo preko oligomerizacije receptorjev, kar posledično povzroči rekrutiranje specializiranih adapterskih proteinov znotraj lipidnih raftov. S preučevanjem membranskih raftov se je rodil tudi koncept CASMER, s pomočjo katerega se je razvila nova ideja zdravljenja raka.

==Vid Kozel - Vloga onkogenov in tumor zavirajočih genov pri razvoju raka==
Onkogeni kodirajo okvarjene proteine ter s tem povzročajo tumorje. Nastanejo iz spremenjenih proto-onkogenov. Za naše zdravje so zelo nevarni, saj spodbujajo delovanje procesov, ki vodijo do raka. Aktivirajo se zaradi genetske spremembe proto-onkogenov, najpogosteje do tega pride zaradi točkovnih mutacij; mutacije z večjo funkcionalnostjo, kromosomske translokacije, virusna integracija, epigenetske spremembe, spremembe regulatornih proteinov. Tumor zavirajoči geni ali tumorski supresorji tvorijo regulatorne proteine, ki preprečujejo delitev rakavih celic ter spodbujajo popravljanje DNA. Aktivirajo se s transkripcijsko aktivacijo, posttranslacijskimi modifikacijami ali interakcijami med proteini. Njihova glavna naloga je vzdrževanje genoma, prav tako pa preprečujejo nenadzorovano rast celic.
Pot RAS-RAF-MEK-ERK je signalna pot onkogenov, ki ima vlogo pri rasti, delitvi, preživetju in diferenciaciji celic. Njena nenormalna aktivacija lahko povzroči nastanek tumorjev. Pot se začne z aktivacijo RAS, do katere pride zaradi zunajceličnih signalov. RAS potem aktivira še RAF in sproži kaskado fosforilacije. Nato se aktivira MEK, ki sproži dvojno fosforilacijo in aktivira ERK, aktivacija le-te pa vodi do razmnoževanja, preživetja ali diferenciacije celic.
TP53 je gen, ki kodira tumor supresorski protein p53, ta pa zatira tumorje. Na poškodbe DNA odgovarja tako, da ustavi celični cikel ter nato popravi DNA, sproži apoptozo ali pa senescenco. Njegovo delovanje inhibira MDM2, ki ga lahko dodatno stabilizira MDM4. Ob mutacijah na TP53, ter posledično na P53, ta izgubi sposobnost obrambe proti tumorjem.
Z ugotavljanjem mutacij onkogenov/tumorskih supresorjev, ali s tem da ti služijo kot biomarkerji, lahko zdravniki napovejo verjetno napredovanje raka ter izberejo ustrezno zdravljenje.

==Nina Majerle - Z G-proteini sklopljeni vzorčno prepoznavni receptorji izraženi v nevtrofilcih==
Nevtrofilci so najpogostejši levkociti v človeški krvi in so ključnega pomena za pravilno delovanje imunskega sistema. Na površini izražajo različne receptorje, ki prepoznavajo molekulske vzorce tipične za patogene organizme in za poškodovane gostiteljske celice. Ti receptorji so ključnega pomena za delovanje nevtrofilcev, saj jim omogočajo regulacijo vnetnega odziva, diferenciacijo, priklic drugih celic imunskega sistema in fagocitozo. Mnogi od teh receptorjev pripadajo družini z G-proteini sklopljenih receptorjev. GPCR-ji imajo značilno strukturo sedmih α-vijačnic, prenos signala prek GPCR-jev pa največkrat poteka preko heterotrimernih G-proteinov. Seminarska naloga obravnava tako splošne značilnosti GPCR-jev, kot tudi podrobneje opiše mehanizme delovanja in funkcije nekaterih bolj znanih GPCR-jev izraženih na membranah nevtrofilcev, ki delujejo po principu vzorčnega prepoznavanja: družina formil peptidnih receptorjev (FPRs), purinergični receptor P2Y2R in dva člana družine receptorjev prostih maščobnih kislin FFA2R in GPR84. Poleg tega prek relevantnih primerov razlaga nekatere ključne pojme in koncepte v biokemiji kot so ortosterično vezavno mesto, alosterični receptorski modulatorji, vzorčno prepoznavanje, homologna in heterologna desenzibilizacija, receptorska transaktivacija, funkcionalna selektivnost in pa tudi pojme, ki se nanašajo na same nevtrofilce kot sta kemotaksija in primiranje. Na koncu se seminarska naloga naveže še na uporabnost poznavanja strukture in delovanja GPCR-jev izraženih v nevtrofilcih pri zdravljenju različnih imunskih obolenj.

