Wiki FKKT - User contributions [en]

MBT seminarji 2021

2021-05-10T23:26:07Z

Urska.PStrnad:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.)
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Engineering a carboxypeptidase from ''Aspergillus niger'' M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation (Xiong K., Liu J., Wang X., Sun B., Zhang Y., Zhao Z., Pei P., & Li X.; Journal of Biotechnology, 330, 1–8, 2021, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015). [[Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem]] Urška Fajdiga (5.5.)
# Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro) (Rothan, H.A., Teoh, T.C; Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021); https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7) [[Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)]] Mirsad Mešić (6.5.)
# A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch (M. Thakur ''et al''.; Bioresource Technology 320, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124288). [[Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba]] Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Production of Tyrian purple indigoid dye from tryptophan in ''Escherichia coli'' (J. Lee ''et al.''; Nat. Chem. Biol. 17, 2021; https://doi.org/10.1038/s41589-020-00684-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1krlatnega_indigoidnega_barvila_iz_triptofana_v_bakteriji_Escherichia_coli Proizvodnja škrlatnega indigoidnega barvila iz triptofana v bakteriji ''Escherichia coli''] Jerneja Nimac (12.5.)
# Development of ''Pseudomonas asiatica'' as a host for the production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol (T. Thi Nguyen et al., Bioresource Technology, vol. 329, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124867). [[Razvoj gostiteljskega organizma Pseudomonas asiatica za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola]] Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Razvoj gostiteljskega organizma Pseudomonas asiatica za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola

2021-05-10T23:13:20Z

Urska.PStrnad:

== Uvod ==

3-hidroksipropionska kislina (3-HP) je zelo uporabna C3 spojina. Lahko jo pretvorimo v mnoge druge C3 spojine (akrilna kislina, akrilamid, propiolakton…), ima pa tudi široko uporabnost v barvni in polimerni industriji ter industriji plenic.

Za učinkovito biološko proizvodnjo 3-HP iz glicerola potrebujemo tri encime. Prvi je glicerol dehidrataza (GDHt), ki katalizira dehidracijo glicerola v 3-hidroksipropionaldehid (3-HPA), za delovanje pa potrebuje koencim B12. Drugi je aldehid dehidrogenaza (ALDH), ki nato oksidira 3-HPA do 3-HP. Tretji je glicerol dehidrataza reaktivaza (GdrAB), ki uporabljeni koencim B12 v GDHt nadomesti z novim. Za proizvodnjo 3-HP iz glicerola je že bilo razvitih nekaj bakterijskih sevov (''E. coli'', ''K. pneumoniae'', ''P. denitrificans''), vendar imajo vsi svoje pomanjkljivosti.

V raziskavi, ki je predstavljena v izhodiščnem članku, so se osredotočili na razvoj nove gostiteljske vrste, ki proizvaja 3-HP iz glicerola, kot vir ogljika pa uporablja glukozo. Izolirali so sev ''Pseudomonas asiatica'' C1 in sekvencirali njegov celoten genom. Po vzpostavitvi 3-HP sintezne poti, so modificirali (inhibirali) pot degradacije 3-HP, metabolizem glicerola in pot sinteze 1,3-propandiola. Tako so razvili sev, ki učinkovito proizvaja 3-HP iz glicerola z minimalnim dodatkom koencima B12.

== Izvedba eksperimenta ==

Uporabljen bakterijski sev so izolirali iz aktivnega blata iz čistilne naprave v Koreji. Po sekvenciranju genoma so sev identificirali kot vrsto'' Pseudomonas asiatica'', ki je gramnegativna, aerobna, paličasta, nesporulirajoča bakterijska vrsta. Sev so poimenovali ''Pseudomonas asiatica'' C1. Celice so gojili v modificiranem gojišču M9 pri 30°C in tako pripravili inokulume za glavni del študije. Da bi ugotovili, koliko koencima B12 sintetizira ''P. asiatica'' C1, so bakterije v eksponentni fazi razbili s sonifikacijo in celični lizat uporabili v gojišču za gojenje reporterskega seva ''Salmonella typhimurium ΔmetEΔcbiB''. Obseg rasti ''S. typhimurium'' je odražal količino koencima B12 v celičnem lizatu.
Za razvoj ustreznih plazmidov so uporabili sev ''E. coli'' Top10. Kromosomske gene so deletirali s pomočjo delecijskih plazmidov, ki so vsebovali fragmente, sestavljene iz 500 baznih parov višje in 500 baznih parov nižje od gena, ki so ga želeli izbrisati. Ko so vektor vstavili v bakterijske celice, je med plazmidom in kromosomsko DNA potekla homologna rekombinacija in prišlo je do delecije na kromosomski DNA. Na tak način so zaporedno izbrisali 11 genov (11 različnih sevov, z 1 do 11 delecijami). Zasnovali so tudi ekspresijski plazmid z zapisom za glicerol dehidratazo, glicerol dehidratazo reaktivazo in aldehid dehidrogenazo pod ustreznimi promotorji. Končni plazmid pDK, ki je vseboval vse potrebno za sintezno pot 3-HP, so nato vstavili v bakterije'' P. asiatica'' C1 in vse njene različice.

