Wiki FKKT - User contributions [en]

Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem

2021-05-05T12:19:39Z

Urška Fajdiga:

Kronična obolenja, ki nastanejo kot posledica staranja in pogosto zaradi nezdravega življenjskega sloga, predstavljajo veliko težavo v zdravstvu po celem svetu. Z namenom preprečitve ali upočasnitve razvoja kroničnih bolezni zdravniki vse bolj spodbujajo k prehranjevanju s čim bolj pestrimi hranili (poleg rednega gibanja itd.). Med taka hranila sodijo tudi oligopeptidi z visokim Fischerjevim razmerjem. Fischerjevo razmerje je molarno razmerje med razvejanimi (valin, levcin, izolevcin) in aromatskimi aminokislinami (fenilalanin, tirozin). Oligopeptidi, ki imajo vrednost Fischerjevega razmerja vsaj 20, izboljšujejo jetrno funkcijo, kažejo nekatere antioksidativne lastnosti in uravnavajo strjevanje krvi [2]. Za pridobivanje takih oligopeptidov se zaenkrat uporabljajo encimske metode s peptidazami – ena izmed njih je tudi karboksipeptidaza.

===Karboksipeptidaza===
Karboksipeptidaze so eksopeptidaze, ki cepijo polipeptidno verigo na C-koncu. Najdemo jih v višjih rastlinah, glivah in živalskih tkivih. Glavni razlog za uporabo karboksipeptidaz za pripravo oligopeptidov s visokim Fischerjevim razmerjem je ta, da lahko odcepijo aromatske aminokisline s konca polipeptidne verige, s čimer se poviša Fischerjevo razmerje peptida (več razvejanih in manj aromatskih aminokislin) – na ta način cepi karboksipeptidaza A [1]. Pomembno je, da eksopeptidaza cepi dovolj specifično, saj v nasprotnem primeru ne dobimo oligopeptidov z želenim Fischerjevim razmerjem. V opisani študiji so raziskovalci preučevali karboksipeptidazo iz glive ''Aspergillus niger'' M00988. Z mutacijo treh aminokislin, ki se poleg drugih nahajajo v mestu za vezavo substrata, so želeli določiti vpliv velikosti aminokislinskega ostanka v vezavnem mestu za substrat na učinkovitost encima. S tem so želeli pridobiti encim, ki bolj specifično prepoznava in cepi aromatske aminokisline ter ga uporabiti za pripravo oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem [4].

===Potek eksperimenta===
Raziskovalci so gen za karboksipeptidazo (CPA) pridobili iz genoma glive ''Aspergillus niger'' s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR). Zapis so nato vstavili v plazmid pMD18-T in ga namnožili v celicah ''E. coli'' DH5α. Za izražanje so gen CPA vstavili v plazmid pCold-TF, s katerim so transformirali celice ''E. coli'' BL21. Izražanje so inducirali z dodatkom IPTG-ja, na novo pridobljeni encim pa so očistili s pomočjo nikelj-afinitetne kromatografije.

V več študijah je že bilo dokazano, da je specifičnost encima za določen substrat tesno povezana z mestom za vezavo substrata, ki se nahaja na encimu [3]. Če se vezavno mesto geometrijsko bolj prilega obliki substrata, se učinkovitost encima poveča – pri tem se nepolarna stranska veriga substrata ujame s hidrofobnim žepom encima, to pa predstavlja podlago za nastanek ugodnih interakcij med encimom in substratom. Raziskovalci so zato s pomočjo mestno-specifične mutageneze zamenjali aminokislinske ostanke, ki se nahajajo v vezavnem žepu za substrat. Pridobili so CPA mutante z mutacijami na mestih 135, 160 in 206: S135G, S135W, Y160G, Y160S, Y206G, Y206S. Njihovo učinkovitost so preverili s sintetičnimi peptidi, ki so predstavljali substrat. Za pridobitev oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem so uporabili algo ''Chlorella'' v prahu, ki je služila kot neke vrste substrat. Pri tem so v prvem koraku uporabili alkalno proteazo, ki večje proteine razcepi do peptidov, v naslednjem koraku pa karboksipeptidazo (ali njene mutante), ki je s peptidov odcepila aromatske aminokislinske ostanke [4].

===Rezultati===
Učinkovitost mutiranih variant encima so preverili z različnimi sintetičnimi peptidi. Mutanta, pri kateri je bil serin na 135. mestu zamenjan z glicinom, je bila bistveno bolj učinkovita kot tista, ki je bila zamenjana s triptofanom. Mutacije na mestih 160 in 206 so dale boljšo učinkovitost encima, če je bil tirozin zamenjan s serinom, medtem ko zamenjava z glicinom ni bila tako učinkovita. Pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem je bila najbolj uspešna mutacija Y160S – nastali so oligopeptidi s povprečnim Fischerjevim razmerjem 38,42, medtem kot je bila mutacija S135W najmanj uspešna – vrednost Fischerjevega razmerja je bila 26,77. Za primerjavo so v enem poskusu proteine tretirali samo z alkalno proteazo, ki je dala peptide s Fischerjevim razmerjem 12,95, ki pa je v primerjavi s hidrolizo v dveh korakih bistveno slabše [4].

===Zaključek===
Raziskovalci so v študiji s pomočjo mestno-specifične mutageneze spremenili karboksipeptidazo iz glive Aspergillus niger in na ta način izboljšali njeno aktivnost. Obenem so se mutirane različice encima izkazale kot učinkovite pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem. Raziskovalci so tudi pokazali, da je iz »surovih« in manj hranilnih proteinov (npr. iz praška ''Chlorella'') možno pridobiti oligopeptide z visokim razmerjem med razvejanimi in aromatskimi aminokislinami, kar je lahko uporabimo v prehrambni industriji. Na podlagi rezultatov študije so možne tudi nadaljnje raziskave za preslikavo mehanizma na višjo skalo in s tem na industrijski nivo [4].

===Viri===
[1] Ambler, R. P. (1972). Carboxypeptidases A and B. Methods in Enzymology, 25(C), 262–272. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(72)25023-6

[2] Fischer, J. E. (1990). Branched-Chain-Enriched Amino Acid Solutions in Patients with Liver Failure: An Early Example of Nutritional Pharmacology. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 14(5_suppl), 249S-256S. https://doi.org/10.1177/014860719001400518

[3] Wang, S., Nie, Y., Xu, Y., Zhang, R., Ko, T. P., Huang, C. H., Chan, H. C., Guo, R. T., & Xiao, R. (2014). Unconserved substrate-binding sites direct the stereoselectivity of medium-chain alcohol dehydrogenase. Chemical Communications, 50(58), 7770–7772. https://doi.org/10.1039/c4cc01752h

[4] Xiong, K., Liu, J., Wang, X., Sun, B., Zhang, Y., Zhao, Z., Pei, P., & Li, X. (2021). Engineering a carboxypeptidase from Aspergillus niger M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation. Journal of Biotechnology, 330, 1–8. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015

Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem

2021-05-05T11:13:53Z

Urška Fajdiga:

Kronična obolenja, ki nastanejo kot posledica staranja in pogosto zaradi nezdravega življenjskega sloga, predstavljajo veliko težavo v zdravstvu po celem svetu. Z namenom preprečitve ali upočasnitve razvoja kroničnih bolezni zdravniki vse bolj spodbujajo k prehranjevanju s čim bolj pestrimi hranili (poleg rednega gibanja itd.). Med taka hranila sodijo tudi oligopeptidi z visokim Fischerjevim razmerjem. Fischerjevo razmerje je molarno razmerje med razvejanimi (valin, levcin, izolevcin) in aromatskimi aminokislinami (fenilalanin, tirozin). Oligopeptidi, ki imajo vrednost Fischerjevega razmerja vsaj 20, izboljšujejo jetrno funkcijo, kažejo nekatere antioksidativne lastnosti in uravnavajo strjevanje krvi [2]. Za pridobivanje takih oligopeptidov se zaenkrat uporabljajo encimske metode s peptidazami – ena izmed njih je tudi karboksipeptidaza.

===Karboksipeptidaza===
Karboksipeptidaze so eksopeptidaze, ki cepijo polipeptidno verigo na C-koncu. Najdemo jih v višjih rastlinah, glivah in živalskih tkivih. Glavni razlog za uporabo karboksipeptidaz za pripravo oligopeptidov s visokim Fischerjevim razmerjem je ta, da lahko odcepijo aromatske aminokisline s konca polipeptidne verige, s čimer se poviša Fischerjevo razmerje peptida (več razvejanih in manj aromatskih aminokislin) – na ta način cepi karboksipeptidaza A [1]. Pomembno je, da eksopeptidaza cepi dovolj specifično, saj v nasprotnem primeru ne dobimo oligopeptidov z želenim Fischerjevim razmerjem. V opisani študiji so raziskovalci preučevali karboksipeptidazo iz glive ''Aspergillus niger'' M00988. Z mutacijo treh aminokislin, ki se poleg drugih nahajajo v mestu za vezavo substrata, so želeli določiti vpliv velikosti aminokislinskega ostanka v vezavnem mestu za substrat na učinkovitost encima. S tem so želeli pridobiti encim, ki bolj specifično prepoznava in cepi aromatske aminokisline ter ga uporabiti za pripravo oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem [4].

===Potek eksperimenta===
Raziskovalci so gen za karboksipeptidazo (CPA) pridobili iz genoma glive ''Aspergillus niger'' s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR). Zapis so nato vstavili v plazmid pMD18-T in ga namnožili v celicah ''E. coli'' DH5α. Za izražanje so gen CPA vstavili v plazmid pCold-TF, s katerim so transformirali celice ''E. coli'' BL21. Izražanje so inducirali z dodatkom IPTG-ja, na novo pridobljeni encim pa so očistili s pomočjo nikelj-afinitetne kromatografije.

V več študijah je že bilo dokazano, da je specifičnost encima za določen substrat tesno povezana z mestom za vezavo substrata, ki se nahaja na encimu [3]. Če se vezavno mesto geometrijsko bolj prilega obliki substrata, se učinkovitost encima poveča – pri tem se nepolarna stranska veriga substrata ujame s hidrofobnim žepom encima, to pa predstavlja podlago za nastanek ugodnih interakcij med encimom in substratom. Raziskovalci so zato s pomočjo mestno-specifične mutageneze zamenjali aminokislinske ostanke, ki se nahajajo v vezavnem žepu za substrat. Pridobili so CPA mutante z mutacijami na mestih 125, 160 in 206: S135G, S135W, Y160G, Y160S, Y206G, Y206S. Njihovo učinkovitost so preverili s sintetičnimi peptidi, ki so predstavljali substrat. Za pridobitev oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem so uporabili algo ''Chlorella'' v prahu, ki je služila kot neke vrste substrat. Pri tem so v prvem koraku uporabili alkalno proteazo, ki večje proteine razcepi do peptidov, v naslednjem koraku pa karboksipeptidazo (ali njene mutante), ki je s peptidov odcepila aromatske aminokislinske ostanke [4].

===Rezultati===
Učinkovitost mutiranih variant encima so preverili z različnimi sintetičnimi peptidi. Mutanta, pri kateri je bil serin na 135. mestu zamenjan z glicinom, je bila bistveno bolj učinkovita kot tista, ki je bila zamenjana s triptofanom. Mutacije na mestih 160 in 206 so dale boljšo učinkovitost encima, če je bil tirozin zamenjan s serinom, medtem ko zamenjava z glicinom ni bila tako učinkovita. Pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem je bila najbolj uspešna mutacija Y160S – nastali so oligopeptidi s povprečnim Fischerjevim razmerjem 38,42, medtem kot je bila mutacija S135W najmanj uspešna – vrednost Fischerjevega razmerja je bila 26,77. Za primerjavo so v enem poskusu proteine tretirali samo z alkalno proteazo, ki je dala peptide s Fischerjevim razmerjem 12,95, ki pa je v primerjavi s hidrolizo v dveh korakih bistveno slabše [4].