==Jakob Urh Veler - Gvanilil ciklaze kot ključni receptorji in encimi pri celični biosignalizaciji==
Družina proteinov gvanilat ciklaze/gvanilil ciklaze (GC) v svoji katalitični domeni ciklizirajo GTP v cGMP. Ciklični GMP je sekundarni sporočevalec. Z nadaljno kaskado vpliva na protein kinaze (cGK), fosfodiesteraze (PDE) in ionske kanalčke (CNG). So pomembne za pravilno delovanje več organskih sistemov. Glede na strukturne, funkcionalne in regulatorne značilnosti GC delimo na membranske (mGC/pGC) in topne (sGC) oblike. Poznamo tipične in atipične sGC. Po priporočeni nomenklaturi poznamo 7 tipov mGC: MG-A, MG-B, MG-C, MG-D, MG-E, MG-F in MG-G. Vlogo encima in receptorja opravljajo topne gvanilil ciklaze v citosolu in membranske na celični membrani. Aktivirane so lahko tudi z endogenim NO, O2, HCO3-, natriuretskimi hormoni in s Ca2+-vezanimi proteini. V nadaljevanju podrobneje opisana aktivacija sGC z NO ter aktivacija GC-A z atrijskim natriuretskim hormonom (ANF). Z manipulacijo genov za zapis gvanilil ciklaz so odkrili njihove vloge v celicah in pomen specifičnih domen. Z različno stopnjo izražanja izoencimov je v celicah visoka diverziteta GC, zato je to mrežo signalizacije brez in vivo opazovanja zahtevno raziskovati. Približno 60 let že raziskujejo gvanilil ciklaze. Razumevanje te signalne poti je ključnega pomena za zdravljenje določenih bolezenskih stanj, saj imajo zdravila več tarčnih mest za delovanje.

==Domen Trontelj - G protein sklopljeni receptorji v fiziologiji okusa in farmakologiji==
G protein sklopljeni receptorji (GPCR), predstavljajo največjo družino receptorjev pri sesalcih in so ključni za uravnavanje večine fizioloških funkcij. Poleg posredovanja pri zaznavi vonja in vida, so prav tako prenašalci signala treh osnovnih okusov- sladko, umami in grenko, prav tako pa so ključnega pomena pri zaznavanju okusa kokumi. Nahajajo se v specializiranih okuševalnih celicah (TRC) znotraj brbončic. Tip I okuševalnih GPCR-jev (TAS1R) so heterodimerni kompleksi, ki skužijo kot receptorji za sladko (TAS1R2/TAS1R3) ali umami (TAS1R1/TAS1R3) okus, medtem ko Tip II obsega monomerne receptorje za grenak okus ali pa kokumi/kalcijeve receptorje.
Receptorji za sladko, umami in kokumi delijo strukturne podobnosti, saj vsebujejo več mest za vezavo agonistov z izrazito selektivnostjo, medtem ko večina grenkih receptorjev vsebuje le eno vezavno mesto, ki neselektivno sprejme veliko različnih ligandov. Vezava agonistov na receptor aktivira sekundarnih prenašalce, kar privede do vdora kalcija, to vodi do depolarizacije celice in na koncu sprostitve nevrotransmiterja.
Kljub nedavnim napredkom na področju raziskav konformacijskih sprememb, potrebnih za aktivacijo receptorja, ostaja še veliko nerešenih. V zadnjih letih so različni pristopi, ki združujejo heterologno izražanje, mutagenezo, homologno modeliranje in knockout študije na miših, skupaj ponudili vpogled v strukturo in pozicijo vezavnih mest za ligande in mehanizme ortosterične in alosterične modulacije.

