Wiki FKKT - User contributions [en]

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T13:47:06Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje [1].
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij [2].
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Kadar je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Kadar sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov. Izračunamo in izmerimo lahko kako je zanka odvisna od 4 ključnih bioloških parametrov: moči in koncentracije transkripcijskih faktorjev (TF) in od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA ter zaporedja DNA zanke [3].
Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu [3].

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov [1].

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalnega mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran [1].
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto [1].

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic [1].

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja [1].
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Da bi globje raziskali ta koncept so sintetizirali Pspacer knjižnico, ki vsebuje 4400 variant. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja [1].
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja [1].
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih [1].
== Viri ==
[1] T. C. Yu, W. L. Liu, M. S. Brinck, J. E. Davis, J. Shek, G. Bower, T. Einav, K. D. Insigne, R. Phillips, S. Kosuri, et al.: Multiplexed Characterization of Rationally Designed Promoter Architectures Deconstructs Combinatorial Logic for IPTG-Inducible Systems. Nat. Commun. 2021, 12, 1–14.

[2] T. Ashuach, D. S. Fischer, A. Kreimer, N. Ahituv, F. J. Theis, N. Yosef: MPRAnalyze: Statistical Framework for Massively Parallel Reporter Assays. Genome Biol. 2019, 20, 183.

[3] S. Johnson, M. Lindén, R. Phillips: Sequence Dependence of Transcription Factor-Mediated DNA Looping. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 7728–7738.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T08:49:17Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje [1].
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij [2].
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Kadar je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov. Izračunamo in izmerimo lahko kako je zanka odvisna od 4 ključnih bioloških parametrov: moči in koncentracije transkripcijskih faktorjev (TF) in od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA ter zaporedja DNA zanke [3].
Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu [3].

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov [1].

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran [1].
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto [1].

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic [1].

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja [1].
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja [1].
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja [1].
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih [1].
== Viri ==
[1] T. C. Yu, W. L. Liu, M. S. Brinck, J. E. Davis, J. Shek, G. Bower, T. Einav, K. D. Insigne, R. Phillips, S. Kosuri, et al.: Multiplexed Characterization of Rationally Designed Promoter Architectures Deconstructs Combinatorial Logic for IPTG-Inducible Systems. Nat. Commun. 2021, 12, 1–14.

[2] T. Ashuach, D. S. Fischer, A. Kreimer, N. Ahituv, F. J. Theis, N. Yosef: MPRAnalyze: Statistical Framework for Massively Parallel Reporter Assays. Genome Biol. 2019, 20, 183.

[3] S. Johnson, M. Lindén, R. Phillips: Sequence Dependence of Transcription Factor-Mediated DNA Looping. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 7728–7738.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T08:46:59Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje [1].
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij [2].
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Kadar je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov. Izračunamo in izmerimo lahko kako je zanka odvisna od 4 ključnih bioloških parametrov: moči in koncentracije transkripcijskih faktorjev (TF) in od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA ter zaporedja DNA zanke [3].
Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu [3].

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov [1].

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran [1].
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto [1].

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic [1].

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja [1].
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja [1].
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja [1].
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih [1].
== Viri ==
[1] T. C. Yu, W. L. Liu, M. S. Brinck, J. E. Davis, J. Shek, G. Bower, T. Einav, K. D. Insigne, R. Phillips, S. Kosuri, et al.: Multiplexed Characterization of Rationally Designed Promoter Architectures Deconstructs Combinatorial Logic for IPTG-Inducible Systems. Nat. Commun. 2021, 12, 1–14.

[2] T. Ashuach, D. S. Fischer, A. Kreimer, N. Ahituv, F. J. Theis, N. Yosef: MPRAnalyze: Statistical Framework for Massively Parallel Reporter Assays. Genome Biol. 2019, 20, 183.

[3] S. Johnson, M. Lindén, R. Phillips: Sequence Dependence of Transcription Factor-Mediated DNA Looping. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 7728–7738.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T08:45:01Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje [1].
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij [2].
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Kadar je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov. Izračunamo in izmerimo lahko kako je zanka odvisna od 4 ključnih bioloških parametrov: moči in koncentracije transkripcijskih faktorjev (TF) in od dolžine ter zaporedja DNA zanke [3].

Študije so pokazale, da je nastanek represijskih zank odvisen od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA. Od razdalje je odvisna zmožnost nastanka represijske zanke. Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu [3].

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov [1].

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran [1].
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto [1].

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic [1].

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja [1].
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja [1].
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja [1].
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih [1].
== Viri ==
[1] T. C. Yu, W. L. Liu, M. S. Brinck, J. E. Davis, J. Shek, G. Bower, T. Einav, K. D. Insigne, R. Phillips, S. Kosuri, et al.: Multiplexed Characterization of Rationally Designed Promoter Architectures Deconstructs Combinatorial Logic for IPTG-Inducible Systems. Nat. Commun. 2021, 12, 1–14.

[2] T. Ashuach, D. S. Fischer, A. Kreimer, N. Ahituv, F. J. Theis, N. Yosef: MPRAnalyze: Statistical Framework for Massively Parallel Reporter Assays. Genome Biol. 2019, 20, 183.

[3] S. Johnson, M. Lindén, R. Phillips: Sequence Dependence of Transcription Factor-Mediated DNA Looping. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 7728–7738.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T08:41:49Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje [1].
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij [2].
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Kadar je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov. Izračunamo in izmerimo lahko kako zanka odvisna od 4 ključnih bioloških parametrov: moči in koncentracije transkripcijskih faktorjev (TF) in od dolžine ter zaporedja DNA zanke [3].

Študije so pokazale, da je nastanek represijskih zank odvisen od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA. Od razdalje je odvisna zmožnost nastanka represijske zanke. Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu [3].

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov [1].

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran [1].
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto [1].

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic [1].

