Wiki FKKT - User contributions [en]

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T22:06:44Z

Uroš Prešeren:

''Povzeto po članku:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.9b00340 Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.]

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je predvsem posledica številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano obliko listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi porotvornimi toksini drugih grampozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev je bilo določeno, kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomih. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP-9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot podlaga za izvajanje sinteznobioloških logičnih vrat. V raziskavi so v ta namen pripravili vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore sta potrebni ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP-9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.'''
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP-9
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 72px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 na površino membrane pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se lahko odcepi z nje bodisi ob prisotnosti MMP-9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP-9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot na prisotnost MMP-9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenima Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele, ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere so značilni bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP-9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost tega sistema, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:30:59Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

''Povzeto po članku:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.9b00340 Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.]

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.'''
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 72px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Seminarji SB 2019/20

2020-04-30T13:25:36Z

Uroš Prešeren:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-30T13:24:40Z

Uroš Prešeren:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran
]Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:21:21Z

Uroš Prešeren:

''Povzeto po članku:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.9b00340 Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.]

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.'''
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 72px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:20:44Z

Uroš Prešeren:

''Povzeto po članku:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.9b00340 Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.]

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.'''
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 72px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:19:01Z

Uroš Prešeren:

Povzeto po članku: Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.'''
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 72px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:14:09Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.'''
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 72px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:13:47Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:12:28Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:02:55Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:02:24Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T13:01:03Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN, ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T12:59:38Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN, ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T12:55:14Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T12:54:17Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela logičnih vrat IN.
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T12:53:30Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela logičnih vrat IN.
! style="width: 80px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 80px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 80px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|}

V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T12:46:55Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela logičnih vrat IN.
! style="width: 80px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 80px; background: #6DA398;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 80px; background: #F3A2AD;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: lightgrey;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: lightgrey;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: lightgrey;border: 1px solid darkgray" |'''0'''
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: lightgrey;border: 1px solid darkgray" |'''1'''
|}

V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T12:37:50Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela logičnih vrat IN.
! style="width: 90px; background: lightgrey;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 90px; background: lightgrey;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 90px; background: lightgrey;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: lightgrey;border: 1px solid darkgray" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: lightgrey;border: 1px solid darkgray" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: lightgrey;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: lightgrey;border: 1px solid darkgray" |1
|}

V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T12:35:23Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela logičnih vrat IN.
! style="width: 90px; background: lightgrey;border: 1px solid darkgray"|MMP9
! style="width: 90px; background: lightgrey;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 90px; background: lightgrey;border: 1px solid darkgray"|pora
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
|}

V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T12:27:28Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela logičnih vrat IN.
! style="width: 90px; background: lightgrey;"|MMP9
! style="width: 90px; background: lightgrey;"|pH < 6,5
! style="width: 90px; background: lightgrey;"|pora
|-
| style="background: lightgrey;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |1
|}

V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T12:19:35Z

Uroš Prešeren: /* Delovanje sistema */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

<div><ul>
<li style="display: inline-table;">
{| class="wikitable"
|+Table 1. Long caption to test for problems in mobile portrait mode.
|-
! Name
! Color
|-
|Fred
|Orange
|-
|Bob
|Green
|-
|Lindy
|Yellow
|} </li>
<li style="display: inline-table;">
{| class="wikitable"
|+Table 2. Long caption to test for problems in mobile portrait mode.
|-
! Animal
! State
|-
|Raccoon
|Maine
|-
|Whale
|Alaska
|-
|Manta Ray
|Florida
|} </li>
</ul></div>

V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T09:55:31Z

Uroš Prešeren: /* Viri */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN. V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla. V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T09:54:23Z

Uroš Prešeren: /* Viri */

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN. V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla. V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124

2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328

3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368

4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92

5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141

6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13

7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511

8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89

9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181

10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T09:50:55Z

Uroš Prešeren:

Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore je potrebna ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN. V prvem primeru je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla. V primeru vrat ALI-IN pa je DARPin D22 pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se ta lahko odcepi s površine membrane bodisi ob prisotnosti MMP9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A [2].

Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj se je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot zgolj na prisotnost MMP9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenim Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere je značilno bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent, ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1. Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 112–124
2. Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ACS Synthetic Biology 9, 316–328
3. Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology 20, 360–368
4. Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. Nature Reviews Microbiology 14, 77–92
5. Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. FEBS Journal 279, 126–141
6. Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. Scientific Reports 7, 1–13
7. Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 55, 489–511
8. Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. Cancer Cell International 13, 89
9. Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181
10. Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nature Cell Biology 2, 737–744

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T09:45:21Z

Uroš Prešeren:

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T09:43:20Z

Uroš Prešeren:

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T09:41:21Z

Uroš Prešeren:

Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

2020-04-30T09:36:17Z

Uroš Prešeren: New page: Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa...

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T19:25:38Z

Uroš Prešeren: /* Tkivna specifičnost */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresijo genov z namenom zdravljenja različnih bolzeni. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev, saj izkorišča njihovo sposobnost vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta ''in vivo'' ter ''ex vivo''. Pri metodi ''in vivo'' virusne vektorje dovedemo v organizem lokalno ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ''ex vivo'' pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost, ki bi omogočala transdukcijo le določenega tipa celic. Za dolgoročno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več mesecev ali let po transdukciji. Virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije znotraj organizma. Ena izmed nevarnosti, ki se ji želimo izogniti, je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem navedenim zahtevam, je potrebno uporabiti čim primernejše viruse in jih modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (''adeno associated viruses''), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje tako imenovane zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusnih proteinov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (''long terminal repeat'') virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (''Rev response element''), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa ''in vitro'' niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Protein Tat z nadomestitvijo virusnega promotorja z evkariontskim izgubi svojo vlogo pri regulaciji transkripcije, zato je tudi gen ''tat'' odstranjen iz genoma. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so ''gag'', ''pol'', ''env'' in ''rev''. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen ''env'' virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

1. K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

2. C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

3. R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

4. L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

5. D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T19:07:32Z

Uroš Prešeren: /* Priprava vektorjev */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresijo genov z namenom zdravljenja različnih bolzeni. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev, saj izkorišča njihovo sposobnost vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta ''in vivo'' ter ''ex vivo''. Pri metodi ''in vivo'' virusne vektorje dovedemo v organizem lokalno ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ''ex vivo'' pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost, ki bi omogočala transdukcijo le določenega tipa celic. Za dolgoročno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več mesecev ali let po transdukciji. Virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije znotraj organizma. Ena izmed nevarnosti, ki se ji želimo izogniti, je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem navedenim zahtevam, je potrebno uporabiti čim primernejše viruse in jih modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (''adeno associated viruses''), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje tako imenovane zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusnih proteinov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (''long terminal repeat'') virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (''Rev response element''), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa ''in vitro'' niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Protein Tat z nadomestitvijo virusnega promotorja z evkariontskim izgubi svojo vlogo pri regulaciji transkripcije, zato je tudi gen ''tat'' odstranjen iz genoma. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so ''gag'', ''pol'', ''env'' in ''rev''. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen ''env'' virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

1. K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

2. C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

3. R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

4. L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

5. D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T19:06:31Z

Uroš Prešeren: /* Idealen virusni vektor */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresijo genov z namenom zdravljenja različnih bolzeni. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev, saj izkorišča njihovo sposobnost vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta ''in vivo'' ter ''ex vivo''. Pri metodi ''in vivo'' virusne vektorje dovedemo v organizem lokalno ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ''ex vivo'' pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost, ki bi omogočala transdukcijo le določenega tipa celic. Za dolgoročno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več mesecev ali let po transdukciji. Virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije znotraj organizma. Ena izmed nevarnosti, ki se ji želimo izogniti, je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem navedenim zahtevam, je potrebno uporabiti čim primernejše viruse in jih modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (''adeno associated viruses''), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusnih proteinov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (''long terminal repeat'') virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (''Rev response element''), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa ''in vitro'' niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Protein Tat z nadomestitvijo virusnega promotorja z evkariontskim izgubi svojo vlogo pri regulaciji transkripcije, zato je tudi gen ''tat'' odstranjen iz genoma. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so ''gag'', ''pol'', ''env'' in ''rev''. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen ''env'' virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