===Zaključek===
Raziskovalci so v študiji s pomočjo mestno-specifične mutageneze spremenili karboksipeptidazo iz glive Aspergillus niger in na ta način izboljšali njeno aktivnost. Obenem so se mutirane različice encima izkazale kot učinkovite pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem. Raziskovalci so tudi pokazali, da je iz »surovih« in manj hranilnih proteinov (npr. iz praška ''Chlorella'') možno pridobiti oligopeptide z visokim razmerjem med razvejanimi in aromatskimi aminokislinami, kar je lahko uporabimo v prehrambni industriji. Na podlagi rezultatov študije so možne tudi nadaljnje raziskave za preslikavo mehanizma na višjo skalo in s tem na industrijski nivo [4].

===Viri===
[1] Ambler, R. P. (1972). Carboxypeptidases A and B. Methods in Enzymology, 25(C), 262–272. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(72)25023-6

[2] Fischer, J. E. (1990). Branched-Chain-Enriched Amino Acid Solutions in Patients with Liver Failure: An Early Example of Nutritional Pharmacology. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 14(5_suppl), 249S-256S. https://doi.org/10.1177/014860719001400518

[3] Wang, S., Nie, Y., Xu, Y., Zhang, R., Ko, T. P., Huang, C. H., Chan, H. C., Guo, R. T., & Xiao, R. (2014). Unconserved substrate-binding sites direct the stereoselectivity of medium-chain alcohol dehydrogenase. Chemical Communications, 50(58), 7770–7772. https://doi.org/10.1039/c4cc01752h

[4] Xiong, K., Liu, J., Wang, X., Sun, B., Zhang, Y., Zhao, Z., Pei, P., & Li, X. (2021). Engineering a carboxypeptidase from Aspergillus niger M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation. Journal of Biotechnology, 330, 1–8. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015

Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem

2021-05-03T16:19:52Z

Urška Fajdiga:

Kronična obolenja, ki nastanejo kot posledica staranja in pogosto zaradi nezdravega življenjskega sloga, predstavljajo veliko težavo v zdravstvu po celem svetu. Z namenom preprečitve ali upočasnitve razvoja kroničnih bolezni zdravniki vse bolj spodbujajo k prehranjevanju s čim bolj pestrimi hranili (poleg rednega gibanja itd.). Med taka hranila sodijo tudi oligopeptidi z visokim Fischerjevim razmerjem. Fischerjevo razmerje je molarno razmerje med razvejanimi (valin, levcin, izolevcin) in aromatskimi aminokislinami (fenilalanin, tirozin). Oligopeptidi, ki imajo vrednost Fischerjevega razmerja vsaj 20, izboljšujejo jetrno funkcijo, kažejo nekatere antioksidativne lastnosti in uravnavajo strjevanje krvi [2]. Za pridobivanje takih oligopeptidov se zaenkrat uporabljajo encimske metode s peptidazami – ena izmed njih je tudi karboksipeptidaza.

===Karboksipeptidaza===
Karboksipeptidaze so eksopeptidaze, ki cepijo polipeptidno verigo na C-koncu. Najdemo jih v višjih rastlinah, glivah in živalskih tkivih. Glavni razlog za uporabo karboksipeptidaz za pripravo oligopeptidov s visokim Fischerjevim razmerjem je ta, da lahko odcepijo aromatske aminokisline s konca polipeptidne verige, s čimer se poviša Fischerjevo razmerje peptida (več razvejanih in manj aromatskih aminokislin) – na ta način cepi karboksipeptidaza A [1]. Pomembno je, da eksopeptidaza cepi dovolj specifično, saj v nasprotnem primeru ne dobimo oligopeptidov z želenim Fischerjevim razmerjem. V opisani študiji so raziskovalci preučevali karboksipeptidazo iz glive ''Aspergillus niger'' M00988. Z mutacijo treh aminokislin, ki se poleg drugih nahajajo v mestu za vezavo substrata, so želeli določiti vpliv velikosti aminokislinskega ostanka v vezavnem mestu za substrat na učinkovitost encima. S tem so želeli pridobiti encim, ki bolj specifično prepoznava in cepi aromatske aminokisline ter ga uporabiti za pripravo oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem [4].

===Potek eksperimenta===
Raziskovalci so gen za karboksipeptidazo (CPA) pridobili iz genoma glive ''Aspergillus niger'' s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR). Zapis so nato vstavili v plazmid pMD18-T in ga namnožili v celicah ''E. coli'' DH5α. Za izražanje so gen CPA vstavili v plazmid pCold-TF, s katerim so transformirali celice ''E. coli'' BL21. Izražanje so inducirali z dodatkom IPTG-ja, na novo pridobljeni encim pa so očistili s pomočjo nikelj-afinitetne kromatografije.

V več študijah je že bilo dokazano, da je specifičnost encima za določen substrat tesno povezana z mestom za vezavo substrata, ki se nahaja na encimu [3]. Če se vezavno mesto geometrijsko bolj prilega obliki substrata, se učinkovitost encima poveča – pri tem se nepolarna stranska veriga substrata ujame s hidrofobnim žepom encima, to pa predstavlja podlago za nastanek ugodnih interakcij med encimom in substratom. Raziskovalci so zato s pomočjo mestno-specifične mutageneze zamenjali aminokislinske ostanke, ki se nahajajo v vezavnem žepu za substrat. Pridobili so CPA mutante z mutacijami na mestih 125, 160 in 206: S125G, S125W, Y160G, Y160S, Y206G, Y206S. Njihovo učinkovitost so preverili s sintetičnimi peptidi, ki so predstavljali substrat. Za pridobitev oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem so uporabili algo ''Chlorella'' v prahu, ki je služila kot neke vrste substrat. Pri tem so v prvem koraku uporabili alkalno proteazo, ki večje proteine razcepi do peptidov, v naslednjem koraku pa karboksipeptidazo (ali njene mutante), ki je s peptidov odcepila aromatske aminokislinske ostanke [4].

===Rezultati===
Učinkovitost mutiranih variant encima so preverili z različnimi sintetičnimi peptidi. Mutanta, pri kateri je bil serin na 135. mestu zamenjan z glicinom, je bila bistveno bolj učinkovita kot tista, ki je bila zamenjana s triptofanom. Mutacije na mestih 160 in 206 so dale boljšo učinkovitost encima, če je bil tirozin zamenjan s serinom, medtem ko zamenjava z glicinom ni bila tako učinkovita. Pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem je bila najbolj uspešna mutacija Y160S – nastali so oligopeptidi s povprečnim Fischerjevim razmerjem 38,42, medtem kot je bila mutacija S135W najmanj uspešna – vrednost Fischerjevega razmerja je bila 26,77. Za primerjavo so v enem poskusu proteine tretirali samo z alkalno proteazo, ki je dala peptide s Fischerjevim razmerjem 12,95, ki pa je v primerjavi s hidrolizo v dveh korakih bistveno slabše [4].

===Zaključek===
Raziskovalci so v študiji s pomočjo mestno-specifične mutageneze spremenili karboksipeptidazo iz glive Aspergillus niger in na ta način izboljšali njeno aktivnost. Obenem so se mutirane različice encima izkazale kot učinkovite pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem. Raziskovalci so tudi pokazali, da je iz »surovih« in manj hranilnih proteinov (npr. iz praška ''Chlorella'') možno pridobiti oligopeptide z visokim razmerjem med razvejanimi in aromatskimi aminokislinami, kar je lahko uporabimo v prehrambni industriji. Na podlagi rezultatov študije so možne tudi nadaljnje raziskave za preslikavo mehanizma na višjo skalo in s tem na industrijski nivo [4].

===Viri===
[1] Ambler, R. P. (1972). Carboxypeptidases A and B. Methods in Enzymology, 25(C), 262–272. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(72)25023-6

[2] Fischer, J. E. (1990). Branched-Chain-Enriched Amino Acid Solutions in Patients with Liver Failure: An Early Example of Nutritional Pharmacology. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 14(5_suppl), 249S-256S. https://doi.org/10.1177/014860719001400518

[3] Wang, S., Nie, Y., Xu, Y., Zhang, R., Ko, T. P., Huang, C. H., Chan, H. C., Guo, R. T., & Xiao, R. (2014). Unconserved substrate-binding sites direct the stereoselectivity of medium-chain alcohol dehydrogenase. Chemical Communications, 50(58), 7770–7772. https://doi.org/10.1039/c4cc01752h

[4] Xiong, K., Liu, J., Wang, X., Sun, B., Zhang, Y., Zhao, Z., Pei, P., & Li, X. (2021). Engineering a carboxypeptidase from Aspergillus niger M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation. Journal of Biotechnology, 330, 1–8. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015

MBT seminarji 2021

2021-05-03T16:05:33Z

Urška Fajdiga:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.)
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Engineering a carboxypeptidase from ''Aspergillus niger'' M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation (Xiong K., Liu J., Wang X., Sun B., Zhang Y., Zhao Z., Pei P., & Li X.; Journal of Biotechnology, 330, 1–8, 2021, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015). [[Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem]] Urška Fajdiga (5.5.)
# Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro) (Rothan, H.A., Teoh, T.C; Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021); https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7) [[Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)]] Mirsad Mešić (6.5.)
# A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch (M. Thakur ''et al''.; Bioresource Technology 320, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124288). [[Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba]] Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem

2021-05-03T16:04:42Z

Urška Fajdiga: New page: Kronična obolenja, ki nastanejo kot posledica staranja in pogosto zaradi nezdravega življenjskega sloga, predstavljajo veliko težavo v zdravstvu po celem svetu. Z namenom preprečitve a...

Kronična obolenja, ki nastanejo kot posledica staranja in pogosto zaradi nezdravega življenjskega sloga, predstavljajo veliko težavo v zdravstvu po celem svetu. Z namenom preprečitve ali upočasnitve razvoja kroničnih bolezni zdravniki vse bolj spodbujajo k prehranjevanju s čim bolj pestrimi hranili (poleg rednega gibanja itd.). Med taka hranila sodijo tudi oligopeptidi z visokim Fischerjevim razmerjem. Fischerjevo razmerje je molarno razmerje med razvejanimi (valin, levcin, izolevcin) in aromatskimi aminokislinami (fenilalanin, tirozin). Oligopeptidi, ki imajo vrednost Fischerjevega razmerja vsaj 20, izboljšujejo jetrno funkcijo, kažejo celo nekatere antioksidativne lastnosti in uravnavajo strjevanje krvi [2]. Za pridobivanje takih oligopeptidov se zaenkrat uporabljajo encimske metode s peptidazami – ena izmed njih je tudi karboksipeptidaza.

===Karboksipeptidaza===
Karboksipeptidaze so eksopeptidaze, ki cepijo polipeptidno verigo na C-koncu. Najdemo jih v višjih rastlinah, glivah in živalskih tkivih. Glavni razlog za uporabo kasrboksipeptidaz za pripravo oligopeptidov s visokim Fischerjevim razmerjem je ta, da lahko odstranjujejo aromatske aminokisline s konca polipeptidne verige, s čimer se poviša Fischerjevo razmerje peptida (več razvejanih in manj aromatskih aminokislin) – na ta način cepi karboksipeptidaza A [1]. Pomembno je, da eksopeptidaza cepi dovolj specifično, saj v nasprotnem primeru ne dobimo oligopeptidov z želenim Fischerjevim razmerjem. V opisani študiji so raziskovalci preučevali karboksipeptidazo iz glive ''Aspergillus niger'' M00988. Z mutacijo treh aminokislin, ki se poleg drugih nahajajo v mestu za vezavo substrata, so želeli določiti vpliv velikosti aminokislinskega ostanka v vezavnem mestu za substrat na učinkovitost encima. S tem so želeli pridobiti encim, ki bolj specifično prepoznava in cepi aromatske aminokisline ter ga uporabiti za pripravo oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem [4].

===Potek eksperimenta===
Raziskovalci so gen za karboksipeptidazo (CPA) pridobili iz genoma glive ''Aspergillus niger'' s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR). Zapis so nato vstavili v plazmid pMD18-T in ga namnožili v celicah ''E. coli'' DH5α. Za izražanje so gen CPA vstavili v plazmid pCold-TF, s katerim so transformirali celice ''E. coli'' BL21. Izražanje so inducirali z dodatkom IPTG-ja, na novo pridobljeni encim pa so očistili s pomočjo nikelj-afinitetne kromatografije.