== Rezultati in diskusija ==

Rast seva ''P. asiatica'' C1 in produkcijo koencima B12 so preverjali za tri različne vire ogljika: glukozo, glukonat in glutamat. Kot referenčni sev so uporabili sev ''P. denitrificans'' ATCC 13867, saj potrjeno dobro raste na glukonatu in glutamatu. Oba seva sta dobro rasla na glukonatu in glutamatu, na glukozi pa je dobro rasel le sev ''P. asiatica'' C1, kar predstavlja prednost, saj je glukoza cenejša. Tudi v količini proizvedenega koencima B12 je bil sev ''P. asiatica'' C1 v prednosti, ne glede na vir ogljika.
Proizvodnja 3-HP v divjem tipu seva ''P. asiatica'' C1 (brez delecij) je bila precej slaba, donos je znašal okoli 0,37 mol/mol glicerola. Pojavil pa se je le en stranski produkt, to je 1,3-propandiol. Pokazali so, da pot sinteze 3-HP sicer dobro deluje v novem gostitelju, vendar so za boljši izkoristek potrebne modifikacije gostiteljskega seva.
V naslednjih fazah eksperimenta so postopno uvajali nove delecije v gostiteljski sev ''P. asiatica'' C1. Najprej so deletirali tri gene, ki kodirajo encime, ki razgrajujejo 3-HP. Sev, ki je imel izbrisane vse tri gene, ni več razgrajeval 3-HP, donos se je povečal na 0,62 mol/mol glicerola. V naslednjem koraku so dodatno izbrisali dva gena, katerih produkta sodelujeta pri katabolni presnovi glicerola, saj je cilj, da se celoten glicerol pretvori v produkt. Donos se je povečal na 0,87 mol/mol glicerola. V zadnjem koraku so dodatno izbrisali še 5 genov za 1,3-propandiol oksidoreduktaze, ki so odgovorni za to, da namesto 3-HP nastaja stranski produkt 1,3-propandiol. V končnem rekombinantnem sevu (z vsemi 11 delecijami) je bil donos 3-HP 0,99 mol/mol glicerola, le 1% glicerola pa se je pretvoril v 1,3-PDO.
Na koncu je sledila proizvodnja 3-HP v 2 litrskem bioreaktorju. Ob dodajanju koencima B12 se je proizvodnja zelo povečala, največja izmerjena produktivnost je bila 2,15 g produkta/L/h izkoristek pa 98%.

== Zaključek ==

Študija dokazuje, da je novi izolat ''P. asiatica'' C1 dober gostitelj za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola. Dobro raste na glukozi in v aerobnih pogojih rasti proizvaja koencim B12, zato je zelo obetaven rekombinantni sev. Za komercialne namene pa je treba izvesti nadaljnje študije za zmanjšanje potrebe po koencimu B12 in za izboljšanje titra.

Razvoj gostiteljskega organizma Pseudomonas asiatica za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola

2021-05-10T23:12:51Z

Urska.PStrnad: New page: == Uvod == 3-hidroksipropionska kislina (3-HP) je zelo uporabna C3 spojina. Lahko jo pretvorimo v mnoge druge C3 spojine (akrilna kislina, akrilamid, propiolakton…), ima pa tudi široko...

Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid

2021-05-04T19:44:15Z

Urska.PStrnad:

''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

== '''Uvod''' ==

Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]

Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

'''Nukleacija''' 
Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

'''Elongacija''' 
Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponento in homodimerno komponento.

'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami''' 
Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

'''Odstranitev nukleacijskega jedra''' 
Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine''' 
Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]

==''' Izvedba eksperimenta '''==

'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A ''' 
Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer ''' 
Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 ''' 
Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido ''' 
Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid ''' 
Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside ''' 
Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Vzorce so vzbujali pri valovni dolžini 504 nm in nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm ter potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
=='''Zaključek''' ==

Simetrične podenote se pogosto spontano sestavijo v simetrične kapside, brez vmesnih stopenj. Avtorji članka so predstavili pot sestavljanja, ki so jo razdelili na ločene reakcije, ki jih lahko nadzorujemo. Tak proces bi lahko uporabili v mnogih uporabnih aplikacijah, npr. pakiranje učinkovin v luknjaste kapside, ki bi jih uporabili kot dostavni sistem za zdravila, ali pa bi odprtine v kapsidi zapolnili z dimeri z uporabnimi površinskimi/kemijskimi lastnostmi. Asimetrične kapside tako lahko odprejo vrata sintezi organiziranih, multi-funkcionalnih delcev.

==''' Viri '''==
[1] Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

[2] H. Su, C. A. Hurd Price, L. Jing, Q. Tian, J. Liu, and K. Qian, “Janus particles: design, preparation, and biomedical applications,” Mater. Today Bio, vol. 4, no. July, 2019, doi: 10.1016/j.mtbio.2019.100033.

[3] Z. Tan, K. Pionek, N. Unchwaniwala, M. L. Maguire, D. D. Loeb, and A. Zlotnick, “The Interface between Hepatitis B Virus Capsid Proteins Affects Self-Assembly, Pregenomic RNA Packaging, and Reverse Transcription,” J. Virol., vol. 89, no. 6, pp. 3275–3284, 2015, doi: 10.1128/jvi.03545-14.

Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid

2021-05-04T19:41:55Z

Urska.PStrnad:

''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

== '''Uvod''' ==

Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]

Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

'''Nukleacija''' 
Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

'''Elongacija''' 
Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponento in homodimerno komponento.

'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami''' 
Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

'''Odstranitev nukleacijskega jedra''' 
Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine''' 
Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]

==''' Izvedba eksperimenta '''==

'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A ''' 
Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer ''' 
Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 ''' 
Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido ''' 
Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid ''' 
Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside ''' 
Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Vzorce so vzbujali pri valovni dolžini 504 nm in nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm ter potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
=='''Zaključek''' ==

Simetrične podenote se pogosto spontano sestavijo v simetrične kapside, brez vmesnih stopenj. Avtorji članka so predstavili pot sestavljanja, ki so jo razdelili na ločene reakcije, ki jih lahko nadzorujemo. Tak proces bi lahko uporabili v mnogih uporabnih aplikacijah, npr. pakiranje učinkovin v luknjaste kapside, ki bi jih uporabili kot dostavni sistem za zdravila, ali pa bi odprtine v kapsidi zapolnili z dimeri z uporabnimi površinskimi/kemijskimi lastnostmi. Asimetrične kapside tako lahko odprejo vrata sintezi organiziranih, multi-funkcionalnih delcev.

==''' Viri '''==
[1] Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

[2] H. Su, C. A. Hurd Price, L. Jing, Q. Tian, J. Liu, and K. Qian, “Janus particles: design, preparation, and biomedical applications,” Mater. Today Bio, vol. 4, no. July, 2019, doi: 10.1016/j.mtbio.2019.100033.