1. K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

2. C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

3. R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

4. L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

5. D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T19:04:26Z

Uroš Prešeren: /* Idealen virusni vektor */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresijo genov z namenom zdravljenja različnih bolzeni. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev, saj izkorišča njihovo sposobnost vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta ''in vivo'' ter ''ex vivo''. Pri metodi ''in vivo'' virusne vektorje dovedemo v organizem lokalno ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ''ex vivo'' pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost, ki bi omogočala transdukcijo le določenega tipa celic. Za dolgoročno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več mesecev ali let po transdukciji. Virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije znotraj organizma. Ena izmed nevarnosti, ki se ji želimo izogniti, je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno uporabiti primerne že poznane viruse in jih modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (''adeno associated viruses''), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusnih proteinov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (''long terminal repeat'') virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (''Rev response element''), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa ''in vitro'' niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Protein Tat z nadomestitvijo virusnega promotorja z evkariontskim izgubi svojo vlogo pri regulaciji transkripcije, zato je tudi gen ''tat'' odstranjen iz genoma. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so ''gag'', ''pol'', ''env'' in ''rev''. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen ''env'' virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

1. K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

2. C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

3. R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

4. L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

5. D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T19:03:34Z

Uroš Prešeren: /* Idealen virusni vektor */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresijo genov z namenom zdravljenja različnih bolzeni. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev, saj izkorišča njihovo sposobnost vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta ''in vivo'' ter ''ex vivo''. Pri metodi ''in vivo'' virusne vektorje dovedemo v organizem lokalno ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ''ex vivo'' pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost, ki bi omogočala transdukcijo le določenega tipa celic. Za dolgoročno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več mesecev ali let po transdukciji. Virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije znotraj organizma. Ena izmed nevarnosti, ki se je želimo izogniti, je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno uporabiti primerne že poznane viruse in jih modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (''adeno associated viruses''), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusnih proteinov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (''long terminal repeat'') virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (''Rev response element''), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa ''in vitro'' niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Protein Tat z nadomestitvijo virusnega promotorja z evkariontskim izgubi svojo vlogo pri regulaciji transkripcije, zato je tudi gen ''tat'' odstranjen iz genoma. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so ''gag'', ''pol'', ''env'' in ''rev''. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen ''env'' virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

1. K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

2. C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

3. R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

4. L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

5. D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T18:56:22Z

Uroš Prešeren: /* Gensko zdravljenje */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresijo genov z namenom zdravljenja različnih bolzeni. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev, saj izkorišča njihovo sposobnost vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta ''in vivo'' ter ''ex vivo''. Pri metodi ''in vivo'' virusne vektorje dovedemo v organizem lokalno ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ''ex vivo'' pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost za določen tip celic. Za dolgotrajno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več let po transdukciji. Za zagotovitev varnega genskega zdravljenja virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije. Ena izmed nevarnosti je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno obstoječe viruse modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (''adeno associated viruses''), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusnih proteinov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (''long terminal repeat'') virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (''Rev response element''), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa ''in vitro'' niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Protein Tat z nadomestitvijo virusnega promotorja z evkariontskim izgubi svojo vlogo pri regulaciji transkripcije, zato je tudi gen ''tat'' odstranjen iz genoma. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so ''gag'', ''pol'', ''env'' in ''rev''. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen ''env'' virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

1. K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

2. C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

3. R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

4. L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

5. D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T16:49:45Z

Uroš Prešeren: /* Gensko zdravljenje */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresijo genov z namenom zdravljenja različnih bolzeni. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta ''in vivo'' ter ''ex vivo''. Pri metodi ''in vivo'' virusne vektorje dovedemo lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ''ex vivo'' pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost za določen tip celic. Za dolgotrajno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več let po transdukciji. Za zagotovitev varnega genskega zdravljenja virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije. Ena izmed nevarnosti je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno obstoječe viruse modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (''adeno associated viruses''), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusnih proteinov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (''long terminal repeat'') virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (''Rev response element''), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa ''in vitro'' niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Protein Tat z nadomestitvijo virusnega promotorja z evkariontskim izgubi svojo vlogo pri regulaciji transkripcije, zato je tudi gen ''tat'' odstranjen iz genoma. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so ''gag'', ''pol'', ''env'' in ''rev''. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen ''env'' virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