V več študijah je že bilo dokazano, da je specifičnost encima za določen substrat tesno povezana z mestom za vezavo substrata, ki se nahaja na encimu [3]. Če se vezavno mesto geometrijsko bolj prilega obliki substrata, se učinkovitost encima poveča – pri tem se nepolarna stranska veriga substrata ujame s hidrofobnim žepom encima, to pa predstavlja podlago za nastanek ugodnih interakcij med encimom in substratom. Raziskovalci so zato s pomočjo mestno-specifične mutageneze zamenjali aminokislinske ostanke, ki se nahajajo v vezavnem žepu za substrat. Pridobili so CPA mutante z mutacijami na mestih 125, 160 in 206: S125G, S125W, Y160G, Y160S, Y206G, Y206S. Njihovo učinkovitost so preverili s sintetičnimi peptidi, ki so predstavljali substrat. Za pridobitev oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem so uporabili algo ''Chlorella'' v prahu, ki je služila kot neke vrste substrat. Pri tem so v prvem koraku uporabili alkalno proteazo, ki večje proteine razcepi do peptidov, v naslednjem koraku pa karboksipeptidazo (ali njene mutante), ki je s peptidov odcepila aromatske aminokislinske ostanke [4].

===Rezultati===
Učinkovitost mutiranih variant encima so preverjali z različnimi sintetičnimi peptidi. Mutanta, pri kateri je bil serin na 135. mestu zamenjan z glicinom, je bila bistveno bolj učinkovita kot tista, ki je bila zamenjana s triptofanom. Mutacije na mestih 160 in 206 so dale boljšo učinkovitost encima, če je bil tirozin zamenjan s serinom, medtem ko zamenjava z glicinom ni bila tako učinkovita. Pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem je bila najbolj uspešna mutacija Y160S – nastali so oligopeptidi s povprečnim Fischerjevim razmerjem 38,42, medtem kot je bila mutacija S135W najmanj uspešna – Fischerjevo razmerje je imelo vrednost 26,77. Za primerjavo so v enem poskusu proteine tretirali samo z alkalno proteazo, ki pa je pokazala Fischerjevo razmerje 12,95 [4].

===Zaključek===
Raziskovalci so v študiji s pomočjo mestno-specifične mutageneze spremenili karboksipeptidazo iz glive Aspergillus niger in na ta način izboljšali njeno aktivnost. Obenem so se mutirane različice encima izkazale kot učinkovite pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem. Raziskovalci so tudi pokazali, da je iz »surovih« in manj hranilnih proteinov možno pridobiti oligopeptide z visokim razmerjem med razvejanimi in aromatskimi aminokislinami, kar je lahko uporabimo v prehrambni industriji. Na podlagi rezultatov študije so možne tudi nadaljnje raziskave za preslikavo mehanizma na višjo skalo in s tem na industrijski nivo [4].

===Viri===
[1] Ambler, R. P. (1972). Carboxypeptidases A and B. Methods in Enzymology, 25(C), 262–272. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(72)25023-6

[2] Fischer, J. E. (1990). Branched-Chain-Enriched Amino Acid Solutions in Patients with Liver Failure: An Early Example of Nutritional Pharmacology. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 14(5_suppl), 249S-256S. https://doi.org/10.1177/014860719001400518

[3] Wang, S., Nie, Y., Xu, Y., Zhang, R., Ko, T. P., Huang, C. H., Chan, H. C., Guo, R. T., & Xiao, R. (2014). Unconserved substrate-binding sites direct the stereoselectivity of medium-chain alcohol dehydrogenase. Chemical Communications, 50(58), 7770–7772. https://doi.org/10.1039/c4cc01752h

[4] Xiong, K., Liu, J., Wang, X., Sun, B., Zhang, Y., Zhao, Z., Pei, P., & Li, X. (2021). Engineering a carboxypeptidase from Aspergillus niger M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation. Journal of Biotechnology, 330, 1–8. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015

MBT seminarji 2021

2021-05-03T15:58:17Z

Urška Fajdiga:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.)
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Engineering a carboxypeptidase from Aspergillus niger M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation (Xiong K., Liu J., Wang X., Sun B., Zhang Y., Zhao Z., Pei P., & Li X.; Journal of Biotechnology, 330, 1–8, 2021, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015). [[Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem]] Urška Fajdiga (5.5.)
# Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro) (Rothan, H.A., Teoh, T.C; Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021); https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7) [[Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)]] Mirsad Mešić (6.5.)
# A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch (M. Thakur ''et al''.; Bioresource Technology 320, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124288). [[Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba]] Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli

2021-04-19T20:05:22Z

Urška Fajdiga:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x#MOESM1 Wang X., Han J. N., Zhang X., Ma Y. Y., Lin Y., Wang H., Li D. J., Zheng T. R., Wu F. Q., Ye J. W., in Chen G. Q.: Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), str. 1-13]

== '''Uvod''' ==
Primarni cilj metabolnega inženirstva je čim bolj povečati produkcijo želene molekule/spojine. Da to dosežemo, moramo čim bolj optimizirati metabolne poti, kar včasih zaradi njihove kompleksnosti postane precej zahtevno. V statičnih sistemih je običajno težko dobiti visoke izkoristke produkta, zato v določenih primerih v uporabo vedno pogosteje prihajajo dinamično regulirani sistemi, ki na nek način oponašajo tvorbo neke spojine, kakor se sicer dogaja v živih organizmih [3]. V sintezni biologiji se vedno bolj uveljavljajo genetsko programirana vezja, ki omogočajo bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije, saj lahko prinesejo velike izboljšave za industrijske namene. Kljub temu razvoj tovrstnih vezij in pripadajočih stikal zaenkrat predstavlja še velik izziv v metabolnem inženirstvu, predvsem zaradi pomanjkanja robustnosti. V nadaljevanju bom na kratko predstavila robustno termosenzibilno stikalo, ki omogoča dokaj natančen dvosmerni nadzor ekspresije genov v živih celicah. Le-ta omogoča sočasno aktivacijo in zaustavitev ali zmanjšanje izražanja dveh različnih setov genov, kar lahko nadziramo in uravnavamo s spremembo temperature [6].

== '''T-stikalo''' ==
Avtorji izhodiščnega članka so termosenzibilno stikalo poimenovali »T-switch«. Omogoča bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije genov v rekombinantni Escerichii coli, temelji pa na temperaturno odvisnem transkripcijskem regulatorju CI857. Gre za mutiran represorski protein CI bakteriofaga λ. Pri 30°C je represor v nativnem stanju, ko pa temperaturo zvišamo na 42°C, se denaturira in tako se promotor lahko aktivira [1]. Pri T-stikalu je situacija podobna, le da se izražanje določenih proteinov spremeni pri spremembi temperature iz 30°C na 37°C . S pomočjo T-stikala je raziskovalni skupini uspelo tvoriti bakterijske kolonije z vzorcem, ki spominja na vzorec drevesnih letnic, ki jih lahko vidimo ob prerezu debla. Tak vzorec jim je uspelo pridobiti s periodičnim spreminjanjem temperature med 30°C in 37°C, pri čemer sta se izmenjaje izražala rdeči (mRFP) in zeleni fluorescenčni protein (sfGFP). V naslednjem koraku jim na enak način uspelo »prisiliti« bakterije, da so spreminjale svojo obliko v odvisnosti od temperature, le da so v tem primeru uravnavali ekspresijo genov, ki so povezani z morfološkimi lastnostmi celic. V zadnjem poskusu so s pomočjo T-stikala povezali biosintezo uporabili za sintezo dveh polihidroksi alkanoatov (PHA), s čimer so pokazali, da lahko s tem sistemom precizno uravnavamo izražanje želenih genov, kar pa lahko prenesemo tudi na višjo skalo [6].

===Delovanje T-stikala===
Genetsko vezje je osnovano na logičnih vratih NE, omogoča pa bifunkcionalno izražanje genov. Vstopni signal predstavlja represor PhIF, ki je povezan s temperaturno odvisnim represorejm cI857. Izhodna signala sta dva: reporterski protein sfGFP (ang. superfolder green fluorescent protein), ki se izraža pod kontrolo promotorja PPhIF, ter reporterski protein mRFP (ang. monomeric red fluorescent protein), ki je postavljen genom phIF. Ko bakterije gojimo pri 30°C, se izraža zeleni fluorescenčni protein in je izražanje rdečega fluorescenčnega proteina »ugasnjeno«, ko pa jih gojimo pri temperaturi 37°C, se zgodi ravno obratno – izraža se rdeči fluorescenčni protein [6].

== '''Optimizacija in lastnosti T-stikala''' ==
===Izdelava prototipa===
Sev E. coli, na katerem so delali, je JM109SGL, ki je sicer prilagojen za sintezo PHA, saj vsebuje mutacijo v genih sad in gabD (sinteza poteka v smer PHB) [4] ter delecijo lacI. Za modul, ki zaznava temperaturo in je nanjo občutljiv, so uporabili izražanje represorskega proteina cI857, ki pri 30°C zavira promotor PR tako, da tvori dimerni kompleks in na ta način lahko regulira transkripcijo represorja PhIF in reporterja mRFP pri temperaturi 30°C in 37°C. Ta konstrukt so označili s številko 165. Drugi konstrukt (155) je vseboval reporterski protein sfGFP, ki je pod kontrolo promotorja PPhIF, le-tega pa inhibira PhIF. Signal za transkripcijo sfGFP ali »mirovanje« je zopet sprememba temperature. S t.i. dvosmernim nadzorom lahko torej obravnavamo ON/OFF izražanje reporterskih proteinov sfGFP in mRFP. Da so preverili delovanje vezja, so z obema konstruktoma skupaj (155+165) transficirali kompetentne celice E. coli in jih pustili rasti v LB gojišču 12 ur pri različnih temperaturah. Medtem so spremljali fluorescenco pri temperaturi med 30°C in 37°C. Le-ta se je spreminjala v skladu s pričakovanji (pri temperaturi 30°C je prevladovalo izražanje sfGFP, pri temperaturi 37°C pa izražanje mRFP) [6].

Prvotni strukturi T-stikala, ki ga sestavljata zgoraj omenjena konstrukta 155 in 165, so dodali še kontrolo z negativno povratno zanko na temperaturno-senzorni panel. V vezje so vnesli represor LacI, ki ga kodira gen lacI in je pod kontrolo promotorja PPhIF. Gen lacI so torej izrazili s sfgfp, s čimer so dosegli strogo zaviranje promotorske aktivnosti promotorja PR, pod katerega so vnesli zapis za operator LacO. Vse skupaj se je odražalo v izražanju sfGFP. Z negativno povratno zanko so dosegli bolj precizno izražanje obeh reporterskih proteinov v primerjavi s prvotnim konstruktom [6].

===Tvorba obročastih vzorcev kot odziv na spremembo temperature===
Genetska vezja lahko izkoriščamo tudi za imitacijo vzorcev, ki se pojavljajo v naravi. Raziskovalna skupina je z namenom prikaza uporabnosti T-stikala testirala odziv sistema na periodično spreminjanje temperature in bifunkcijski nadzor med tvorbo kolonij. Pri tem so imitirali tvorbo obročev, ki nastanejo pri drevesih zaradi vpliva temperature in vlažnosti v posameznem letnem času, vidimo pa jih lahko na prerezu debla. Kolonije rekombinantnih celic so se pod vplivom temperature uredile v porazdeljene obroče zelene barve, ki predstavlja sfGFP, in rdeče barve, ki predstavlja mRFP. Poskus so izvajali 3 dni tako, da so celice gojili po 10 ur pri 37°C in po 14 ur pri 30°C. Kolonije so se torej pri 37°C obarvale rdeče, pri 30°C pa zeleno. Zanimivo je, da se je čisto prva kolonija, ki je bila sprva rdeča, ob pojavu zelene kolonije obarvala rumeno, kar nakazuje na združevanje zelene in rdeče barve. Zeleni obročki so bili bolj razločni, rdeči pa so bili proti zunanjosti manj intenzivni, ker je bila in sito spominska ekspresija mRFP periodično aktivirana, ko je bila kolonija izpostavljena temperaturi 37°C. Če bi želeli dobiti razločne in enako intenzivne rdeče obročke, bi moral biti izklop (stanje OFF) enakomeren za oba reporterska proteina tekom temperaturne spremembe (iz 30°C na 37°C).
Za tvorbo natančnejših obročastih vzorcev, kjer je izražanje sfGFP in mRFP pod strogo kontrolo, so uvedli nadzor z negativno povratno zanko z LacI ter oznako za razgradnjo AAV. Pri tem je postala barva prvega zelenega obroča (najbolj v notranjosti) bolj razločna in mešanje z rdečo barvo je bilo zmanjšano. Izražanje reporterskih proteinov se je zmanjšalo, ko je kolonija dosegla stacionarno fazo rasti, kar se je pričakovano odražalo tudi na intenziteti fluorescence. Raziskovalci so s tem poskusom pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala in spremembo temperature nadzorujemo in uravnavamo izražanje genov [6].