[3] Z. Tan, K. Pionek, N. Unchwaniwala, M. L. Maguire, D. D. Loeb, and A. Zlotnick, “The Interface between Hepatitis B Virus Capsid Proteins Affects Self-Assembly, Pregenomic RNA Packaging, and Reverse Transcription,” J. Virol., vol. 89, no. 6, pp. 3275–3284, 2015, doi: 10.1128/jvi.03545-14.

Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid

2021-05-04T19:34:28Z

Urska.PStrnad:

''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

== '''Uvod''' ==

Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]

Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

'''Nukleacija''' 
Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

'''Elongacija''' 
Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponento in homodimerno komponento.

'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami''' 
Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

'''Odstranitev nukleacijskega jedra''' 
Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine''' 
Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]

==''' Izvedba eksperimenta '''==

'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A ''' 
Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer ''' 
Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 ''' 
Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido ''' 
Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid ''' 
Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside ''' 
Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Vzorce so vzbujali pri valovni dolžini 504 nm in nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm ter potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
=='''Zaključek''' ==

Simetrične podenote se pogosto spontano sestavijo v simetrične kapside, brez vmesnih stopenj. Avtorji članka so predstavili pot sestavljanja, ki so jo razdelili na ločene reakcije, ki jih lahko nadzorujemo. Tak proces bi lahko uporabili v mnogih uporabnih aplikacijah, npr. pakiranje učinkovin v luknjaste kapside, ki bi jih uporabili kot dostavni sistem za zdravila, ali pa bi odprtine v kapsidi zapolnili z dimeri z uporabnimi površinskimi/kemijskimi lastnostmi. Asimetrične kapside tako lahko odprejo vrata sintezi organiziranih, multi-funkcionalnih delcev.

==''' Viri '''==
[1] Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

[2] H. Su, C. A. Hurd Price, L. Jing, Q. Tian, J. Liu, and K. Qian, “Janus particles: design, preparation, and biomedical applications,” Mater. Today Bio, vol. 4, no. July, 2019, doi: 10.1016/j.mtbio.2019.100033.

[3] Z. Tan, K. Pionek, N. Unchwaniwala, M. L. Maguire, D. D. Loeb, and A. Zlotnick, “The Interface between Hepatitis B Virus Capsid Proteins Affects Self-Assembly, Pregenomic RNA Packaging, and Reverse Transcription,” J. Virol., vol. 89, no. 6, pp. 3275–3284, 2015, doi: 10.1128/jvi.03545-14.

Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid

2021-05-04T19:31:52Z

Urska.PStrnad:

''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

== '''Uvod''' ==

Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]

Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

'''Nukleacija'''

Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

'''Elongacija'''

Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponento in homodimerno komponento.

'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami'''

Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

'''Odstranitev nukleacijskega jedra'''

Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine'''

Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]

==''' Izvedba eksperimenta '''==

'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A '''

Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer '''

Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 '''

Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido '''

Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid '''

Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''

Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Vzorce so vzbujali pri valovni dolžini 504 nm in nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm ter potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
=='''Zaključek''' ==

Simetrične podenote se pogosto spontano sestavijo v simetrične kapside, brez vmesnih stopenj. Avtorji članka so predstavili pot sestavljanja, ki so jo razdelili na ločene reakcije, ki jih lahko nadzorujemo. Tak proces bi lahko uporabili v mnogih uporabnih aplikacijah, npr. pakiranje učinkovin v luknjaste kapside, ki bi jih uporabili kot dostavni sistem za zdravila, ali pa bi odprtine v kapsidi zapolnili z dimeri z uporabnimi površinskimi/kemijskimi lastnostmi. Asimetrične kapside tako lahko odprejo vrata sintezi organiziranih, multi-funkcionalnih delcev.

==''' Viri '''==
[1] Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

[2] H. Su, C. A. Hurd Price, L. Jing, Q. Tian, J. Liu, and K. Qian, “Janus particles: design, preparation, and biomedical applications,” Mater. Today Bio, vol. 4, no. July, 2019, doi: 10.1016/j.mtbio.2019.100033.

[3] Z. Tan, K. Pionek, N. Unchwaniwala, M. L. Maguire, D. D. Loeb, and A. Zlotnick, “The Interface between Hepatitis B Virus Capsid Proteins Affects Self-Assembly, Pregenomic RNA Packaging, and Reverse Transcription,” J. Virol., vol. 89, no. 6, pp. 3275–3284, 2015, doi: 10.1128/jvi.03545-14.

Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid

2021-05-04T19:27:55Z

Urska.PStrnad:

''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

== '''Uvod''' ==

Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]

Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

'''Nukleacija'''

Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

'''Elongacija'''

Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponento in homodimerno komponento.

'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami'''

Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

'''Odstranitev nukleacijskega jedra'''

Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine'''

Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]

==''' Izvedba eksperimenta '''==

'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A '''

Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer '''

Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 '''

Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido '''

Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid '''

Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''

Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Pri vzbujevalni valovni dolžini 504 nm so nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm in potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
=='''Zaključek''' ==

Simetrične podenote se pogosto spontano sestavijo v simetrične kapside, brez vmesnih stopenj. Avtorji članka so predstavili pot sestavljanja, ki so jo razdelili na ločene reakcije, ki jih lahko nadzorujemo. Tak proces bi lahko uporabili v mnogih uporabnih aplikacijah, npr. pakiranje učinkovin v luknjaste kapside, ki bi jih uporabili kot dostavni sistem za zdravila, ali pa bi odprtine v kapsidi zapolnili z dimeri z uporabnimi površinskimi/kemijskimi lastnostmi. Asimetrične kapside tako lahko odprejo vrata sintezi organiziranih, multi-funkcionalnih delcev.

==''' Viri '''==
[1] Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

[2] H. Su, C. A. Hurd Price, L. Jing, Q. Tian, J. Liu, and K. Qian, “Janus particles: design, preparation, and biomedical applications,” Mater. Today Bio, vol. 4, no. July, 2019, doi: 10.1016/j.mtbio.2019.100033.