==Karin Kunstelj - Potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije najdene prav v metabolizmu celic kostnega mozga in njegovega mikrookolja==
Izogibanje detekciji in odgovoru imunskega odziva sodi med glavne težave levkemije poleg neuspešne imunoterapije. Burne poti mikrookolja so v ozadju odgovora tako rakavih kot zdravil celic, problem pa se pojavi, ko rakave celice prevzamejo vodilno vlogo metabolizmov in nadzorujejo reakcije sebi v prid. Novo možnost terapije bi potemtakem lahko predstavljalo ciljanje povezav med mikrookoljem kostnega mozga in levkemičnim celicam. V seminarji je opisano mikrookolje kostnega mozga, pomembne metabolične poti ogljikovih hidratov, aminokislin in maščobnih kislin ter pa sami procesi levkemičnih celic, ki zdravljenju povzročajo težave in neuspešnost. Prav tako opozori na nove potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije, ki svoj center najdejo prav v mikrookolju kostnega mozga. Na koncu pa še poudari na pomembnost dodatnih raziskav in študij.

==Tonja Oman Sušnik - Metabolizem glukoze, senescenca živčnih celic in Alzheimerjeva bolezen==
Alzheimerjeva bolezen je nevrodegenerativna bolezen z visoko pojavnostjo predvsem med starejšimi. Pri njej sčasoma pride do upada miselnih sposobnosti in razvoja drugih psiholoških motenj. Njen razvoj je sicer že precej dobro raziskan, a zdravila, ki bi v celoti odpravil škodo storjeno na možganih, še ne poznamo. Tekom same bolezni se prepleta mnogo simptomov, ki so odvisni eden od drugega. To so med drugimi inzulinska rezistenca, celična senescenca, nevroinflamacija, nalaganje proteinskih plakov in oslabljen metabolizem glukoze. Najpomembnejša pri tem je celična senescenca, ki je v močni povezavi s staranjem. Ta napade tako živčne celice kot tudi glialne celice in povzroči nalaganje proteinov ter oslabljeno energijsko proizvodnjo celice. Slabša energetska preskrbljenost, kar je za nevrone izredno nevarno in se odraža v njihovem slabšem delovanju ter zmanjšani sinaptični plastičnosti, pa je tudi posledica zmanjšanega prevzema glukoze. Z boleznijo se število glukoznih transporterjev zmanjšuje, veča pa se inzulinska rezistenca. Nevroni zato ne sprejmejo dovolj glukoze za proizvodnjo ATP. Kako bi samo znanje o teh fizioloških okvarah prenesli na zdravljenje, še ni znano, a na to temo poteka mnogo tekočih raziskav. Najbolj ugodno bi bilo odstranjevanje senescentih celic, neposredno targetiranje glukoznega metabolizma ali razbijanje proteinskih plakov. Pozitivne rezultate dajejo tudi raziskave, kjer so opazovali odzivnost metabolizma glukoze na srednje intenzivno vadbo. Ta se je že pri enkrat tedenski vadbi močno izboljšal, napredovanje bolezni pa skoraj popolnoma zaustavilo.