===Spreminjanje celične morfologije s toplotno regulacijo===
V tem poskusu so raziskovalci uporabili prototip T-stikala za uravnavanje izražanja genov, povezanih z morfologijo celic. Za razliko od prejšnjega poskusa v tem primeru torej niso uravnavali izražanja reporterskih proteinov, saj so jih zamenjali s proteini, ki vplivajo na morfologijo celic. Pri tem so vključili gen za protein MreB, ki je odgovoren za tvorbo oblike celice, in gen za protein FtsZ, ki je odgovoren za celično razdelitev po podvojitvi jedra. Oba gena omogočata tvorbo paličastih, nitastih ali sferoidnih oblik celic. Do sferoidne oblike je prišlo pri prekomernem izražanju mreB (pri 30°C), do nitastih struktur pa ob prekomernem izražanju ftsZ (pri 37°C) [6].

===Tvorba biopolimerov===
Metabolno inženirstvo že dolgo izkoriščamo za povečano proizvodnjo želenega produkta. V ta namen lahko izkoriščamo tudi pripravo vezij z dinamičnim nadzorom, s katerim lahko uravnavamo tarčne poti, za povečano akomulacijo želenih bioproduktov. To je pogosto uporabljen postopek za učinkovito pridobivanje želenih produktov, pri katerem je faza rasti celic ločena od faze produkcije (Lv et al., 2019). Družina polihidroksi alkanoatov (PHA) predstavlja biorazgradljive biopolimere, ki jih sintetizirajo določeni mikroorganizmi. Imajo različne termo-mehanične lastnosti, ki so odvisne od sestavin gojišča, v katerem nastajajo, njihove molske mase in načinov polimerizacije – na ta način lahko njihovo sintezo tudi prilagajamo. Za sintezo PHA so avtorji članka združili in polimerizirali dve PHA biokocki, in sicer PHB in P4HB, poimenovali pa so ju PHB-b-P4HB. Sinteza tega produkta poteka preko sintezne poti, v kateri glukoza nastopa kot edini vir ogljika. Sintezna pot je razdeljena v 3 module: sinteza 3-hidroksibutirat-CoA, sinteza 4-hidroksibutirat-CoA in konstitutivno izražanje PHA sintaze (PhaC), ki omogoča neprestano polimerizacijo. Pri tem lahko sintezo obeh intermediatov (PHB in P4HB), ki sta pod kontrolo promotorja tac, sprožimo z dodatkom IPTG. Na podlagi uporabe T-stikala je raziskovalni skupini torej uspelo uravnavati izražanje dveh samostojnih metabolnih poti za sintezo 3HB-CoA in 4HB-CoA, s čimer so dobili polimer PHB-b-P4HB [6].

== '''Zaključek''' ==
Termo stikalo, ki temelji na temperaturno-odvisni regulaciji izražanja proteinov, predstavlja zelo učinkovito in uporabno strategijo za nadzorovano prepisovanje več genov, ki jo lahko prenesemo na industrijsko raven [2]. Avtorji članka so pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala uravnavamo in spreminjamo morfologijo celic in barvne vzorce kolonij. Velik korak naprej, ki je tudi pomemben za pridobivanje industrijsko pomembnih bioproduktov, pa predstavlja tudi možnost biosinteze makromolekul s pomočjo znanja sintezne biologije, saj so tovrstna genetska vezja učinkovita, poleg tega pa zagotavljajo široko uporabnost.

== '''Viri'''==
[1.] Elvin, C. M., Thompson, P. R., Argall, M. E., Philip Hendr, N., Stamford, P. J., Lilley, P. E., & Dixon, N. E. (1990). Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene, 87(1), 123–126. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90503-J

[2] Harder, B. J., Bettenbrock, K., & Klamt, S. (2018). Temperature-dependent dynamic control of the TCA cycle increases volumetric productivity of itaconic acid production by Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering, 115(1), 156–164. https://doi.org/10.1002/bit.26446

[3.] Holtz, W. J., & Keasling, J. D. (2010). Engineering Static and Dynamic Control of Synthetic Pathways. In Cell (Vol. 140, Issue 1, pp. 19–23). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.12.029

[4.] Li, Z. J., Shi, Z. Y., Jian, J., Guo, Y. Y., Wu, Q., & Chen, G. Q. (2010). Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metabolic Engineering, 12(4), 352–359. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2010.03.003

[5.] Lv, Y., Qian, S., Du, G., Chen, J., Zhou, J., & Xu, P. (2019). Coupling feedback genetic circuits with growth phenotype for dynamic population control and intelligent bioproduction. In Metabolic Engineering (Vol. 54, pp. 109–116). Academic Press Inc. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.03.009

[6.] Wang, X., Han, J. N., Zhang, X., Ma, Y. Y., Lin, Y., Wang, H., Li, D. J., Zheng, T. R., Wu, F. Q., Ye, J. W., & Chen, G. Q. (2021). Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), 1–13. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21654-x

Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli

2021-04-19T20:04:00Z

Urška Fajdiga:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x#MOESM1 Wang X., Han J. N., Zhang X., Ma Y. Y., Lin Y., Wang H., Li D. J., Zheng T. R., Wu F. Q., Ye J. W., in Chen G. Q.: Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), str. 1-13]

== '''Uvod''' ==
Primarni cilj metabolnega inženirstva je čim bolj povečati produkcijo želene molekule/spojine. Da to dosežemo, moramo čim bolj optimizirati metabolne poti, kar včasih zaradi njihove kompleksnosti postane precej zahtevno. V statičnih sistemih je običajno težko dobiti visoke izkoristke produkta, zato v določenih primerih v uporabo vedno pogosteje prihajajo dinamično regulirani sistemi, ki na nek način oponašajo tvorbo neke spojine, kakor se sicer dogaja v živih organizmih [3]. V sintezni biologiji se vedno bolj uveljavljajo genetsko programirana vezja, ki omogočajo bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije, saj lahko prinesejo velike izboljšave za industrijske namene. Kljub temu razvoj tovrstnih vezij in pripadajočih stikal zaenkrat predstavlja še velik izziv v metabolnem inženirstvu, predvsem zaradi pomanjkanja robustnosti. V nadaljevanju bom na kratko predstavila robustno termosenzibilno stikalo, ki omogoča dokaj natančen dvosmerni nadzor ekspresije genov v živih celicah. Le-ta omogoča sočasno aktivacijo in zaustavitev ali zmanjšanje izražanja dveh različnih setov genov, kar lahko nadziramo in uravnavamo s spremembo temperature [6].

== '''T-stikalo''' ==
Avtorji izhodiščnega članka so termosenzibilno stikalo poimenovali »T-switch«. Omogoča bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije genov v rekombinantni Escerichii coli, temelji pa na temperaturno odvisnem transkripcijskem regulatorju CI857. Gre za mutiran represorski protein CI bakteriofaga λ. Pri 30°C je represor v nativnem stanju, ko pa temperaturo zvišamo na 42°C, se denaturira in tako se promotor lahko aktivira [1]. Pri T-stikalu je situacija podobna, le da se izražanje določenih proteinov spremeni pri spremembi temperature iz 30°C na 37°C . S pomočjo T-stikala je raziskovalni skupini uspelo tvoriti bakterijske kolonije z vzorcem, ki spominja na vzorec drevesnih letnic, ki jih lahko vidimo ob prerezu debla. Tak vzorec jim je uspelo pridobiti s periodičnim spreminjanjem temperature med 30°C in 37°C, pri čemer sta se izmenjaje izražala rdeči (mRFP) in zeleni fluorescenčni protein (sfGFP). V naslednjem koraku jim na enak način uspelo »prisiliti« bakterije, da so spreminjale svojo obliko v odvisnosti od temperature, le da so v tem primeru uravnavali ekspresijo genov, ki so povezani z morfološkimi lastnostmi celic. V zadnjem poskusu so s pomočjo T-stikala povezali biosintezo uporabili za sintezo dveh polihidroksi alkanoatov (PHA), s čimer so pokazali, da lahko s tem sistemom precizno uravnavamo izražanje želenih genov, kar pa lahko prenesemo tudi na višjo skalo [6].

===Delovanje T-stikala===
'''Genetsko vezje''' je osnovano na logičnih vratih NE, omogoča pa bifunkcionalno izražanje genov. Vstopni signal predstavlja represor PhIF, ki je povezan s temperaturno odvisnim represorejm cI857. Izhodna signala sta dva: reporterski protein sfGFP (ang. superfolder green fluorescent protein), ki se izraža pod kontrolo promotorja PPhIF, ter reporterski protein mRFP (ang. monomeric red fluorescent protein), ki je postavljen genom phIF. Ko bakterije gojimo pri 30°C, se izraža zeleni fluorescenčni protein in je izražanje rdečega fluorescenčnega proteina »ugasnjeno«, ko pa jih gojimo pri temperaturi 37°C, se zgodi ravno obratno – izraža se rdeči fluorescenčni protein [6].

== '''Optimizacija in lastnosti T-stikala''' ==
===Izdelava prototipa===
Sev E. coli, na katerem so delali, je JM109SGL, ki je sicer prilagojen za sintezo PHA, saj vsebuje mutacijo v genih sad in gabD (sinteza poteka v smer PHB) [4] ter delecijo lacI. Za modul, ki zaznava temperaturo in je nanjo občutljiv, so uporabili izražanje represorskega proteina cI857, ki pri 30°C zavira promotor PR tako, da tvori dimerni kompleks in na ta način lahko regulira transkripcijo represorja PhIF in reporterja mRFP pri temperaturi 30°C in 37°C. Ta konstrukt so označili s številko 165. Drugi konstrukt (155) je vseboval reporterski protein sfGFP, ki je pod kontrolo promotorja PPhIF, le-tega pa inhibira PhIF. Signal za transkripcijo sfGFP ali »mirovanje« je zopet sprememba temperature. S t.i. dvosmernim nadzorom lahko torej obravnavamo ON/OFF izražanje reporterskih proteinov sfGFP in mRFP. Da so preverili delovanje vezja, so z obema konstruktoma skupaj (155+165) transficirali kompetentne celice E. coli in jih pustili rasti v LB gojišču 12 ur pri različnih temperaturah. Medtem so spremljali '''fluorescenco''' pri temperaturi med 30°C in 37°C. Le-ta se je spreminjala v skladu s pričakovanji (pri temperaturi 30°C je prevladovalo izražanje sfGFP, pri temperaturi 37°C pa izražanje mRFP) [6].

Prvotni strukturi T-stikala, ki ga sestavljata zgoraj omenjena konstrukta 155 in 165, so dodali še kontrolo z negativno povratno zanko na temperaturno-senzorni panel. V vezje so vnesli represor LacI, ki ga kodira gen lacI in je pod kontrolo promotorja PPhIF. Gen lacI so torej izrazili s sfgfp, s čimer so dosegli strogo zaviranje promotorske aktivnosti promotorja PR, pod katerega so vnesli zapis za operator LacO. Vse skupaj se je odražalo v izražanju sfGFP. Z negativno povratno zanko so dosegli bolj precizno izražanje obeh reporterskih proteinov v primerjavi s prvotnim konstruktom [6].