[3] Z. Tan, K. Pionek, N. Unchwaniwala, M. L. Maguire, D. D. Loeb, and A. Zlotnick, “The Interface between Hepatitis B Virus Capsid Proteins Affects Self-Assembly, Pregenomic RNA Packaging, and Reverse Transcription,” J. Virol., vol. 89, no. 6, pp. 3275–3284, 2015, doi: 10.1128/jvi.03545-14.

Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid

2021-05-04T01:39:14Z

Urska.PStrnad:

''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

== '''Uvod''' ==

Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]

Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

'''Nukleacija'''

Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

'''Elongacija'''

Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponentno in homodimerno komponento.

'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami'''

Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

'''Odstranitev nukleacijskega jedra'''

Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine'''

Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]

==''' Izvedba eksperimenta '''==

'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A '''

Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer '''

Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 '''

Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido '''

Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid '''

Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih in kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''

Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Pri vzbujevalni valovni dolžini 504 nm so nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm in potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
=='''Zaključek''' ==

Simetrične podenote se pogosto spontano sestavijo v simetrične kapside, brez vmesnih stopenj. Avtorji članka so predstavili pot sestavljanja, ki so jo razdelili na ločene reakcije, ki jih lahko nadzorujemo. Tak proces bi lahko uporabili v mnogih uporabnih aplikacijah, npr. pakiranje učinkovin v luknjaste kapside, ki bi jih uporabili kot dostavni sistem za zdravila, ali pa bi odprtine v kapsidi zapolnili z dimeri z uporabnimi površinskimi/kemijskimi lastnostmi. Asimetrične kapside tako lahko odprejo vrata sintezi organiziranih, multi-funkcionalnih delcev.

==''' Viri '''==
[1] Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

[2] H. Su, C. A. Hurd Price, L. Jing, Q. Tian, J. Liu, and K. Qian, “Janus particles: design, preparation, and biomedical applications,” Mater. Today Bio, vol. 4, no. July, 2019, doi: 10.1016/j.mtbio.2019.100033.

[3] Z. Tan, K. Pionek, N. Unchwaniwala, M. L. Maguire, D. D. Loeb, and A. Zlotnick, “The Interface between Hepatitis B Virus Capsid Proteins Affects Self-Assembly, Pregenomic RNA Packaging, and Reverse Transcription,” J. Virol., vol. 89, no. 6, pp. 3275–3284, 2015, doi: 10.1128/jvi.03545-14.

Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid

2021-05-04T01:38:45Z

Urska.PStrnad:

''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

== '''Uvod''' ==

Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]
Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

'''Nukleacija'''

Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

'''Elongacija'''

Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponentno in homodimerno komponento.

'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami'''

Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

'''Odstranitev nukleacijskega jedra'''

Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine'''

Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]

==''' Izvedba eksperimenta '''==

'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A '''

Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer '''

Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 '''

Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido '''

Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid '''

Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih in kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''

Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Pri vzbujevalni valovni dolžini 504 nm so nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm in potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
=='''Zaključek''' ==

Simetrične podenote se pogosto spontano sestavijo v simetrične kapside, brez vmesnih stopenj. Avtorji članka so predstavili pot sestavljanja, ki so jo razdelili na ločene reakcije, ki jih lahko nadzorujemo. Tak proces bi lahko uporabili v mnogih uporabnih aplikacijah, npr. pakiranje učinkovin v luknjaste kapside, ki bi jih uporabili kot dostavni sistem za zdravila, ali pa bi odprtine v kapsidi zapolnili z dimeri z uporabnimi površinskimi/kemijskimi lastnostmi. Asimetrične kapside tako lahko odprejo vrata sintezi organiziranih, multi-funkcionalnih delcev.

==''' Viri '''==
[1] Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

[2] H. Su, C. A. Hurd Price, L. Jing, Q. Tian, J. Liu, and K. Qian, “Janus particles: design, preparation, and biomedical applications,” Mater. Today Bio, vol. 4, no. July, 2019, doi: 10.1016/j.mtbio.2019.100033.

[3] Z. Tan, K. Pionek, N. Unchwaniwala, M. L. Maguire, D. D. Loeb, and A. Zlotnick, “The Interface between Hepatitis B Virus Capsid Proteins Affects Self-Assembly, Pregenomic RNA Packaging, and Reverse Transcription,” J. Virol., vol. 89, no. 6, pp. 3275–3284, 2015, doi: 10.1128/jvi.03545-14.

Seminarji SB 2020/21

2021-05-04T01:38:07Z

Urska.PStrnad:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
8 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
9 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
10 [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid

2021-05-04T01:30:06Z

Urska.PStrnad: New page: ''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (...

''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

== '''Uvod''' ==

Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]
Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

'''Nukleacija'''

Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

'''Elongacija'''

Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponentno in homodimerno komponento.

'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami'''

Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

'''Odstranitev nukleacijskega jedra'''

Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine'''

Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti.[1]

==''' Izvedba eksperimenta '''==

'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A '''

Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer '''

Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 '''

Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido '''

Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid '''

Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih in kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''

Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Pri vzbujevalni valovni dolžini 504 nm so nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm in potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
=='''Zaključek''' ==

Simetrične podenote se pogosto spontano sestavijo v simetrične kapside, brez vmesnih stopenj. Avtorji članka so predstavili pot sestavljanja, ki so jo razdelili na ločene reakcije, ki jih lahko nadzorujemo. Tak proces bi lahko uporabili v mnogih uporabnih aplikacijah, npr. pakiranje učinkovin v luknjaste kapside, ki bi jih uporabili kot dostavni sistem za zdravila, ali pa bi odprtine v kapsidi zapolnili z dimeri z uporabnimi površinskimi/kemijskimi lastnostmi. Asimetrične kapside tako lahko odprejo vrata sintezi organiziranih, multi-funkcionalnih delcev.

==''' Viri '''==
[1] Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

[2] H. Su, C. A. Hurd Price, L. Jing, Q. Tian, J. Liu, and K. Qian, “Janus particles: design, preparation, and biomedical applications,” Mater. Today Bio, vol. 4, no. July, 2019, doi: 10.1016/j.mtbio.2019.100033.