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja [1].
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja [1].
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja [1].
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih [1].
== Viri ==
[1] T. C. Yu, W. L. Liu, M. S. Brinck, J. E. Davis, J. Shek, G. Bower, T. Einav, K. D. Insigne, R. Phillips, S. Kosuri, et al.: Multiplexed Characterization of Rationally Designed Promoter Architectures Deconstructs Combinatorial Logic for IPTG-Inducible Systems. Nat. Commun. 2021, 12, 1–14.

[2] T. Ashuach, D. S. Fischer, A. Kreimer, N. Ahituv, F. J. Theis, N. Yosef: MPRAnalyze: Statistical Framework for Massively Parallel Reporter Assays. Genome Biol. 2019, 20, 183.

[3] S. Johnson, M. Lindén, R. Phillips: Sequence Dependence of Transcription Factor-Mediated DNA Looping. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 7728–7738.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T08:40:53Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje [1].
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij [2].
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Kadar je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov. . Izračunamo in izmerimo lahko kako zanka odvisna od 4 ključnih bioloških parametrov: moči in koncentracije transkripcijskih faktorjev (TF) in od dolžine ter zaporedja DNA zanke [3].

Študije so pokazale, da je nastanek represijskih zank odvisen od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA. Od razdalje je odvisna zmožnost nastanka represijske zanke. Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu [3].

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov [1].

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran [1].
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto [1].

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic [1].

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja [1].
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja [1].
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja [1].
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih [1].
== Viri ==
[1] T. C. Yu, W. L. Liu, M. S. Brinck, J. E. Davis, J. Shek, G. Bower, T. Einav, K. D. Insigne, R. Phillips, S. Kosuri, et al.: Multiplexed Characterization of Rationally Designed Promoter Architectures Deconstructs Combinatorial Logic for IPTG-Inducible Systems. Nat. Commun. 2021, 12, 1–14.

[2] T. Ashuach, D. S. Fischer, A. Kreimer, N. Ahituv, F. J. Theis, N. Yosef: MPRAnalyze: Statistical Framework for Massively Parallel Reporter Assays. Genome Biol. 2019, 20, 183.

[3] S. Johnson, M. Lindén, R. Phillips: Sequence Dependence of Transcription Factor-Mediated DNA Looping. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 7728–7738.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T06:43:36Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje [1].
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij. Ta pristop nam omogoča merjenje tisočih sintetičnih zaporedij v enem eksperimentu [2].
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Ko je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov. . Izračunamo in izmerimo lahko kako zanka odvisna od 4 ključnih bioloških parametrov: moči in koncentracije transkripcijskih faktorjev (TF) in od dolžine ter zaporedja DNA zanke [3].

Študije so pokazale, da je nastanek represijskih zank odvisen od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA. Od razdalje je odvisna zmožnost nastanka represijske zanke. Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu [3].

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov [1].

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran [1].
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto [1].

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic [1].

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja [1].
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja [1].
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja [1].
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih [1].
== Viri ==
[1] T. C. Yu, W. L. Liu, M. S. Brinck, J. E. Davis, J. Shek, G. Bower, T. Einav, K. D. Insigne, R. Phillips, S. Kosuri, et al.: Multiplexed Characterization of Rationally Designed Promoter Architectures Deconstructs Combinatorial Logic for IPTG-Inducible Systems. Nat. Commun. 2021, 12, 1–14.

[2] T. Ashuach, D. S. Fischer, A. Kreimer, N. Ahituv, F. J. Theis, N. Yosef: MPRAnalyze: Statistical Framework for Massively Parallel Reporter Assays. Genome Biol. 2019, 20, 183.

[3] S. Johnson, M. Lindén, R. Phillips: Sequence Dependence of Transcription Factor-Mediated DNA Looping. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 7728–7738.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T06:43:12Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje [1].
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij. Ta pristop nam omogoča merjenje tisočih sintetičnih zaporedij v enem eksperimentu [2].
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Ko je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov. . Izračunamo in izmerimo lahko kako zanka odvisna od 4 ključnih bioloških parametrov: moči in koncentracije transkripcijskih faktorjev (TF) in od dolžine ter zaporedja DNA zanke [3].

Študije so pokazale, da je nastanek represijskih zank odvisen od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA. Od razdalje je odvisna zmožnost nastanka represijske zanke. Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu [3].

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov [1].

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran [1].
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto [1].

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic [1].

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja [1].
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja [1].
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja [1].
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih [1].
== Viri ==
[1] T. C. Yu, W. L. Liu, M. S. Brinck, J. E. Davis, J. Shek, G. Bower, T. Einav, K. D. Insigne, R. Phillips, S. Kosuri, et al.: Multiplexed Characterization of Rationally Designed Promoter Architectures Deconstructs Combinatorial Logic for IPTG-Inducible Systems. Nat. Commun. 2021, 12, 1–14.
[2] T. Ashuach, D. S. Fischer, A. Kreimer, N. Ahituv, F. J. Theis, N. Yosef: MPRAnalyze: Statistical Framework for Massively Parallel Reporter Assays. Genome Biol. 2019, 20, 183.
[3] S. Johnson, M. Lindén, R. Phillips: Sequence Dependence of Transcription Factor-Mediated DNA Looping. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 7728–7738.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T06:21:35Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje.
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij. Ta pristop nam omogoča merjenje tisočih sintetičnih zaporedij v enem eksperimentu, pri čemer pogosto uporabimo črtne kode kot odčitke.
S pomočjo MPRA so lahko racionalno izbrali več tisoč dizajniranih različic lacZYA promotorjev.
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Ko je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov.

Študije so pokazale, da je nastanek represijskih zank odvisen od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA. Od razdalje je odvisna zmožnost nastanka represijske zanke. Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu.

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov.

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran.
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto. Zbrali so meritve 1493 različic znotraj te knjižnice (93.3%).

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic.