===Tvorba obročastih vzorcev kot odziv na spremembo temperature===
Genetska vezja lahko izkoriščamo tudi za imitacijo vzorcev, ki se pojavljajo v naravi. Raziskovalna skupina je z namenom prikaza uporabnosti T-stikala testirala odziv sistema na periodično spreminjanje temperature in bifunkcijski nadzor med tvorbo kolonij. Pri tem so imitirali tvorbo obročev, ki nastanejo pri drevesih zaradi vpliva temperature in vlažnosti v posameznem letnem času, vidimo pa jih lahko na prerezu debla. Kolonije rekombinantnih celic so se pod vplivom temperature uredile v porazdeljene obroče zelene barve, ki predstavlja sfGFP, in rdeče barve, ki predstavlja mRFP. '''Poskus''' so izvajali 3 dni tako, da so celice gojili po 10 ur pri 37°C in po 14 ur pri 30°C. Kolonije so se torej pri 37°C obarvale rdeče, pri 30°C pa zeleno. Zanimivo je, da se je čisto prva kolonija, ki je bila sprva rdeča, ob pojavu zelene kolonije obarvala rumeno, kar nakazuje na združevanje zelene in rdeče barve. Zeleni obročki so bili bolj razločni, rdeči pa so bili proti zunanjosti manj intenzivni, ker je bila in sito spominska ekspresija mRFP periodično aktivirana, ko je bila kolonija izpostavljena temperaturi 37°C. Če bi želeli dobiti razločne in enako intenzivne rdeče obročke, bi moral biti izklop (stanje OFF) enakomeren za oba reporterska proteina tekom temperaturne spremembe (iz 30°C na 37°C).
Za tvorbo natančnejših obročastih vzorcev, kjer je izražanje sfGFP in mRFP pod strogo kontrolo, so uvedli nadzor z negativno povratno zanko z LacI ter oznako za razgradnjo AAV. Pri tem je postala barva prvega zelenega obroča (najbolj v notranjosti) bolj razločna in mešanje z rdečo barvo je bilo zmanjšano. Izražanje reporterskih proteinov se je zmanjšalo, ko je kolonija dosegla stacionarno fazo rasti, kar se je pričakovano odražalo tudi na intenziteti fluorescence. Raziskovalci so s tem poskusom pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala in spremembo temperature nadzorujemo in uravnavamo izražanje genov [6].

===Spreminjanje celične morfologije s toplotno regulacijo===
V tem poskusu so raziskovalci uporabili prototip T-stikala za uravnavanje izražanja genov, povezanih z morfologijo celic. Za razliko od prejšnjega poskusa v tem primeru torej niso uravnavali izražanja reporterskih proteinov, saj so jih zamenjali s proteini, ki vplivajo na morfologijo celic. Pri tem so vključili gen za protein MreB, ki je odgovoren za tvorbo oblike celice, in gen za protein FtsZ, ki je odgovoren za celično razdelitev po podvojitvi jedra. Oba gena omogočata tvorbo paličastih, nitastih ali sferoidnih oblik celic. Do sferoidne oblike je prišlo pri prekomernem izražanju mreB (pri 30°C), do nitastih struktur pa ob prekomernem izražanju ftsZ (pri 37°C) [6].

===Tvorba biopolimerov===
Metabolno inženirstvo že dolgo izkoriščamo za povečano proizvodnjo želenega produkta. V ta namen lahko izkoriščamo tudi pripravo vezij z dinamičnim nadzorom, s katerim lahko uravnavamo tarčne poti, za povečano akomulacijo želenih bioproduktov. To je pogosto uporabljen postopek za učinkovito pridobivanje želenih produktov, pri katerem je faza rasti celic ločena od faze produkcije (Lv et al., 2019). Družina polihidroksi alkanoatov (PHA) predstavlja biorazgradljive biopolimere, ki jih sintetizirajo določeni mikroorganizmi. Imajo različne termo-mehanične lastnosti, ki so odvisne od sestavin gojišča, v katerem nastajajo, njihove molske mase in načinov polimerizacije – na ta način lahko njihovo sintezo tudi prilagajamo. Za sintezo PHA so avtorji članka združili in polimerizirali dve PHA biokocki, in sicer PHB in P4HB, poimenovali pa so ju PHB-b-P4HB. Sinteza tega produkta poteka preko sintezne poti, v kateri glukoza nastopa kot edini vir ogljika. Sintezna pot je razdeljena v 3 module: sinteza 3-hidroksibutirat-CoA, sinteza 4-hidroksibutirat-CoA in konstitutivno izražanje PHA sintaze (PhaC), ki omogoča neprestano polimerizacijo. Pri tem lahko sintezo obeh intermediatov (PHB in P4HB), ki sta pod kontrolo promotorja tac, sprožimo z dodatkom IPTG. Na podlagi uporabe T-stikala je raziskovalni skupini torej uspelo uravnavati izražanje dveh samostojnih metabolnih poti za sintezo 3HB-CoA in 4HB-CoA, s čimer so dobili polimer PHB-b-P4HB [6].

== '''Zaključek''' ==
Termo stikalo, ki temelji na temperaturno-odvisni regulaciji izražanja proteinov, predstavlja zelo učinkovito in uporabno strategijo za nadzorovano prepisovanje več genov, ki jo lahko prenesemo na industrijsko raven [2]. Avtorji članka so pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala uravnavamo in spreminjamo morfologijo celic in barvne vzorce kolonij. Velik korak naprej, ki je tudi pomemben za pridobivanje industrijsko pomembnih bioproduktov, pa predstavlja tudi možnost biosinteze makromolekul s pomočjo znanja sintezne biologije, saj so tovrstna genetska vezja učinkovita, poleg tega pa zagotavljajo široko uporabnost.

== '''Viri'''==
[1.] Elvin, C. M., Thompson, P. R., Argall, M. E., Philip Hendr, N., Stamford, P. J., Lilley, P. E., & Dixon, N. E. (1990). Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene, 87(1), 123–126. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90503-J

[2] Harder, B. J., Bettenbrock, K., & Klamt, S. (2018). Temperature-dependent dynamic control of the TCA cycle increases volumetric productivity of itaconic acid production by Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering, 115(1), 156–164. https://doi.org/10.1002/bit.26446

[3.] Holtz, W. J., & Keasling, J. D. (2010). Engineering Static and Dynamic Control of Synthetic Pathways. In Cell (Vol. 140, Issue 1, pp. 19–23). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.12.029

[4.] Li, Z. J., Shi, Z. Y., Jian, J., Guo, Y. Y., Wu, Q., & Chen, G. Q. (2010). Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metabolic Engineering, 12(4), 352–359. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2010.03.003

[5.] Lv, Y., Qian, S., Du, G., Chen, J., Zhou, J., & Xu, P. (2019). Coupling feedback genetic circuits with growth phenotype for dynamic population control and intelligent bioproduction. In Metabolic Engineering (Vol. 54, pp. 109–116). Academic Press Inc. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.03.009

[6.] Wang, X., Han, J. N., Zhang, X., Ma, Y. Y., Lin, Y., Wang, H., Li, D. J., Zheng, T. R., Wu, F. Q., Ye, J. W., & Chen, G. Q. (2021). Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), 1–13. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21654-x

Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli

2021-04-19T20:01:32Z

Urška Fajdiga:

Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli

2021-04-19T20:00:58Z

Urška Fajdiga:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x#MOESM1 Wang X., Han J. N., Zhang X., Ma Y. Y., Lin Y., Wang H., Li D. J., Zheng T. R., Wu F. Q., Ye J. W., in Chen G. Q.: Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), str. 1-13]

== '''Uvod''' ==
Primarni cilj metabolnega inženirstva je čim bolj povečati produkcijo želene molekule/spojine. Da to dosežemo, moramo čim bolj optimizirati metabolne poti, kar včasih zaradi njihove kompleksnosti postane precej zahtevno. V statičnih sistemih je običajno težko dobiti visoke izkoristke produkta, zato v določenih primerih v uporabo vedno pogosteje prihajajo dinamično regulirani sistemi, ki na nek način oponašajo tvorbo neke spojine, kakor se sicer dogaja v živih organizmih [3]. V sintezni biologiji se vedno bolj uveljavljajo genetsko programirana vezja, ki omogočajo bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije, saj lahko prinesejo velike izboljšave za industrijske namene. Kljub temu razvoj tovrstnih vezij in pripadajočih stikal zaenkrat predstavlja še velik izziv v metabolnem inženirstvu, predvsem zaradi pomanjkanja robustnosti. V nadaljevanju bom na kratko predstavila robustno termosenzibilno stikalo, ki omogoča dokaj natančen dvosmerni nadzor ekspresije genov v živih celicah. Le-ta omogoča sočasno aktivacijo in zaustavitev ali zmanjšanje izražanja dveh različnih setov genov, kar lahko nadziramo in uravnavamo s spremembo temperature [6].

== '''T-stikalo''' ==
Avtorji izhodiščnega članka so termosenzibilno stikalo poimenovali »T-switch«. Omogoča bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije genov v rekombinantni Escerichii coli, temelji pa na temperaturno odvisnem transkripcijskem regulatorju CI857. Gre za mutiran represorski protein CI bakteriofaga λ. Pri 30°C je represor v nativnem stanju, ko pa temperaturo zvišamo na 42°C, se denaturira in tako se promotor lahko aktivira [1]. Pri T-stikalu je situacija podobna, le da se izražanje določenih proteinov spremeni pri spremembi temperature iz 30°C na 37°C . S pomočjo T-stikala je raziskovalni skupini uspelo tvoriti bakterijske kolonije z vzorcem, ki spominja na vzorec drevesnih letnic, ki jih lahko vidimo ob prerezu debla. Tak vzorec jim je uspelo pridobiti s periodičnim spreminjanjem temperature med 30°C in 37°C, pri čemer sta se izmenjaje izražala rdeči (mRFP) in zeleni fluorescenčni protein (sfGFP). V naslednjem koraku jim na enak način uspelo »prisiliti« bakterije, da so spreminjale svojo obliko v odvisnosti od temperature, le da so v tem primeru uravnavali ekspresijo genov, ki so povezani z morfološkimi lastnostmi celic. V zadnjem poskusu so s pomočjo T-stikala povezali biosintezo uporabili za sintezo dveh polihidroksi alkanoatov (PHA), s čimer so pokazali, da lahko s tem sistemom precizno uravnavamo izražanje želenih genov, kar pa lahko prenesemo tudi na višjo skalo [6].

===Delovanje T-stikala===
Genetsko vezje je osnovano na logičnih vratih NE, omogoča pa bifunkcionalno izražanje genov. Vstopni signal predstavlja represor PhIF, ki je povezan s temperaturno odvisnim represorejm cI857. Izhodna signala sta dva: reporterski protein sfGFP (ang. superfolder green fluorescent protein), ki se izraža pod kontrolo promotorja PPhIF, ter reporterski protein mRFP (ang. monomeric red fluorescent protein), ki je postavljen genom phIF. Ko bakterije gojimo pri 30°C, se izraža zeleni fluorescenčni protein in je izražanje rdečega fluorescenčnega proteina »ugasnjeno«, ko pa jih gojimo pri temperaturi 37°C, se zgodi ravno obratno – izraža se rdeči fluorescenčni protein [6].