[3] Z. Tan, K. Pionek, N. Unchwaniwala, M. L. Maguire, D. D. Loeb, and A. Zlotnick, “The Interface between Hepatitis B Virus Capsid Proteins Affects Self-Assembly, Pregenomic RNA Packaging, and Reverse Transcription,” J. Virol., vol. 89, no. 6, pp. 3275–3284, 2015, doi: 10.1128/jvi.03545-14.

Protikovidna cepiva

2021-04-21T13:58:51Z

Urska.PStrnad:

Študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)]] - 18.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) ]] - 18.3.(6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)]] - 8.4. (6 min) 
# [[Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland]] - 8.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5)]] - 15.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva CanSino (Ad5)]] - 15.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano)]] - 22.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano)]] - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko) - 6.5. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Vector Institute (proteinsko) - 6.5. (6 min) 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 13.5. (6 min) 
nerazporejeno:
# Značilnosti cepiva Zydus Cadila (DNA) 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) 
 
----
Povezava do [https://www.youtube.com/watch?v=K3odScka55A videa z razlago] o načinu določanja učinkovitosti cepiv in o (ne)smislu primerjanja teh vrednosti (Vox).

Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano)

2021-04-21T13:54:11Z

Urska.PStrnad:

Covaxin (tudi BBV152) je prvo indijsko cepivo proti COVID-19, ki ga proizvaja indijsko biotehnološko podjetje Bharat Biotech. Je inaktivirano cepivo in temelji na dobro uveljavljeni in časovno preizkušeni platformi v svetu tehnologije cepiv, saj takšna cepiva obstajajo že desetletja. Inaktivirani virusi se ne razmnožujejo, zato ne povzročajo bolezni, vseeno pa povzročijo, da imunski sistem sproži obrambno reakcijo proti okužbi. Za izdelavo cepiva je bil uporabljen sev NIV-2020-770, ki so ga izolirali v Indiji. Virusne delce so namnožili v ledvičnih celicah afriške zelene opice (Vero CCL-18). Po namnožitvi v bioreaktorju, so virusne delce očistili in jih nato inaktivirali z ß-propiolaktonom, ki se veže na virusne gene, kar prepreči nadaljnjo razmnoževanje virusa, hkrati pa proteini ostanejo nespremenjeni.
Za namen kliničnih študij so pripravili 3 različice cepiva, ki so se razlikovale v koncentraciji antigena (3 µg in 6 µg) in vrsti adjuvansa (Algel in Algel-IMDG). Določili so, da je cepivo najbolj stabilno na temperaturi med 2 in 8°C. Covaxin poleg inaktiviranih virusnih delcev SARS-CoV-2 in adjuvansov vsebuje tudi konzervans in pufer, ki uravnava pH.
Cepivo je vneseno intramuskularno. Ko vstopi v telo, antigen predstavitvene celice fagocitirajo virusne delce in ločene fragmente virusa izpostavijo na svoji površini. Ustrezne T celice pomagalke nato zaznajo te fragmente, se aktivirajo in rekrutirajo limfocite B, ki nato proizvedejo protitelesa proti koronavirusu in predstavljajo zaščito pred okužbo z živim koronavirusom.

== Rezultati kliničnih raziskav ==

'''Faza 1:'''
V prvi fazi kliničnih testiranj je sodelovalo 375 ljudi starih med 18 in 55 let. Cepivo je bilo administrirano v dveh dozah z zamikom 14 dni. Skupaj je samo 15% ljudi poročalo o stranskih učinkih (bolečina na mestu vboda, glavobol in utrujenost). Kasnejše raziskave so pokazale, da cepivo inducira humoralno in celično imunost.

'''Faza 2:'''
Cepivo so preizkusili na 380 ljudeh starih med 12 in 65 let. Druga doza je bila administrirana 28 dni po prvi dozi. Izkazalo se je, da so sodelujoči razvili protitelesa na SARS-CoV-2. Zaznane so bile tudi T celice pomagalke. Izkazalo se je, da 6 µl Algel-IMDG sproži boljši imunski odziv in zato so ravno tega preverjali v tretji fazi kliničnih študij.

'''Faza 3:'''
Cepivo BBV152 je bila v tretji fazi preizkušeno na 25,800 osebah, polovica teh je prejela cepivo, polovica pa je prejela le placebo. Sodelujoči so bili stari od 18 do 98 let. Vse testirane so po cepljenju razdelili v tri kategorije:

- Kategorija 1; opazovali so simptome, ki so se pojavili po cepljenju.

- Kategorija 2; zanimali so jih simptomatski in asimptomatski pacienti.

- Kategorija 3; kontrolira so še razvoj odpornosti na koronavirus.

Za testiranje učinkovitosti so spremljali 130 ljudi, ki so se minimalno 14 dni po drugi dozi, okužili s SARS-CoC-2. Rezultati raziskav so pokazali, da je učinkovitost cepiva 81%. Covaxin je učinkovit tudi proti angleškemu sevu.

== Viri ==
1. Bharat Biotech, “COVAXIN® - India’s First Indigenous COVID-19 Vaccine,” 2020, [Online]. Available: https://www.bharatbiotech.com/covaxin.html.

2. D. McMaster, M. Veremu, and K. Jonas, “Inactivated COVID-19 vaccine BBV152/COVAXIN effectively neutralizes recently emerged B 1.1.7 variant of SARS-CoV-2,” Int. Soc. Travel Med., pp. 1–56, 2020.

3. P. D. Yadav et al., “Immunogenicity and protective efficacy of inactivated SARS-CoV-2 vaccine candidate, BBV152 in rhesus macaques,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21639-w.

4. J. Corum and C. Zimmer, “How Bharat Biotech’s Vaccine Works,” New York Times, 2021, [Online]. Available: https://www.nytimes.com/interactive/2021/health/bharat-biotech-covid-19-vaccine.html.

5. S. Mohandas et al., “Immunogenicity and protective efficacy of BBV152, whole virion inactivated SARS- CoV-2 vaccine candidates in the Syrian hamster model,” iScience, vol. 24, no. 2, p. 102054, 2021, doi: 10.1016/j.isci.2021.102054.