BIO2 Povzetki seminarjev 2023

2023-11-06T16:23:36Z

Tonja omansusnik: Oddaja povzetka seminarske naloge pri predmetu biokemija

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 =
==Anja Kokol - Pomen kompertmentalizirane signalizacije v membranskih raftih pri razvoju raka==
Raziskovanje lipidnih raftov, membranskih domen, bogatih s holesterolom in sfingolipidi, je izboljšalo razumevanje celične membrane pri signalni transdukciji. Te sortirne platforme igrajo ključno vlogo pri kompartmentalizaciji signalnih poti in s tem spodbujajo ali zavirajo preživetje, smrt in metastazo tumorskih celic. Transformirane celice vsebujejo višjo raven znotrajceličnega holesterola in s tem posledično več membranskih raftov. Rafti so, zraven prenosa signalov, pomembni za aktivacijo receptorjev, endocitozo, znotrajcelični promet in organizacijo z lipidi in proteini. V obliki lipidnih lupin zagotavljajo proteinom, ki so jih tako ločili od ostalih, primerno mikrookolje in s pomočjo takšnega mehanizma vklopijo ali izklopijo določene poti prenosa signala. Na celične procese pomembno vpliva asimetrija holesterola v plazemski membrani, ki se vzdržuje z aktivnim transportom holesterola iz notranjega v zunanji del. Zaradi prenosa signala po lipidnih raftih lahko pride do prekomerne ekspresije in aktivacije številnih poti in sistemov rastnih faktorjev, kar pripomore k razvoju tumorja. Eden od njih je tudi aktivator signalne poti PI3K/AKT, ki je pomemben udeleženec pri nastanku raka. Značilnost sesalskih celic je prisotnost receptorjev smrti na njihovi površini. Ti zagotavljajo sposobnost apoptoze. Ligandi receptorjev smrti sprožijo značilno signalizacijo preko oligomerizacije receptorjev, kar posledično povzroči rekrutiranje specializiranih adapterskih proteinov znotraj lipidnih raftov. S preučevanjem membranskih raftov se je rodil tudi koncept CASMER, s pomočjo katerega se je razvila nova ideja zdravljenja raka.

==Vid Kozel - Vloga onkogenov in tumor zavirajočih genov pri razvoju raka==
Onkogeni kodirajo okvarjene proteine ter s tem povzročajo tumorje. Nastanejo iz spremenjenih proto-onkogenov. Za naše zdravje so zelo nevarni, saj spodbujajo delovanje procesov, ki vodijo do raka. Aktivirajo se zaradi genetske spremembe proto-onkogenov, najpogosteje do tega pride zaradi točkovnih mutacij; mutacije z večjo funkcionalnostjo, kromosomske translokacije, virusna integracija, epigenetske spremembe, spremembe regulatornih proteinov. Tumor zavirajoči geni ali tumorski supresorji tvorijo regulatorne proteine, ki preprečujejo delitev rakavih celic ter spodbujajo popravljanje DNA. Aktivirajo se s transkripcijsko aktivacijo, posttranslacijskimi modifikacijami ali interakcijami med proteini. Njihova glavna naloga je vzdrževanje genoma, prav tako pa preprečujejo nenadzorovano rast celic.
Pot RAS-RAF-MEK-ERK je signalna pot onkogenov, ki ima vlogo pri rasti, delitvi, preživetju in diferenciaciji celic. Njena nenormalna aktivacija lahko povzroči nastanek tumorjev. Pot se začne z aktivacijo RAS, do katere pride zaradi zunajceličnih signalov. RAS potem aktivira še RAF in sproži kaskado fosforilacije. Nato se aktivira MEK, ki sproži dvojno fosforilacijo in aktivira ERK, aktivacija le-te pa vodi do razmnoževanja, preživetja ali diferenciacije celic.
TP53 je gen, ki kodira tumor supresorski protein p53, ta pa zatira tumorje. Na poškodbe DNA odgovarja tako, da ustavi celični cikel ter nato popravi DNA, sproži apoptozo ali pa senescenco. Njegovo delovanje inhibira MDM2, ki ga lahko dodatno stabilizira MDM4. Ob mutacijah na TP53, ter posledično na P53, ta izgubi sposobnost obrambe proti tumorjem.
Z ugotavljanjem mutacij onkogenov/tumorskih supresorjev, ali s tem da ti služijo kot biomarkerji, lahko zdravniki napovejo verjetno napredovanje raka ter izberejo ustrezno zdravljenje.