1. K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

2. C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

3. R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

4. L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

5. D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T16:48:41Z

Uroš Prešeren: /* Gensko zdravljenje */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresijo genov. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta ''in vivo'' ter ''ex vivo''. Pri metodi ''in vivo'' virusne vektorje dovedemo lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ''ex vivo'' pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost za določen tip celic. Za dolgotrajno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več let po transdukciji. Za zagotovitev varnega genskega zdravljenja virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije. Ena izmed nevarnosti je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno obstoječe viruse modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (''adeno associated viruses''), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusnih proteinov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (''long terminal repeat'') virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (''Rev response element''), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa ''in vitro'' niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Protein Tat z nadomestitvijo virusnega promotorja z evkariontskim izgubi svojo vlogo pri regulaciji transkripcije, zato je tudi gen ''tat'' odstranjen iz genoma. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so ''gag'', ''pol'', ''env'' in ''rev''. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen ''env'' virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

1. K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

2. C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

3. R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

4. L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

5. D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T15:50:08Z

Uroš Prešeren:

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresije genov. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta ''in vivo'' ter ''ex vivo''. Pri metodi ''in vivo'' virusne vektorje dovedemo lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ''ex vivo'' pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost za določen tip celic. Za dolgotrajno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več let po transdukciji. Za zagotovitev varnega genskega zdravljenja virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije. Ena izmed nevarnosti je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno obstoječe viruse modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (''adeno associated viruses''), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (''long terminal repeat'') virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (''Rev response element''), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa ''in vitro'' niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Protein Tat z nadomestitvijo virusnega promotorja z evkariontskim izgubi svojo vlogo pri regulaciji transkripcije, zato je tudi gen ''tat'' odstranjen iz genoma. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so ''gag'', ''pol'', ''env'' in ''rev''. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen ''env'' virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

1. K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

2. C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

3. R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

4. L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

5. D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T14:48:35Z

Uroš Prešeren: /* Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresije genov. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta in vivo ter ex vivo. Pri metodi in vivo virusne vektorje dovede lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ex vivo pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost za določen tip celic. Za dolgotrajno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več let po transdukciji. Za zagotovitev varnega genskega zdravljenja virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije. Ena izmed nevarnosti je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno obstoječe viruse modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (adeno associated viruses), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi AAV] so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusno DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko to v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, vodi do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.
Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (Rev response element), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa in vitro niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Z inaktivacijo regije LTR tudi protein Tat ni več potreben. Edini geni, nujno potrebni za tvorbo lentivirusnega vektorja so gag, pol, env in rev. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen env virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

[1] K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4] L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

[5] D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T14:43:16Z

Uroš Prešeren: /* Retrovirusni in lentivirusni vektorji */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresije genov. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta in vivo ter ex vivo. Pri metodi in vivo virusne vektorje dovede lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ex vivo pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost za določen tip celic. Za dolgotrajno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več let po transdukciji. Za zagotovitev varnega genskega zdravljenja virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije. Ena izmed nevarnosti je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno obstoječe viruse modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (adeno associated viruses), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
[[Retrovirusi]] se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusno DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko to v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, vodi do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.
Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (Rev response element), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa in vitro niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Z inaktivacijo regije LTR tudi protein Tat ni več potreben. Edini geni, nujno potrebni za tvorbo lentivirusnega vektorja so gag, pol, env in rev. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen env virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

[1] K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4] L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

[5] D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T14:13:51Z

Uroš Prešeren: /* Primer */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresije genov. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta in vivo ter ex vivo. Pri metodi in vivo virusne vektorje dovede lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ex vivo pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost za določen tip celic. Za dolgotrajno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več let po transdukciji. Za zagotovitev varnega genskega zdravljenja virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije. Ena izmed nevarnosti je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno obstoječe viruse modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (adeno associated viruses), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer uporabe ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
Retrovirusi se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusno DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko to v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, vodi do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.
Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (Rev response element), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa in vitro niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Z inaktivacijo regije LTR tudi protein Tat ni več potreben. Edini geni, nujno potrebni za tvorbo lentivirusnega vektorja so gag, pol, env in rev. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen env virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

[1]

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4]