6. B. Ganneru et al., “Th1 skewed immune response of whole virion inactivated SARS CoV 2 vaccine and its safety evaluation,” iScience, vol. 24, no. 4, p. 102298, 2021, doi: 10.1016/j.isci.2021.102298.

7. W. Are, T. H. E. Risks, O. F. Bharat, and B. C.- Vaccine, “FACT SHEET FOR VACCINE RECIPIENTS & CAREGIVERS RESTRICTED USE IN EMERGENCY SITUATION OF COVID-19 SARS-CoV-2 VACCINE BY BHARAT BIOTECH,” p. 500.

Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano)

2021-04-21T13:52:47Z

Urska.PStrnad:

Covaxin (tudi BBV152) je prvo indijsko cepivo proti COVID-19, ki ga proizvaja indijsko biotehnološko podjetje Bharat Biotech. Je inaktivirano cepivo in temelji na dobro uveljavljeni in časovno preizkušeni platformi v svetu tehnologije cepiv, saj takšna cepiva obstajajo že desetletja. Inaktivirani virusi se ne razmnožujejo, zato ne povzročajo bolezni, vseeno pa povzročijo, da imunski sistem sproži obrambno reakcijo proti okužbi. Za izdelavo cepiva je bil uporabljen sev NIV-2020-770, ki so ga izolirali v Indiji. Virusne delce so namnožili v ledvičnih celicah afriške zelene opice (Vero CCL-18). Po namnožitvi v bioreaktorju, so virusne delce očistili in jih nato inaktivirali z ß-propiolaktonom, ki se veže na virusne gene, kar prepreči nadaljnjo razmnoževanje virusa, hkrati pa proteini ostanejo nespremenjeni.
Za namen kliničnih študij so pripravili 3 različice cepiva, ki so se razlikovale v koncentraciji antigena (3 µg in 6 µg) in vrsti adjuvansa (Algel in Algel-IMDG). Določili so, da je cepivo najbolj stabilno na temperaturi med 2 in 8°C. Covaxin poleg inaktiviranih virusnih delcev SARS-CoV-2 in adjuvansov vsebuje tudi konzervans in pufer, ki uravnava pH.
Cepivo je vneseno intramuskularno. Ko vstopi v telo, antigen predstavitvene celice fagocitirajo virusne delce in ločene fragmente virusa izpostavijo na svoji površini. Ustrezne T celice pomagalke nato zaznajo te fragmente, se aktivirajo in rekrutirajo limfocite B, ki nato proizvedejo protitelesa proti koronavirusu in predstavljajo zaščito pred okužbo z živim koronavirusom.

== Rezultati kliničnih raziskav ==

Faza 1:
V prvi fazi kliničnih testiranj je sodelovalo 375 ljudi starih med 18 in 55 let. Cepivo je bilo administrirano v dveh dozah z zamikom 14 dni. Skupaj je samo 15% ljudi poročalo o stranskih učinkih (bolečina na mestu vboda, glavobol in utrujenost). Kasnejše raziskave so pokazale, da cepivo inducira humoralno in celično imunost.
Faza 2:
Cepivo so preizkusili na 380 ljudeh starih med 12 in 65 let. Druga doza je bila administrirana 28 dni po prvi dozi. Izkazalo se je, da so sodelujoči razvili protitelesa na SARS-CoV-2. Zaznane so bile tudi T celice pomagalke. Izkazalo se je, da 6 µl Algel-IMDG sproži boljši imunski odziv in zato so ravno tega preverjali v tretji fazi kliničnih študij.
Faza 3:
Cepivo BBV152 je bila v tretji fazi preizkušeno na 25,800 osebah, polovica teh je prejela cepivo, polovica pa je prejela le placebo. Sodelujoči so bili stari od 18 do 98 let. Vse testirane so po cepljenju razdelili v tri kategorije:

- Kategorija 1; opazovali so simptome, ki so se pojavili po cepljenju.

- Kategorija 2; zanimali so jih simptomatski in asimptomatski pacienti.

- Kategorija 3; kontrolira so še razvoj odpornosti na koronavirus.

Za testiranje učinkovitosti so spremljali 130 ljudi, ki so se minimalno 14 dni po drugi dozi, okužili s SARS-CoC-2. Rezultati raziskav so pokazali, da je učinkovitost cepiva 81%. Covaxin je učinkovit tudi proti angleškemu sevu.

== Viri ==
1. Bharat Biotech, “COVAXIN® - India’s First Indigenous COVID-19 Vaccine,” 2020, [Online]. Available: https://www.bharatbiotech.com/covaxin.html.

2. D. McMaster, M. Veremu, and K. Jonas, “Inactivated COVID-19 vaccine BBV152/COVAXIN effectively neutralizes recently emerged B 1.1.7 variant of SARS-CoV-2,” Int. Soc. Travel Med., pp. 1–56, 2020.

3. P. D. Yadav et al., “Immunogenicity and protective efficacy of inactivated SARS-CoV-2 vaccine candidate, BBV152 in rhesus macaques,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21639-w.

4. J. Corum and C. Zimmer, “How Bharat Biotech’s Vaccine Works,” New York Times, 2021, [Online]. Available: https://www.nytimes.com/interactive/2021/health/bharat-biotech-covid-19-vaccine.html.

5. S. Mohandas et al., “Immunogenicity and protective efficacy of BBV152, whole virion inactivated SARS- CoV-2 vaccine candidates in the Syrian hamster model,” iScience, vol. 24, no. 2, p. 102054, 2021, doi: 10.1016/j.isci.2021.102054.

6. B. Ganneru et al., “Th1 skewed immune response of whole virion inactivated SARS CoV 2 vaccine and its safety evaluation,” iScience, vol. 24, no. 4, p. 102298, 2021, doi: 10.1016/j.isci.2021.102298.