==Nina Majerle - Z G-proteini sklopljeni vzorčno prepoznavni receptorji izraženi v nevtrofilcih==
Nevtrofilci so najpogostejši levkociti v človeški krvi in so ključnega pomena za pravilno delovanje imunskega sistema. Na površini izražajo različne receptorje, ki prepoznavajo molekulske vzorce tipične za patogene organizme in za poškodovane gostiteljske celice. Ti receptorji so ključnega pomena za delovanje nevtrofilcev, saj jim omogočajo regulacijo vnetnega odziva, diferenciacijo, priklic drugih celic imunskega sistema in fagocitozo. Mnogi od teh receptorjev pripadajo družini z G-proteini sklopljenih receptorjev. GPCR-ji imajo značilno strukturo sedmih α-vijačnic, prenos signala prek GPCR-jev pa največkrat poteka preko heterotrimernih G-proteinov. Seminarska naloga obravnava tako splošne značilnosti GPCR-jev, kot tudi podrobneje opiše mehanizme delovanja in funkcije nekaterih bolj znanih GPCR-jev izraženih na membranah nevtrofilcev, ki delujejo po principu vzorčnega prepoznavanja: družina formil peptidnih receptorjev (FPRs), purinergični receptor P2Y2R in dva člana družine receptorjev prostih maščobnih kislin FFA2R in GPR84. Poleg tega prek relevantnih primerov razlaga nekatere ključne pojme in koncepte v biokemiji kot so ortosterično vezavno mesto, alosterični receptorski modulatorji, vzorčno prepoznavanje, homologna in heterologna desenzibilizacija, receptorska transaktivacija, funkcionalna selektivnost in pa tudi pojme, ki se nanašajo na same nevtrofilce kot sta kemotaksija in primiranje. Na koncu se seminarska naloga naveže še na uporabnost poznavanja strukture in delovanja GPCR-jev izraženih v nevtrofilcih pri zdravljenju različnih imunskih obolenj.

==Jakob Urh Veler - Gvanilil ciklaze kot ključni receptorji in encimi pri celični biosignalizaciji==
Družina proteinov gvanilat ciklaze/gvanilil ciklaze (GC) v svoji katalitični domeni ciklizirajo GTP v cGMP. Ciklični GMP je sekundarni sporočevalec. Z nadaljno kaskado vpliva na protein kinaze (cGK), fosfodiesteraze (PDE) in ionske kanalčke (CNG). So pomembne za pravilno delovanje več organskih sistemov. Glede na strukturne, funkcionalne in regulatorne značilnosti GC delimo na membranske (mGC/pGC) in topne (sGC) oblike. Poznamo tipične in atipične sGC. Po priporočeni nomenklaturi poznamo 7 tipov mGC: MG-A, MG-B, MG-C, MG-D, MG-E, MG-F in MG-G. Vlogo encima in receptorja opravljajo topne gvanilil ciklaze v citosolu in membranske na celični membrani. Aktivirane so lahko tudi z endogenim NO, O2, HCO3-, natriuretskimi hormoni in s Ca2+-vezanimi proteini. V nadaljevanju podrobneje opisana aktivacija sGC z NO ter aktivacija GC-A z atrijskim natriuretskim hormonom (ANF). Z manipulacijo genov za zapis gvanilil ciklaz so odkrili njihove vloge v celicah in pomen specifičnih domen. Z različno stopnjo izražanja izoencimov je v celicah visoka diverziteta GC, zato je to mrežo signalizacije brez in vivo opazovanja zahtevno raziskovati. Približno 60 let že raziskujejo gvanilil ciklaze. Razumevanje te signalne poti je ključnega pomena za zdravljenje določenih bolezenskih stanj, saj imajo zdravila več tarčnih mest za delovanje.