[5]

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T14:13:28Z

Uroš Prešeren: /* Idealen virusni vektor */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresije genov. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta in vivo ter ex vivo. Pri metodi in vivo virusne vektorje dovede lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ex vivo pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==
Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost za določen tip celic. Za dolgotrajno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več let po transdukciji. Za zagotovitev varnega genskega zdravljenja virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije. Ena izmed nevarnosti je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno obstoječe viruse modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (adeno associated viruses), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
Retrovirusi se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusno DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko to v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, vodi do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.
Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (Rev response element), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa in vitro niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Z inaktivacijo regije LTR tudi protein Tat ni več potreben. Edini geni, nujno potrebni za tvorbo lentivirusnega vektorja so gag, pol, env in rev. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen env virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

[1]

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4]

[5]

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T14:13:01Z

Uroš Prešeren: /* Gensko zdravljenje */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresije genov. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta in vivo ter ex vivo. Pri metodi in vivo virusne vektorje dovede lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ex vivo pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Idealen virusni vektor ==

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
Retrovirusi se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusno DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko to v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, vodi do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.
Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (Rev response element), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa in vitro niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Z inaktivacijo regije LTR tudi protein Tat ni več potreben. Edini geni, nujno potrebni za tvorbo lentivirusnega vektorja so gag, pol, env in rev. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen env virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

[1]

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4]

[5]

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T14:12:05Z

Uroš Prešeren: /* Gensko zdravljenje */

== Gensko zdravljenje ==
Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresije genov. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta in vivo ter ex vivo. Pri metodi in vivo virusne vektorje dovede lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ex vivo pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
Retrovirusi se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusno DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko to v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, vodi do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.
Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (Rev response element), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa in vitro niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Z inaktivacijo regije LTR tudi protein Tat ni več potreben. Edini geni, nujno potrebni za tvorbo lentivirusnega vektorja so gag, pol, env in rev. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen env virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

[1]

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4]

[5]

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T13:54:59Z

Uroš Prešeren: /* Retrovirusni in lentivirusni vektorji */

== Gensko zdravljenje ==

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
Retrovirusi se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusno DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko to v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, vodi do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.
Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (Rev response element), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (''nef'', ''vpr'', ''vif'' in ''vpu'') za replikacijo virusa in vitro niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Z inaktivacijo regije LTR tudi protein Tat ni več potreben. Edini geni, nujno potrebni za tvorbo lentivirusnega vektorja so gag, pol, env in rev. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

=== Tkivna specifičnost ===
Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen env virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

=== Primer uporabe ===
Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ''ex vivo''.

== Viri ==

[1]

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4]

[5]

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T13:51:39Z

Uroš Prešeren: /* Retrovirusni in lentivirusni vektorji */

== Gensko zdravljenje ==

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
Retrovirusi se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusno DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko to v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, vodi do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.
Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

=== Priprava vektorjev ===
Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (Rev response element), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (nef, vpr, vif in vpu) za replikacijo virusa in vitro niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Z inaktivacijo regije LTR tudi protein Tat ni več potreben. Edini geni, nujno potrebni za tvorbo lentivirusnega vektorja so gag, pol, env in rev. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

== Viri ==

[1]

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4]

[5]

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

2018-05-13T13:49:55Z

Uroš Prešeren: /* Retrovirusni in lentivirusni vektorji */

== Gensko zdravljenje ==

== Adenovirusni vektorji ==

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic ''in vivo''. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

=== Priprava vektorjev ===

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, ''early'') in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco ''loxP'', zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne ''in vivo''; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

=== Tkivna specifičnost ===

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

=== Primer ===

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

== Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV) ==

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za ''in vivo'' uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji ''rep'' in ''cap'' izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let.
Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama ''rep'' in ''cap'' poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

== Retrovirusni in lentivirusni vektorji ==
Retrovirusi se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusno DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko to v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, vodi do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.
Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

== Viri ==

[1]

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4]

[5]

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Molekularna biologija virusov

2018-04-11T07:10:23Z

Uroš Prešeren:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2017/18 obravnavajo področje virusov, saj v naslednjem letu ne boste imeli možnosti vpisa izbirnega predmeta Virologija. Tematika je razdeljena na 16 poglavij. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu.