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja.
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja.
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja.
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T06:20:38Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje.
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij. Ta pristop nam omogoča merjenje tisočih sintetičnih zaporedij v enem eksperimentu, pri čemer pogosto uporabimo črtne kode kot odčitke.
S pomočjo MPRA so lahko racionalno izbrali več tisoč dizajniranih različic lacZYA promotorjev.
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Ko je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov.
Študije so pokazale, da je nastanek represijskih zank odvisen od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA. Od razdalje je odvisna zmožnost nastanka represijske zanke. Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu.
Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov.
Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran.
== Uravnavanje moči vezavnih mest ==
Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto. Zbrali so meritve 1493 različic znotraj te knjižnice (93.3%).

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic.

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja.
== Dodatna operatorska mesta ==
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja.
== Validacija ==
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja.
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T06:12:14Z

Urška Zagorc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3]
== Uvod ==
Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje.
== Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov ==
Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan.
Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij. Ta pristop nam omogoča merjenje tisočih sintetičnih zaporedij v enem eksperimentu, pri čemer pogosto uporabimo črtne kode kot odčitke.
S pomočjo MPRA so lahko racionalno izbrali več tisoč dizajniranih različic lacZYA promotorjev.
== Preučevanje lacZYA promotorja ==
lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Ko je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Ko sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov.
Študije so pokazale, da je nastanek represijskih zank odvisen od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA. Od razdalje je odvisna zmožnost nastanka represijske zanke. Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu.
Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov.
Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalne mesta.
Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran. Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto. Zbrali so meritve 1493 različic znotraj te knjižnice (93.3%).
Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic.
Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja.
Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja.
Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja.
== Zaključek ==
Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom.
Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih.

Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

2021-05-02T06:06:04Z

Urška Zagorc: New page: ''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-020-20094-3 Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectu...

Seminarji SB 2020/21

2021-05-02T05:53:23Z

Urška Zagorc:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
8 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
9 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

BNT-seminar

2021-03-08T17:58:52Z

Urška Zagorc: /* Bionanotehnologija 2021- seminar */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2017-11-17T22:24:37Z

Urška Zagorc: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2017 stran]

=== Luka Gregorič: Pozitivne vloge negativnih regulatorjev ===

Pri preučevanju regulacije sistemov v celici, so negativni regulatorji bolj temen, neraziskan del celotnega procesa, čeprav enako pomemben. Brez njih se lahko v celici začenja nenadzorovano deljenje in posledično rakavost tkiva, ali pa se nam poveča možnost hujšega obolenja. V živčnem sistemu lahko brez GPR-jev poteče prekomerna mielinizacija aksonov, ki pomenijo veliko zmanjšanje vseh kognitivnih sposobnosti organizma in posledično tudi manjšo zmožnost prilagajanja. V mišičnem tkivu, pa lahko pomanjkanje ali slabše delovanje negativnih regulatorjev naredi tkiva manj eksplozivna in povzroči hitrejše staranje, zaradi razlik med tkivi tipa 1 in tipa 2. V najhujšem primeru pa nam pomanjkanje negativnih regulatorjev celo povzroči mišično atofijo, medtem ko nam bi boljše poznavanje prav njih lahko omogočilo, da obdržimo mlade mišice čez celo življenje. Hitrost celotnega delovanja negativnih regulatorjev pa ni odvisna od moči signala, saj signal v zelo majhnem času lahko spravijo na prvotno raven, ne glede na to, kdaj se je ta signal začel. Visoka odzivnost signalov pa tudi pomaga telesu, ko se rabi hitro odzvati na različne dražljaje. Najhitrejše to naredi tako, da je signal vedno aktiviran in se izklopi le ob primeru, da se je potrebno hitro odzvati.

=== Ines Medved: Vohalni receptorji v epidermisu ===
Primarna vloga vohalnih receptorjev je zaznava vonja, ki je zelo pomembna. Poleg zaznave vonja pa imajo receptorji za vonj tudi druge funkcije. Ti receptorji se nahajajo v tkivih, ki niso povezana z vohalno nalogo. Nahajajo se skoraj po celotnem telesu npr. v ledvicah, možganih, srcu, koži, v krvi … V epidermisu so našli dva takšna receptorja, in sicer receptorja OR2AT4 in OR51E2. Kljub podobnemu mehanizmu delovanja se po funkciji zelo razlikujeta. OR2AT4 ob stimulaciji z agonistom poveča celično proliferacijo, vpliva na migracijo celic in sodeluje pri reepitalizaciji v procesu celjenja ran. Ugotovili so, da sodeluje tudi pri zaprtju rane. Za razliko od OR2AT4 receptor OR51E2 zmanjša celično proliferacijo, sodeluje pa v melanogenezi, dendritogenezi in pri celični diferenciaciji. Vohalni receptor OR51E2 ima vlogo tudi v rakavih celicah prostate. Receptorja sta zelo specifična. Vohalni receptor OR2AT4 stimulira le sandanol in brahmanol, OR51E2 pa β-ionon. Za oba receptorja so našli tudi antagoniste, ki blokirajo Ca2+ signal. Za OR2AT4 so odkrili dva antagonista oksifenilon in fenirat, za receptor OR51E2 pa α-ionon. Kljub podobni lokaciji in mehanizmom se receptorja zelo razlikujeta. Medtem ko bi se OR2AT4 lahko uporabljal pri zdravljenju oziroma celjenju rane, bi bil lahko receptor OR51E2 potencialni pokazatelj za rakave celice.

===Daria Latysheva: The role of intrinsically disordered proteins in signalling pathways and regulation ===

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins, which do not have a defined three – dimensional structure, yet are completely functional. Found mostly in eukaryotic cells, they play an important role in biosignalling and regulation of a cell. Undergoing coupled folding and binding, IDPs’ recognition elements are cable of taking over the structures of different targets. Since IDPs have multiple interaction motifs, they often serve as signalling centres, thus contributing to the dynamic assembly of complex molecules and varied signalling pathways. Undergoing post – translational modifications, these proteins also add complexity to the regulatory networks and can change the original output of the crosswalk. IDPs are also an important component of higher - order signalling assemblies, enabling the formation of reversible complexes. Being an attractive field of the research, IDPs were not yet studied completely and there is still much to be understood about the structure, functions and the location of IDPs in the cell. Experimental and computational techniques are being developed to identify and characterise disordered regions in proteins in order to emphasize the prevalent role of IDPs in cellular signalling and regulation.