==Domen Trontelj - G protein sklopljeni receptorji v fiziologiji okusa in farmakologiji==
G protein sklopljeni receptorji (GPCR), predstavljajo največjo družino receptorjev pri sesalcih in so ključni za uravnavanje večine fizioloških funkcij. Poleg posredovanja pri zaznavi vonja in vida, so prav tako prenašalci signala treh osnovnih okusov- sladko, umami in grenko, prav tako pa so ključnega pomena pri zaznavanju okusa kokumi. Nahajajo se v specializiranih okuševalnih celicah (TRC) znotraj brbončic. Tip I okuševalnih GPCR-jev (TAS1R) so heterodimerni kompleksi, ki skužijo kot receptorji za sladko (TAS1R2/TAS1R3) ali umami (TAS1R1/TAS1R3) okus, medtem ko Tip II obsega monomerne receptorje za grenak okus ali pa kokumi/kalcijeve receptorje.
Receptorji za sladko, umami in kokumi delijo strukturne podobnosti, saj vsebujejo več mest za vezavo agonistov z izrazito selektivnostjo, medtem ko večina grenkih receptorjev vsebuje le eno vezavno mesto, ki neselektivno sprejme veliko različnih ligandov. Vezava agonistov na receptor aktivira sekundarnih prenašalce, kar privede do vdora kalcija, to vodi do depolarizacije celice in na koncu sprostitve nevrotransmiterja.
Kljub nedavnim napredkom na področju raziskav konformacijskih sprememb, potrebnih za aktivacijo receptorja, ostaja še veliko nerešenih. V zadnjih letih so različni pristopi, ki združujejo heterologno izražanje, mutagenezo, homologno modeliranje in knockout študije na miših, skupaj ponudili vpogled v strukturo in pozicijo vezavnih mest za ligande in mehanizme ortosterične in alosterične modulacije.

==Karin Kunstelj - Potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije najdene prav v metabolizmu celic kostnega mozga in njegovega mikrookolja==
Izogibanje detekciji in odgovoru imunskega odziva sodi med glavne težave levkemije poleg neuspešne imunoterapije. Burne poti mikrookolja so v ozadju odgovora tako rakavih kot zdravil celic, problem pa se pojavi, ko rakave celice prevzamejo vodilno vlogo metabolizmov in nadzorujejo reakcije sebi v prid. Novo možnost terapije bi potemtakem lahko predstavljalo ciljanje povezav med mikrookoljem kostnega mozga in levkemičnim celicam. V seminarji je opisano mikrookolje kostnega mozga, pomembne metabolične poti ogljikovih hidratov, aminokislin in maščobnih kislin ter pa sami procesi levkemičnih celic, ki zdravljenju povzročajo težave in neuspešnost. Prav tako opozori na nove potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije, ki svoj center najdejo prav v mikrookolju kostnega mozga. Na koncu pa še poudari na pomembnost dodatnih raziskav in študij.

==Tonja Oman Sušnik - Metabolizem glukoze, senescenca živčni celic in Alzheimerjeva bolezen==
Alzheimerjeva bolezen je nevrodegenerativna bolezen z visoko pojavnostjo predvsem med starejšimi. Pri njej sčasoma pride do upada miselnih sposobnosti in razvoja drugih psiholoških motenj. Njen razvoj je sicer že precej dobro raziskan, a zdravila, ki bi v celoti odpravil škodo storjeno na možganih, še ne poznamo. Tekom same bolezni se prepleta mnogo simptomov, ki so odvisni eden od drugega. To so med drugimi inzulinska rezistenca, celična senescenca, nevroinflamacija, nalaganje proteinskih plakov in oslabljen metabolizem glukoze. Najpomembnejša pri tem je celična senescenca, ki je v močni povezavi s staranjem. Ta napade tako živčne celice kot tudi glialne celice in povzroči nalaganje proteinov ter oslabljeno energijsko proizvodnjo celice. Slabša energetska preskrbljenost, kar je za nevrone izredno nevarno in se odraža v njihovem slabšem delovanju ter zmanjšani sinaptični plastičnosti, pa je tudi posledica zmanjšanega prevzema glukoze. Z boleznijo se število glukoznih transporterjev zmanjšuje, veča pa se inzulinska rezistenca. Nevroni zato ne sprejmejo dovolj glukoze za proizvodnjo ATP. Kako bi samo znanje o teh fizioloških okvarah prenesli na zdravljenje, še ni znano, a na to temo poteka mnogo tekočih raziskav. Najbolj ugodno bi bilo odstranjevanje senescentih celic, neposredno targetiranje glukoznega metabolizma ali razbijanje proteinskih plakov. Pozitivne rezultate dajejo tudi raziskave, kjer so opazovali odzivnost metabolizma glukoze na srednje intenzivno vadbo. Ta se je že pri enkrat tedenski vadbi močno izboljšal, napredovanje bolezni pa skoraj popolnoma zaustavilo.