Vsako temo obdelata praviloma dva študenta, nekatere teme pa omogočajo tudi razdelitev snovi na tri dele (to je označeno na prvem seznamu). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili.
Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov!

Predstavitve seminarjev po datumih so razvidne iz spletne učilnice.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev sta običajno dve vprašanji od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (lahko 3) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (lahko 3) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi (lahko 3) 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Diagnostika virusnih okužb 
13. Rastlinski virusi (lahko 3) 
14. Protivirusna zdravila (lahko 3) 
15. Protivirusna cepiva 
16. Virusi in rak 
17. Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (Ines Medved, Veronika Razpotnik, Andrej Ivanovski) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi (Milica Jankovic, Andrej Race) 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi (Anže Jenko, Ana Maklin) 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi (Tanja Zupan, Ajda Krč) 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi (Anja Černe, Špela Deučman) 
6. Retrovirusi (Katja Doberšek, Špela Supej, Barbara Slapnik) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) (Nika Zaveršek, Nika Goršek) 
8. Nitasti fagi () 
9. Ikozaedrični fagi (Urban Hribar, Luka Gregorič, Luka Fratina) 
10. Viroidi in satelitski virusi (Lea Knez, Patrik Levačić) 
11. Evolucija virusov () 
12. Diagnostika virusnih okužb (Samo Purič, Peter Škrinjar) 
13. Rastlinski virusi (Katja Dolenc, Martin Špendl) 
14. Protivirusna zdravila (Tina Turel, Maja Vrabec, Polona Skrt) 
15. Protivirusna cepiva (Daria Latysheva, Jerneja Nimac) 
16. Virusi in rak (Ana Obaha, Lija Srnovršnik) 
17. Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju (Andreja Habič, Uroš Prešern)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, ki vsebuje povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 
Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

Molekularna biologija virusov

2018-03-16T10:10:20Z

Uroš Prešeren:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2017/18 obravnavajo področje virusov, saj v naslednjem letu ne boste imeli možnosti vpisa izbirnega predmeta Virologija. Tematika je razdeljena na 16 poglavij. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu.

Vsako temo obdelata praviloma dva študenta, nekatere teme pa omogočajo tudi razdelitev snovi na tri dele (to je označeno na prvem seznamu). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili.
Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov!

Predstavitve seminarjev po datumih so razvidne iz spletne učilnice.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev sta običajno dve vprašanji od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (lahko 3) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (lahko 3) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi (lahko 3) 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Virusi in rak 
13. Rastlinski virusi (lahko 3) 
14. Protivirusna zdravila (lahko 3) 
15. Protivirusna cepiva 
16. Diagnostika virusnih okužb 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (Ines Medved, Veronika Razpotnik) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi (Milica Jankovic) 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi (Anže Jenko, Ana Maklin) 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi (Andreja Habič, Uroš Prešern) 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi (Anja Černe, Špela Deučman) 
6. Retrovirusi (Katja Doberšek, Špela Supej, Barbara Slapnik) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) (Nika Zaveršek, Nika Goršek) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi 
10. Viroidi in satelitski virusi(Ivanovski) 
11. Evolucija virusov (Polona Skrt) 
12. Virusi in rak (Ana Obaha, Lija Srnovršnik) 
13. Rastlinski virusi (Katja Dolenc, Martin Špendl) 
14. Protivirusna zdravila (Tina Turel, Maja Vrabec) 
15. Protivirusna cepiva (Daria Latysheva, Jerneja Nimac) 
16. Diagnostika virusnih okužb (Samo Purič) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, ki vsebuje povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]
Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