===Polona Skrt: Mehanizem zaznavanja okusa maščobe ===

Okus je pomembna zaznavna zmožnost, saj nas usmerja pri uživanju hranilne in prebavljive hrane ter nas ščiti pred strupi in ostalimi nevarnimi snovmi. Čutne celice se nahajajo v brbončicah v ustni votlini, na jeziku in v grlu. V brbončicah se nahaja okoli 100 celic, ki jih delimo v 3 skupine. Prvi tip so celice podobne glia celicam, ki se ovijejo okoli ostalih celic in jim nudijo oporo ter preprečujejo nekontrolirano širjenje živčnih prenašalcev. Naslednji tip so t.i. receptorske celice, ki zaznavajo sladko, grenko in umami ter sproščajo nevrotransmiterje, ki signal prenesejo do živčevja. Tretji tip celic so predsinaptične celice, ki se odzivajo predvsem na kisel okus. Njihova posebnost je, da se prek sinaps direktno povezujejo z živčnim vlakni. Pri signalizaciji okusov so zelo pomembni z G-proteini povezani receptorji, ki omogočajo zaznavanje sladkega, grenkega in umami okusa ter ionski kanalčki, ki prenašajo informacijo o kislem in slanem okusu. Ne dolgo nazaj so znanstveniki, k prej omenjenim petim osnovnim okusom, dodali še šestega – okus po maščobi. Signalizacija najverjetneje poteka preko receptorja CD36, možni pa so še GPR120 in GPR40 ter DRK kanalčki. Mehanizem je še dokaj neraziskan, predpostavljajo pa sodelovanje med več receptorji.

===Peter Škrinjar: Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo ===

Okus je eden izmed petih osnovnih čutov, katerega naloga je prepoznavanje hranil in preprečevanje vnosa telesu nevarnih snovi. Pri tem mu pomagajo receptorji za okus. Te se razlikujejo za vseh pet osnovnih okusov – grenko, sladko in umami zaznamo s pomočjo GPCR-jev, slano in kislo pa s pomočjo ionskih kanalčkov. Raziskave še potekajo glede receptorjev za maščobnokislinski okus. Poleg receptorjev v ustih pa poznamo tudi receptorje za okus v prebavni cevi. Tam so te pomembni predvsem v enteroendokrinih celicah, kjer ob prisotnosti različnih ligandov sprožijo izločanje različnih peptidnih hormonov (GLP-1, CCK, PYY itd.). Te nato stimulirajo vagusni živec, ki prenese informacijo do možganov, ki se primerno odzovejo (npr. ob prisotnosti sladkorjev se v prebavni cevi izloča GLP-1, ki sproži izločanje inzulina iz trebušne slinavke). Receptorje za okus lahko povežemo tudi z debelostjo. Genetske razlike pri receptorjih za maščobnokislinski okus (predvsem CD36, ki je najbolj raziskan) lahko povzročijo slabše zaznavanje maščobnih kislin, kar bi nato vodilo do debelosti. To povezavo je sicer potrebno še dokazati. Podobno bi lahko predvidevali za maščobnokislinske receptorje v prebavnem traktu. Kot alternativa za zdravljenje debelosti se je pojavila hipoteza o zdravljenju preko receptorjev za okus na adipocitah brez α-gustducina, na katere imajo grenke komponente inhibicijski učinek.

===Milica Janković: Jedrni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov===

Jedrni receptorji so proteini prisotni v celicah, ki prenašajo signale svojih ligandov. Naddružino jedrnih receptorjev sestavlja 48 transkripcijskih faktorjev (pri ljudeh). Aktivirajo se po vezavi liganda in vključujejo receptorje za steroidne hormone, lipofilne vitamine, ščitnične hormone in retinoinsko kislino. Receptor- ligandni kompleks se veže na specifično področje na DNA, katero imenujemo hormonski responsni element (HRE). Jedrni receptorji so transkripcijski faktorji, ker delujejo direktno v jedru in spreminjajo ekspresijo genov ter na ta način vplivajo na razvoj, diferencijacijo in homeostazo in metabolizem. Obstajajo štirje tipi nuklearnih receptorjev, ki se razlikujejo po signalnih poteh.Zavzemajo tudi različne konformacije, ki so povzročene z vezavo agonista, oziroma antagonista. Morda najbolj revolucionarna ugotovitev, je bilo presenetljivo odkritje, da obstajajo številni receptorji, kateri so povezani na majhne molekulske ligande. Ker ti ligandi niso znani, receptorji so poimenovani siroti (orphans) receptorji. Vprašanje je bilo, kako bi lahko prišli do odkritja tistih ligandov? Vsi jedrni receptorji imajo podobno strukturo, na podlagi česa je bilo lahko narediti vrsto testov za identifikacijo ligandov.
Ker se pa vežejo na majhne molekule, predstavljajo zanimive terapevtske cilje. Bi bili bogat vir za razvoj sintetičnih majhnih molekul kot ligandov.