== '''Optimizacija in lastnosti T-stikala''' ==
===Izdelava prototipa===
Sev E. coli, na katerem so delali, je JM109SGL, ki je sicer prilagojen za sintezo PHA, saj vsebuje mutacijo v genih sad in gabD (sinteza poteka v smer PHB) [4] ter delecijo lacI. Za modul, ki zaznava temperaturo in je nanjo občutljiv, so uporabili izražanje represorskega proteina cI857, ki pri 30°C zavira promotor PR tako, da tvori dimerni kompleks in na ta način lahko regulira transkripcijo represorja PhIF in reporterja mRFP pri temperaturi 30°C in 37°C. Ta konstrukt so označili s številko 165. Drugi konstrukt (155) je vseboval reporterski protein sfGFP, ki je pod kontrolo promotorja PPhIF, le-tega pa inhibira PhIF. Signal za transkripcijo sfGFP ali »mirovanje« je zopet sprememba temperature. S t.i. dvosmernim nadzorom lahko torej obravnavamo ON/OFF izražanje reporterskih proteinov sfGFP in mRFP. Da so preverili delovanje vezja, so z obema konstruktoma skupaj (155+165) transficirali kompetentne celice E. coli in jih pustili rasti v LB gojišču 12 ur pri različnih temperaturah. Medtem so spremljali fluorescenco pri temperaturi med 30°C in 37°C. Le-ta se je spreminjala v skladu s pričakovanji (pri temperaturi 30°C je prevladovalo izražanje sfGFP, pri temperaturi 37°C pa izražanje mRFP) [6].

== '''Optimizacija in lastnosti T-stikala''' ==
Prvotni strukturi T-stikala, ki ga sestavljata zgoraj omenjena konstrukta 155 in 165, so dodali še kontrolo z negativno povratno zanko na temperaturno-senzorni panel. V vezje so vnesli represor LacI, ki ga kodira gen lacI in je pod kontrolo promotorja PPhIF. Gen lacI so torej izrazili s sfgfp, s čimer so dosegli strogo zaviranje promotorske aktivnosti promotorja PR, pod katerega so vnesli zapis za operator LacO. Vse skupaj se je odražalo v izražanju sfGFP. Z negativno povratno zanko so dosegli bolj precizno izražanje obeh reporterskih proteinov v primerjavi s prvotnim konstruktom [6].

===Tvorba obročastih vzorcev kot odziv na spremembo temperature===
Genetska vezja lahko izkoriščamo tudi za imitacijo vzorcev, ki se pojavljajo v naravi. Raziskovalna skupina je z namenom prikaza uporabnosti T-stikala testirala odziv sistema na periodično spreminjanje temperature in bifunkcijski nadzor med tvorbo kolonij. Pri tem so imitirali tvorbo obročev, ki nastanejo pri drevesih zaradi vpliva temperature in vlažnosti v posameznem letnem času, vidimo pa jih lahko na prerezu debla. Kolonije rekombinantnih celic so se pod vplivom temperature uredile v porazdeljene obroče zelene barve, ki predstavlja sfGFP, in rdeče barve, ki predstavlja mRFP. Poskus so izvajali 3 dni tako, da so celice gojili po 10 ur pri 37°C in po 14 ur pri 30°C. Kolonije so se torej pri 37°C obarvale rdeče, pri 30°C pa zeleno. Zanimivo je, da se je čisto prva kolonija, ki je bila sprva rdeča, ob pojavu zelene kolonije obarvala rumeno, kar nakazuje na združevanje zelene in rdeče barve. Zeleni obročki so bili bolj razločni, rdeči pa so bili proti zunanjosti manj intenzivni, ker je bila in sito spominska ekspresija mRFP periodično aktivirana, ko je bila kolonija izpostavljena temperaturi 37°C. Če bi želeli dobiti razločne in enako intenzivne rdeče obročke, bi moral biti izklop (stanje OFF) enakomeren za oba reporterska proteina tekom temperaturne spremembe (iz 30°C na 37°C).
Za tvorbo natančnejših obročastih vzorcev, kjer je izražanje sfGFP in mRFP pod strogo kontrolo, so uvedli nadzor z negativno povratno zanko z LacI ter oznako za razgradnjo AAV. Pri tem je postala barva prvega zelenega obroča (najbolj v notranjosti) bolj razločna in mešanje z rdečo barvo je bilo zmanjšano. Izražanje reporterskih proteinov se je zmanjšalo, ko je kolonija dosegla stacionarno fazo rasti, kar se je pričakovano odražalo tudi na intenziteti fluorescence. Raziskovalci so s tem poskusom pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala in spremembo temperature nadzorujemo in uravnavamo izražanje genov [6].

===Spreminjanje celične morfologije s toplotno regulacijo===
V tem poskusu so raziskovalci uporabili prototip T-stikala za uravnavanje izražanja genov, povezanih z morfologijo celic. Za razliko od prejšnjega poskusa v tem primeru torej niso uravnavali izražanja reporterskih proteinov, saj so jih zamenjali s proteini, ki vplivajo na morfologijo celic. Pri tem so vključili gen za protein MreB, ki je odgovoren za tvorbo oblike celice, in gen za protein FtsZ, ki je odgovoren za celično razdelitev po podvojitvi jedra. Oba gena omogočata tvorbo paličastih, nitastih ali sferoidnih oblik celic. Do sferoidne oblike je prišlo pri prekomernem izražanju mreB (pri 30°C), do nitastih struktur pa ob prekomernem izražanju ftsZ (pri 37°C) [6].

===Tvorba biopolimerov===
Metabolno inženirstvo že dolgo izkoriščamo za povečano proizvodnjo želenega produkta. V ta namen lahko izkoriščamo tudi pripravo vezij z dinamičnim nadzorom, s katerim lahko uravnavamo tarčne poti, za povečano akomulacijo želenih bioproduktov. To je pogosto uporabljen postopek za učinkovito pridobivanje želenih produktov, pri katerem je faza rasti celic ločena od faze produkcije (Lv et al., 2019). Družina polihidroksi alkanoatov (PHA) predstavlja biorazgradljive biopolimere, ki jih sintetizirajo določeni mikroorganizmi. Imajo različne termo-mehanične lastnosti, ki so odvisne od sestavin gojišča, v katerem nastajajo, njihove molske mase in načinov polimerizacije – na ta način lahko njihovo sintezo tudi prilagajamo. Za sintezo PHA so avtorji članka združili in polimerizirali dve PHA biokocki, in sicer PHB in P4HB, poimenovali pa so ju PHB-b-P4HB. Sinteza tega produkta poteka preko sintezne poti, v kateri glukoza nastopa kot edini vir ogljika. Sintezna pot je razdeljena v 3 module: sinteza 3-hidroksibutirat-CoA, sinteza 4-hidroksibutirat-CoA in konstitutivno izražanje PHA sintaze (PhaC), ki omogoča neprestano polimerizacijo. Pri tem lahko sintezo obeh intermediatov (PHB in P4HB), ki sta pod kontrolo promotorja tac, sprožimo z dodatkom IPTG. Na podlagi uporabe T-stikala je raziskovalni skupini torej uspelo uravnavati izražanje dveh samostojnih metabolnih poti za sintezo 3HB-CoA in 4HB-CoA, s čimer so dobili polimer PHB-b-P4HB [6].

== '''Zaključek''' ==
Termo stikalo, ki temelji na temperaturno-odvisni regulaciji izražanja proteinov, predstavlja zelo učinkovito in uporabno strategijo za nadzorovano prepisovanje več genov, ki jo lahko prenesemo na industrijsko raven [2]. Avtorji članka so pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala uravnavamo in spreminjamo morfologijo celic in barvne vzorce kolonij. Velik korak naprej, ki je tudi pomemben za pridobivanje industrijsko pomembnih bioproduktov, pa predstavlja tudi možnost biosinteze makromolekul s pomočjo znanja sintezne biologije, saj so tovrstna genetska vezja učinkovita, poleg tega pa zagotavljajo široko uporabnost.

== '''Viri'''==
[1.] Elvin, C. M., Thompson, P. R., Argall, M. E., Philip Hendr, N., Stamford, P. J., Lilley, P. E., & Dixon, N. E. (1990). Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene, 87(1), 123–126. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90503-J

[2] Harder, B. J., Bettenbrock, K., & Klamt, S. (2018). Temperature-dependent dynamic control of the TCA cycle increases volumetric productivity of itaconic acid production by Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering, 115(1), 156–164. https://doi.org/10.1002/bit.26446

[3.] Holtz, W. J., & Keasling, J. D. (2010). Engineering Static and Dynamic Control of Synthetic Pathways. In Cell (Vol. 140, Issue 1, pp. 19–23). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.12.029

[4.] Li, Z. J., Shi, Z. Y., Jian, J., Guo, Y. Y., Wu, Q., & Chen, G. Q. (2010). Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metabolic Engineering, 12(4), 352–359. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2010.03.003

[5.] Lv, Y., Qian, S., Du, G., Chen, J., Zhou, J., & Xu, P. (2019). Coupling feedback genetic circuits with growth phenotype for dynamic population control and intelligent bioproduction. In Metabolic Engineering (Vol. 54, pp. 109–116). Academic Press Inc. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.03.009

[6.] Wang, X., Han, J. N., Zhang, X., Ma, Y. Y., Lin, Y., Wang, H., Li, D. J., Zheng, T. R., Wu, F. Q., Ye, J. W., & Chen, G. Q. (2021). Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), 1–13. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21654-x

Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli

2021-04-19T19:57:41Z

Urška Fajdiga: /* Viri */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x#MOESM1 Wang X., Han J. N., Zhang X., Ma Y. Y., Lin Y., Wang H., Li D. J., Zheng T. R., Wu F. Q., Ye J. W., in Chen G. Q.: Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), str. 1-13]

== '''Uvod''' ==
Primarni cilj metabolnega inženirstva je čim bolj povečati produkcijo želene molekule/spojine. Da to dosežemo, moramo čim bolj optimizirati metabolne poti, kar včasih zaradi njihove kompleksnosti postane precej zahtevno. V statičnih sistemih je običajno težko dobiti visoke izkoristke produkta, zato v določenih primerih v uporabo vedno pogosteje prihajajo dinamično regulirani sistemi, ki na nek način oponašajo tvorbo neke spojine, kakor se sicer dogaja v živih organizmih [3]. V sintezni biologiji se vedno bolj uveljavljajo genetsko programirana vezja, ki omogočajo bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije, saj lahko prinesejo velike izboljšave za industrijske namene. Kljub temu razvoj tovrstnih vezij in pripadajočih stikal zaenkrat predstavlja še velik izziv v metabolnem inženirstvu, predvsem zaradi pomanjkanja robustnosti. V nadaljevanju bom na kratko predstavila robustno termosenzibilno stikalo, ki omogoča dokaj natančen dvosmerni nadzor ekspresije genov v živih celicah. Le-ta omogoča sočasno aktivacijo in zaustavitev ali zmanjšanje izražanja dveh različnih setov genov, kar lahko nadziramo in uravnavamo s spremembo temperature [6].

== '''T-stikalo''' ==
Avtorji izhodiščnega članka so termosenzibilno stikalo poimenovali »T-switch«. Omogoča bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije genov v rekombinantni Escerichii coli, temelji pa na temperaturno odvisnem transkripcijskem regulatorju CI857. Gre za mutiran represorski protein CI bakteriofaga λ. Pri 30°C je represor v nativnem stanju, ko pa temperaturo zvišamo na 42°C, se denaturira in tako se promotor lahko aktivira [1]. Pri T-stikalu je situacija podobna, le da se izražanje določenih proteinov spremeni pri spremembi temperature iz 30°C na 37°C . S pomočjo T-stikala je raziskovalni skupini uspelo tvoriti bakterijske kolonije z vzorcem, ki spominja na vzorec drevesnih letnic, ki jih lahko vidimo ob prerezu debla. Tak vzorec jim je uspelo pridobiti s periodičnim spreminjanjem temperature med 30°C in 37°C, pri čemer sta se izmenjaje izražala rdeči (mRFP) in zeleni fluorescenčni protein (sfGFP). V naslednjem koraku jim na enak način uspelo »prisiliti« bakterije, da so spreminjale svojo obliko v odvisnosti od temperature, le da so v tem primeru uravnavali ekspresijo genov, ki so povezani z morfološkimi lastnostmi celic. V zadnjem poskusu so s pomočjo T-stikala povezali biosintezo uporabili za sintezo dveh polihidroksi alkanoatov (PHA), s čimer so pokazali, da lahko s tem sistemom precizno uravnavamo izražanje želenih genov, kar pa lahko prenesemo tudi na višjo skalo [6].