7. W. Are, T. H. E. Risks, O. F. Bharat, and B. C.- Vaccine, “FACT SHEET FOR VACCINE RECIPIENTS & CAREGIVERS RESTRICTED USE IN EMERGENCY SITUATION OF COVID-19 SARS-CoV-2 VACCINE BY BHARAT BIOTECH,” p. 500.

Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano)

2021-04-21T13:52:14Z

Urska.PStrnad:

Covaxin (tudi BBV152) je prvo indijsko cepivo proti COVID-19, ki ga proizvaja indijsko biotehnološko podjetje Bharat Biotech. Je inaktivirano cepivo in temelji na dobro uveljavljeni in časovno preizkušeni platformi v svetu tehnologije cepiv, saj takšna cepiva obstajajo že desetletja. Inaktivirani virusi se ne razmnožujejo, zato ne povzročajo bolezni, vseeno pa povzročijo, da imunski sistem sproži obrambno reakcijo proti okužbi. Za izdelavo cepiva je bil uporabljen sev NIV-2020-770, ki so ga izolirali v Indiji. Virusne delce so namnožili v ledvičnih celicah afriške zelene opice (Vero CCL-18). Po namnožitvi v bioreaktorju, so virusne delce očistili in jih nato inaktivirali z ß-propiolaktonom, ki se veže na virusne gene, kar prepreči nadaljnjo razmnoževanje virusa, hkrati pa proteini ostanejo nespremenjeni.
Za namen kliničnih študij so pripravili 3 različice cepiva, ki so se razlikovale v koncentraciji antigena (3 µg in 6 µg) in vrsti adjuvansa (Algel in Algel-IMDG). Določili so, da je cepivo najbolj stabilno na temperaturi med 2 in 8°C. Covaxin poleg inaktiviranih virusnih delcev SARS-CoV-2 in adjuvansov vsebuje tudi konzervans in pufer, ki uravnava pH.
Cepivo je vneseno intramuskularno. Ko vstopi v telo, antigen predstavitvene celice fagocitirajo virusne delce in ločene fragmente virusa izpostavijo na svoji površini. Ustrezne T celice pomagalke nato zaznajo te fragmente, se aktivirajo in rekrutirajo limfocite B, ki nato proizvedejo protitelesa proti koronavirusu in predstavljajo zaščito pred okužbo z živim koronavirusom.

== Rezultati kliničnih raziskav ==

Faza 1:
V prvi fazi kliničnih testiranj je sodelovalo 375 ljudi starih med 18 in 55 let. Cepivo je bilo administrirano v dveh dozah z zamikom 14 dni. Skupaj je samo 15% ljudi poročalo o stranskih učinkih (bolečina na mestu vboda, glavobol in utrujenost). Kasnejše raziskave so pokazale, da cepivo inducira humoralno in celično imunost.
Faza 2:
Cepivo so preizkusili na 380 ljudeh starih med 12 in 65 let. Druga doza je bila administrirana 28 dni po prvi dozi. Izkazalo se je, da so sodelujoči razvili protitelesa na SARS-CoV-2. Zaznane so bile tudi T celice pomagalke. Izkazalo se je, da 6 µl Algel-IMDG sproži boljši imunski odziv in zato so ravno tega preverjali v tretji fazi kliničnih študij.
Faza 3:
Cepivo BBV152 je bila v tretji fazi preizkušeno na 25,800 osebah, polovica teh je prejela cepivo, polovica pa je prejela le placebo. Sodelujoči so bili stari od 18 do 98 let. Vse testirane so po cepljenju razdelili v tri kategorije:
- Kategorija 1; opazovali so simptome, ki so se pojavili po cepljenju.
- Kategorija 2; zanimali so jih simptomatski in asimptomatski pacienti.
- Kategorija 3; kontrolira so še razvoj odpornosti na koronavirus.
Za testiranje učinkovitosti so spremljali 130 ljudi, ki so se minimalno 14 dni po drugi dozi, okužili s SARS-CoC-2. Rezultati raziskav so pokazali, da je učinkovitost cepiva 81%. Covaxin je učinkovit tudi proti angleškemu sevu.

== Viri ==
1. Bharat Biotech, “COVAXIN® - India’s First Indigenous COVID-19 Vaccine,” 2020, [Online]. Available: https://www.bharatbiotech.com/covaxin.html.

2. D. McMaster, M. Veremu, and K. Jonas, “Inactivated COVID-19 vaccine BBV152/COVAXIN effectively neutralizes recently emerged B 1.1.7 variant of SARS-CoV-2,” Int. Soc. Travel Med., pp. 1–56, 2020.

3. P. D. Yadav et al., “Immunogenicity and protective efficacy of inactivated SARS-CoV-2 vaccine candidate, BBV152 in rhesus macaques,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21639-w.

4. J. Corum and C. Zimmer, “How Bharat Biotech’s Vaccine Works,” New York Times, 2021, [Online]. Available: https://www.nytimes.com/interactive/2021/health/bharat-biotech-covid-19-vaccine.html.

5. S. Mohandas et al., “Immunogenicity and protective efficacy of BBV152, whole virion inactivated SARS- CoV-2 vaccine candidates in the Syrian hamster model,” iScience, vol. 24, no. 2, p. 102054, 2021, doi: 10.1016/j.isci.2021.102054.

6. B. Ganneru et al., “Th1 skewed immune response of whole virion inactivated SARS CoV 2 vaccine and its safety evaluation,” iScience, vol. 24, no. 4, p. 102298, 2021, doi: 10.1016/j.isci.2021.102298.

7. W. Are, T. H. E. Risks, O. F. Bharat, and B. C.- Vaccine, “FACT SHEET FOR VACCINE RECIPIENTS & CAREGIVERS RESTRICTED USE IN EMERGENCY SITUATION OF COVID-19 SARS-CoV-2 VACCINE BY BHARAT BIOTECH,” p. 500.

Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano)

2021-04-21T13:51:38Z

Urska.PStrnad: New page: Covaxin (tudi BBV152) je prvo indijsko cepivo proti COVID-19, ki ga proizvaja indijsko biotehnološko podjetje Bharat Biotech. Je inaktivirano cepivo in temelji na dobro uveljavljeni in č...