===Tina Turel: Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze===

V biomedicini je v zadnjih letih prišlo do odkritja, da črevesna mikroflora sodeluje v različnih metabolnih procesih. Mikroorganizmi v črevesju komunicirajo z gostiteljem preko TLR-jev. TLR so receptorji v prirojenem imunskem sistemu, ki zaznajo določeno patogeno zaporedje in aktivirajo imunski odziv oziroma omogočajo komunikacijo med črevesno mikrofloro in gostiteljem. Prav tako pa lahko TLR-ji pa omogočijo, da v različnih metabolnih procesih lahko sodelujejo tudi mikroorganizmi. V študiji so se znanstveniki usmerili v določitev vseh členov, ki vplivajo na presnovo glukoze. Presnova glukoze je univerzalni postopek, ki je prisoten v vseh vretenčarjih in tudi v nekaterih nevretenčarjih. Študija je odkrila manjkajočo povezavo med IFNɣ in presnovo glukoze in sicer A. muciniphilo, ključni mikroorganizem, ki je odgovoren za izboljšanje tolerance na glukozo. Potrdili so, da bakterija lahko izboljša toleranco glukoze v različnih gostiteljih. Irgm1 so določili kot glavnega posrednik med IFNɣ in A. muciniphilo. Dejstvo je, da je A. muciniphila prisotna tudi v človeški mikroflori, zato so znanstveniki opravili poskuse tudi na prostovoljcih. Izkazalo se je, da je postopek in pa vpliv določenih komponent na presnovo in toleranco glukoze enak kot pri miših. Raziskava pa ponuja novo pot v zdravljenju metabolnih bolezni in sicer reguliranje ravni A. muciniphile.

===Ana Maklin: Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu===

PGP in njegov ortolog PHO13 v kvasovkah sta bila predmet številnih raziskav. Njune funkcije so zelo raznolike, jasno pa je, da s svojo fosfatazno aktivnostjo ter drugimi lastnostmi pomembno vplivata tudi na metabolizem. Zaradi stranske aktivnosti nekaterih encimov v metabolnih procesi, nastajajo tudi produkti, ki lahko ovirajo normalno delovanje celic. Evolucijsko gledano, so organizmi torej morali ustvariti popravljalni sistem, ki prepreči nadaljnje posledice teh napak. Naloga PGP in PHO13 je, da s svojo aktivnostjo pretvorita neželjene produkte, ki nastajajo zaradi stranske aktivnosti encimov, v druge, ki niso škodljivi. V metabolizmu glukoze, zaradi stranske aktivnosti gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze in piruvat kinaze nastajata 4-fosfoeritronat in 2-fosfolaktat. Prvi je inhibitor 6-fosfoglukonat dehidrogenaze, drugi pa fosfofruktokinaze-1. Inhibicija teh dveh encimov bi brez PGP in PHO13 povzročila moteno glikolizo in pentoza fosftno pot. PHO13 oziroma njegova odsotno v celicah ima pomembo vlogo tudi pri pretvorbi rastlinske biomase v etanol. Ker uporaba etanola iz biomase kot vir obnovljive energije postaja vedno bolj razširjena, je PHO13 postal pomemben predmet za napredek v metabolnem inženirstvu. Deaktivacija PHO13 v kvasovkah z izraženimi XR/XDH/XK namreč preprečuje defosforilacijo ksiluloze 5-fosfata, kar omogoča nadaljevanje metabolnih procesov potrebnih za nastanek etanola, izboljša toleranco na običajne inhibitorje fermentacije (šibke kisline, produkti razgradnje sladkorjev) ter povzroči pospešeno transkripcijo genov, vključenih v pentozo fosfatno pot (naprimer TAL1,ki kodira protein transaldolazo, enega ključnih encimov pri neoksidativni pentoza fosfatni poti).

===Barbara Slapnik: Regulacija metabolizma glukoze v sesalskih celičnih kulturah===

Regulacija metabolizma glukoze je iz vidika celičnih kultur zelo pomembna, saj vpliva na celično rast in produktivnost celic. Boljše poznavanje regulacije metabolizma nam omogoča njegovo kontroliranje in s tem možnost za povečanje produktivnosti celic v celičnih kulturah. Regulacija metabolizma glukoze v celici poteka v več stopnjah. Pretok omejujejo intermediati, ki vstopajo še v druge metabolne poti. Zelo pomembna stopnja je regulacija z encimi. Glavni encimi, ki regulirajo glikolizo so heksokinaza, fosfofruktokinaza in piruvat kinaza. Poznamo več izooblik encimov, ki se razlikujejo po delovanju in afiniteti do substratov. Regulacija metabolizma glukoze poteka tudi na nivoju celične signalizacije. Protein kinaza B, ki ga imenujemo tudi Akt je odvisen od prisotnosti inzulina. Akt vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje heksokinaze ter fosfofruktokinaze. AMP kinaza je ključna za aktivacijo katabolnih poti in inhibicijo anabolnih poti. c-Myc je transkripcijski faktor, ki vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje fosfofruktokinaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, fosfoglicerat kinaze in enolaze. p53 je transkripcijski faktor, ki zmanjša transkripcijo glukoznega prenašalca 1 in 3 ter aktivnost fosfoglicerat mutaze. Razumevanje regulacije metabolizma glukoze nam omogoča boljšo celično rast v bioreaktorjih.

===Urban Hribar: Metabolizem polariziranih makrofagov===

Makrofagi lahko spremenijo svoje delovanje kot odziv na zunanje dejavnike za opravljanje različnih nalog. Temu procesu pravimo aktivacija oziroma polarizacija makrofagov. Makrofagi se lahko palarizirajo v makrofage tipa M1 (klasično aktivirani) in tipa M2 (alternativno aktivirani). Makrofagi M1 so pomembni v boju proti okužbam mikrobov in so znani kot makrofagi, ki promovirajo vnetja. Proizvajajo tudi dušikov oksid (NO) in vnetostne citokinine. Na dolgi rok lahko makrofagi M1 in njihovi produkti škodujejo tkivu lastnega oganizma. Zato makrofagi tipa M2 zavirajo vnetja in so odgovorni za popravilo tkiva. Pri funkcijah teh makrofagov imajo pomembno vlogo tudi spremenjeni metabolizmi polariziranih makrofagov. Makrofagi M1 imajo pospešeno delovanje glikolize ter zmanjšano aktivnost oksidativne fosforilacije. Z pospešeno glikolizo ter laktatno fermentacijo makrofagi proizvajajo večino svojih zalog ATP. Poleg tega ima tudi prekinjen krebsov cikel na dveh mestih. Prvo mesto je pri reakciji izocitrata v alfa-ketoglutarat, drugo mesto pa pri reakciji sukcinata v fumarat. Prekinitve v ciklu vodijo do kopičenja intermediatov, ki pa se uporabljajo za sintezo NO, prostgladinov in vnetnosnih citokinov. Hkrati je krebsov cikel makrofagov M1 povezan z ciklom sečnine, ki lahko proizvaja NO. Posebnost makrofagov M1 je tudi da v mitohondrijih proizvajajo povečane količine reaktivnih kisikovih zvrst (ROS). Te se tudi uporabljajo za boj proti bakterijam in proizvodnjo vnetnostnih citokinov.