===Delovanje T-stikala===
Genetsko vezje je osnovano na logičnih vratih NE, omogoča pa bifunkcionalno izražanje genov. Vstopni signal predstavlja represor PhIF, ki je povezan s temperaturno odvisnim represorejm cI857. Izhodna signala sta dva: reporterski protein sfGFP (ang. superfolder green fluorescent protein), ki se izraža pod kontrolo promotorja PPhIF, ter reporterski protein mRFP (ang. monomeric red fluorescent protein), ki je postavljen genom phIF. Ko bakterije gojimo pri 30°C, se izraža zeleni fluorescenčni protein in je izražanje rdečega fluorescenčnega proteina »ugasnjeno«, ko pa jih gojimo pri temperaturi 37°C, se zgodi ravno obratno – izraža se rdeči fluorescenčni protein [6].

== '''Rezultati''' ==
===Izdelava prototipa===
Sev E. coli, na katerem so delali, je JM109SGL, ki je sicer prilagojen za sintezo PHA, saj vsebuje mutacijo v genih sad in gabD (sinteza poteka v smer PHB) [4] ter delecijo lacI. Za modul, ki zaznava temperaturo in je nanjo občutljiv, so uporabili izražanje represorskega proteina cI857, ki pri 30°C zavira promotor PR tako, da tvori dimerni kompleks in na ta način lahko regulira transkripcijo represorja PhIF in reporterja mRFP pri temperaturi 30°C in 37°C. Ta konstrukt so označili s številko 165. Drugi konstrukt (155) je vseboval reporterski protein sfGFP, ki je pod kontrolo promotorja PPhIF, le-tega pa inhibira PhIF. Signal za transkripcijo sfGFP ali »mirovanje« je zopet sprememba temperature. S t.i. dvosmernim nadzorom lahko torej obravnavamo ON/OFF izražanje reporterskih proteinov sfGFP in mRFP. Da so preverili delovanje vezja, so z obema konstruktoma skupaj (155+165) transficirali kompetentne celice E. coli in jih pustili rasti v LB gojišču 12 ur pri različnih temperaturah. Medtem so spremljali fluorescenco pri temperaturi med 30°C in 37°C. Le-ta se je spreminjala v skladu s pričakovanji (pri temperaturi 30°C je prevladovalo izražanje sfGFP, pri temperaturi 37°C pa izražanje mRFP) [6].

== '''Optimizacija in lastnosti T-stikala''' ==
Prvotni strukturi T-stikala, ki ga sestavljata zgoraj omenjena konstrukta 155 in 165, so dodali še kontrolo z negativno povratno zanko na temperaturno-senzorni panel. V vezje so vnesli represor LacI, ki ga kodira gen lacI in je pod kontrolo promotorja PPhIF. Gen lacI so torej izrazili s sfgfp, s čimer so dosegli strogo zaviranje promotorske aktivnosti promotorja PR, pod katerega so vnesli zapis za operator LacO. Vse skupaj se je odražalo v izražanju sfGFP. Z negativno povratno zanko so dosegli bolj precizno izražanje obeh reporterskih proteinov v primerjavi s prvotnim konstruktom [6].

===Tvorba obročastih vzorcev kot odziv na spremembo temperature===
Genetska vezja lahko izkoriščamo tudi za imitacijo vzorcev, ki se pojavljajo v naravi. Raziskovalna skupina je z namenom prikaza uporabnosti T-stikala testirala odziv sistema na periodično spreminjanje temperature in bifunkcijski nadzor med tvorbo kolonij. Pri tem so imitirali tvorbo obročev, ki nastanejo pri drevesih zaradi vpliva temperature in vlažnosti v posameznem letnem času, vidimo pa jih lahko na prerezu debla. Kolonije rekombinantnih celic so se pod vplivom temperature uredile v porazdeljene obroče zelene barve, ki predstavlja sfGFP, in rdeče barve, ki predstavlja mRFP. Poskus so izvajali 3 dni tako, da so celice gojili po 10 ur pri 37°C in po 14 ur pri 30°C. Kolonije so se torej pri 37°C obarvale rdeče, pri 30°C pa zeleno. Zanimivo je, da se je čisto prva kolonija, ki je bila sprva rdeča, ob pojavu zelene kolonije obarvala rumeno, kar nakazuje na združevanje zelene in rdeče barve. Zeleni obročki so bili bolj razločni, rdeči pa so bili proti zunanjosti manj intenzivni, ker je bila in sito spominska ekspresija mRFP periodično aktivirana, ko je bila kolonija izpostavljena temperaturi 37°C. Če bi želeli dobiti razločne in enako intenzivne rdeče obročke, bi moral biti izklop (stanje OFF) enakomeren za oba reporterska proteina tekom temperaturne spremembe (iz 30°C na 37°C).
Za tvorbo natančnejših obročastih vzorcev, kjer je izražanje sfGFP in mRFP pod strogo kontrolo, so uvedli nadzor z negativno povratno zanko z LacI ter oznako za razgradnjo AAV. Pri tem je postala barva prvega zelenega obroča (najbolj v notranjosti) bolj razločna in mešanje z rdečo barvo je bilo zmanjšano. Izražanje reporterskih proteinov se je zmanjšalo, ko je kolonija dosegla stacionarno fazo rasti, kar se je pričakovano odražalo tudi na intenziteti fluorescence. Raziskovalci so s tem poskusom pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala in spremembo temperature nadzorujemo in uravnavamo izražanje genov [6].

===Spreminjanje celične morfologije s toplotno regulacijo===
V tem poskusu so raziskovalci uporabili prototip T-stikala za uravnavanje izražanja genov, povezanih z morfologijo celic. Za razliko od prejšnjega poskusa v tem primeru torej niso uravnavali izražanja reporterskih proteinov, saj so jih zamenjali s proteini, ki vplivajo na morfologijo celic. Pri tem so vključili gen za protein MreB, ki je odgovoren za tvorbo oblike celice, in gen za protein FtsZ, ki je odgovoren za celično razdelitev po podvojitvi jedra. Oba gena omogočata tvorbo paličastih, nitastih ali sferoidnih oblik celic. Do sferoidne oblike je prišlo pri prekomernem izražanju mreB (pri 30°C), do nitastih struktur pa ob prekomernem izražanju ftsZ (pri 37°C) [6].

===Tvorba biopolimerov===
Metabolno inženirstvo že dolgo izkoriščamo za povečano proizvodnjo želenega produkta. V ta namen lahko izkoriščamo tudi pripravo vezij z dinamičnim nadzorom, s katerim lahko uravnavamo tarčne poti, za povečano akomulacijo želenih bioproduktov. To je pogosto uporabljen postopek za učinkovito pridobivanje želenih produktov, pri katerem je faza rasti celic ločena od faze produkcije (Lv et al., 2019). Družina polihidroksi alkanoatov (PHA) predstavlja biorazgradljive biopolimere, ki jih sintetizirajo določeni mikroorganizmi. Imajo različne termo-mehanične lastnosti, ki so odvisne od sestavin gojišča, v katerem nastajajo, njihove molske mase in načinov polimerizacije – na ta način lahko njihovo sintezo tudi prilagajamo. Za sintezo PHA so avtorji članka združili in polimerizirali dve PHA biokocki, in sicer PHB in P4HB, poimenovali pa so ju PHB-b-P4HB. Sinteza tega produkta poteka preko sintezne poti, v kateri glukoza nastopa kot edini vir ogljika. Sintezna pot je razdeljena v 3 module: sinteza 3-hidroksibutirat-CoA, sinteza 4-hidroksibutirat-CoA in konstitutivno izražanje PHA sintaze (PhaC), ki omogoča neprestano polimerizacijo. Pri tem lahko sintezo obeh intermediatov (PHB in P4HB), ki sta pod kontrolo promotorja tac, sprožimo z dodatkom IPTG. Na podlagi uporabe T-stikala je raziskovalni skupini torej uspelo uravnavati izražanje dveh samostojnih metabolnih poti za sintezo 3HB-CoA in 4HB-CoA, s čimer so dobili polimer PHB-b-P4HB [6].

== '''Zaključek''' ==
Termo stikalo, ki temelji na temperaturno-odvisni regulaciji izražanja proteinov, predstavlja zelo učinkovito in uporabno strategijo za nadzorovano prepisovanje več genov, ki jo lahko prenesemo na industrijsko raven [2]. Avtorji članka so pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala uravnavamo in spreminjamo morfologijo celic in barvne vzorce kolonij. Velik korak naprej, ki je tudi pomemben za pridobivanje industrijsko pomembnih bioproduktov, pa predstavlja tudi možnost biosinteze makromolekul s pomočjo znanja sintezne biologije, saj so tovrstna genetska vezja učinkovita, poleg tega pa zagotavljajo široko uporabnost.

== '''Viri'''==
[1.] Elvin, C. M., Thompson, P. R., Argall, M. E., Philip Hendr, N., Stamford, P. J., Lilley, P. E., & Dixon, N. E. (1990). Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene, 87(1), 123–126. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90503-J

[2] Harder, B. J., Bettenbrock, K., & Klamt, S. (2018). Temperature-dependent dynamic control of the TCA cycle increases volumetric productivity of itaconic acid production by Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering, 115(1), 156–164. https://doi.org/10.1002/bit.26446

[3.] Holtz, W. J., & Keasling, J. D. (2010). Engineering Static and Dynamic Control of Synthetic Pathways. In Cell (Vol. 140, Issue 1, pp. 19–23). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.12.029

[4.] Li, Z. J., Shi, Z. Y., Jian, J., Guo, Y. Y., Wu, Q., & Chen, G. Q. (2010). Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metabolic Engineering, 12(4), 352–359. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2010.03.003

[5.] Lv, Y., Qian, S., Du, G., Chen, J., Zhou, J., & Xu, P. (2019). Coupling feedback genetic circuits with growth phenotype for dynamic population control and intelligent bioproduction. In Metabolic Engineering (Vol. 54, pp. 109–116). Academic Press Inc. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.03.009

[6.] Wang, X., Han, J. N., Zhang, X., Ma, Y. Y., Lin, Y., Wang, H., Li, D. J., Zheng, T. R., Wu, F. Q., Ye, J. W., & Chen, G. Q. (2021). Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), 1–13. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21654-x

Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli

2021-04-19T19:56:08Z

Urška Fajdiga: New page: ''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x#MOESM1 Wang X., Han J. N., Zhang X., Ma Y. Y., Lin Y., Wang H., Li D. J., Zheng T. R., Wu F. Q., Ye J. W., in Ch...

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x#MOESM1 Wang X., Han J. N., Zhang X., Ma Y. Y., Lin Y., Wang H., Li D. J., Zheng T. R., Wu F. Q., Ye J. W., in Chen G. Q.: Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), str. 1-13]

== '''Uvod''' ==
Primarni cilj metabolnega inženirstva je čim bolj povečati produkcijo želene molekule/spojine. Da to dosežemo, moramo čim bolj optimizirati metabolne poti, kar včasih zaradi njihove kompleksnosti postane precej zahtevno. V statičnih sistemih je običajno težko dobiti visoke izkoristke produkta, zato v določenih primerih v uporabo vedno pogosteje prihajajo dinamično regulirani sistemi, ki na nek način oponašajo tvorbo neke spojine, kakor se sicer dogaja v živih organizmih [3]. V sintezni biologiji se vedno bolj uveljavljajo genetsko programirana vezja, ki omogočajo bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije, saj lahko prinesejo velike izboljšave za industrijske namene. Kljub temu razvoj tovrstnih vezij in pripadajočih stikal zaenkrat predstavlja še velik izziv v metabolnem inženirstvu, predvsem zaradi pomanjkanja robustnosti. V nadaljevanju bom na kratko predstavila robustno termosenzibilno stikalo, ki omogoča dokaj natančen dvosmerni nadzor ekspresije genov v živih celicah. Le-ta omogoča sočasno aktivacijo in zaustavitev ali zmanjšanje izražanja dveh različnih setov genov, kar lahko nadziramo in uravnavamo s spremembo temperature [6].