BIO2 Seminar 2017

2018-01-06T19:32:24Z

Uroš Prešeren: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Ines Medved || 12 || Receptorji za vonj v epidermisu || Špela Supej || Lea Knez || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Luka Gregorič || 12 || Pozitivne vloge negativnih regulatorjev || Uroš Prešern || Katja Doberšek || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Daria Latysheva || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Daria_Latysheva:_The_role_of_intrinsically_disordered_proteins_in_signalling_pathways_and_regulation The role of intrinsically disordered proteins in signallng pathways and regulation] || Luka Fratina || Martin Špendl || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Polona Skrt || 12 || Mehanizem zaznavanja okusa maščobe || Andreja Habič || Ajda Galič || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Peter Škrinjar || 12 || Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo || Andrej Race || Nika Zaveršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Milica Janković || 12 || Nuklearni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov || Anže Jenko || Nika Goršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Tina Turel || 14-15 || Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze || Ines Medved || Špela Supej || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Barbara Slapnik || 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze v celičnih kulturah|| Luka Gregorič || Uroš Prešern || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ana Maklin || 14-15 || Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu || Daria Latysheva || Luka Fratina || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ajda Krč || 16 || Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju || Polona Skrt || Andreja Habič || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urban Hribar || 16 || Metabolizem polariziranih makrofagov || Peter Škrinjar || Andrej Race || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urška Zagorc || 16 || Salmonela in citratni cikel || Milica Janković || Anže Jenko || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Patrik Levačić || 17 || Ceramidi in njihova povezava z debelostjo || Tina Turel || Ines Medved || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Jerneja Nimac || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Jerneja_Nimac:_Ketonska_telesca_kot_signalni_metaboliti Ketonska telesca kot signalni metaboliti] || Barbara Slapnik || Luka Gregorič || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Lija Srnovršnik || 17 || Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem || Ana Maklin || Daria Latysheva || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Nika Mikulič || 18 || Hiperamoniemija in metode zdravljenja || Ajda Krč || Polona Skrt || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Tanja Zupan || 18 || Presnovne bolezni aminokislin || Urban Hribar || Peter Škrinjar || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Anja Tavčar || 18 || Regulacija imunskega odziva z metabolizmom l-arginina || Urška Zagorc || Milica Janković || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Maja Vrabec || 19 || Poškodbe mitohondrijske DNA in popravljalni mehanizmi || Patrik Levačić || Tina Turel || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Špela Deučman || 19 || Vloga reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) pri celični signalizaciji || Jerneja Nimac || Barbara Slapnik || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Anja Černe || 19 || Vpliv mitohondrijskega stresa na staranje || Lija Srnovršnik || Ana Maklin || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Lea Knez || 20 || Trehaloza-6-fosfat kot signalna molekula v rastlinah || Nika Mikulič || Ajda Krč || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Katja Doberšek || 20 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Katja_Doberšek:_Vpliv_zunajceličnih_dejavnikov_na_sintezo_celuloze_v_rastlinskih_celicah Vpliv zunajceličnih dejavnikov na sintezo celuloze v rastlinskih celicah] || Tanja Zupan || Urban Hribar || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Martin Špendl || 20 || Lektini in prepoznavanje sladkornih podenot || Anja Tavčar || Urška Zagorc || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Ajda Galič || 21 || || Katja Dolenc || Patrik Levačić || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Zaveršek || 21 || Povezava velike depresivne motnje z razmerjem med omega-6 in omega-3 maščobnimi kislinami || Špela Deučman || Jerneja Nimac || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Goršek || 21 || Lipidi v gostiteljski celici ob okužbi z virusom hepatitisa C || Anja Černe || Lija Srnovršnik || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Špela Supej || 22 || Biosinteza rastlinskih alkaloidov || Lea Knez || Katja Dolenc|| 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Uroš Prešern || 22 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Uro.C5.A1_Pre.C5.A1ern:_Ribonukleotid_reduktaza_-_encim.2C_ki_po_vseh_letih_od_odkritja_.C5.A1e_vedno_presene.C4.8Da Ribonukleotid reduktaza: encim, ki po vseh letih od odkritja še vedno preseneča] || Katja Doberšek || Tanja Zupan || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Luka Fratina || 22 || Industrijska proizvodnja aminokislin || Martin Špendl || Anja Tavčar || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Andreja Habič || 23 || Rjavo maščobno tkivo kot sekrecijski organ || Ajda Galič || Maja Vrabec || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Andrej Race || 23 || Ghrelin || Nika Zaveršek || Špela Deučman || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Anže Jenko || 23 || || Nika Goršek || Anja Černe || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Katja Dolenc || 23 || || Maja Vrabec || Nika Mikulič || 20/01/17 || 22/01/17 || 24/01/17
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.