===Urška Zagorc: Salmonela in citratni cikel===

Zastrupitev z bakterijo salmonelo spada med najpogostejše zastrupitve s hrano. Bakterija lahko živi v različnih okoljih, saj zna zelo dobro prilagoditi svoj metabolizem in se hkrati tudi izmakniti naravnemu imunskemu sistemu. Za to poskrbijo številni encimi citratnega cikla v salmoneli. Encimi akonitaza, izocitrat dehidrogenaza in izocitrat liaza inhibirajo delovanje inflamasoma NLRP3. Inflamasom je receptor imunskega sistema in aktivira kaspaze, ki vodijo v celično smrt. Z inhibiranim delovanjem teh inflamasomov posledično ne pride do celične smrti škodljivih celic. Tudi citrat in citratni cikel imata pri ohranjanju bakterije salmonele svojo vlogo. Citrat, na primer, je povezan v kompleks z železom. Ob izpostavljenosti dušikovemu oksidu, ki ima velik vpliv na celoten ogljikov metabolizem, se citrat porablja. Zmanjša se količina železa v celici, ki je bila prej v ravnotežju, hkrati pa se zmanjša tudi rast salmonele. Citratni cikel pa ni edini način, ki ga uporablja bakterija salmonela za svoje preživetje. Razvila je namreč mnogo poti, po katerih se lahko izogne oviram gostitelja. Ta se poleg inflamasomov bori s salmoneli strupenimi snovmi, kot je dušikov oksid, a tudi za to je bakterija že našla rešitev.

BIO2 Seminar 2017

2017-11-08T15:59:43Z

Urška Zagorc: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Ines Medved || 12 || Receptorji za vonj v epidermisu || Špela Supej || Lea Knez || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Luka Gregorič || 12 || Pozitivne vloge negativnih regulatorjev || Uroš Prešern || Katja Doberšek || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Daria Latysheva || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Daria_Latysheva:_The_role_of_intrinsically_disordered_proteins_in_signalling_pathways_and_regulation The role of intrinsically disordered proteins in signallng pathways and regulation] || Luka Fratina || Martin Špendl || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Polona Skrt || 12 || Mehanizem zaznavanja okusa maščobe || Andreja Habič || Ajda Galič || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Peter Škrinjar || 12 || Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo || Andrej Race || Nika Zaveršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Milica Janković || 12 || Nuklearni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov || Anže Jenko || Nika Goršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Tina Turel || 14-15 || Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze || Ines Medved || Špela Supej || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Barbara Slapnik || 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze v celičnih kulturah|| Luka Gregorič || Uroš Prešern || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ana Maklin || 14-15 || || Daria Latysheva || Luka Fratina || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ajda Krč || 16 || || Polona Skrt || Andreja Habič || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urban Hribar || 16 || Citratni cikel v makrofagih || Peter Škrinjar || Andrej Race || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urška Zagorc || 16 || Salmonela in citratni cikel || Milica Janković || Anže Jenko || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Patrik Levačić || 17 || Transport maščobnih kislin v mitohondrij prek L-karnitina || Tina Turel || Ines Medved || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Jerneja Nimac || 17 || || Barbara Slapnik || Luka Gregorič || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Lija Srnovršnik || 17 || || Ana Maklin || Daria Latysheva || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Nika Mikulič || 18 || || Ajda Krč || Polona Skrt || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Tanja Zupan || 18 || || Urban Hribar || Peter Škrinjar || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Anja Tavčar || 18 || || Urška Zagorc || Milica Janković || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Maja Vrabec || 19 || || Patrik Levačić || Tina Turel || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Špela Deučman || 19 || || Jerneja Nimac || Barbara Slapnik || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Anja Černe || 19 || || Lija Srnovršnik || Ana Maklin || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Lea Knez || 20 || || Nika Mikulič || Ajda Krč || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Katja Doberšek || 20 || || Tanja Zupan || Urban Hribar || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Martin Špendl || 20 || || Anja Tavčar || Urška Zagorc || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Ajda Galič || 21 || || Maja Vrabec || Patrik Levačić || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Zaveršek || 21 || || Špela Deučman || Jerneja Nimac || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Goršek || 21 || || Anja Černe || Lija Srnovršnik || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Špela Supej || 22 || || Lea Knez || Nika Mikulič || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Uroš Prešern || 22 || || Katja Doberšek || Tanja Zupan || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Luka Fratina || 22 || || Martin Špendl || Anja Tavčar || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Andreja Habič || 23 || || Ajda Galič || Maja Vrabec || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Andrej Race || 23 || || Nika Zaveršek || Špela Deučman || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Anže Jenko || 23 || || Nika Goršek || Anja Černe || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Katja Dolenc || 23 || || ? || ? || 20/01/17 || 22/01/17 || 24/01/17
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2017-03-12T11:13:47Z

Urška Zagorc: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Patrik Levaćić: Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionanlnost in strukturo prebavnih celic'''