== '''T-stikalo''' ==
Avtorji izhodiščnega članka so termosenzibilno stikalo poimenovali »T-switch«. Omogoča bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije genov v rekombinantni Escerichii coli, temelji pa na temperaturno odvisnem transkripcijskem regulatorju CI857. Gre za mutiran represorski protein CI bakteriofaga λ. Pri 30°C je represor v nativnem stanju, ko pa temperaturo zvišamo na 42°C, se denaturira in tako se promotor lahko aktivira [1]. Pri T-stikalu je situacija podobna, le da se izražanje določenih proteinov spremeni pri spremembi temperature iz 30°C na 37°C . S pomočjo T-stikala je raziskovalni skupini uspelo tvoriti bakterijske kolonije z vzorcem, ki spominja na vzorec drevesnih letnic, ki jih lahko vidimo ob prerezu debla. Tak vzorec jim je uspelo pridobiti s periodičnim spreminjanjem temperature med 30°C in 37°C, pri čemer sta se izmenjaje izražala rdeči (mRFP) in zeleni fluorescenčni protein (sfGFP). V naslednjem koraku jim na enak način uspelo »prisiliti« bakterije, da so spreminjale svojo obliko v odvisnosti od temperature, le da so v tem primeru uravnavali ekspresijo genov, ki so povezani z morfološkimi lastnostmi celic. V zadnjem poskusu so s pomočjo T-stikala povezali biosintezo uporabili za sintezo dveh polihidroksi alkanoatov (PHA), s čimer so pokazali, da lahko s tem sistemom precizno uravnavamo izražanje želenih genov, kar pa lahko prenesemo tudi na višjo skalo [6].

===Delovanje T-stikala===
Genetsko vezje je osnovano na logičnih vratih NE, omogoča pa bifunkcionalno izražanje genov. Vstopni signal predstavlja represor PhIF, ki je povezan s temperaturno odvisnim represorejm cI857. Izhodna signala sta dva: reporterski protein sfGFP (ang. superfolder green fluorescent protein), ki se izraža pod kontrolo promotorja PPhIF, ter reporterski protein mRFP (ang. monomeric red fluorescent protein), ki je postavljen genom phIF. Ko bakterije gojimo pri 30°C, se izraža zeleni fluorescenčni protein in je izražanje rdečega fluorescenčnega proteina »ugasnjeno«, ko pa jih gojimo pri temperaturi 37°C, se zgodi ravno obratno – izraža se rdeči fluorescenčni protein [6].

== '''Rezultati''' ==
===Izdelava prototipa===
Sev E. coli, na katerem so delali, je JM109SGL, ki je sicer prilagojen za sintezo PHA, saj vsebuje mutacijo v genih sad in gabD (sinteza poteka v smer PHB) [4] ter delecijo lacI. Za modul, ki zaznava temperaturo in je nanjo občutljiv, so uporabili izražanje represorskega proteina cI857, ki pri 30°C zavira promotor PR tako, da tvori dimerni kompleks in na ta način lahko regulira transkripcijo represorja PhIF in reporterja mRFP pri temperaturi 30°C in 37°C. Ta konstrukt so označili s številko 165. Drugi konstrukt (155) je vseboval reporterski protein sfGFP, ki je pod kontrolo promotorja PPhIF, le-tega pa inhibira PhIF. Signal za transkripcijo sfGFP ali »mirovanje« je zopet sprememba temperature. S t.i. dvosmernim nadzorom lahko torej obravnavamo ON/OFF izražanje reporterskih proteinov sfGFP in mRFP. Da so preverili delovanje vezja, so z obema konstruktoma skupaj (155+165) transficirali kompetentne celice E. coli in jih pustili rasti v LB gojišču 12 ur pri različnih temperaturah. Medtem so spremljali fluorescenco pri temperaturi med 30°C in 37°C. Le-ta se je spreminjala v skladu s pričakovanji (pri temperaturi 30°C je prevladovalo izražanje sfGFP, pri temperaturi 37°C pa izražanje mRFP) [6].

== '''Optimizacija in lastnosti T-stikala''' ==
Prvotni strukturi T-stikala, ki ga sestavljata zgoraj omenjena konstrukta 155 in 165, so dodali še kontrolo z negativno povratno zanko na temperaturno-senzorni panel. V vezje so vnesli represor LacI, ki ga kodira gen lacI in je pod kontrolo promotorja PPhIF. Gen lacI so torej izrazili s sfgfp, s čimer so dosegli strogo zaviranje promotorske aktivnosti promotorja PR, pod katerega so vnesli zapis za operator LacO. Vse skupaj se je odražalo v izražanju sfGFP. Z negativno povratno zanko so dosegli bolj precizno izražanje obeh reporterskih proteinov v primerjavi s prvotnim konstruktom [6].

===Tvorba obročastih vzorcev kot odziv na spremembo temperature===
Genetska vezja lahko izkoriščamo tudi za imitacijo vzorcev, ki se pojavljajo v naravi. Raziskovalna skupina je z namenom prikaza uporabnosti T-stikala testirala odziv sistema na periodično spreminjanje temperature in bifunkcijski nadzor med tvorbo kolonij. Pri tem so imitirali tvorbo obročev, ki nastanejo pri drevesih zaradi vpliva temperature in vlažnosti v posameznem letnem času, vidimo pa jih lahko na prerezu debla. Kolonije rekombinantnih celic so se pod vplivom temperature uredile v porazdeljene obroče zelene barve, ki predstavlja sfGFP, in rdeče barve, ki predstavlja mRFP. Poskus so izvajali 3 dni tako, da so celice gojili po 10 ur pri 37°C in po 14 ur pri 30°C. Kolonije so se torej pri 37°C obarvale rdeče, pri 30°C pa zeleno. Zanimivo je, da se je čisto prva kolonija, ki je bila sprva rdeča, ob pojavu zelene kolonije obarvala rumeno, kar nakazuje na združevanje zelene in rdeče barve. Zeleni obročki so bili bolj razločni, rdeči pa so bili proti zunanjosti manj intenzivni, ker je bila in sito spominska ekspresija mRFP periodično aktivirana, ko je bila kolonija izpostavljena temperaturi 37°C. Če bi želeli dobiti razločne in enako intenzivne rdeče obročke, bi moral biti izklop (stanje OFF) enakomeren za oba reporterska proteina tekom temperaturne spremembe (iz 30°C na 37°C).
Za tvorbo natančnejših obročastih vzorcev, kjer je izražanje sfGFP in mRFP pod strogo kontrolo, so uvedli nadzor z negativno povratno zanko z LacI ter oznako za razgradnjo AAV. Pri tem je postala barva prvega zelenega obroča (najbolj v notranjosti) bolj razločna in mešanje z rdečo barvo je bilo zmanjšano. Izražanje reporterskih proteinov se je zmanjšalo, ko je kolonija dosegla stacionarno fazo rasti, kar se je pričakovano odražalo tudi na intenziteti fluorescence. Raziskovalci so s tem poskusom pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala in spremembo temperature nadzorujemo in uravnavamo izražanje genov [6].

===Spreminjanje celične morfologije s toplotno regulacijo===
V tem poskusu so raziskovalci uporabili prototip T-stikala za uravnavanje izražanja genov, povezanih z morfologijo celic. Za razliko od prejšnjega poskusa v tem primeru torej niso uravnavali izražanja reporterskih proteinov, saj so jih zamenjali s proteini, ki vplivajo na morfologijo celic. Pri tem so vključili gen za protein MreB, ki je odgovoren za tvorbo oblike celice, in gen za protein FtsZ, ki je odgovoren za celično razdelitev po podvojitvi jedra. Oba gena omogočata tvorbo paličastih, nitastih ali sferoidnih oblik celic. Do sferoidne oblike je prišlo pri prekomernem izražanju mreB (pri 30°C), do nitastih struktur pa ob prekomernem izražanju ftsZ (pri 37°C) [6].

===Tvorba biopolimerov===
Metabolno inženirstvo že dolgo izkoriščamo za povečano proizvodnjo želenega produkta. V ta namen lahko izkoriščamo tudi pripravo vezij z dinamičnim nadzorom, s katerim lahko uravnavamo tarčne poti, za povečano akomulacijo želenih bioproduktov. To je pogosto uporabljen postopek za učinkovito pridobivanje želenih produktov, pri katerem je faza rasti celic ločena od faze produkcije (Lv et al., 2019). Družina polihidroksi alkanoatov (PHA) predstavlja biorazgradljive biopolimere, ki jih sintetizirajo določeni mikroorganizmi. Imajo različne termo-mehanične lastnosti, ki so odvisne od sestavin gojišča, v katerem nastajajo, njihove molske mase in načinov polimerizacije – na ta način lahko njihovo sintezo tudi prilagajamo. Za sintezo PHA so avtorji članka združili in polimerizirali dve PHA biokocki, in sicer PHB in P4HB, poimenovali pa so ju PHB-b-P4HB. Sinteza tega produkta poteka preko sintezne poti, v kateri glukoza nastopa kot edini vir ogljika. Sintezna pot je razdeljena v 3 module: sinteza 3-hidroksibutirat-CoA, sinteza 4-hidroksibutirat-CoA in konstitutivno izražanje PHA sintaze (PhaC), ki omogoča neprestano polimerizacijo. Pri tem lahko sintezo obeh intermediatov (PHB in P4HB), ki sta pod kontrolo promotorja tac, sprožimo z dodatkom IPTG. Na podlagi uporabe T-stikala je raziskovalni skupini torej uspelo uravnavati izražanje dveh samostojnih metabolnih poti za sintezo 3HB-CoA in 4HB-CoA, s čimer so dobili polimer PHB-b-P4HB [6].

== '''Zaključek''' ==
Termo stikalo, ki temelji na temperaturno-odvisni regulaciji izražanja proteinov, predstavlja zelo učinkovito in uporabno strategijo za nadzorovano prepisovanje več genov, ki jo lahko prenesemo na industrijsko raven [2]. Avtorji članka so pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala uravnavamo in spreminjamo morfologijo celic in barvne vzorce kolonij. Velik korak naprej, ki je tudi pomemben za pridobivanje industrijsko pomembnih bioproduktov, pa predstavlja tudi možnost biosinteze makromolekul s pomočjo znanja sintezne biologije, saj so tovrstna genetska vezja učinkovita, poleg tega pa zagotavljajo široko uporabnost.

== '''Viri'''==
[1.] Elvin, C. M., Thompson, P. R., Argall, M. E., Philip Hendr, N., Stamford, P. J., Lilley, P. E., & Dixon, N. E. (1990). Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene, 87(1), 123–126. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90503-J
[2] Harder, B. J., Bettenbrock, K., & Klamt, S. (2018). Temperature-dependent dynamic control of the TCA cycle increases volumetric productivity of itaconic acid production by Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering, 115(1), 156–164. https://doi.org/10.1002/bit.26446
[3.] Holtz, W. J., & Keasling, J. D. (2010). Engineering Static and Dynamic Control of Synthetic Pathways. In Cell (Vol. 140, Issue 1, pp. 19–23). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.12.029
[4.] Li, Z. J., Shi, Z. Y., Jian, J., Guo, Y. Y., Wu, Q., & Chen, G. Q. (2010). Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metabolic Engineering, 12(4), 352–359. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2010.03.003
[5.] Lv, Y., Qian, S., Du, G., Chen, J., Zhou, J., & Xu, P. (2019). Coupling feedback genetic circuits with growth phenotype for dynamic population control and intelligent bioproduction. In Metabolic Engineering (Vol. 54, pp. 109–116). Academic Press Inc. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.03.009
[6.] Wang, X., Han, J. N., Zhang, X., Ma, Y. Y., Lin, Y., Wang, H., Li, D. J., Zheng, T. R., Wu, F. Q., Ye, J. W., & Chen, G. Q. (2021). Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), 1–13. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21654-x

Seminarji SB 2020/21

2021-04-19T19:43:22Z

Urška Fajdiga:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
8 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-19T19:42:41Z

Urška Fajdiga:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
8 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-19T19:39:59Z

Urška Fajdiga:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v E._coli] (Urška Fajdiga) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
8 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.