Covaxin (tudi BBV152) je prvo indijsko cepivo proti COVID-19, ki ga proizvaja indijsko biotehnološko podjetje Bharat Biotech. Je inaktivirano cepivo in temelji na dobro uveljavljeni in časovno preizkušeni platformi v svetu tehnologije cepiv, saj takšna cepiva obstajajo že desetletja. Inaktivirani virusi se ne razmnožujejo, zato ne povzročajo bolezni, vseeno pa povzročijo, da imunski sistem sproži obrambno reakcijo proti okužbi. Za izdelavo cepiva je bil uporabljen sev NIV-2020-770, ki so ga izolirali v Indiji. Virusne delce so namnožili v ledvičnih celicah afriške zelene opice (Vero CCL-18). Po namnožitvi v bioreaktorju, so virusne delce očistili in jih nato inaktivirali z ß-propiolaktonom, ki se veže na virusne gene, kar prepreči nadaljnjo razmnoževanje virusa, hkrati pa proteini ostanejo nespremenjeni.
Za namen kliničnih študij so pripravili 3 različice cepiva, ki so se razlikovale v koncentraciji antigena (3 µg in 6 µg) in vrsti adjuvansa (Algel in Algel-IMDG). Določili so, da je cepivo najbolj stabilno na temperaturi med 2 in 8°C. Covaxin poleg inaktiviranih virusnih delcev SARS-CoV-2 in adjuvansov vsebuje tudi konzervans in pufer, ki uravnava pH.
Cepivo je vneseno intramuskularno. Ko vstopi v telo, antigen predstavitvene celice fagocitirajo virusne delce in ločene fragmente virusa izpostavijo na svoji površini. Ustrezne T celice pomagalke nato zaznajo te fragmente, se aktivirajo in rekrutirajo limfocite B, ki nato proizvedejo protitelesa proti koronavirusu in predstavljajo zaščito pred okužbo z živim koronavirusom.

== Rezultati kliničnih raziskav ==

Faza 1:
V prvi fazi kliničnih testiranj je sodelovalo 375 ljudi starih med 18 in 55 let. Cepivo je bilo administrirano v dveh dozah z zamikom 14 dni. Skupaj je samo 15% ljudi poročalo o stranskih učinkih (bolečina na mestu vboda, glavobol in utrujenost). Kasnejše raziskave so pokazale, da cepivo inducira humoralno in celično imunost.
Faza 2:
Cepivo so preizkusili na 380 ljudeh starih med 12 in 65 let. Druga doza je bila administrirana 28 dni po prvi dozi. Izkazalo se je, da so sodelujoči razvili protitelesa na SARS-CoV-2. Zaznane so bile tudi T celice pomagalke. Izkazalo se je, da 6 µl Algel-IMDG sproži boljši imunski odziv in zato so ravno tega preverjali v tretji fazi kliničnih študij.
Faza 3:
Cepivo BBV152 je bila v tretji fazi preizkušeno na 25,800 osebah, polovica teh je prejela cepivo, polovica pa je prejela le placebo. Sodelujoči so bili stari od 18 do 98 let. Vse testirane so po cepljenju razdelili v tri kategorije:
- Kategorija 1; opazovali so simptome, ki so se pojavili po cepljenju.
- Kategorija 2; zanimali so jih simptomatski in asimptomatski pacienti.
- Kategorija 3; kontrolira so še razvoj odpornosti na koronavirus.
Za testiranje učinkovitosti so spremljali 130 ljudi, ki so se minimalno 14 dni po drugi dozi, okužili s SARS-CoC-2. Rezultati raziskav so pokazali, da je učinkovitost cepiva 81%. Covaxin je učinkovit tudi proti angleškem sevu.

== Viri ==
1. Bharat Biotech, “COVAXIN® - India’s First Indigenous COVID-19 Vaccine,” 2020, [Online]. Available: https://www.bharatbiotech.com/covaxin.html.

2. D. McMaster, M. Veremu, and K. Jonas, “Inactivated COVID-19 vaccine BBV152/COVAXIN effectively neutralizes recently emerged B 1.1.7 variant of SARS-CoV-2,” Int. Soc. Travel Med., pp. 1–56, 2020.

3. P. D. Yadav et al., “Immunogenicity and protective efficacy of inactivated SARS-CoV-2 vaccine candidate, BBV152 in rhesus macaques,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21639-w.

4. J. Corum and C. Zimmer, “How Bharat Biotech’s Vaccine Works,” New York Times, 2021, [Online]. Available: https://www.nytimes.com/interactive/2021/health/bharat-biotech-covid-19-vaccine.html.

5. S. Mohandas et al., “Immunogenicity and protective efficacy of BBV152, whole virion inactivated SARS- CoV-2 vaccine candidates in the Syrian hamster model,” iScience, vol. 24, no. 2, p. 102054, 2021, doi: 10.1016/j.isci.2021.102054.

6. B. Ganneru et al., “Th1 skewed immune response of whole virion inactivated SARS CoV 2 vaccine and its safety evaluation,” iScience, vol. 24, no. 4, p. 102298, 2021, doi: 10.1016/j.isci.2021.102298.

7. W. Are, T. H. E. Risks, O. F. Bharat, and B. C.- Vaccine, “FACT SHEET FOR VACCINE RECIPIENTS & CAREGIVERS RESTRICTED USE IN EMERGENCY SITUATION OF COVID-19 SARS-CoV-2 VACCINE BY BHARAT BIOTECH,” p. 500.

MBT seminarji 2021

2021-03-10T17:20:05Z

Urska.PStrnad:

MBT seminarji 2021

2021-03-10T17:16:43Z

Urska.PStrnad:

MBT seminarji 2021

2021-03-10T17:15:54Z

Urska.PStrnad:

BNT-seminar

2021-03-09T17:45:31Z

Urska.PStrnad:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30200303 
30019363 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
30200317 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-09T17:44:11Z

Urska.PStrnad:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30200303 
30019363 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.