Vnos nano delcev titanovega dioksida (TiO2) preko prehrambenih izdelkov kot so sladkarije ter žvečilni gumiji je praktično nemogoče. Prebavni trakt služi kot pomembna meja med telesom in zunanjim okoljem. Cilj raziskave je bilo opazovanje posledic vnosa 30 nano meterskih delcev titanovega dioksida preko modela celične strukture tankega črevesja ter določitev kako akutna ter kronična izpostavljenost takim delcem lahko vpliva na funkcionalnost in strukturo celice. Postopek prepoznavanja TiO2 delcev je zelo kompleksen, navadno se uporablja Ramanova spektroskopija, ki izkorišča lastnosti molekule kot so vibracijska ter rotacijska stanja, s tem pa dobimo tako imenovani ''finger-print'' molekule, saj ima vsaka molekula svoje lastnosti in se po njih loči od drugih molekul. Rezultati raziskave so potrdili, da čeprav akutna izpostavljenost ni pustila resnejših posledic na celični strukturi, ima kronična izpostavljenost kar nekaj posledic na celičnem nivoju. Spremeni se funkcionalnost celice, nivo delovanja membranskih encimov vpade, spremeni se prav tako tudi struktura, saj se zmanjša sposobnost vsrkavanja nutrientov preko mikrovilov.

'''Tina Turel: Povezanost retrovirusov z razvojem možganov'''

Možgani človeka so bistveno bolj razviti od možganov drugih sesalcev in zato veliko težji za raziskovanje in razumevanje. Številne raziskave so dokazale, da bi transportni elementi (TE-ji), ki so še pred nekaj leti veljali za neuporaben del DNA, tako imenovan »junk DNK«, lahko bili odgovorni za današnjo stopnjo razvitosti človeških možganov.
Retrovirusi so posebna skupina virusov. Nekateri veljajo za škodljive (HIV), drugi pa so povsem neškodljivi. V našem DNA je več kot 1000 različnih retrovirusov. V raziskavi, ki jo je vodil Johan Jakobsson in se je odvijala v Lundu, so dokazovali pomembno vlogo ERV-ja, endogenega retrovirusa v razvoju človeških možganov. Želeli so pokazati, da nekaj tisoč ERV-jev, mnogi so primarno specifični, delujejo kot priklopna podlaga za epigenetske represorsko beljakovino TRIM28, ki vzpostavi lokalni hetero kromatin okoli ERV-jev. Retrovirusi lahko pri vsakem človeku reagirajo drugače, saj so tak tip genetskega materiala, da se lahko nahajajo v katerem koli delu v genomu. Različna izražanja ERV-ja pa bi bila lahko tudi razlog za možganske okvare, ki povzročijo bolezni, kot so ALS, shizofrenija in bipolarna motnja .

'''Nina Mezgec Mrzlikar: Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo'''

Shizofrenija je duševna motnja, ki se razvije v zgodnjem odraslem obdobju. DISC-1 (Disrupted-In-Schizophrenia-1) je protein, kodiran z genom DISC-1 in je močno izražen v možganskem hipokampusu. Sodeluje pri razvoju aksonov in povezovanju celic. Caveolin-1 je ogrodni protein bistven pri regulaciji receptorjev na membranah in spodbuja razvoj novih povezav med živčnimi celicami. V tej raziskavi so znanstveniki proučevali vpliv proteina Cav-1 na izražanje gena DISC-1 v živčnih celicah. Ugotovljeno je bilo, da prekomerno izražen gen Cav-1 povzroči večje izražanje gena DISC-1 in drugih sinaptičnih proteinov, ki so potrebni za prenos živčnega signala. V miših, katerim so iz hipokampusa odstranili Cav-1 je posledično prišlo do manjšega izražanja DISC-1 in hkrati drugih sinaptičnih proteinov. Izguba Cav-1 torej zmanjšuje aktivnost sinaps, kar pa je vzrok za številne nevrodegenerativne bolezni, kot je tudi shizofrenija. Ugotovitve kažejo na pomembno vlogo proteina Caveolin-1 v celicah, saj vzdržuje pravilno delovanje receptorjev in s tem prenos živčnega signala.

'''Sonja Gabrijelčič: Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami'''

Odpornost bakterij na antibiotike je v porastu po vsem svetu. Pojavlja se tako v državah v razvoju, kjer je predvsem posledica nekvalitetnih antibiotikov, kot v najrazvitejših državah sveta, kjer se pojavlja več in več patogenov, ki lahko preživijo v okolju z več zdravilnimi učinkovinami oziroma antibiotiki. Bakterije lahko pridobijo odpornost ali z izmenjavo mobilnih genetskih elementov ali z mutacijo genetskega materiala, ki je že v celici. V raziskavi, ki jo opisuje članek, so raziskovalci želeli opazovati slednje, zato so izmed bakterij, ki so lahko sočasno odporne na več antibiotikov, izbrali Mycobacterium smegmatis, sorodnico bakterije, ki povzroča tuberkulozo, in eno od predstavnic skupine bakterij, pri kateri do izmenjevanja plazmidov praktično ne pride. Klasificirali so tipe mutacij, do katerih je prišlo, in se osredotočili predvsem na mutacije, ki so se zgodile na mestih genoma, kjer se kodirajo proteini, ki so sestavni deli ribosomov. Ugotovili so, da so taki mutanti odporni na antibiotike z različnimi mehanizmi delovanja, ki jim niso bili še nikoli izpostavljeni, na antibiotike širokega spektra in poleg tega tudi na nekatere druge mehanske strese na membrane.

'''Daria Latysheva: Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic'''

Mehansko aktivni kanalčki so membranski proteini, ki so neposredno odvisni od sile in pretvarjajo mehanske držljaje v električne oz. biokemijske signale. Piezo1 je mehansko aktiven ionski kanalček, ki spodbuja celično smrt v predelih z visoko gostoto celic. V raziskavi so ugotovili, da kotrolira tudi mitotsko delitev. Raziskali so mehanizem delovanja Piezo1 v procesu celične delitve. Pri nizki gostoti celic oz. kjer so celice raztegnjene se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter se odpre; posledično sproži influks kalcija v celico. ERK1 se aktivira zaradi povečane koncentracije Ca2+ ionov, kar vpliva na aktivnost ciklina B v G2 fazi mitotske delitve in povzroči proliferacijo. Način, na kateri Piezo1 aktivira dva nasprotna procesa je odvisen od lokacije in načina aktivacije kanalčka. V predelih z nizko gostoto celic se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter hitro aktivira celično delitev. Če so celice razporejene tesno druga ob drugi, se Piezo1 oblikuje v velike citiplazemske agregate in spodbuja celično smrt. Zaradi sposobnosti zaznave mehanskega raztezka ter prevelike in premajhne gostote celic Piezo 1 deluje kot homeostatski senzor in kontrolira število epitelijskih celic.

'''Nika Goršek: Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku'''

MRP1 ali »Multidrug resistance protein« je protein, ki spada v družino ABC-transporterjev. Pomemben je pri reguliranju redoks homeostaze, vnetij in sekrecije hormonov. Znano je tudi, da ima pomembno vlogo pri odpornosti na zdravila in njihovem črpanju iz celic. V raziskavi na univerzi Rockefeller so z uporabo elektronske kriomikroskopije določili njegovo zgradbo. Sestavljajo ga štirje glavni deli: dva transmembranska dela, ki tvorita telo transporterja, dva dela, ki vežeta ATP, motiv v obliki lase in N-terminalni transmembranski del. Čeprav ima MRP1 dva dela, ki bi lahko vezala ATP, pa tega veže le en, saj pri drugem delu pride do drugačnega zaporedja aminokislin. V raziskavah so dokazali, da mutacije določenih delov proteina vodijo v bolezenska stanja in da bi sprememba le ene aminokisline v zaporedju vplivala na aktivnost proteina. MRP1 ima le eno dvojno vezavno mesto, ki je pozitivno nabito. Pestrost substratov je zaradi takega vezavnega mesta veliko večja, kot pri nekaterih drugih znanih proteinih. Prenaša lahko organske, amfipatične in aninonske molekule, na primer zdravila proti raku, opijate, antidepresive in tudi nekatere za življenje pomembne snovi (hormoni in protivnetne molekule). Ob vezavi substrata se oblika proteina MRP1 spremeni, aktivnost pa se poveča. Po končanem transportu pa protein preide nazaj v prvotno, neaktivno obliko.

'''Dragana Savković: Stopnja preživetja evkariontskih celic po elektroforezni nanoinjekciji'''

Znotrajcelična dostava makromolekul je pomemben korak za terapevtske in raziskovalne namene. Za uvajanje tujih molekul v citoplazmo živih celic uporabljale so se metode, katere so se v večini primerov uporabljale za veliko število celic v kulturi in je splošno znano, da veliko število teh celic (do 50%) ne preživi ta proces. Da bi rešili ta problem, razvili so alternativno metodo znotrajcelične dobave, oziroma znotrajcelično elektroforezno nanoinjekcijo. V raziskavi so primerjali stopnjo preživetja celic injiciranih z pipeto s premerom 100 nm in pipeto s premerom 500 nm. Ugotovili so, da je stopnja preživetja z uporabo 100 nm pipeto veliko večja kot s 500 nm pipeto in tudi da ostale preživele celice kažejo bolj naraven cikel celic.

'''Urška Zagorc: Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1'''

Sladkorna bolezen tipa 1, ki je značilna predvsem za otroke in mladostnike, je posledica motnje v imunskem sistemu. Organizem uniči lastne celice v trebušni slinavki, ki proizvajajo inzulin. Ta omogoča glukozi iz hrane vstop v celico, s čimer celica dobi hrano in energijo. V raziskavi nemškega raziskovalnega centra za zdravje in okolje Helmholtz Zentrum München so sodelovali otroci, katerih ožji družinski član ima diabetes tipa 1 in otroci brez dednih dispozicij. Analizirali so krvne vzorce otrok z avto-protitelesi ter jih primerjala z vzorci otrok, ki ne kažejo znakov bolezni niti nimajo protiteles.Identificirali so 41 peptidov iz 26 proteinov, ki se razlikujejo v krvnih vzorcih tistih otrok s protitelesi in tistih brez. Glede na koncentracijo peptidov v treh proteinih (hepatocitni rastni faktor HGF, istem komplementa H in ceruloplazmin) in glede na starost otroka, so dosegli tudi boljšo oceno hitrosti razvoja bolezni. Večja koncentracija sistema komplementa H in hepatocitnega rastnega faktorja ter nižja koncentracija ceruloplazmina pri tem nižji starosti bolnika, pomenijo hitrejši napredek bolezni. Identificirani proteini nam pokažejo bolj natančno oceno stopnje pred pojavom simptomov. Zaradi njih je možno tudi ugotoviti ali ima bolnik s protitelesi, večjo ali manjšo možnost za razvoj sladkorne bolezni tipa 1 in kako hitro se bo bolezen razvila.

TBK2017-seminar

2017-03-07T17:30:48Z

Urška Zagorc: /* Temelji biokemije- seminar */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Presnova vodikovega peroksida in učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik ||Vloga holesterola v celici || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170117163039.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || S CRISPR/Cas9 nad x-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110734.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104154408.htm|| 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja sladkosti || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301084913.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || Nova tehnika za boljšo regeneracijo kostnega tkiva || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161220093946.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012518.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213083810.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017-seminar

2017-03-02T20:17:17Z

Urška Zagorc: /* Temelji biokemije- seminar */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo diabetesa tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Presnova vodikovega peroksida in učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik || || || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || || || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017-seminar

2017-03-02T20:14:23Z

Urška Zagorc: /* Temelji biokemije- seminar */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo diabetisa tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Presnova vodikovega peroksida in učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik || || || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || || || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.